עבודה זו התאפשרה על ידי מענק מ-NIH (EY012977), פרס קריירה במדעי ביו מן Wellcome בורוז קרן, קרן וייטהול, קרן סלואן (AKM).

1. וירוס טיפול ואחסון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגנה נכונה טכניקות הטיפול יש לבחור בהתבסס על רמת בטיחות ביולוגית של הנגיף לשמש. שיטות אלה ניתן למצוא biosafety במהדורה מיקרוביולוגי ביו 5 th מעבדות, באתר האינטרנט של ה-CDC ( <a href="http://www.cdc.gov/od/OHS/biosfty/bmbl5/bmbl5toc.htm">http://www.cdc.gov/od/OHS/biosfty/bmbl5/bmbl5toc.htm</a> ). השימוש וקטורים AAV מאושר biosafety רמה 1 (BSL-1). לצורך הניסוי שמוצג כאן, חלוק מעבדה וכפפות יהיה שחוק כאשר טיפול וירוס, בהתאם לנהלים לטיפול BSL-1 סוכנים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לשמר את הפעילות של הנגיף עדיף לחלק אותו aliquots קטן כדי למנוע הקפאת חוזרות הפשרה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן הקבינט biosafety (BSC) Class II עבור aliquoting וירוס ידי ניקוי BSC של חפצים מיותרים לחיטוי את פני השטח עם EtOH 70%. מניחים כוס המכילה פתרון אקונומיקה 10% למכסה המנוע לאיסוף AAV-מזוהמים בפסולת. להציב גם BSC הם צינורות 0.5mL סטרילית מיכל של קרח יבש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפשירי מניות ויראלי על הקרח מחוץ BSC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> וורטקס הנגיף ופתח את הצינור הפנימי BSC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה נפח aliquot הרצוי (למשל 5 μL) לתוך צינור 0.5mL, לסגור את הצינור ולשים אותו בקרח יבש יקפיא את הנגיף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר כל וירוס כבר aliquoted, להיפטר הצינור וירוס טיפים פיפטה במיכל פסולת המכילה אקונומיקה 10%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את מיכל הפסולת מכסה המנוע להוסיף אקונומיקה 10% נוספים, ואז לשפוך אקונומיקה בכיור. השליכו פסולת פלסטיק במיכל Biohazard כפי שהורה הקצין מכון שלך biosafety. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקה כל ציוד או משטחים כי בא במגע עם הנגיף עם אקונומיקה 10%. בטל כפפות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חנות aliquots למקפיא -80 מעלות צלזיוס. </li></ol> 2. כירורגיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכסים את אזור הניתוח עם נייר סופג מעבדה הספסל. כלים כירורגיים צריך להיות מעוקר ניתוח נעשה בתנאים aseptic בהתאם biosafety המוסד שלך והנחיות לשימוש בבעלי חיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר אזור הסמוך לאזור כירורגית אשר יוקדש טעינת micropipettes בווירוס, ולכסות עם נייר סופג מעבדה הספסל. הצב aliquot של הנגיף במיכל קרח באזור זה, ולאפשר הנגיף להפשיר על הקרח כמו הניתוח מתבצע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת מיכל פסולת של 10% אקונומיקה באזור וירוס ייעודי לטיפול עבור סילוק טיפים פיפטה, וכו &#39;כי בא במגע עם הנגיף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משוך micropipette Wiretrol זכוכית בקוטר טיפ של כ 20 מיקרון. המקום טיפה קטנה של שמן מינרלי בקצה הקהה של micropipette והכנס את הבוכנה חוט מסופק עם micropipettes. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אבטח את micropipette בתוך מלחציים של הזרוע micropump. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזרק עכבר תת עורי עם עצירות במינון של 0.5 מ&quot;ג / ק&quot;ג. להרדים את העכבר עם Avertin באמצעות הזרקה intraperitoneal עם מינון של 200 מ&quot;ג / ק&quot;ג ולהסיר את השיער מהחלק העליון של הראש עם מספריים כירורגיות, מוודא להשאיר שוליים גדולים מספיק כדי למנוע שיער מלהיכנס את החתך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף שמיכה חימום לבסיס stereotax לשמור על טמפרטורת גוף של 37 מעלות צלזיוס במשך הניתוח לאבטח את העכבר על stereotax. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרחוץ את הראש עם שלושה עלובי לסירוגין של אתנול בבטאדין לחטא את האזור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים ירידה של משחה עין Tobradex על כל עין כדי לשמור על עיניים לחות במהלך הניתוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עושים חתך לאורך קו האמצע של הראש למשוך את העור לאחור כדי לחשוף את הגולגולת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר בזהירות את fascia מהגולגולת באמצעות קנס שקצהו מלקחיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אתר את האזור להיות מוזרק באמצעות קואורדינטות stereotaxic ולסמן את הגולגולת עם עט כירורגית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מקדח דנטלי עם אזור 1.4mm בר, דקה של הגולגולת כ 2 מ&quot;מ בקוטר עד סדקים בגולגולת, חלוקת שטח דליל למקטעים שונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך הליך זה, לשמור על הגולגולת לח עם יישומים של תמיסת מלח סטרילית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע craniotomy בעדינות על ידי הסרת חלקי הגולגולת באמצעות דליל במיוחד קנס מלקחיים מוטה. </li></ol> 3. הזרקת הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם KimWipe להציב מעל המכסה, פתח את הצינור של וירוס פיפטה 1.5uL (להזרקה 1uL) של הנגיף על חתיכה קטנה של parafilm. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הניחו את קצה micropipette לתוך המניה ויראלי ידני למשוך את הבוכנה. אם הקושי הוא מנוסה ציור מניות נגיפי אל תוך micropipette, הטיפ יכול להיות מוגדל מעט להיות פירסינג KimWipe עם micropipette לשבור חלק קטן של זכוכית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרוע micropump תחתון על הבוכנה עד כמות קטנה של וירוס הוא הפיג מקצה micropipette. הסר ירידה קטנה עם המוליך כותנה טיפ המוליך להשליך על wastמיכל דואר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למרוח טיפת שמן מינרלי אל קצה micropipette כדי למנוע סתימת כמו micropipette מונמך לתוך המוח. </li></ol> 4. הזרקת וירוס <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש ב X ו-Y stereotaxic קואורדינטות, עמדת micropipette על השטח להיות מוזרק. בניסוי זה, stereotaxic את הקואורדינטות משמש לאיתור קליפת המוח החזותית העיקריים הם האחורי 2.7mm ל 2.5mm גבחת ו לרוחב קו האמצע. לאט לאט להוריד את micropipette (בקצב משוער של 1mm/1minute) לתפקיד Z הנכון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזן את הפרמטרים הרצויים הזרקה לתוך תיבת Micro4 בקר micropump SYS וליזום את הזריקה. לצורך ניסוי זה, 1 microliter מעל 10 דקות ישמש בשיעור של זריקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר הוא סיים את הזריקה, לעזוב את פיפטה לנוח 1-2 דקות כדי למנוע בזרימת של הנגיף במהלך ההסרה. לאחר תקופה זו, לאט לאט להסיר את micropipette מהמוח (שיעור זהה לזה לעיל). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תפר את הקרקפת ואת החותם אותו עם דבק רקמות. הזרק את החיה מתחת לעור עם עצירות במינון של 0.1 מ&quot;ג / ק&quot;ג כל 8-12 שעות במשך 72 השעות הבאות, או כל עוד בעל החיים הוא מציג סימנים של כאב. אפשר לשחזר את החיה מתחת לפנס חום עד שהוא ambulating ומוכן להחזיר את הכלוב שלה. ניסויי הדמיה יכול להיות יזם לאחר זמן דגירה הרצוי (ימים עד שבועות לאחר ההזרקה נגיפי). </li></ol> 5. ניקוי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוטפים את micropipette עם אקונומיקה 10% וזורקים אותו במיכל החדים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השלך את מיכל הפסולת באותו אופן כמו בסעיף 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל ספסל נייר מעבדה לפח Biohazard ולנגב את כל המשטחים ומכשירים שייתכן לבוא במגע עם הנגיף עם אקונומיקה 10%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הווירוס יכול להיות בשימוש קפוא שוב, תוך התחשבות כי חזר להקפיא / להפשיר מחזורים לגרום השפלה של הנגיף. </li></ol> 6. נציג תוצאות <img src="/files/ftp_upload/2140/2140fig1.jpg" alt="איור 1" /> באיור 1. Transduced נוירון לאחר הזרקה של פעמיים תקועים adeno הקשורים וירוס סרוטיפ 1 (dsAAV S1) נושאת חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) תחת שליטה של promotor CMV. גוף התא, כמו גם הדנדריטים הפרוקסימלית ומ דיסטלי גלויים לעין בסעיפים קבוע צילמו באמצעות מיקרוסקופ epifluorescent. בר סולם = 100 מיקרומטר. <img src="/files/ftp_upload/2140/2140fig2.jpg" alt="איור 2" /> איור 2. תיוג אופייני זריקה וירוס תוך גולגולתי בקליפת הראייה העיקרית באמצעות S1 dsAAV מראה את מידת התפשטות הנגיף, כמו גם נוירונים שכותרתו, גליה ותהליכים. בר סולם = 250 מיקרומטר. <img src="/files/ftp_upload/2140/2140fig3.jpg" alt="איור 3" /> איור 3. תיוג של תאים בהיפוקמפוס באמצעות S1 dsAAV. בר סולם = 250 מיקרומטר. נתונים אלה מעובדים Lowery et al. 2009 1

<ol>
	<li>Kaplitt, M. G., Leone, P., Samulski, R. J., Xiao, X., Pfaff, D. W., O'Malley, K. L., During, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+gene+expression+and+phenotypic+correction+using+adeno-associated+virus+vectors+in+the+mammalian+brain.">Long-term gene expression and phenotypic correction using adeno-associated virus vectors in the mammalian brain.</a> Nat Genet. 8, 148-154 (1994).</li><li>Harding, T. C., Dickinson, P. J., Roberts, B. N., Yendluri, S., Gonzalez-Edick, M., Lecouteur, R. A., Jooss, K. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+gene+transfer+efficiency+in+the+murine+striatum+and+an+orthotopic+glioblastoma+tumor+model,+using+AAV-7-+and+AAV-8-pseudotyped+vectors.">Enhanced gene transfer efficiency in the murine striatum and an orthotopic glioblastoma tumor model, using AAV-7- and AAV-8-pseudotyped vectors.</a> Hum Gene Ther. 17, 807-820 (2006).</li><li>Lo, W. D., Qu, G., Sferra, T. J., Clark, R., Chen, R., Johnson, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus-mediated+gene+transfer+to+the+brain:+duration+and+modulation+of+expression.">Adeno-associated virus-mediated gene transfer to the brain: duration and modulation of expression.</a> Hum Gene Ther. 10, 201-213 (1999).</li><li>Lowery, R. L., Zhang, Y., Kelly, E. A., Lamantia, C. E., Harvey, B. K., Majewska, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+long-term+labeling+of+cells+in+the+developing+and+adult+rodent+visual+cortex+using+double-stranded+adeno-associated+viral+vectors.">Rapid long-term labeling of cells in the developing and adult rodent visual cortex using double-stranded adeno-associated viral vectors.</a> Dev Neurobiol. 69, 674-688 (2009).</li></ol>

פרוטוקולים בעלי חיים ניסיוניים אושרו על ידי האוניברסיטה של ​​אוניברסיטת רוצ&#39;סטר ועדת משאבים בעלי חיים (UCAR) בהתאם למדיניות PHS על טיפול השתמש ההומאנית של חיות מעבדה.

Virally בתיווך משלוח גן בעל פוטנציאל גדול למחקר של תהליכים נוירולוגיות וטיפול בהפרעות במוח 1,2,3. צדדיות הגדול של טכניקה זו יכולה גם להיות מנוצלת כדי fluorescently תווית תאים הדמיה הן במבחנה in vivo 4. כאן אנו מדגימים נוהל מפורט עבור התמרה של נוירונים גליה בעכבר קלי?...

<table><tbody><tr><td>St&amp;#8211;lting Mouse and Neonatal Rat Adaptor</td><td>Stoelting Co.</td><td>51625</td><td>Regular stereotax for securing animals for surgery may be substituted</td></tr><tr><td>Extra Fine Bonn Scissors, 8.5cm, straight tip, cutting edge 13mm</td><td>Fine Science Tools</td><td>14084-08</td><td></td></tr><tr><td>Eye Dressing Forceps, 10cm, tip width 0.5mm, curved</td><td>Fine Science Tools</td><td>11152-10</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5/45 Forceps- Dumoxel Standard Tip, 11cm, angled</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-35</td><td>Extra-fine tipped forceps for performing craniotomy</td></tr><tr><td>Standard Pattern Forceps, straight, 2.5mmx1.35mmtip, 12cm</td><td>Fine Science Tools</td><td>11000-12</td><td></td></tr><tr><td>Microtorque Control Box and Tech2000 handpiece</td><td>Ram Products, Inc.</td><td>TECH2000ON/OFF</td><td>Dental drill</td></tr><tr><td>Micro Drill Stainless Steel Burrs 1.4mm tip diameter</td><td>Fine Science Tools</td><td>19008-14</td><td></td></tr><tr><td>Wiretrol micropipettes, to deliver 1-5 Ul</td><td>VWR international</td><td>5-000-1001 or 53480-287</td><td></td></tr><tr><td>Mineral oil</td><td>VWR international</td><td>29447-338</td><td></td></tr><tr><td>Manual Micromanipulator and Tilting Base (right-handed)</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>M3301-M3-R</td><td>Used for determining stereotaxic co-ordinates</td></tr><tr><td>UltraMicroPump (UMP3) (one) with SYS-Micro4 Controller</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>UMP3-1</td><td></td></tr><tr><td>Sutures</td><td>VWR international</td><td>95056-952</td><td></td></tr><tr><td>P-97 Flaming/Brown Micropipette Puller</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Tobradex</td><td></td><td></td><td>Available from your institution&amp;rsquo;s veterinary services</td></tr></tbody></table>

intracranial injection of adeno-associated viral vectors

הזרקה תוך גולגולתי של וקטורים ויראליים שהונדסו חלבון פלואורסצנטי היא טכניקה תיוג תכליתי עבור להדמיה של תת מסוימים של תאים באזורים שונים במוח הן in vivo ו בסעיפים המוח. בניגוד הזרקה של צבעי ניאון, תיוג ויראלי מציעה המיקוד של סוגי תאים בודדים הוא זול יותר זמן רב יותר מאשר הקמת קווי עכבר מהונדס. בטכניקה זו, adeno הקשורים וקטור ויראלי (AAV) מוזרק intracranially באמצעות קואורדינטות stereotaxic, micropipette ואת משאבת אוטומטיות למסירה מדויקת של AAV לאזור הרצוי עם נזק מינימלי לרקמות שמסביב. פרמטרים של הזרקה ניתן להתאים את הניסויים הפרט על ידי התאמת גיל החיה בקצב הזרקה, מיקום הזריקה, עוצמת הזריקה, של הזרקה, AAV סרוטיפ ואת האמרגן נהיגה ביטוי גנים. בהתאם לתנאי הנבחר, virally-Induced ביטוי transgene יכול לאפשר ויזואליזציה של קבוצות של תאים, תאים בודדים או תהליכים תאיים בסדר, עד לרמה של הקוצים הדנדריטים. הניסוי שמוצג כאן מציג זריקה של AAV פעמיים תקועים לבטא חלבון פלואורסצנטי ירוק עבור תיוג של גליה נוירונים בקליפת המוח החזותית העיקרי בעכבר.

Watch this Scientific Journal Video about Intracranial Injection of Adeno-associated Viral Vectors at JoVE.com

Intracranial Injection of Adeno-associated Viral Vectors

כאן אנו מציגים את הזריקה תוך גולגולתי של וקטורים AAV תיוג הניאון של גליה נוירונים בקליפת המוח הראייתית.

הזרקה תוך גולגולתי של Adeno הקשורים וקטורים ויראליים

Intracranial injection of viral vectors engineered to express a fluorescent protein is a versatile labeling technique for visualization of specific ...

intracranial-injection-of-adeno-associated-viral-vectors

Research

JoVE Journal

Neuroscience

47.2K Views.  University of Rochester. כאן אנו מציגים את הזריקה תוך גולגולתי של וקטורים AAV תיוג הניאון של גליה נוירונים בקליפת המוח הראייתית.

Video: Intracranial Injection of Adeno-associated Viral Vectors

Creating Anatomically Accurate and Reproducible Intracranial Xenografts of Human Brain Tumors

Orthotopic tumor models are currently the best way to study the characteristics of a tumor type, with and without intervention, in the context of a live animal &#8211;&#160;particularly in sites with unique physiological and architectural qualities such as the brain. In vitro and ectopic models cannot account for features such as vasculature, blood brain barrier, metabolism, drug delivery and toxicity, and a host of other relevant factors. Orthotopic models have their limitations too, but with proper technique tumor cells of interest can be accurately engrafted into tissue that most closely mimics conditions in the human brain. By employing methods that deliver precisely measured volumes to accurately defined locations at a consistent rate and pressure, mouse models of human brain tumors with predictable growth rates can be reproducibly created and are suitable for reliable analysis of various interventions. The protocol described here focuses on the technical details of designing and preparing for an intracranial injection, performing the surgery, and ensuring successful and reproducible tumor growth and provides starting points for a variety of conditions that can be customized for a range of different brain tumor models.

The brain is a unique site with qualities that are not well represented by in vitro or ectopic analyses. Orthotopic mouse models with reproducible location and growth characteristics can be reliably created with intracranial injections using a stereotaxic fixation instrument and a low pressure syringe pump.

יצירה אנטומית מדויק והשחזור תוך גולגולת xenografts של גידולים במוח אדם

Orthotopic tumor models are currently the best way to study the characteristics of a tumor type, with and without intervention, in the context of a live ...

Medicine

Intracerebroventricular Viral Injection of the Neonatal Mouse Brain for Persistent and Widespread Neuronal Transduction

With the pace of scientific advancement accelerating rapidly, new methods are needed for experimental neuroscience to quickly and easily manipulate gene expression in the mouse brain. Here we describe a technique first introduced by Passini and Wolfe for direct intracranial delivery of virally-encoded transgenes into the neonatal mouse brain. In its most basic form, the procedure requires only an ice bucket and a microliter syringe. However, the protocol can also be adapted for use with stereotaxic frames to improve consistency for researchers new to the technique. The method relies on the ability of adeno-associated virus (AAV) to move freely from the cerebral ventricles into the brain parenchyma while the ependymal lining is still immature during the first 12-24 hr after birth. Intraventricular injection of AAV at this age results in widespread transduction of neurons throughout the brain. Expression begins within days of injection and persists for the lifetime of the animal. Viral titer can be adjusted to control the density of transduced neurons, while co-expression of a fluorescent protein provides a vital label of transduced cells. With the rising availability of viral core facilities to provide both off-the-shelf, pre-packaged reagents and custom viral preparation, this approach offers a timely method for manipulating gene expression in the mouse brain that is fast, easy, and far less expensive than traditional germline engineering.

Here we demonstrate a technique for widespread neuronal transduction by intraventricular injection of adeno-associated virus into the neonatal mouse brain. This method provides a rapid and easy way to attain lifelong expression of virally-delivered transgenes.

הזרקת נגיפי Intracerebroventricular של ילודים עכבר המוח לתמרה עצבית מתמשכת ונרחבת

With the pace of scientific advancement accelerating rapidly, new methods are needed for experimental neuroscience to quickly and easily manipulate gene ...

Methods and Tips for Intravenous Administration of Adeno-associated Virus to Rats and Evaluation of Central Nervous System Transduction

Adeno-associated virus (AAV) vectors are a key reagent in the neurosciences for clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR), optogenetics, cre-lox targeting, etc. The purpose of this manuscript is to aid the investigator attempting expansive central nervous system (CNS) gene transfer in the rat via tail vein injection of AAV. Wide-scale expression is relevant for conditions with widespread pathology, and a rat model is significant due to its greater size and physiologic similarities to humans compared to mice. In this example application, a wide-scale neuronal transduction is used to mimic a neurodegenerative disease that affects the entire spinal cord, amyotrophic lateral sclerosis (ALS). The efficient wide-scale CNS transduction can also be used to deliver therapeutic protein factors in pre-clinical studies. After a post-injection expression interval of several weeks, the effects of the transduction are evaluated. For a green fluorescent protein (GFP) control vector, the amount of GFP in the cerebellum is estimated quickly and reliably by a basic imaging program. For motor disease phenotypes that are induced by the ALS related protein transactive response DNA-binding protein of 43 kDa (TDP-43), the deficits are scored by escape reflex and rotarod. Beyond disease modeling and gene therapy, there are diverse potential applications for the wide-scale gene targeting described here. The expanded use of this method will aid in expediting hypothesis testing in the neurosciences and neurogenetics.

Methods for a wide-scale central nervous system gene delivery in the rat are covered. In this example, the purpose is to mimic a disease that affects the entire spinal cord. The widespread transduction can be used to deliver a therapeutic protein to the CNS from a one-time, peripheral administration.

שיטות וטיפים על עירוי לוריד של Adeno-הקשורים וירוס חולדות והערכה של מערכת העצבים המרכזית התמרה חושית

Adeno-associated virus (AAV) vectors are a key reagent in the neurosciences for clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR), ...

Adeno-associated Virus-mediated Transgene Expression in Genetically Defined Neurons of the Spinal Cord

Selective manipulation of spinal neuronal subpopulations has mainly been achieved by two different methods: 1) Intersectional genetics, whereby double or triple transgenic mice are generated in order to achieve selective expression of a reporter or effector gene (e.g., from the Rosa26 locus) in the desired spinal population. 2) Intraspinal injection of Cre-dependent recombinant adeno-associated virus (rAAV); here Cre-dependent AAV vectors coding for the reporter or effector gene of choice are injected into the spinal cord of mice expressing Cre recombinase in the desired neuronal subpopulation. This protocol describes how to generate Cre-dependent rAAV vectors and how to transduce neurons in the dorsal horn of the lumbar spinal cord segments L3-L5 with rAAVs. As the lumbar spinal segments L3-L5 are innervated by those peripheral sensory neurons that transmit sensory information from the hindlimbs, spontaneous behavior and responses to sensory tests applied to the hindlimb ipsilateral to the injection side can be analyzed in order to interrogate the function of the manipulated neurons in sensory processing. We provide examples of how this technique can be used to analyze genetically defined subsets of spinal neurons. The main advantages of virus-mediated transgene expression in Cre transgenic mice compared to classical reporter mouse-induced transgene expression are the following: 1) Different Cre-dependent rAAVs encoding various reporter or effector proteins can be injected into a single Cre transgenic line, thus overcoming the need to create several multiple transgenic mouse lines. 2) Intraspinal injection limits manipulation of Cre-expressing cells to the injection site and to the time after injection. The main disadvantages are: 1) Reporter gene expression from rAAVs is more variable. 2) Surgery is required to transduce the spinal neurons of interest. Which of the two methods is more appropriate depends on the neuron population and research question to be addressed.

Intraspinal injection of recombinase dependent recombinant adeno-associated virus (rAAV) can be used to manipulate any genetically labelled cell type in the spinal cord. Here we describe how to transduce neurons in the dorsal horn of the lumbar spinal cord. This technique enables functional interrogation of the manipulated neuron subtype.

הביטוי Adeno-הקשורים Transgene וירוס בתיווך בנוירונים מבחינה גנטית מוגדרים של חוט השדרה

Selective manipulation of spinal neuronal subpopulations has mainly been achieved by two different methods: 1) Intersectional genetics, whereby double or ...

Direct Intrathecal Injection of Recombinant Adeno-associated Viruses in Adult Mice

Intrathecal (IT) injection of adeno-associated virus (AAV) has drawn considerable interest in CNS gene therapy by virtue of its safety, noninvasiveness, and excellent transduction efficacy in the CNS.&#160;Previous studies have demonstrated the therapeutic potency of AAV-delivered gene therapy in neurodegenerative disorders by IT administration. However, high rates of unpredictable failure due to the technical limitation of IT administration in small animals have been reported. Here, we established a scoring system to indicate the success extent of lumbar puncture in small animals by adding 1% lidocaine hydrochloride into the injection solution. We further show that the extent of transient weakness following injection can predict the transduction efficiency of AAV. Thus, this IT injection method can be used to optimize therapeutic trials in mouse models of CNS diseases that afflict wide regions of the CNS.

Here we present a direct intrathecal injection technique using 1% lidocaine hydrochloride in a viral solution to ensure efficient adeno-associated virus delivery to small animals and establish a scoring system to predict transduction efficiency in the central nervous system according to the degree of transient weakness induced by lidocaine.

במחלה ישירה הזרקה של וירוסים Adeno-הקשורים רקומביננטי בעכברים מבוגרים

Intrathecal (IT) injection of adeno-associated virus (AAV) has drawn considerable interest in CNS gene therapy by virtue of its safety, noninvasiveness, ...

Production, Purification, and Quality Control for Adeno-associated Virus-based Vectors

Gene delivery tools based on adeno-associated viruses (AAVs) are a popular choice for the delivery of transgenes to the central nervous system (CNS), including gene therapy applications. AAV vectors are non-replicating, able to infect both dividing and non-dividing cells&#160;and provide long-term transgene expression. Importantly, some serotypes, such as the newly described PHP.B, can cross the blood-brain-barrier (BBB) in animal models, following systemic delivery. AAV vectors can be efficiently produced in the laboratory. However, robust and reproducible protocols are required to obtain AAV vectors with sufficient purity levels and titer values high enough for in vivo applications. This protocol describes an efficient and reproducible strategy for AAV vector production, based on an iodixanol gradient purification strategy. The iodixanol purification method is suitable for obtaining batches of high-titer AAV vectors of high purity, when compared to other purification methods. Furthermore, the protocol is generally faster than other methods currently described. In addition, a quantitative polymerase chain reaction (qPCR)-based strategy is described for a fast and accurate determination of the vector titer, as well as a silver staining method to determine the purity of the vector batch. Finally, representative results of gene delivery to the CNS, following systemic administration of AAV-PHP.B, are presented. Such results should be possible in all labs using the protocols described in this article.

Here, we describe an efficient and reproducible strategy to produce, titer, and quality-control batches of adeno-associated virus vectors. It allows the user to obtain a vector preparation with high-titer&#160;(&#8805;1 x 1013 vector genomes/mL) and a high purity, ready for in vitro or in vivo use.

הפקה, טיהור, ובקרת איכות על Adeno-הקשורים וקטורים מבוסס-וירוס

Gene delivery tools based on adeno-associated viruses (AAVs) are a popular choice for the delivery of transgenes to the central nervous system (CNS), ...

Convection Enhanced Delivery of Optogenetic Adeno-associated Viral Vector to the Cortex of Rhesus Macaque Under Guidance of Online MRI Images

In non-human primate (NHP) optogenetics, infecting large cortical areas with viral vectors is often a difficult and time-consuming task. Here, we demonstrate the use of magnetic resonance (MR)-guided convection enhanced delivery (CED) of optogenetic viral vectors into primary somatosensory (S1) and motor (M1) cortices of macaques to obtain efficient, widespread cortical expression of light-sensitive ion channels. Adeno-associated viral (AAV) vectors encoding the red-shifted opsin C1V1 fused to yellow fluorescent protein (EYFP) were injected into the cortex of rhesus macaques under MR-guided CED. Three months post-infusion, epifluorescent imaging confirmed large regions of optogenetic expression (&#62;130 mm2) in M1 and S1 in two macaques. Furthermore, we were able to record reliable light-evoked electrophysiology responses from the expressing areas using micro-electrocorticographic arrays. Later histological analysis and immunostaining against the reporter revealed widespread and dense optogenetic expression in M1 and S1 corresponding to the distribution indicated by epifluorescent imaging. This technique enables us to obtain expression across large areas of the cortex within a shorter period of time with minimal damage compared to the traditional techniques and can be an optimal approach for optogenetic viral delivery in large animals such as NHPs. This approach demonstrates great potential for network-level manipulation of neural circuits with cell-type specificity in animal models evolutionarily close to humans.&#160;

Here, we demonstrate magnetic resonance (MR)-guided convection enhanced delivery (CED) of viral vectors into the cortex as an efficient and simplified approach for achieving optogenetic expression across large cortical areas in the macaque brain.

הסעה משופר משלוח אלקטרואופטיקה Adeno-וקטור ויראלי הקשורים לקליפת מקוק רזוס תחת הדרכה של תמונות MRI מקוונות

In non-human primate (NHP) optogenetics, infecting large cortical areas with viral vectors is often a difficult and time-consuming task. Here, we ...

Subconjunctival Administration of Adeno-associated Virus Vectors in Small Animal Models

Ocular diseases include a wide range of inherited genetic and acquired disorders that are appealing targets for local drug delivery due to their relative ease of accessibility via multiple administration routes. Subconjunctival (SCJ) injections offer advantages over other intraocular administration routes as they are simple, safe, and usually performed in an outpatient setting. SCJ injections in small animals usually require the assistance of an operating microscope due to the size of the eye. Previous work has demonstrated that SCJ injection of specific adeno-associated virus (AAV) serotypes is a valid gene delivery strategy for targeted transduction of the ocular surface, eye muscle, cornea, and optic nerve, providing a potential approach for the treatment of many ocular diseases.
Herein, a detailed protocol is presented for SCJ injections in a mouse model using an injection system consisting of a programmable infusion/withdrawal syringe pump (which allows for consistent and precise injection speed and pressure) and a gastight removable syringe coupled with microinjection needles. The injection system is also adaptable for other intraocular administration routes such as intrastromal, intracameral, intravitreal, and subretinal injections in small animals. Although the delivery of adeno-associated viral vectors for ocular gene therapy studies is described, the protocol herein can also be adapted for a variety of ophthalmic solutions in small animal models. The key practical steps in the administration route, setup for the injection platform, preparation of the injection, and tips from direct experience will be discussed in detail. In addition, common validation techniques for AAV delivery confirmation to the desired tissues will also be briefly discussed.

In this manuscript, subconjunctival injection is demonstrated as a valid vector delivery method for ocular tissues in mice using an injection system consisting of an infusion/withdrawal syringe pump and a gastight removable syringe coupled with microinjection needles. This injection system is also adaptable for other intraocular administration routes.

מתן תת-לחמית של וקטורים של וירוסים הקשורים לאדנו במודלים של בעלי חיים קטנים

Ocular diseases include a wide range of inherited genetic and acquired disorders that are appealing targets for local drug delivery due to their relative ...

מתן ניקור מותני של AAV9 בחולדות צעירות לטיפול גנטי במערכת העצבים המרכזית

Intrathecal Vector Delivery in Juvenile Rats via Lumbar Cistern Injection

Gene therapy is a powerful technology to deliver new genes to a patient for the treatment of disease, be it to introduce a functional gene, inactivate a toxic gene, or provide a gene whose product can modulate the biology of the disease. The delivery method for the therapeutic vector can take many forms, ranging from intravenous infusion for systemic delivery to direct injection into the target tissue. For neurodegenerative disorders, it is often desirable to skew transduction towards the brain and/or spinal cord. The least invasive approach to target the entire central nervous system involves injection into the cerebrospinal fluid (CSF), allowing the therapeutic to reach a large fraction of the central nervous system. The safest approach to deliver a vector into the CSF is the lumbar intrathecal injection, where a needle is introduced into the lumbar cistern of the spinal cord. This technique, also known as a lumbar puncture, has been widely used in neonatal and adult rodents and in large animal models. While the technique is similar across species and developmental stages, subtle differences in size, structure, and elasticity of tissues surrounding the intrathecal space require accommodations in the approach. This article describes a method for performing lumbar puncture in juvenile rats to deliver an adeno-associated serotype 9 vector. Here, 25-35 &#181;L of vector were injected into the lumbar cistern, and a green fluorescent protein (GFP) reporter was used to evaluate the transduction profile resulting from each injection. The benefits and challenges of this approach are discussed.

מחבר זרקור: הערכת יעילות הטיפול הגנטי התוך-תאי בחולדות צעירות

A surgical procedure is described to perform injections into the lumbar cistern of the juvenile rat. This approach has been used for the intrathecal delivery of gene therapy vectors, but it is anticipated that this approach can be used for a variety of therapeutics, including cells and drugs.

משלוח וקטורי תוך-תאי בחולדות צעירות באמצעות הזרקת בור מים מותני

Gene therapy is a powerful technology to deliver new genes to a patient for the treatment of disease, be it to introduce a functional gene, inactivate a ...

הזרקה תוך גולגולתי של Adeno הקשורים וקטורים ויראליים

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

יצירה אנטומית מדויק והשחזור תוך גולגולת xenografts של גידולים במוח אדם

הזרקת נגיפי Intracerebroventricular של ילודים עכבר המוח לתמרה עצבית מתמשכת ונרחבת

שיטות וטיפים על עירוי לוריד של Adeno-הקשורים וירוס חולדות והערכה של מערכת העצבים המרכזית התמרה חושית

הביטוי Adeno-הקשורים Transgene וירוס בתיווך בנוירונים מבחינה גנטית מוגדרים של חוט השדרה

במחלה ישירה הזרקה של וירוסים Adeno-הקשורים רקומביננטי בעכברים מבוגרים

הפקה, טיהור, ובקרת איכות על Adeno-הקשורים וקטורים מבוסס-וירוס

הסעה משופר משלוח אלקטרואופטיקה Adeno-וקטור ויראלי הקשורים לקליפת מקוק רזוס תחת הדרכה של תמונות MRI מקוונות

מתן תת-לחמית של וקטורים של וירוסים הקשורים לאדנו במודלים של בעלי חיים קטנים

משלוח וקטורי תוך-תאי בחולדות צעירות באמצעות הזרקת בור מים מותני

משלוח וקטורי תוך-תאי בחולדות צעירות באמצעות הזרקת בור מים מותני