הפרוטוקול מציג מודלים של דרוזופילה שבהם ניתן לאפיין את תפקוד הלב ולשלוט בו באמצעות אור. זה מאפשר לחוקרים לחקור מחלות לב אנושיות בדרוזופילה באמצעות בעלי חיים שלמים. שיטה זו יכולה להשיג באופן אמין הדמיית OCT לא פולשנית ובקרה אופטוגנטית של תפקוד הלב Drosophila.
יש לו יעילות ואיכות גבוהות. קצב אופטוגנטי יכול להיות חלופה לקצב חשמלי כטיפול לטיפול בהפרעות קצב. ניתן להרחיב את הדמיית ה-OCT והקצב האופטוגנטי למערכות מודל אחרות כמו אורגנואידים של הלב, דגי זברה וגרון ולב.
כדי להתחיל, שלב חמש ידיים GAL4 מעל TM6 נקבה בתולה בעלת צינורות כפולים ושניים עד שלושה זבובים זכרים מ- UAS Ops ו- Stocks לכל בקבוקון. למחרת, הכינו מזון מוגדר למחצה על פי הוראות מרכז המניות דרוזופילה בבלומינגטון על ידי הוספת 5.14 גרם לכל 100 מיליליטר סוכרוז למיכל על צלחת חמה. ואז מגניב אותו ל 60 מעלות צלזיוס עם ערבוב מתמיד.
לאחר מכן, הכינו בקבוקוני זבוב צרים על ידי הוספת 50 מיקרוליטרים של תמיסת אתנול רשתית של 100 מילימולר לכל בקבוקון. השתמש פיפטה סרולוגית כדי להיפטר מחמישה מיליליטר של מזון זבובים לכל זבוב צר. לאחר מערבולת במהירות מקסימלית למשך 10 שניות, חברו את הבקבוקונים הללו ועטפו אותם בבד הכהה כדי להגן עליהם מפני אור.
למחרת, העבירו את הזבובים בהתמדה ומטילים ביצים לבקבוקונים עם אתנול רשתית כל-טרנס המכיל מזון. הגן על המדפים באמצעות בקבוקונים מפני אור. לאחר 24 עד 48 שעות, בהתאם למספר הביצים המוטלות, יש להשליך את ההורים כדי למנוע ריבוי יתר של בקבוקונים.
לאחר מכן, לאסוף צאצאים שאינם טובי להדמיית לב. בחרו זחל GAL4 או גולם של כטב"מים מהבקבוקון, הניחו אותו על טישו ונגבו בעדינות את המדיה ממשטח הגוף באמצעות מברשת צביעה. הכינו את שקופית המיקרוסקופ עם חתיכה קטנה של סרט דו-צדדי באמצע.
לאחר מכן, הניחו בעדינות את הזחל או הגולם על משטח הטייפ כשהצד הגבי למעלה ובניצב לצד הארוך של המגלשה באמצעות מברשת או פינצטה עדינה. הפעילו לחץ עדין כדי להצמיד את הזחל או הגולם לפני השטח של הסרט. כעת, הגדר את השקופית על שלב ההדמיה כאשר הזחל או הגולם פונים כלפי מטה והפעל את טומוגרפיה קוהרנטיות אופטית או מקור אור OCT על ידי תוכנת בקרת לייזר.
פתח את תוכנת בקרת OCT של התחום הספקטרלי הכתוב בהתאמה אישית. לאחר מכן, לחץ על חלון התצוגה המקדימה. לאחר מכן, הגדר את פרמטרי הסריקה בתוכנת OCT של התחום הספקטרלי.
השתמש במיקרו-מניפולטורים כדי לשלוט בשלב הדגימה כדי להביא את לב הזבוב למיקוד. התאם את מיקום המוקד כדי למזער את השתקפות האור ממשטח הקוטיקולה של הזבוב. כמו כן, שקול למרוח שמן מינרלי על פני הזחל או הגלמים כדי למזער את ההשתקפות.
לאחר מכן, הגדר את פרמטרי הסריקה עבור רכישת תמונה OCT במצב M וקבל חמש קבוצות של נתוני בקרה ללא פולסים של גירוי אור אדום כדי לחשב דופק במנוחה. תכנן את פעימת האור עבור גירוי הקצב בתוכנת בקרת OCT המותאמת אישית. לשם כך, לחץ על כרטיסיות ההגדרות והוסף את רצפי פולס האור המתוכננים כדי לשלוט בתדר הדופק, רוחב הדופק, משך הגירוי וזמן ההמתנה על פי פרוטוקולי גירוי שונים.
לאחר מכן פתח את תוכנת בקר האור כדי ליצור פולסים של אור אדום. בחרו את מצב הדופק בבחירת המצב. לחצו פעמיים על הדמות עבור הגדרות פרופיל הדופק, ובחרו במצב עוקב.
שמור את העוצמה כבויה על אפס והגדר את אחוז העוצמה בעת חישוב צפיפות ההספק בפועל. רכוש קטעי וידאו במצב M של הלב Drosophila הפועם עם גירוי קל על ידי לחיצה על לרכוש בתוכנת בקרת OCT. תעדו הבזקים של אור אדום במורד לב הזבוב במהלך רכישת ההדמיה.
שים לב שנדרשות הגדרות קצב שונות כדי לשלוט בתפקוד לב הזבוב באמצעות דגמי זבוב של צ'אנרהודופסין ו-NPHR עם הזזה לאדום. פתח את תוכנת פילוח לב הזבוב שפותחה בהתאמה אישית ולחץ על קובץ נבחר. לאחר מכן בחר את הקובץ לניתוח בממשק המשתמש הגרפי.
הזינו את הגבולות האנכיים והאופקיים של אזור הלב בפיקסלים בתיבות המלל העליונות. לחץ על שינוי גודל. באמצעות המחוון בתחתית, ודא שכל אזור הלב גלוי ושהוא ממלא את כל הקופסה עבור האוסף כולו.
לאחר לחיצה על לשונית החיזוי, התוכנית תעבור על כל פרוסה באוסף ותבחר את אזור הלב תוך כשלוש דקות. לאחר השלמת החיזוי, לחץ על עלילת משאבי אנוש כדי להציג תרשים של אזור הלב לאורך זמן בחלון חדש. בחר את אזורי הפסגה או העמק הנכונים, בחר את הדופק ולאחר מכן כרטיסיות HR כדי ליצור נתון סופי.
הפרמטרים הפונקציונליים יישמרו בו זמנית בקבצי ה- CSV. ספציפיות הרקמה של דרייבר GAL4 ביד אומתה על ידי הדמיה של ביטוי חלבון פלואורסצנטי ירוק. תמונות OCT טיפוסיות של חתך גוף זחל ופופאל מוצגות כאן.
כדי לחקות מצבי לב שונים, תוכננו ארבעה סוגים של פולסים קלים. פעימה בודדת שנמשכה 10 שניות לאחר חמש שניות של זמן המתנה, יצרה דום לב בר-שחזור. עבור קצב הלב בתדרים נמוכים יותר מקצב הלב במנוחה, נעשה שימוש בשני רצפי פולסים קלים עם תדרי קצב השווים למחצית מקצב הלב במנוחה, ורבע מהדופק במנוחה שנמשך שמונה שניות עם זמן המתנה של שש שניות בין לבין.
דפוס הגירוי להגברת קצב הלב עקב הפעלת channelrhodopsin בהסטה אדומה כלל שלושה רצפים של פולסים קלים. תדירות התכווצות הלב המופחתת בעקבות אותות האור גרמה לקצב לב איטי יותר המחקה זחלים וגלמים. סדרה של שלוש רכבות פולסים קלות בתדרי גירוי שונים הופעלה על זחלים וגלמים הראו בבירור קצב לב מוגבר בעקבות פולסים קלים.
בחירת ההכנה של צאצא נכון, הרכבה של הדגימה, והליך הדמיה הם חיוניים. אנו מקווים להעביר את טכנולוגיית הקצב האופטוגנטי למודלים גדולים יותר של בעלי חיים, לחקור מחלות לב של יונקים ולחקור גישות טיפוליות חדשות לטיפול בהפרעות קצב.
