עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי NIH מענק AI069358 וקרן מחקר BloodCenter.

<ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני שמתחילים את התהליך, את הפריטים הבאים צריכים להיות מוכנים אסף: <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קרח </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מזרק 5 מ&quot;ל עם מחט 27g </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מזרק 5 מ&quot;ל עם מחט 25 גרם </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בלוק קלקר וסיכות להרכבה על העכבר </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מגש שעליו לחסום הרכבה ניתן למקם </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מספריים ומלקחיים </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אוסף צינורות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 70% אתנול </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> PBS עם 3% עגל בסרום עוברי (FCS) (Pre צונן ושמרה על הקרח) </li></ul></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את העכבר, לרסס אותו עם 70% אתנול ו לעלות אותו על בלוק קלקר על גבו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מספריים מלקחיים לחתוך את העור החיצונית של הצפק בעדינות למשוך אותו לאחור כדי לחשוף את העור הפנימית רירית חלל הצפק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזרק 5 מ&quot;ל של קרח קר PBS (עם FCS 3%) לתוך חלל הצפק באמצעות מחט 27g. דחוף את המחט לאט הצפק נזהרים שלא לנקב כל האיברים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר ההזרקה, בעדינות לעסות את הצפק כדי לסלק את כל התאים מחוברים אל הפתרון PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 25 גרם, שפוע המחט, מצורף מזרק 5 מ&quot;ל ב הצפק לאסוף את הנוזל תוך כדי תנועה את קצה המחט בעדינות, כדי למנוע סתימת על ידי רקמת שומן או איברים אחרים. כמו איסוף הנוזלים כמה שניתן להפקיד את ההשעיה תא שנאספו צינורות שמרה על הקרח לאחר הסרת המחט של המזרק. אופציונלי: חזור על שלב 4-6 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עושים חתך בעור הפנימי של הצפק ובעוד מרים את העור עם מלקחיים להשתמש פיפטה פסטר מפלסטיק כדי לאסוף את הנוזלים הנותרים מחלל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם בשלב 6 או 7 זיהום דם גלוי מזוהה אז המדגם מזוהמים צריך להיות מושלך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין על השעיית התא נאספים 1500 סל&quot;ד במשך 8 דקות, לבטל את supernatant ו resuspend התאים התקשורת הרצוי או PBS עבור הספירה. </li></ol> פרוטוקול אלטרנטיבית להשיג thioglycollate שהושרו מקרופאגים: שיטה זו משמשת כדי להשיג תשואה גבוהה יותר של מקרופאגים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזרק 5 מ&quot;ל של 3% (w / v) ברואר thioglycollate בינוני (7) לתוך חלל הצפק של עכבר אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המתן 3-5 ימים, המשך לשלב 1 לעיל לאיסוף של התאים. </li></ol> לעומת הגישה nonelicited, כ 10 פעמים יותר מקרופאגים ניתן לאסוף. החשש היחיד הוא מתקבל על ידי מקרופאגים הליך זה שונה בכמה מאפיינים פיזיולוגיים שלהם. נציג התוצאות: מתוך עכבר unmanipulated, 5-10000000 התאים חלל הצפק ניתן להשיג עם פרוטוקול בידוד טוב. בין כל תאים חיים, 50-60% הם תאים B, מקרופאגים ~ 30% ו 5-10% הם תאים T (איור 1). <img src="/files/ftp_upload/1488/1488fig1.jpg" alt="איור 1" /> באיור 1. הפנוטיפ של תאים בודדים מתוך חלל הצפק. הבידוד בעקבות התאים חלל הצפק הם הוכתמו עכבר אנטי TCRβ-FITC, B220-PE-טקסס אדום, כחול פסיפיק CD11b, CD23-PE-Cy7 CD5 ו-APC. מגרשים תזרים נציג cytometric להראות אחוזים של תאים B ו-T (א), מקרופאגים (ב), B1 ו-B2 תאים (ג) ו B1a ו B1b תאים (ד).

<ol>
	<li>Zhang, X., Goncalves, R., Mosser, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+isolation+and+characterization+of+murine+macrophages.">The isolation and characterization of murine macrophages.</a> Current Protocols in Immunology. , (2008).</li><li>Boes, M., Prodeus, A. P., Schmidt, T., Carroll, M. C., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+critical+role+of+natural+immunoglobulin+M+in+immediate+defense+against+systemic+bacterial+infection.">A critical role of natural immunoglobulin M in immediate defense against systemic bacterial infection.</a> J. Exp. Med. 188, 2381-2386 (1998).</li><li>Mc Daniel, L. S., Benjamin, W. H., Forman, C., Briles, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+clearance+by+anti-phosphocholine+antibodies+as+a+mechanism+of+protection+in+experimental+pneumococcal+bacteremia.">Blood clearance by anti-phosphocholine antibodies as a mechanism of protection in experimental pneumococcal bacteremia.</a> J. Immunol. 133, 3308-3312 (1984).</li><li>Paciorkowski, N., Porte, P., Shultz, L. D., Rajan, T. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B1+B+lymphocytes+play+a+critical+role+in+host+protection+against+lymphatic+filarial+parasites.">B1 B lymphocytes play a critical role in host protection against lymphatic filarial parasites.</a> J. Exp. Med. 191, 731-736 (2000).</li><li>Mercolino, T. J., Arnold, L. W., Hawkins, L. A., Haughton, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normal+mouse+peritoneum+contains+a+large+population+of+Ly-1++(CD5)+B+cells+that+recognize+phosphatidyl+choline:+relationship+to+cells+that+secrete+hemolytic+antibody+specific+for+autologous+erythrocytes.">Normal mouse peritoneum contains a large population of Ly-1+ (CD5) B cells that recognize phosphatidyl choline: relationship to cells that secrete hemolytic antibody specific for autologous erythrocytes.</a> J. Exp. Med. 168, 687-698 (1988).</li><li>O'Garra, A., Chang, R., Go, N., Hastings, R., Haughton, G., Howard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ly-1+B+(B-1)+cells+are+the+main+source+of+B+cell+derived+interleukin+10.">Ly-1 B (B-1) cells are the main source of B cell derived interleukin 10.</a> Eur. J. Immunol. 22, 711-717 (1992).</li><li>Hoover, D. L., Nacy, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+activation+to+kill+Leishmania+tropica:+Defective+intracellular+killing+of+amastigotes+by+macrophages+elicited+with+sterile+inflammatory+agents.">Macrophage activation to kill Leishmania tropica: Defective intracellular killing of amastigotes by macrophages elicited with sterile inflammatory agents.</a> J. Immunol. 132, 1487-1491 (1984).</li><li>Austin, P. E., McCulloch, E. A., Till, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+factor+in+L-cell+conditioned+medium+capable+of+stimulating+colony+formation+by+mouse+marrow+cells+in+culture.">Characterization of the factor in L-cell conditioned medium capable of stimulating colony formation by mouse marrow cells in culture.</a> J. Cell Physiol. 77, 121-134 (1971).</li><li>Stanley, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+macrophage+colony-stimulating+factor,+CSF-1.">The macrophage colony-stimulating factor, CSF-1.</a> Methods Enzymol. 116, 564-587 (1985).</li><li>Baumgarth, N., Chen, J., Herman, O. C., Jager, G. C., Herzenberg, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+B-1+and+B-2+cells+in+immune+protection+from+influenza+virus+infection.">The role of B-1 and B-2 cells in immune protection from influenza virus infection.</a> Curr. Top. Microbiol. Immunol. 252, 163-169 (2000).</li><li>Baumgarth, N., Herman, O. C., Jager, G. C., Brown, L. E., Herzenberg, L. A., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B-1+and+B-2+cell-derived+immunoglobulin+M+antibodies+are+nonredundant+components+of+the+protective+response+to+influenza+virus+infection.">B-1 and B-2 cell-derived immunoglobulin M antibodies are nonredundant components of the protective response to influenza virus infection.</a> J. Exp. Med. 192, 271-280 (2000).</li><li>Berland, R., Wortis, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origins+and+functions+of+B-1+cells+with+notes+on+the+role+of+CD5.">Origins and functions of B-1 cells with notes on the role of CD5.</a> Annu. Rev. Immunol. 20, 253-300 (2002).</li></ol>

בידוד של תאים חלל הצפק היא טכניקה חשובה למחקר של תאים חיסוניים שונים, בעיקר מאקרופאגים ספציפי תת תא B. אמנם זה תהליך פשוט, יש כמה שלבים קריטיים מעורב. נוכחות של זיהום בדם במדגם שנאסף יש להימנע להשיג תא טהור חלל הצפק האוכלוסייה. המתת חסד על ידי נקע בצוואר הרחם צריך להיעשות בזהירות כדי למנוע זיהום דם בתוך חלל הבטן. לחילופין CO 2 יכול לשמש. בנוסף, במהלך הטיפול בהליך תקין יש לנקוט כדי למנוע ניקוב השלפוחית ​​או לאיברים אחרים בתוך חלל הבטן. שחזור ביותר של הנוזל מוזרק חשוב גם תשואה התא. הליך זה נעשה שימוש נרחב ללמוד ביולוגיה macrophage מאז מספרים מתונה של תושב, מקרופאגים unstimulated יכול בקלות להיות המתקבל חלל הצפק, בניגוד המשימה המפרכת להבדיל ובתאים מיאלואידית לתוך מקרופאגים בוגרת במבחנה, באמצעות המושבה macrophage גורם מגרה (8 , 9). התשואה macrophage מתוך חלל הצפק ניתן לשפר על ידי שימוש בשיטת התמחרות thioglycollate, למרות השימוש thioglycollate עשוי לשנות את המאפיינים הפיזיולוגיים של מקרופאגים (7). בתאי B הם חלק חשוב של המערכת החיסונית שלנו משחקת תפקיד מכריע הן חסינות מולדת ובעלי כושר הסתגלות. בין תאים שונים subpopulations B, תאים B1 מהווים קבוצת משנה ייחודית של תאים B המעורבים חסינות אוטואימוניות מולדת, תקנה החיסונית. בתאים B1 ממוקמים בעיקר חלל הצפק הם חידוש עצמי. הם אחד היצרנים העיקריים של IgM טבעי המספק את השורה הראשונה של הגנה כנגד מספר וירוסים וחיידקים (10-12). בתאים B1 הם גם מקור עיקרי של IL-10 (6), המהווה ציטוקינים חשוב המעורב בויסות החיסון. למרות מספר מחקרים כבר נרדף עם התאים B1, עדיין יש מרחב לצורך הערכה נוספת של פונקציות מנוגדות שלהם, במיוחד תפקיד הפיקוח שלהם. חלל הצפק תא שיטת בידוד מספק הזדמנות ייחודית ללמוד את הפונקציות של תאים B1.

<table><tbody><tr><td>Thioglycollate Medium, Brewer Modified</td><td>BD Biosciences</td><td>211716</td><td></td></tr></tbody></table>

isolation of mouse peritoneal cavity cells

חלל הצפק הוא קרום חלל הבטן, כפות מלאות נוזל של יונקים, אשר מכיל את הכבד, הטחול, רוב דרכי העיכול ואת הקרביים האחרים. זה מכיל מספר תאים חיסוניים כולל מקרופאגים, תאים B ותאי T. נוכחות מספר גבוה של מקרופאגים נאיבי חלל הצפק שהופך אותו לאתר מועדף לאיסוף נאיבי תושב מקרופאגים ברקמה (1). חלל הצפק חשוב גם במחקר בתאי B בגלל נוכחות של תת קבוצה ייחודית חלל הצפק תושב B לתא המכונה התאים B1 בנוסף התאים B2 קונבנציונאלי. בתאים B1 מחולקים לתאים B1a ו B1b, אשר יכול להיות מכובדת על ידי ביטוי את פני השטח של CD11b ו CD5. בתאים B1 הם מקור חשוב של IgM טבעי מתן הגנה מוקדם ממגוון רחב של פתוגנים (2-4). תאים אלה הם autoreactive בטבע (5), אבל איך הם נשלטים על מנת למנוע אוטואימוניות עדיין אינה מובנת לחלוטין. להיפך, CD5<sup&gt; +</sup&gt; B1a תאים בעלי מאפיינים מסוימים הרגולציה מכוח יכולתם לייצר IL-10 (6). לכן, חלל הצפק בתאים B1 הם אוכלוסיית תאים מעניין ללמוד כי תפקוד מגוונים שלהם unaddressed שאלות רבות הקשורות התפתחותם ורגולציה. הבידוד של חלל הצפק תאים תושב החיסונית היא בעייתית בשל היעדר מבנה מוגדר בתוך חלל הצפק. פרוטוקול שלנו יתאר הליך לקבלת תאים חיסוניים קיימא מתוך חלל הצפק של עכברים, אשר לאחר מכן ניתן להשתמש לצורך ניתוח פנוטיפי ידי cytometry זרימה ועל מבחני ביוכימיים שונים החיסונית.

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Mouse Peritoneal Cavity Cells at JoVE.com

Isolation of Mouse Peritoneal Cavity Cells

חלל הצפק ביונקים מכילה אוכלוסיות תאים שונות החיסונית חיוני תגובות חיסוניות מולדות. שיטת בידוד יעיל נדרש ניתוח ביוכימי ותפקודי של תאים אלה. כאן אנו מספקים שיטה מקיפה עבור בידוד של תאים חלל הצפק בתוך העכבר.

בידוד של תאים עכבר פריטוניאלית חלל

The peritoneal cavity is a membrane-bound and fluid-filled abdominal cavity of mammals, which contains the liver, spleen, most of the gastro-intestinal ...

isolation-of-mouse-peritoneal-cavity-cells

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

143.2K Views.  Blood Research Institute. חלל הצפק ביונקים מכילה אוכלוסיות תאים שונות החיסונית חיוני תגובות חיסוניות מולדות. שיטת בידוד יעיל נדרש ניתוח ביוכימי ותפקודי של תאים אלה. כאן אנו מספקים שיטה מקיפה עבור בידוד של תאים חלל הצפק בתוך העכבר.

Video: Isolation of Mouse Peritoneal Cavity Cells

Isolation of Mouse Lung Dendritic Cells

Lung dendritic cells (DC) play a fundamental role in sensing invading pathogens 1,2 as well as in the control of tolerogenic responses 3 in the respiratory tract. At least three main subsets of lung dendritic cells have been described in mice: conventional DC (cDC) 4, plasmacytoid DC (pDC) 5 and the IFN-producing killer DC (IKDC) 6,7. The cDC subset is the most prominent DC subset in the lung 8. 
The common marker known to identify DC subsets is CD11c, a type I transmembrane integrin (&beta;2) that is also expressed on monocytes, macrophages, neutrophils and some B cells 9. In some tissues, using CD11c as a marker to identify mouse DC is valid, as in spleen, where most CD11c+ cells represent the cDC subset which expresses high levels of the major histocompatibility complex class II (MHC-II). However, the lung is a more heterogeneous tissue where beside DC subsets, there is a high percentage of a distinct cell population that expresses high levels of CD11c bout low levels of MHC-II. Based on its characterization and mostly on its expression of F4&#47;80, an splenic macrophage marker, the CD11chiMHC-IIlo lung cell population has been identified as pulmonary macrophages 10 and more recently, as a potential DC precursor 11. 
In contrast to mouse pDC, the study of the specific role of cDC in the pulmonary immune response has been limited due to the lack of a specific marker that could help in the isolation of these cells. Therefore, in this work, we describe a procedure to isolate highly purified mouse lung cDC. The isolation of pulmonary DC subsets represents a very useful tool to gain insights into the function of these cells in response to respiratory pathogens as well as environmental factors that can trigger the host immune response in the lung.

A highly purified preparation of mouse lung dendritic cells is described. Specific emphasis is given to the isolation of conventional dendritic cell subset.

בידוד של ריאות תאים דנדריטים עכבר

Lung dendritic cells (DC) play a fundamental role in sensing invading pathogens 1,2 as well as in the control of tolerogenic responses 3 in the ...

Isolating And Immunostaining Lymphocytes and Dendritic Cells from Murine Peyer's Patches

Peyer's patches (PPs) are integral components of the gut-associated lymphoid tissues (GALT) and play a central role in intestinal immunosurveillance and homeostasis. Particulate antigens and microbes in the intestinal lumen are continuously sampled by PP M cells in the follicle-associated epithelium (FAE) and transported to an underlying network of dendritic cells (DCs), macrophages, and lymphocytes. In this article, we describe protocols in which murine PPs are (i) dissociated into single cell suspensions and subjected to flow cytometry and (ii) prepared for cryosectioning and immunostaining. For flow cytometry, PPs are mechanically dissociated and then filtered through 70 &mu;m membranes to generate single cell suspensions free of epithelial cells and large debris. Starting with 20-25 PPs (from four mice), this quick and reproducible method yields a population of &gt;2.5 x 106 cells with &gt;90% cell viability. For cryosectioning, freshly isolated PPs are immersed in Optimal Cutting Temperature (OCT) medium, snap-frozen in liquid nitrogen, and then sectioned using a cryomicrotome. Tissue sections (5-12 &mu;m) are air-dried, fixed with acetone or methanol, and then subjected to immunolabeling.

There is an increasing interest in understanding the immunological functions of specific subpopulations of cells in Peyer's patches (PPs), the primary inductive sites of gut-associated lymphoid tissues. Here we outline parallel protocols for preparing PP single cell preparations for flow cytometric analysis and PP cryosections for immunostaining.

וגם בידוד Immunostaining ימפוציטים ותאי דנדריטים מהתיקונים של Peyer Murine

Peyer's  patches (PPs) are integral components of the gut-associated lymphoid tissues  (GALT) and play a central role in intestinal immunosurveillance and ...

Isolation of Murine Peritoneal Macrophages to Carry Out Gene Expression Analysis Upon Toll-like Receptors Stimulation

During infection and inflammation, circulating monocytes leave the bloodstream and migrate into tissues, where they differentiate into macrophages. Macrophages express surface Toll-like receptors (TLRs), which recognize molecular patterns conserved through evolution in a wide range of microorganisms. TLRs play a central role in macrophage activation which is usually associated with gene expression alteration. Macrophages are critical in many diseases and have emerged as attractive targets for therapy. In the following protocol, we describe a procedure to isolate murine peritoneal macrophages using Brewer&#8217;s thioglycollate medium. The latter will boost monocyte migration into the peritoneum, accordingly this will raise macrophage yield by 10-fold. Several studies have been carried out using bone marrow, spleen or peritoneal derived macrophages. However, peritoneal macrophages were shown to be more mature upon isolation and are more stable in their functionality and phenotype. Thus, macrophages isolated from murine peritoneal cavity present an important cell population that can serve in different immunological and metabolic studies. Once isolated, macrophages were stimulated with different TLR ligands and consequently&#160;gene expression was evaluated.

We describe here a simple protocol to isolate murine peritoneal macrophages. This procedure is followed by RNA extraction to carry out gene expression analysis upon Toll-like receptors stimulation.

בידוד של הצפק Murine המקרופאגים לבצע ניתוח ביטוי גנים בעת ביצוע כמו אגרה רצפטורים הגירוי

During infection and inflammation, circulating monocytes leave the bloodstream and migrate into tissues, where they differentiate into macrophages. ...

Isolation of Peritoneum-derived Mast Cells and Their Functional Characterization with Ca2+-imaging and Degranulation Assays

Mast cells (MCs), as a part of the immune system, play a key role in defending the host against several pathogens and in the initiation of the allergic immune response. The activation of MCs via the cross-linking of surface IgE bound to high affinity IgE receptor (Fc&#949;RI), as well as through the stimulation of several other receptors, initiates the rise of the free intracellular Ca2+ level ([Ca2+]i) that promotes the release of inflammatory and allergic mediators. The identification of molecular constituents involved in these signaling pathways is crucial for understanding the regulation of MC function. In this article, we describe a protocol for the isolation of murine connective tissue type MCs by peritoneal lavage and cultivation of peritoneal MCs (PMCs). Cultures of MCs from various knockout mouse models by this methodology represent a useful approach to the identification of proteins involved in MC signaling pathways. In addition, we also describe a protocol for single cell Fura-2 imaging as an important technique for the quantification of Ca2+ signaling in MCs. Fluorescence-based monitoring of [Ca2+]i is a reliable and commonly used approach to study Ca2+ signaling events, including store-operated calcium entry, which is of utmost importance for MC activation. For the analysis of MC degranulation, we describe a &#946;-hexosaminidase release assay. The amount of &#946;-hexosaminidase released into the culture medium is considered as a degranulation marker for all three different secretory subsets described in MCs. &#946;-hexosaminidase can easily be quantified by its reaction with a colorigenic substrate in a microtiter plate colorimetric assay. This highly reproducible technique is cost-effective and requires no specialized equipment. Overall, the provided protocol demonstrates a high yield of MCs expressing typical MC surface markers, displaying typical morphological and phenotypic features of MCs, and demonstrating highly reproducible responses to secretagogues in Ca2+-imaging and degranulation assays.

Isolation of Peritoneum-derived Mast Cells and Their Functional Characterization with Ca2+-imaging and Degranulation Assays

Here, we present a protocol to isolate and cultivate murine peritoneal mast cells. We also describe two protocols for their functional characterization: a fluorescent imaging of intracellular free Ca2+ concentration and a degranulation assay based on colorimetric quantification of the released &#946;-hexosaminidase.

בידוד של תאי פיטום, נגזר צפק ואיפיונן פונקציונלי עם Ca2 +-הדמיה, מבחני Degranulation

Mast cells (MCs), as a part of the immune system, play a key role in defending the host against several pathogens and in the initiation of the allergic ...

Isolation and Culture of Bone Marrow-Derived Macrophages from Mice

Macrophages have important effector functions in homeostasis and inflammation. These cells are present in every tissue in the body and have the important ability to change their profile according to the stimuli present in the microenvironment. Cytokines can profoundly affect macrophage physiology, especially IFN-&#947; and interleukin 4, generating M1 and M2 types respectively. Because of the versatility of these cells, the production of a population of bone marrow-derived macrophages can be a basic step in many experimental models of cell biology. The aim of this protocol is to help researchers in the isolation and culture of macrophages derived from bone marrow progenitors. Bone marrow progenitors from pathogen-free C57BL/6 mice are transformed into macrophages upon exposure to macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) that, in this protocol, is obtained from the supernatant of the murine fibroblast lineage L-929. After incubation, mature macrophages are available for use from the 7th to the 10th day. A single animal can be the source of approximately 2 x 107 macrophages. Therefore, it is an ideal protocol for obtaining large amounts of primary macrophages using basic methods of cell culture.

The present protocol describes the isolation and culture of bone marrow-derived macrophages from mice.

בידוד ותרבית של מקרופאגים שמקורם במח עצם מעכברים

Macrophages have important effector functions in homeostasis and inflammation. These cells are present in every tissue in the body and have the important ...

<meta charset="utf8"></head><body>הכנה וקטורית לנטיויראלית לאפנון גן In Vivo

Lentiviral Vector Preparation for Efficient Gene and MicroRNA Modulation of Peritoneal Cavity Tissue&#45;Resident Macrophages In Vivo in Mice

Peritoneal tissue-resident macrophages have broad functions in the maintenance of homeostasis and are involved in pathologies within local and neighboring tissues. Their functions are dictated by microenvironmental cues; thus, it is essential to investigate their behavior in an in vivo physiological niche. Currently, specific peritoneal macrophage-targeting methodologies employ whole-mouse transgenic models. Here, a protocol for effective in vivo modulation of mRNA and small RNA species (e.g., microRNA) expression in peritoneal macrophages using lentivirus particles is described. Lentivirus preparations were made in HEK293T cells and purified on a single sucrose layer. In vivo validation of lentivirus effectivity following intraperitoneal injection revealed predominant infection of macrophages restricted to local tissue. Targeting of peritoneal macrophages was successful during homeostasis and thioglycolate-induced peritonitis. The limitations of the protocol, including low-level inflammation induced by intraperitoneal delivery of lentivirus and time restrictions for potential experiments, are discussed. Overall, this study presents a quick and accessible protocol for the rapid assessment of gene function in peritoneal macrophages in vivo.

<meta charset="utf8"></head><body>Author Spotlight: Exploring Macrophage Immunometabolism Through Lentiviral Vector-Mediated Gene Manipulation

We demonstrate a step-by-step protocol for the investigation of gene function in peritoneal tissue-resident macrophages in vivo, using lentiviral vectors.

הכנה וקטורית לנטיויראלית לאפנון יעיל של גנים ומיקרו-רנ"א של מקרופאגים שוכנים ברקמת חלל הצפק in vivo בעכברים

Peritoneal tissue-resident macrophages have broad functions in the maintenance of homeostasis and are involved in pathologies within local and neighboring ...

Isolation of Murine Intestinal Mesenchyme Resulting in a High Yield of Telocytes

The murine small intestine, or colon mesenchyme, is highly heterogenous, containing distinct cell types including blood and lymphatic endothelium, nerves, fibroblasts, myofibroblasts, smooth muscle cells, immune cells, and the recently identified cell type, telocytes. Telocytes are unique mesenchymal cells with long cytoplasmic processes, reaching a distance of tens to hundreds of microns from the cell body. Telocytes have recently emerged as an important intestinal stem cell niche component, providing Wnt proteins that are essential for stem and progenitor cell proliferation.
Although protocols on how to isolate mesenchyme from the mouse intestine are available, it is not clear whether these procedures allow the efficient isolation of telocytes. Isolating telocytes efficiently requires special protocol adjustments that would allow dissociation of the strong cell-cell contact between telocytes and neighboring cells without affecting their viability. Here, available intestinal mesenchyme isolation protocols were adjusted to support the successful isolation and culture of mesenchyme containing a relatively high yield of viable single-cell telocytes.
The obtained single-cell suspension can be analyzed by several techniques, such as immunostaining, cell sorting, imaging, and mRNA experiments. This protocol yields mesenchyme with sufficiently conserved antigenic and functional properties of telocytes, and can be used for several applications. For example, they can be used for co-culture with mouse- or human-derived organoids to support organoid growth with no growth factor supplementation, to better reflect the situation in the original tissue.

Here, we present a protocol to isolate murine intestinal mesenchyme, including telocytes. These can be used for several applications, such as co-culture with mouse or human-derived organoids, to support growth and better reflect the situation in the original tissue.

בידוד של מזנכימה במעי מורין וכתוצאה מכך תשואה גבוהה של טלוציטים

The murine small intestine, or colon mesenchyme, is highly heterogenous, containing distinct cell types including blood and lymphatic endothelium, nerves, ...

Medicine

Whole Cell Electrophysiology of Primary Cultured Murine Enterochromaffin Cells

Enterochromaffin (EC) cells in the gastrointestinal (GI) epithelium constitute the largest subpopulation of enteroendocrine cells. As specialized sensory cells, EC cells sense luminal stimuli and convert them into serotonin (5-hyroxytryptamine, 5-HT) release events. However, the electrophysiology of these cells is poorly understood because they are difficult to culture and to identify. The method presented in this paper outlines primary EC cell cultures optimized for single cell electrophysiology. This protocol utilizes a transgenic cyan fluorescent protein (CFP) reporter to identify mouse EC cells in mixed primary cultures, advancing the approach to obtaining high-quality recordings of whole cell electrophysiology in voltage- and current-clamp modes.

Enterochromaffin (EC) cells comprise a small subset of gastrointestinal epithelial cells. EC cells are electrically excitable and release serotonin, yet difficulties in culturing and identifying EC cells have limited physiological studies. The method presented here establishes a primary culture model amenable to examination of single EC cells by electrophysiology.

אלקטרופיזיולוגיה התא כולו של ראשי Enterochromaffin מאתר בתרבית תאים

Enterochromaffin (EC) cells in the gastrointestinal (GI) epithelium constitute the largest subpopulation of enteroendocrine cells. As specialized sensory ...

בידוד של תאים עכבר פריטוניאלית חלל

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

בידוד של ריאות תאים דנדריטים עכבר

וגם בידוד Immunostaining ימפוציטים ותאי דנדריטים מהתיקונים של Peyer Murine

בידוד של הצפק Murine המקרופאגים לבצע ניתוח ביטוי גנים בעת ביצוע כמו אגרה רצפטורים הגירוי

בידוד של תאי פיטום, נגזר צפק ואיפיונן פונקציונלי עם Ca^{2 +}-הדמיה, מבחני Degranulation

בידוד ותרבית של מקרופאגים שמקורם במח עצם מעכברים

הכנה וקטורית לנטיויראלית לאפנון יעיל של גנים ומיקרו-רנ"א של מקרופאגים שוכנים ברקמת חלל הצפק in vivo בעכברים

הכנה וקטורית לנטיויראלית לאפנון יעיל של גנים ומיקרו-רנ"א של מקרופאגים שוכנים ברקמת חלל הצפק in vivo בעכברים

הכנה וקטורית לנטיויראלית לאפנון יעיל של גנים ומיקרו-רנ"א של מקרופאגים שוכנים ברקמת חלל הצפק in vivo בעכברים

בידוד של מזנכימה במעי מורין וכתוצאה מכך תשואה גבוהה של טלוציטים

אלקטרופיזיולוגיה התא כולו של ראשי Enterochromaffin מאתר בתרבית תאים