ESB מודה מימון על ידי פרס ממציא ניו המנהל של NIH (DP2 OD002002-01), NIH אתגר גרנט 1RC1MH088182-01, NIH גרנד הזדמנויות גרנט 1RC2DE020919-01, NIH 1R01NS067199-01, NSF (0,835,878 ו - 0,848,804), מכון מקגוורן תוכנית Neurotechnology פרס , משרד ההגנה, NARSAD, פ אלפרד סלואן קרן, ג&#39;רי מארג&#39; ברנט, פרס המחקר SFN עבור חדשנות Neuroscience, מעבדת המדיה ב-MIT, קרן Benesse ו ח &#39;וולאס קולטר קרן.

<ol>
	<li>Chow, B., Han, X., Qian, X., Boyden, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-performance+halorhodopsin+variants+for+improved+genetically-targetable+optical+neural+silencing.">High-performance halorhodopsin variants for improved genetically-targetable optical neural silencing.</a> Frontiers in Systems Neuroscience. , (2009).</li><li>Bi, A., Cui, J., Ma, Y. P., Olshevskaya, E., Pu, M., Dizhoor, A. M., Pan, Z. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ectopic+expression+of+a+microbial-type+rhodopsin+restores+visual+responses+in+mice+with+photoreceptor+degeneration.">Ectopic expression of a microbial-type rhodopsin restores visual responses in mice with photoreceptor degeneration.</a> Neuron. 50, 23-33 (2006).</li><li>Han, X., Qian, X., Bernstein, J., Zhou, H., Franzesi, G., Stern, P., Bronson, R., Graybiel, A., Desimone, R., Boyden, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Millisecond-Timescale+Optical+Control+of+Neural+Dynamics+in+the+Nonhuman+Primate+Brain.">Millisecond-Timescale Optical Control of Neural Dynamics in the Nonhuman Primate Brain.</a> Neuron. 62 (2), 191-198 (2009).</li><li>Zhang, F., Wang, L. P., Brauner, M., Liewald, J. F., Kay, K., Watzke, N., Wood, P. G., Bamberg, E., Nagel, G., Gottschalk, A., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multimodal+fast+optical+interrogation+of+neural+circuitry.">Multimodal fast optical interrogation of neural circuitry.</a> Nature. 446 (7136), 633-639 (2007).</li><li>Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Millisecond-timescale+genetically+targeted+optical+control+of+neural+activity.">Millisecond-timescale genetically targeted optical control of neural activity.</a> Nat Neurosci. 8 (9), 1263-1268 (2005).</li><li>Han, X., Boyden, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple-color+optical+activation,+silencing,+and+desynchronization+of+neural+activity,+with+single-spike+temporal+resolution.">Multiple-color optical activation, silencing, and desynchronization of neural activity, with single-spike temporal resolution.</a> PLoS ONE. 2, e299-e299 (2007).</li><li>Szobota, S., Gorostiza, P., Del Bene, F., Wyart, C., Fortin, D. L., Kolstad, K. D., Tulyathan, O., Volgraf, M., Numano, R., Aaron, H. L., Scott, E. K., Kramer, R. H., Flannery, J., Baier, H., Trauner, D., Isacoff, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remote+control+of+neuronal+activity+with+a+light-gated+glutamate+receptor.">Remote control of neuronal activity with a light-gated glutamate receptor.</a> Neuron. 54 (4), 535-545 (2007).</li><li>Lima, S. Q., Miesenbock, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remote+control+of+behavior+through+genetically+targeted+photostimulation+of+neurons.">Remote control of behavior through genetically targeted photostimulation of neurons.</a> Cell. 121 (1), 141-152 (2005).</li><li>Zhang, F., Wang, L. P., Boyden, E. S., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Channelrhodopsin-2+and+optical+control+of+excitable+cells.">Channelrhodopsin-2 and optical control of excitable cells.</a> Nat. Methods. 3, 785-792 (2006).</li><li>Ishizuka, T., Kakuda, M., Araki, R., Yawo, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+evaluation+of+photosensitivity+in+genetically+engineered+neurons+expressing+green+algae+light-gated+channels.">Kinetic evaluation of photosensitivity in genetically engineered neurons expressing green algae light-gated channels.</a> Neurosci Res. 54 (2), 85-94 (2006).</li><li>Luo, L., Callaway, E. M., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+dissection+of+neural+circuits.">Genetic dissection of neural circuits.</a> Neuron. 57 (5), 634-660 (2008).</li></ol>

כל ההליכים היו בהתאם מדריך NIH עבור בחיות מעבדה ואושרו על ידי טיפול בבעלי חיים-MIT השתמשו ועדות biosafety.

בשנים האחרונות, מספר מקודדים גנטית לרגישות אופטי אפשרו נוירונים להיות מופעל השתיק in vivo באופן temporally מדויק, בתגובה פולסים קצרים של אור (למשל, 1,4,5,6,7,8 , 11). מפתח שיטה שבה הנוירונים היה רגיש לאור במוח של יונקים, היא באמצעות וירוסים כגון lentiviruses ו adeno הקשורים וירוסים (AAV), אשר יכול להעביר גנים קידוד עבור opsins אל מוחם של בעלי חיים, החל עכברים וקופים, ב אופנה בטוחים ויציבים (למשל, 2,9,10). וירוסים לאפשר זמן תגובה מהיר יותר מאשר לעשות transgenics, במיוחד עבור אורגניזמים שאינם אורגניזמים מודל גנטי כגון חולדות וקופים, ועל opsins עשוי לאפשר רמת ביטוי גבוהה כי לא ניתן בתרחישים מהונדס. כאן אנו מדגימים מערך מקביל מזרק מסוגל לייצר, תוך לוח זמנים מהיר, &quot;מעגל ברמה transgenics&quot;, המאפשר כולה 3 ממדי מבנים במוח להיות ממוקד virally עם הגן, בשלב ניתוח יחיד. המערך כולל מזרק אחד או יותר משאבות ספיקה שכל כונן סט של מזרקים, שכל אחד מהם הזנות לתוך סיליקה התמזגו-polyimide / נימי באמצעות מחבר בלחץ גבוה, סובלני. נימים הם בגודל, ונוסף אז אל, במקומות הרצויים שצוין על ידי אישית כרסום לוח מיצוב stereotactic, ובכך מאפשר וירוסים או חומרים כימיים אחרים כדי להיות מועברת להגדיר את הרצוי של אזורים במוח. כדי להשתמש במכשיר, המנתח הראשון ממלא את המשנה fluidic לחלוטין עם שמן, backfills הנימים עם הנגיף, מחדיר את המכשיר לתוך המוח, ממלאה ריאגנטים לאט (&lt;0.1 μL / min). טכנולוגיה זו תאפשר מגוון רחב של סוגים חדשים של ניסויים, כגון כיבוי אלפית השנייה, זמנים של המושלמת בצורת מבנים (כגון ההיפוקמפוס) בזמנים מדויקים במהלך התנהגות, איון temporally מדויק של מבנים דו שעשויים לפעול מיותר (כגון האמיגדלה על ימין ועל שמאל), ואת ההפרעות של מספר אזורים במוח בדידים (למשל, נהיגה שני האזורים מחוברים מחוץ שלב ללמוד איך האזור צולבות בתיאום תלוי הפעילות בכל אזור, או מגרה כניסות לאזור תוך השתקת קבוצת משנה של מטרות כדי להבין איזה מספר מטרות הן קריטיות עבור מתווך את ההשפעות של תשומות אלה). עבור מוחות גדולים כמו אלה הפרימטים, שבו יש לנו הפגינו לאחרונה ההפעלה אופטי תאים עצביים סוג מסוים 3, מביך הפעילות בתחום התנהגותית הרלוונטיים עשוי לדרוש תיוג ויראלי של מבנים גדולים ומורכבים. נציין כי במקביל מערכי מזרק ניתן להשתמש כדי להזריק כמעט כל מטען - סמים, neuromodulators, נוירוטרנסמיטורים, או אפילו תאים - ב 3-D דפוסים מורכבים במוח, באופן מדויק ובזמן. לבסוף, מבחינה translational, יתכן מהירה, המטופל אישית ריפוי גנטי או מסירה מכשירים התרופה עשויה להיות מהירה אישית מעוצבת ו מפוברק כדי להתאים הגיאומטריות מוח בודדים, תמיכה לטיפולים חדשים עבור מגוון רחב של פתולוגיות, באופן פוטנציאלי באמצעות מולקולות בקרה אופטית. מערכים מזרק נועדו להיות מדויק, הן מרחבית volumetrically. ב-X ו-Y הכיוונים, זה נעשה על ידי קידוח חורים מאוד למקם במדויק באמצעות זול מיני הטחנה, עם חורים גדולים מספיק כדי להתאים את מרססים, כך מרססים מוחזקים במקביל זה לזה, וגם מדויק מיקום. בכיוון-Z, מרססים הם גזומים באמצעות מנגנון stereotaxic, מה שמאפשר רמת דיוק שווה ערך לזה של הניתוח stereotaxic עצמו. הדיוק נפח העולה מן הדיוק של המשאבה המילטון, כמו גם כמעט אפס מת נפח מחברים, עיבוד כרומטוגרפיה בלחץ גבוה הנוזל (HPLC) שדה. מרססים עשויים צינורות סיליקה התמזגו נימי, שהוא חזק ונוקשה מספיק כי הוא שומר על צורה מדויקת המרווח תחת לחץ, ללא עובי קיר גדול של חלופות כגון cannulas פלדה. שינויים קטנים יכולים בקלות להיות עשוי להתאים את מערך מקביל מזרק מגוון של ניסויים. לדוגמה, אם נפח קטן יותר של וירוסים או ריווח עדין נדרש, צינור נימי קטן יכול להיות מועסק, יחד עם המקדח המתאים קטן יותר. מכשירים עתידיים עשויים לנצל את ערוצי microfluidic משאבות, כדי להגדיל את מספר מרססים במקביל, כדי למזער את גודל (אולי המאפשר מכשירים כאלה להיות מותקן על ראשיהם של בעלי החיים נעים באופן חופשי).

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Dremel Tool</td>
<td>Tool</td>
<td>Dremel</td>
<td>3956-02</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Laser Cutter</td>
<td>Tool</td>
<td>Universal Laser Systems</td>
<td>VLS2.30</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hot glue gun</td>
<td>Tool</td>
<td>Stanley Bostitch</td>
<td>GR20</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Injection/withdrawal syringe pump (Hamilton pump)</td>
<td>Tool</td>
<td>Harvard Apparatus</td>
<td>702001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>10 &mu;l Hamilton syringes</td>
<td>Tool</td>
<td>Hamilton Company</td>
<td>701N</td>
<td>Need one per injection site</td>
</tr>
<tr>
<td>Mouse stereotax</td>
<td>Tool</td>
<td>Stoelting</td>
<td>51725D</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Modela mini-mill</td>
<td>Tool</td>
<td>Roland</td>
<td>MDX-15</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>0.011" diameter drill bit for mini mill</td>
<td>Tool</td>
<td>Mcmaster-Carr</td>
<td>8915A12</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1/32" diameter drill bit For mini-mill</td>
<td>Tool</td>
<td>McMaster-Carr</td>
<td>8848A35</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>High speed dental drill</td>
<td>Tool</td>
<td>Lynx</td>
<td>333</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dental drill accessories</td>
<td>Tool</td>
<td>Pearson</td>
<td>F 35-08-25 F 35-07-10 P 86-02-38</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td></td>
<td></td>
<td></td>
<td></td>
<td></td>
</tr>
<tr>
<td>1.5mm outer diameter (OD) stainless steel cannula</td>
<td>Material</td>
<td>Small-Parts</td>
<td>HTX-15R</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1-72 binding slotted machine screw</td>
<td>Material</td>
<td>Small-Parts</td>
<td>MX-0172B</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1-72 hex nut</td>
<td>Material</td>
<td>Small-Parts</td>
<td>HNX-0172</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PCB proto-board, 1/32" thick</td>
<td>Material</td>
<td>Digi-Key</td>
<td>PC57-T-ND</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Acrylic Sheet, 1/8" thick</td>
<td>Material</td>
<td>Mcmaster-Carr</td>
<td>8560K239</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>HPLC connectors</td>
<td>Material</td>
<td>Upchurch Scientific</td>
<td>F-252, P-627, P-200, P-235, F-240 (some of these can be bought in 10-packs; simply add an &#x2018;x&#x2019; to the end of the part number)</td>
<td>Need one per injection per site, except F-252, P-627, and P-235, which can be reused</td>
</tr>
<tr>
<td>Fused silica capillary tubing, OD: 245 &mu;m, ID: 100 &mu;m</td>
<td>Material</td>
<td>Polymicro Technologies</td>
<td>2000022-10M</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>5-minute general purpose epoxy</td>
<td>Material</td>
<td>Permatex</td>
<td>84101</td>
<td>5-minute general purpose epoxy</td>
</tr>
<tr>
<td>Polyethylene tubing .066 x .095 inch</td>
<td>Material</td>
<td>VWR</td>
<td>63018-827</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

scalable fluidic injector arrays for viral targeting of intact 3-d brain circuits

ההבנה שלנו של מעגלים עצביים - איך הם לתווך חישובים תחושה המשרתים מחשבה, רגש ופעולה, וכיצד הם פגומים ב הפרעות נוירולוגיות ופסיכיאטריות - יהיה הקל מאוד עבור במהירות המיקוד גנים 3 מורכבים על ידי טכנולוגיה - מעגלים עצביים ממדי, המאפשר יצירה מהירה של &quot;מעגל ברמה transgenics&quot;. לאחרונה פיתחנו שיטות שבו וירוסים קידוד רגישים לאור חלבונים יכול לרגש סוגי תאים מסוימים כדי הפעלת אלפית השנייה, זמנים ואת ההשתקה במוח שלם. כאן אנו מציגים את תכנון וביצוע של מערך מזרק מסוגל לספק וירוסים (או נוזלים אחרים) לעשרות נקודות מוגדר בתוך מבנה 3 מימדי של המוח (<strong&gt; איור. 1A, 1B</strong&gt;). המערך כולל מזרק אחד או יותר משאבות ספיקה שכל כונן סט של מזרקים, שכל אחד מהם הזנות לתוך סיליקה התמזגו-polyimide / נימי באמצעות מחבר בלחץ גבוה, סובלני. נימים הם בגודל, ונוסף אז אל, במקומות הרצויים שצוין על ידי אישית כרסום לוח מיצוב stereotactic, ובכך מאפשר וירוסים או חומרים כימיים אחרים כדי להיות מועברת להגדיר את הרצוי של אזורים במוח. כדי להשתמש במכשיר, המנתח הראשון ממלא את המשנה fluidic לחלוטין עם שמן, backfills הנימים עם הנגיף, מחדיר את המכשיר לתוך המוח, ממלאה ריאגנטים לאט (&lt;0.1 מיקרוליטר / min). אופי מקבילים של המערך ההזרקה מקלה תיוג מהיר, מדויק ויציב של מעגלים עצביים כולה עם מטענים ויראלי כגון לרגישות אופטי כדי לאפשר לאור הפעלה השתקה של מעגלים חשמליים במוח מוגדר. יחד עם טכנולוגיות אחרות, כגון מערכי סיבים אופטיים להעברת אור קובע הרצוי של אזורים במוח, אנו מקווים ליצור ארגז כלים המאפשר חיטוט שיטתי של פונקציות עצביות סיבתי במוח שלם. טכנולוגיה זו לא רק לפתוח את הגישות שיטתי כזה מעגל ממוקד המוח אצל יונקים, ולהקל על תיוג של אזורים במוח אצל בעלי חיים גדולים כמו פרימטים לא אנושיים, אך עשוי גם לפתוח נתיב translational קליניים תא ספציפי prosthetics שליטה אופטית דיוק, אשר עשוי לאפשר טיפול משופר של הפרעות מוח סורר. לבסוף, מכשירים כגון המתואר כאן עשוי להקל דווקא בעיתוי משלוח fluidic של מטענים אחרים, כגון לתאי גזע וסוכני תרופתי, ל 3 ממדי מבנים, בצורה בקלות להתאמה אישית למשתמש.

Watch this Scientific Journal Video about Scalable Fluidic Injector Arrays for Viral Targeting of Intact 3-D Brain Circuits at JoVE.com

Scalable Fluidic Injector Arrays for Viral Targeting of Intact 3-D Brain Circuits

בקרה וניתוח של מעגלים עצביים<em&gt; In vivo</em&gt; יהיה בהנחיית טכנולוגיה עבור משלוח של וירוסים ריאגנטים אחרים 3 ממדי הרצוי סטים של אזורים במוח. אנו מדגימים אישית fluidic מזרק מערך ייצור, ואספקה ​​של virally בקידוד לרגישות אופטי, המאפשר מניפולציה אופטית של מעגלים חשמליים במוח ומורכב.

Scalable Fluidic Injector מערכים עבור ויראלי הכוונת של 3-D מעגלים פגוע המוח

Our understanding of neural circuits--how they mediate the computations that subserve sensation, thought, emotion, and action, and how they are corrupted ...

scalable-fluidic-injector-arrays-for-viral-targeting-intact-3-d-brain

Research

JoVE Journal

Neuroscience

14.2K Views.  Massachusetts Institute of Technology. בקרה וניתוח של מעגלים עצביים In vivo יהיה בהנחיית טכנולוגיה עבור משלוח של וירוסים ריאגנטים אחרים 3 ממדי הרצוי סטים של אזורים במוח. אנו מדגימים אישית fluidic מזרק מערך ייצור, ואספקה ​​של virally בקידוד לרגישות אופטי, המאפשר מניפולציה אופטית של מעגלים חשמליים במוח ...

Video: Scalable Fluidic Injector Arrays for Viral Targeting of Intact 3-D Brain Circuits

Targeting of Deep Brain Structures with Microinjections for Delivery of Drugs, Viral Vectors, or Cell Transplants

Microinjections into the brain parenchyma are important procedures to deliver drugs, viral vectors or cell transplants.  The brain lesion that an injecting needle produces during its trajectory is a major concern especially in the mouse brain for not only the brain is small but also sometimes multiple injections are needed.  We show here a method to produce glass capillary needles with a 50-&mu;m lumen which significantly reduces the brain damage and allows a precise targeting into the rodent brain. This method allows a delivery of small volumes (from 20 to 100 nl), reduces bleeding risks, and minimizes passive diffusion of drugs into the brain parenchyma. By using different size of capillary glass tubes, or changing the needle lumen, several types of substances and cells can be injected. Microinjections with a glass capillary tube represent a significant improvement in injection techniques and deep brain targeting with minimal collateral damage in small rodents.

In this article, we show a method to make glass capillary needles with a 50-&mu;m lumen. This technique significantly reduces the brain damage, minimizes passive diffusion of drugs and allows a precise targeting into the rodent brain.

מיקוד של מבנים מוחיים עמוקים עם Microinjections עבור משלוח של תרופות, וקטורים ויראליים, או השתלת תאים

Microinjections into the brain parenchyma are important procedures to deliver drugs, viral vectors or cell transplants.  The brain lesion that an ...

Intact Histological Characterization of Brain-implanted Microdevices and Surrounding Tissue

Research into the design and utilization of brain-implanted microdevices, such as microelectrode arrays, aims to produce clinically relevant devices that interface chronically with surrounding brain tissue. Tissue surrounding these implants is thought to react to the presence of the devices over time, which includes the formation of an insulating "glial scar" around the devices. However, histological analysis of these tissue changes is typically performed after explanting the device, in a process that can disrupt the morphology of the tissue of interest.
Here we demonstrate a protocol in which cortical-implanted devices are collected intact in surrounding rodent brain tissue. We describe how, once perfused with fixative, brains are removed and sliced in such a way as to avoid explanting devices. We outline fluorescent antibody labeling and optical clearing methods useful for producing an informative, yet thick tissue section. Finally, we demonstrate the mounting and imaging of these tissue sections in order to investigate the biological interface around brain-implanted devices.

Here we present a histological method for capturing, labeling, optically clearing, and imaging the intact brain tissue interface around chronically implanted microdevices in rodent brain tissue. Results from the techniques comprising this method are useful for understanding the impact of various penetrating brain-implants on their surrounding tissue.

אפיון היסטולוגית שלם של Microdevices מוח מושתלים-ורקמה סובבת

Research  into the design and utilization of brain-implanted microdevices, such as  microelectrode arrays, aims to produce clinically relevant devices ...

Electrophysiological Recording in the Brain of Intact Adult Zebrafish

Previously, electrophysiological studies in adult zebrafish have been limited to slice preparations or to eye cup preparations and electrorentinogram recordings. This paper describes how an adult zebrafish can be immobilized, intubated, and used for in vivo electrophysiological experiments, allowing recording of neural activity. Immobilization of the adult requires a mechanism to deliver dissolved oxygen to the gills in lieu of buccal and opercular movement. With our technique, animals are immobilized and perfused with habitat water to fulfill this requirement. A craniotomy is performed under tricaine methanesulfonate (MS-222; tricaine) anesthesia to provide access to the brain. The primary electrode is then positioned within the craniotomy window to record extracellular brain activity. Through the use of a multitube perfusion system, a variety of pharmacological compounds can be administered to the adult fish and any alterations in the neural activity can be observed. The methodology not only allows for observations to be made regarding changes in neurological activity, but it also allows for comparisons to be made between larval and adult zebrafish. This gives researchers the ability to identify the alterations in neurological activity due to the introduction of various compounds at different life stages.

This paper describes how an adult zebrafish can be immobilized, intubated, and used for in vivo electrophysiological experiments to allow recordings and manipulation of neural activity in an intact animal.

הקלטת אלקטרו במוח של דג הזברה למבוגר שלמה

Previously, electrophysiological studies in adult zebrafish have been limited to slice preparations or to eye cup preparations and electrorentinogram ...

3-D Imaging and Analysis of Neurons Infected In Vivo with Toxoplasma gondii

Toxoplasma gondii is an obligate, intracellular parasite with a broad host range, including humans and rodents. In both humans and rodents, Toxoplasma establishes a lifelong persistent infection in the brain. While this brain infection is asymptomatic in most immunocompetent people, in the developing fetus or immunocompromised individuals such as acquired immune deficiency syndrome (AIDS) patients, this predilection for and persistence in the brain can lead to devastating neurologic disease. Thus, it is clear that the brain-Toxoplasma interaction is critical to the symptomatic disease produced by Toxoplasma, yet we have little understanding of the cellular or molecular interaction between cells of the central nervous system (CNS) and the parasite. In the mouse model of CNS toxoplasmosis it has been known for over 30 years that neurons are the cells in which the parasite persists, but little information is available about which part of the neuron is generally infected (soma, dendrite, axon) and if this cellular relationship changes between strains. In part, this lack is secondary to the difficulty of imaging and visualizing whole infected neurons from an animal. Such images would typically require serial sectioning and stitching of tissue imaged by electron microscopy or confocal microscopy after immunostaining. By combining several techniques, the method described here enables the use of thick sections (160 &#181;m) to identify and image whole cells that contain cysts, allowing three-dimensional visualization and analysis of individual, chronically infected neurons without the need for immunostaining, electron microscopy, or serial sectioning and stitching. Using this technique, we can begin to understand the cellular relationship between the parasite and the infected neuron.

3-D Imaging and Analysis of Neurons Infected In Vivo with Toxoplasma gondii

Using this protocol, we were able to image 160 &#181;m thick brain sections from mice infected with the parasite Toxoplasma gondii, which enables visualization and analysis of the spatial relationship between the encysting parasite and the infected neuron.

הדמיה 3-D וניתוח של נוירונים נגועים<em&gt; In vivo</em&gt; עם<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Toxoplasma gondii is an obligate, intracellular parasite with a broad host range, including humans and rodents. In both humans and rodents, Toxoplasma ...

Modification of a Colliculo-thalamocortical Mouse Brain Slice, Incorporating 3-D printing of Chamber Components and Multi-scale Optical Imaging

The ability of the brain to process sensory information relies on both ascending and descending sets of projections. Until recently, the only way to study these two systems and how they interact has been with the use of in vivo preparations. Major advances have been made with acute brain slices containing the thalamocortical and cortico-thalamic pathways in the somatosensory, visual, and auditory systems. With key refinements to our recent modification of the auditory thalamocortical slice1, we are able to more reliably capture the projections between most of the major auditory midbrain and forebrain structures: the inferior colliculus (IC), medial geniculate body (MGB), thalamic reticular nucleus (TRN), and the auditory cortex (AC). With portions of all these connections retained, we are able to answer detailed questions that complement the questions that can be answered with in vivo preparations. The use of flavoprotein autofluorescence imaging enables us to rapidly assess connectivity in any given slice and guide the ensuing experiment. Using this slice in conjunction with recording and imaging techniques, we are now better equipped to understand how information processing occurs at each point in the auditory forebrain as information ascends to the cortex, and the impact of descending cortical modulation. 3-D printing to build slice chamber components permits double-sided perfusion and broad access to networks within the slice and maintains the widespread connections key to fully utilizing this preparation.

Using multiple angles to cut the mouse pup brain, we improve upon a previously-described acute brain slice which captures the connections between most of the major auditory midbrain and forebrain structures.

שינוי של Colliculo-thalamocortical עכבר המוח פרוסה, שילוב הדפסת 3-D של לשכת רכיבים ודימות אופטי רב בקנה מידה

The ability of the brain to process sensory information relies on both ascending and descending sets of projections. Until recently, the only way to study ...

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Optogenetic approaches are now widely used to study the function of neural populations and circuits by combining targeted expression of light-activated proteins and subsequent manipulation of neural activity by light. Channelrhodopsins (ChRs) are light-gated cation-channels and when fused to a fluorescent protein their expression allows for visualization and concurrent activation of specific cell types and their axonal projections in defined areas of the brain. Via stereotactic injection of viral vectors, ChR fusion proteins can be constitutively or conditionally expressed in specific cells of a defined brain region, and their axonal projections can subsequently be studied anatomically and functionally via ex vivo optogenetic activation in brain slices. This is of particular importance when aiming to understand synaptic properties of connections that could not be addressed with conventional electrical stimulation approaches, or in identifying novel afferent and efferent connectivity that was previously poorly understood. Here, a few examples illustrate how this technique can be applied to investigate these questions to elucidating fear-related circuits in the amygdala. The amygdala is a key region for acquisition and expression of fear, and storage of fear and emotional memories. Many lines of evidence suggest that the medial prefrontal cortex (mPFC) participates in different aspects of fear acquisition and extinction, but its precise connectivity with the amygdala is just starting to be understood. First, it is shown how ex vivo optogenetic activation can be used to study aspects of synaptic communication between mPFC afferents and target cells in the basolateral amygdala (BLA). Furthermore, it is illustrated how this ex vivo optogenetic approach can be applied to assess novel connectivity patterns using a group of GABAergic neurons in the amygdala, the paracapsular intercalated cell cluster (mpITC), as an example.

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Optogenetic approaches are widely used to manipulate neural activity and assess the consequences for brain function. Here, a technique is outlined that&#160;upon in vivo expression of the optical activator Channelrhodopsin, allows for ex vivo analysis of synaptic properties of specific long range and local neural connections in fear-related circuits.

Ex Vivo optogenetic Dissection של מעגלי פחד פרוסות המוח

Optogenetic approaches are now widely used to study the function of neural populations and circuits by combining targeted expression of light-activated ...

Developing HiPSC Derived Serum Free Embryoid Bodies for the Interrogation of 3-D Stem Cell Cultures Using Physiologically Relevant Assays

Although a number of in vitro disease models have been developed using hiPSCs, one limitation is that these two-dimensional (2-D) systems may not represent the underlying cytoarchitectural and functional complexity of the affected individuals carrying suspected disease variants. Conventional 2-D models remain incomplete representations of in vivo-like structures and do not adequately capture the complexity of the brain. Thus, there is an emerging need for more 3-D hiPSC-based models that can better recapitulate the cellular interactions and functions seen in an in vivo system.
Here we report a protocol to develop a 3-D system from undifferentiated hiPSCs based on the serum free embryoid body (SFEB). This 3-D model mirrors aspects of a developing ventralized neocortex and allows for studies into functions integral to living neural cells and intact tissue such as migration, connectivity, communication, and maturation. Specifically, we demonstrate that the SFEBs using our protocol can be interrogated using physiologically relevant and high-content cell based assays such as calcium imaging, and multi-electrode array (MEA) recordings without cryosectioning. In the case of MEA recordings, we demonstrate that SFEBs increase both spike activity and network-level bursting activity during long-term culturing. This SFEB protocol provides a robust and scalable system for the study of developing network formation in a 3-D model that captures aspects of early cortical development.

Here we report a protocol to develop a three-dimensional (3-D) system from human induced-pluripotent stem cells (hiPSCs) called the serum free embryoid body (SFEB). This 3-D model can be used like an organotypic slice culture to model human cortical development and for the physiological interrogation of developing neural circuits.

פיתוח HiPSC נגזר סרום חינם גופים embryoid לחקירת 3-D תא תרבויות גזע באמצעות מבחנים רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית

Although a number of in vitro disease models have been developed using hiPSCs, one limitation is that these two-dimensional (2-D) systems may not ...

Combining Optogenetics with Artificial microRNAs to Characterize the Effects of Gene Knockdown on Presynaptic Function within Intact Neuronal Circuits

The purpose of this protocol is to characterize the effect of gene knockdown on presynaptic function within intact neuronal circuits. We describe a workflow on how to combine artificial microRNA (miR)-mediated RNA interference with optogenetics to achieve selective stimulation of manipulated presynaptic boutons in acute brain slices. The experimental approach involves the use of a single viral construct and a single neuron-specific promoter to drive the expression of both an optogenetic probe and artificial miR(s) against presynaptic gene(s). When stereotactically injected in the brain region of interest, the expressed construct makes it possible to stimulate with light exclusively the neurons with reduced expression of the gene(s) under investigation. This strategy does not require the development and maintenance of genetically modified mouse lines and can in principle be applied to other organisms and to any neuronal gene of choice. We have recently applied it to investigate how the knockdown of alternative splice isoforms of presynaptic P/Q-type voltage-gated calcium channels (VGCCs) regulates short-term synaptic plasticity at CA3 to CA1 excitatory synapses in acute hippocampal slices. A similar approach could also be used to manipulate and probe the neuronal circuitry in vivo.

This protocol provides a workflow on how to combine artificial microRNA-mediated RNA interference with optogenetics to stimulate specifically presynaptic boutons with reduced expression of selective gene(s) within intact neuronal circuits.

שילוב Optogenetics עם מיקרו Rna מלאכותי כדי לאפיין תופעות נוקאאוט גנטי על פונקציה Presynaptic בתוך מעגלים עצביים ללא פגע

The purpose of this protocol is to characterize the effect of gene knockdown on presynaptic function within intact neuronal circuits. We describe a ...

Generation of 3-D Collagen-based Hydrogels to Analyze Axonal Growth and Behavior During Nervous System Development

This protocol uses natural type I collagen to generate three-dimensional (3-D) hydrogel for monitoring and analyzing the axonal growth. The protocol is centered on culturing small pieces of embryonic or early postnatal rodent brains inside a 3-D hydrogel formed by the rat tail tendon-derived type I collagen with specific porosity. Tissue pieces are cultured inside the hydrogel and confronted to specific brain fragments or genetically-modified cell aggregates to produce and secrete molecules suitable for creating a gradient inside the porous matrix. The steps of this protocol are simple and reproducible but include critical steps to be considered carefully during its development. Moreover, the behavior of growing axons can be monitored and analyzed directly using a phase-contrast microscope or mono/multiphoton fluorescence microscope after fixation by immunocytochemical methods.

Here, we provide a method for analyzing the behavior of growing axons in 3D matrices, mimicking their natural development.

דור של 3-D הידרוג'לים קולגן מבוססי לנתח צמיחה Axonal התנהגות במהלך פיתוח מערכת העצבים

This protocol uses natural type I collagen to generate three-dimensional (3-D) hydrogel for monitoring and analyzing the axonal growth. The protocol is ...

Multi-Fiber Photometry to Record Neural Activity in Freely-Moving Animals

Recording the activity of a group of neurons in a freely-moving animal is a challenging undertaking. Moreover, as the brain is dissected into smaller and smaller functional subgroups, it becomes paramount to record from projections and/or genetically-defined subpopulations of neurons. Fiber photometry is an accessible and powerful approach that can overcome these challenges. By combining optical and genetic methodologies, neural activity can be measured in deep brain structures by expressing genetically-encoded calcium indicators, which translate neural activity into an optical signal that can be easily measured. The current protocol details the components of a multi-fiber photometry system, how to access deep brain structures to deliver and collect light, a method to account for motion artifacts, and how to process and analyze fluorescent signals. The protocol details experimental considerations when performing single and dual color imaging, from either single or multiple implanted optic fibers.

This protocol details how to implement and perform multi-fiber photometry recordings, how to correct for calcium-independent artifacts, and important considerations for dual-color photometry imaging.

מולטי-סיב פונסה להקליט פעילות עצבית בבעלי חיים הנעים באופן חופשי

Recording the activity of a group of neurons in a freely-moving animal is a challenging undertaking. Moreover, as the brain is dissected into smaller and ...