עבודה זו התאפשרה על ידי מענק מ-NIH (EY012977), פרס קריירה במדעי ביו מן Wellcome בורוז קרן, קרן וייטהול, קרן סלואן (AKM).

1. וירוס טיפול ואחסון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגנה נכונה טכניקות הטיפול יש לבחור בהתבסס על רמת בטיחות ביולוגית של הנגיף לשמש. שיטות אלה ניתן למצוא biosafety במהדורה מיקרוביולוגי ביו 5 th מעבדות, באתר האינטרנט של ה-CDC ( <a href="http://www.cdc.gov/od/OHS/biosfty/bmbl5/bmbl5toc.htm">http://www.cdc.gov/od/OHS/biosfty/bmbl5/bmbl5toc.htm</a> ). השימוש וקטורים AAV מאושר biosafety רמה 1 (BSL-1). לצורך הניסוי שמוצג כאן, חלוק מעבדה וכפפות יהיה שחוק כאשר טיפול וירוס, בהתאם לנהלים לטיפול BSL-1 סוכנים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לשמר את הפעילות של הנגיף עדיף לחלק אותו aliquots קטן כדי למנוע הקפאת חוזרות הפשרה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן הקבינט biosafety (BSC) Class II עבור aliquoting וירוס ידי ניקוי BSC של חפצים מיותרים לחיטוי את פני השטח עם EtOH 70%. מניחים כוס המכילה פתרון אקונומיקה 10% למכסה המנוע לאיסוף AAV-מזוהמים בפסולת. להציב גם BSC הם צינורות 0.5mL סטרילית מיכל של קרח יבש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפשירי מניות ויראלי על הקרח מחוץ BSC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> וורטקס הנגיף ופתח את הצינור הפנימי BSC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה נפח aliquot הרצוי (למשל 5 μL) לתוך צינור 0.5mL, לסגור את הצינור ולשים אותו בקרח יבש יקפיא את הנגיף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר כל וירוס כבר aliquoted, להיפטר הצינור וירוס טיפים פיפטה במיכל פסולת המכילה אקונומיקה 10%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את מיכל הפסולת מכסה המנוע להוסיף אקונומיקה 10% נוספים, ואז לשפוך אקונומיקה בכיור. השליכו פסולת פלסטיק במיכל Biohazard כפי שהורה הקצין מכון שלך biosafety. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקה כל ציוד או משטחים כי בא במגע עם הנגיף עם אקונומיקה 10%. בטל כפפות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חנות aliquots למקפיא -80 מעלות צלזיוס. </li></ol> 2. כירורגיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכסים את אזור הניתוח עם נייר סופג מעבדה הספסל. כלים כירורגיים צריך להיות מעוקר ניתוח נעשה בתנאים aseptic בהתאם biosafety המוסד שלך והנחיות לשימוש בבעלי חיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר אזור הסמוך לאזור כירורגית אשר יוקדש טעינת micropipettes בווירוס, ולכסות עם נייר סופג מעבדה הספסל. הצב aliquot של הנגיף במיכל קרח באזור זה, ולאפשר הנגיף להפשיר על הקרח כמו הניתוח מתבצע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת מיכל פסולת של 10% אקונומיקה באזור וירוס ייעודי לטיפול עבור סילוק טיפים פיפטה, וכו &#39;כי בא במגע עם הנגיף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משוך micropipette Wiretrol זכוכית בקוטר טיפ של כ 20 מיקרון. המקום טיפה קטנה של שמן מינרלי בקצה הקהה של micropipette והכנס את הבוכנה חוט מסופק עם micropipettes. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אבטח את micropipette בתוך מלחציים של הזרוע micropump. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזרק עכבר תת עורי עם עצירות במינון של 0.5 מ&quot;ג / ק&quot;ג. להרדים את העכבר עם Avertin באמצעות הזרקה intraperitoneal עם מינון של 200 מ&quot;ג / ק&quot;ג ולהסיר את השיער מהחלק העליון של הראש עם מספריים כירורגיות, מוודא להשאיר שוליים גדולים מספיק כדי למנוע שיער מלהיכנס את החתך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף שמיכה חימום לבסיס stereotax לשמור על טמפרטורת גוף של 37 מעלות צלזיוס במשך הניתוח לאבטח את העכבר על stereotax. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרחוץ את הראש עם שלושה עלובי לסירוגין של אתנול בבטאדין לחטא את האזור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים ירידה של משחה עין Tobradex על כל עין כדי לשמור על עיניים לחות במהלך הניתוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עושים חתך לאורך קו האמצע של הראש למשוך את העור לאחור כדי לחשוף את הגולגולת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר בזהירות את fascia מהגולגולת באמצעות קנס שקצהו מלקחיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אתר את האזור להיות מוזרק באמצעות קואורדינטות stereotaxic ולסמן את הגולגולת עם עט כירורגית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מקדח דנטלי עם אזור 1.4mm בר, דקה של הגולגולת כ 2 מ&quot;מ בקוטר עד סדקים בגולגולת, חלוקת שטח דליל למקטעים שונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך הליך זה, לשמור על הגולגולת לח עם יישומים של תמיסת מלח סטרילית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע craniotomy בעדינות על ידי הסרת חלקי הגולגולת באמצעות דליל במיוחד קנס מלקחיים מוטה. </li></ol> 3. הזרקת הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם KimWipe להציב מעל המכסה, פתח את הצינור של וירוס פיפטה 1.5uL (להזרקה 1uL) של הנגיף על חתיכה קטנה של parafilm. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הניחו את קצה micropipette לתוך המניה ויראלי ידני למשוך את הבוכנה. אם הקושי הוא מנוסה ציור מניות נגיפי אל תוך micropipette, הטיפ יכול להיות מוגדל מעט להיות פירסינג KimWipe עם micropipette לשבור חלק קטן של זכוכית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרוע micropump תחתון על הבוכנה עד כמות קטנה של וירוס הוא הפיג מקצה micropipette. הסר ירידה קטנה עם המוליך כותנה טיפ המוליך להשליך על wastמיכל דואר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למרוח טיפת שמן מינרלי אל קצה micropipette כדי למנוע סתימת כמו micropipette מונמך לתוך המוח. </li></ol> 4. הזרקת וירוס <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש ב X ו-Y stereotaxic קואורדינטות, עמדת micropipette על השטח להיות מוזרק. בניסוי זה, stereotaxic את הקואורדינטות משמש לאיתור קליפת המוח החזותית העיקריים הם האחורי 2.7mm ל 2.5mm גבחת ו לרוחב קו האמצע. לאט לאט להוריד את micropipette (בקצב משוער של 1mm/1minute) לתפקיד Z הנכון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזן את הפרמטרים הרצויים הזרקה לתוך תיבת Micro4 בקר micropump SYS וליזום את הזריקה. לצורך ניסוי זה, 1 microliter מעל 10 דקות ישמש בשיעור של זריקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר הוא סיים את הזריקה, לעזוב את פיפטה לנוח 1-2 דקות כדי למנוע בזרימת של הנגיף במהלך ההסרה. לאחר תקופה זו, לאט לאט להסיר את micropipette מהמוח (שיעור זהה לזה לעיל). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תפר את הקרקפת ואת החותם אותו עם דבק רקמות. הזרק את החיה מתחת לעור עם עצירות במינון של 0.1 מ&quot;ג / ק&quot;ג כל 8-12 שעות במשך 72 השעות הבאות, או כל עוד בעל החיים הוא מציג סימנים של כאב. אפשר לשחזר את החיה מתחת לפנס חום עד שהוא ambulating ומוכן להחזיר את הכלוב שלה. ניסויי הדמיה יכול להיות יזם לאחר זמן דגירה הרצוי (ימים עד שבועות לאחר ההזרקה נגיפי). </li></ol> 5. ניקוי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוטפים את micropipette עם אקונומיקה 10% וזורקים אותו במיכל החדים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השלך את מיכל הפסולת באותו אופן כמו בסעיף 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל ספסל נייר מעבדה לפח Biohazard ולנגב את כל המשטחים ומכשירים שייתכן לבוא במגע עם הנגיף עם אקונומיקה 10%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הווירוס יכול להיות בשימוש קפוא שוב, תוך התחשבות כי חזר להקפיא / להפשיר מחזורים לגרום השפלה של הנגיף. </li></ol> 6. נציג תוצאות <img src="/files/ftp_upload/2140/2140fig1.jpg" alt="איור 1" /> באיור 1. Transduced נוירון לאחר הזרקה של פעמיים תקועים adeno הקשורים וירוס סרוטיפ 1 (dsAAV S1) נושאת חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) תחת שליטה של promotor CMV. גוף התא, כמו גם הדנדריטים הפרוקסימלית ומ דיסטלי גלויים לעין בסעיפים קבוע צילמו באמצעות מיקרוסקופ epifluorescent. בר סולם = 100 מיקרומטר. <img src="/files/ftp_upload/2140/2140fig2.jpg" alt="איור 2" /> איור 2. תיוג אופייני זריקה וירוס תוך גולגולתי בקליפת הראייה העיקרית באמצעות S1 dsAAV מראה את מידת התפשטות הנגיף, כמו גם נוירונים שכותרתו, גליה ותהליכים. בר סולם = 250 מיקרומטר. <img src="/files/ftp_upload/2140/2140fig3.jpg" alt="איור 3" /> איור 3. תיוג של תאים בהיפוקמפוס באמצעות S1 dsAAV. בר סולם = 250 מיקרומטר. נתונים אלה מעובדים Lowery et al. 2009 1

<ol>
	<li>Kaplitt, M. G., Leone, P., Samulski, R. J., Xiao, X., Pfaff, D. W., O'Malley, K. L., During, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+gene+expression+and+phenotypic+correction+using+adeno-associated+virus+vectors+in+the+mammalian+brain.">Long-term gene expression and phenotypic correction using adeno-associated virus vectors in the mammalian brain.</a> Nat Genet. 8, 148-154 (1994).</li><li>Harding, T. C., Dickinson, P. J., Roberts, B. N., Yendluri, S., Gonzalez-Edick, M., Lecouteur, R. A., Jooss, K. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+gene+transfer+efficiency+in+the+murine+striatum+and+an+orthotopic+glioblastoma+tumor+model,+using+AAV-7-+and+AAV-8-pseudotyped+vectors.">Enhanced gene transfer efficiency in the murine striatum and an orthotopic glioblastoma tumor model, using AAV-7- and AAV-8-pseudotyped vectors.</a> Hum Gene Ther. 17, 807-820 (2006).</li><li>Lo, W. D., Qu, G., Sferra, T. J., Clark, R., Chen, R., Johnson, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus-mediated+gene+transfer+to+the+brain:+duration+and+modulation+of+expression.">Adeno-associated virus-mediated gene transfer to the brain: duration and modulation of expression.</a> Hum Gene Ther. 10, 201-213 (1999).</li><li>Lowery, R. L., Zhang, Y., Kelly, E. A., Lamantia, C. E., Harvey, B. K., Majewska, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+long-term+labeling+of+cells+in+the+developing+and+adult+rodent+visual+cortex+using+double-stranded+adeno-associated+viral+vectors.">Rapid long-term labeling of cells in the developing and adult rodent visual cortex using double-stranded adeno-associated viral vectors.</a> Dev Neurobiol. 69, 674-688 (2009).</li></ol>

פרוטוקולים בעלי חיים ניסיוניים אושרו על ידי האוניברסיטה של ​​אוניברסיטת רוצ&#39;סטר ועדת משאבים בעלי חיים (UCAR) בהתאם למדיניות PHS על טיפול השתמש ההומאנית של חיות מעבדה.

Virally בתיווך משלוח גן בעל פוטנציאל גדול למחקר של תהליכים נוירולוגיות וטיפול בהפרעות במוח 1,2,3. צדדיות הגדול של טכניקה זו יכולה גם להיות מנוצלת כדי fluorescently תווית תאים הדמיה הן במבחנה in vivo 4. כאן אנו מדגימים נוהל מפורט עבור התמרה של נוירונים גליה בעכבר קליפת המוח החזותית באמצעות פעמיים תקועים adeno אסוציאציה וירוס להביע משופרת חלבון פלואורסצנטי ירוק. בעוד טכניקה זו היא יחסית ישר קדימה, יש מספר פרטים טכניים שצריכים להילקח בחשבון. אחד השיקולים החשובים הוא הזרקה-Induced נזק לרקמות - ולכן הוא חיוני כדי להשתמש בזהירות רבה במהלך הניתוח ואת הכניסה / הסרת micropipette. הניתוח נכשל עלול להביא שינוי של מבנים להיות צילמו. בנוסף, לאחר טעינת הוירוס לתוך micropipette, בזהירות רבה יש לנקוט כדי לנקות את כל בועות האוויר בקצה פיפטה ולהבטיח את נפח תקין מוזרק. הפחתת micropipette מעט מעבר ליעד Z-לתאם אז נסיגה אותו במקום הנכון יכולה למנוע מהווירוס גדותיו מתוך הזריקה. בעת בחירת זמן דגירה, המאפשר זמן מספיק לצורך ביטוי גנים נגיפיים צריך להיחשב. זה ישתנה בהתאם הנגיף בשימוש. התגובה החיסונית מוגבל עשוי להיות שהושרו על ידי הזריקה. מניסיוננו, דלקת זו מוגבלת בדרך כלל כדי לעקוב אחר המחט יכול להימנע על ידי הדמיה הרחק מן העין את הזריקה (כ 50 μms או יותר). לבסוף, אם חלקים במוח יש רכוב על שקופיות, להשתמש במדיום הרכבה antifade הוא הציע לקיים פלואורסצנטי. הזרקה תוך גולגולתי של וקטורים ויראליים יש יתרונות טכניים על מספר טכניקות תיוג אחרים. באמצעות שימוש קואורדינטות stereotaxic נפח ויסות מוזרק, פלורסנט התווית יכול להיות מקומי בדיוק לאזור של עניין. כמות התמרה ניתן לשנות על ידי התאמת מוזרק בנפח, titer וירוס או את זמן ההישרדות, המאפשר ויזואליזציה של או קבוצות של תאים או תאים בודדים. בנוסף, השימוש של וירוסים שונים (למשל, lentivirus הרפס וירוס, adenovirus) יכול גם לווסת את העיתוי והכמות של חלבון פלואורסצנטי לידי ביטוי, כמו גם את סוגי התאים הממוקדים. בסך הכל, טכניקה זו יכולה לספק עבור תיוג מאוד תכליתי של גורמים שונים במוח הדמיה.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Stoelting Mouse and Neonatal Rat Adaptor</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Stoelting</td>
<td>51625</td>
<td>Regular stereotax for securing animals for surgery may be substituted</td>
</tr>
<tr>
<td>Extra Fine Bonn Scissors, 8.5cm, straight tip, cutting edge 13mm</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>14084-08</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Eye Dressing Forceps, 10cm, tip width 0.5mm, curved</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>11152-10</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dumont #5/45 Forceps- Dumoxel Standard Tip, 11cm, angled</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>11251-35</td>
<td>Extra-fine tipped forceps for performing craniotomy</td>
</tr>
<tr>
<td>Standard Pattern Forceps, straight, 2.5mmx1.35mmtip, 12cm</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>11000-12</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microtorque Control Box and Tech2000 handpiece</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ram Products, Inc.</td>
<td>TECH2000ON/OFF</td>
<td>Dental drill</td>
</tr>
<tr>
<td>Micro Drill Stainless Steel Burrs 1.4mm tip diameter</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>19008-14</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Wiretrol micropipettes, to deliver 1-5 Ul</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR International/ Drummond</td>
<td>5-000-1001 or 53480-287</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Mineral oil</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR International</td>
<td>29447-338</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Manual Micromanipulator and Tilting Base (right-handed)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>World Precision Instruments, Inc.</td>
<td>M3301-M3-R</td>
<td>Used for determining stereotaxic co-ordinates</td>
</tr>
<tr>
<td>UltraMicroPump (UMP3) (one) with SYS-Micro4 Controller</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>World Precision Instruments, Inc.</td>
<td>UMP3-1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sutures</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR International</td>
<td>95056-952</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>P-97 Flaming/Brown Micropipette Puller</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sutter Instruments</td>
<td>P-97</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tobradex</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Available from your institution&#x2019;s veterinary services</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

intracranial injection of adeno-associated viral vectors

הזרקה תוך גולגולתי של וקטורים ויראליים שהונדסו חלבון פלואורסצנטי היא טכניקה תיוג תכליתי עבור להדמיה של תת מסוימים של תאים באזורים שונים במוח הן in vivo ו בסעיפים המוח. בניגוד הזרקה של צבעי ניאון, תיוג ויראלי מציעה המיקוד של סוגי תאים בודדים הוא זול יותר זמן רב יותר מאשר הקמת קווי עכבר מהונדס. בטכניקה זו, adeno הקשורים וקטור ויראלי (AAV) מוזרק intracranially באמצעות קואורדינטות stereotaxic, micropipette ואת משאבת אוטומטיות למסירה מדויקת של AAV לאזור הרצוי עם נזק מינימלי לרקמות שמסביב. פרמטרים של הזרקה ניתן להתאים את הניסויים הפרט על ידי התאמת גיל החיה בקצב הזרקה, מיקום הזריקה, עוצמת הזריקה, של הזרקה, AAV סרוטיפ ואת האמרגן נהיגה ביטוי גנים. בהתאם לתנאי הנבחר, virally-Induced ביטוי transgene יכול לאפשר ויזואליזציה של קבוצות של תאים, תאים בודדים או תהליכים תאיים בסדר, עד לרמה של הקוצים הדנדריטים. הניסוי שמוצג כאן מציג זריקה של AAV פעמיים תקועים לבטא חלבון פלואורסצנטי ירוק עבור תיוג של גליה נוירונים בקליפת המוח החזותית העיקרי בעכבר.

Watch this Scientific Journal Video about Intracranial Injection of Adeno-associated Viral Vectors at JoVE.com

Intracranial Injection of Adeno-associated Viral Vectors

כאן אנו מציגים את הזריקה תוך גולגולתי של וקטורים AAV תיוג הניאון של גליה נוירונים בקליפת המוח הראייתית.

הזרקה תוך גולגולתי של Adeno הקשורים וקטורים ויראליים

Intracranial injection of viral vectors engineered to express a fluorescent protein is a versatile labeling technique for visualization of specific ...

intracranial-injection-of-adeno-associated-viral-vectors

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Neuroscience

47.1K Views.  University of Rochester. כאן אנו מציגים את הזריקה תוך גולגולתי של וקטורים AAV תיוג הניאון של גליה נוירונים בקליפת המוח הראייתית.

Video: Intracranial Injection of Adeno-associated Viral Vectors

Targeting of Deep Brain Structures with Microinjections for Delivery of Drugs, Viral Vectors, or Cell Transplants

Microinjections into the brain parenchyma are important procedures to deliver drugs, viral vectors or cell transplants.  The brain lesion that an injecting needle produces during its trajectory is a major concern especially in the mouse brain for not only the brain is small but also sometimes multiple injections are needed.  We show here a method to produce glass capillary needles with a 50-&mu;m lumen which significantly reduces the brain damage and allows a precise targeting into the rodent brain. This method allows a delivery of small volumes (from 20 to 100 nl), reduces bleeding risks, and minimizes passive diffusion of drugs into the brain parenchyma. By using different size of capillary glass tubes, or changing the needle lumen, several types of substances and cells can be injected. Microinjections with a glass capillary tube represent a significant improvement in injection techniques and deep brain targeting with minimal collateral damage in small rodents.

In this article, we show a method to make glass capillary needles with a 50-&mu;m lumen. This technique significantly reduces the brain damage, minimizes passive diffusion of drugs and allows a precise targeting into the rodent brain.

מיקוד של מבנים מוחיים עמוקים עם Microinjections עבור משלוח של תרופות, וקטורים ויראליים, או השתלת תאים

Microinjections into the brain parenchyma are important procedures to deliver drugs, viral vectors or cell transplants.  The brain lesion that an ...

Limbal Approach-Subretinal Injection of Viral Vectors for Gene Therapy in Mice Retinal Pigment Epithelium

The eye is a small and enclosed organ which makes it an ideal target for gene therapy. Recently various strategies have been applied to gene therapy in retinopathies using non-viral and viral gene delivery to the retina and retinal pigment epithelium (RPE). Subretinal injection is the best approach to deliver viral vectors directly to RPE cells. Before the clinical trial of a gene therapy, it is inevitable to validate the efficacy of the therapy in animal models of various retinopathies. Thus, subretinal injection in mice becomes a fundamental technique for an ocular gene therapy. In this protocol, we provide the easy and replicable technique for subretinal injection of viral vectors to experimental mice. This technique is modified from the intravitreal injection, which is widely used technique in ophthalmology clinics. The representative results of RPE/choroid/scleral complex flat-mount will help to understand the efficacy of this technique and adjust the volume and titer of viral vectors for the extent of gene transduction.

Subretinal injection is a surgical technique for effective gene delivery to retinal pigment epithelium in the mouse eye. Here we describe an easy and replicable method for subretinal injection of viral vectors to retinal pigment epithelium in experimental mice.

הזרקת גישת subretinal Limbal של ויראלי וקטורים לטיפול גנטי בעכברים הרשתית פיגמנט האפיתל

The eye is a small and enclosed organ which makes it an ideal target for gene therapy. Recently various strategies have been applied to gene therapy in ...

Subpial Adeno-associated Virus 9 (AAV9) Vector Delivery in Adult Mice

The successful development of a subpial adeno-associated virus 9 (AAV9) vector delivery technique in adult rats and pigs has been reported on previously. Using subpially-placed polyethylene catheters (PE-10 or PE-5) for AAV9 delivery, potent transgene expression through the spinal parenchyma (white and gray matter) in subpially-injected spinal segments has been demonstrated. Because of the wide range of transgenic mouse models of neurodegenerative diseases, there is a strong desire for the development of a potent central nervous system (CNS)-targeted vector delivery technique in adult mice. Accordingly, the present study describes the development of a spinal subpial vector delivery device and technique to permit safe and effective spinal AAV9 delivery in adult C57BL/6J mice. In spinally immobilized and anesthetized mice, the pia mater (cervical 1 and lumbar 1-2 spinal segmental level) was incised with a sharp 34 G needle using an XYZ manipulator. A second XYZ manipulator was then used to advance a blunt 36G needle into the lumbar and/or cervical subpial space. The AAV9 vector (3-5 &#181;L; 1.2 x 1013 genome copies (gc)) encoding green fluorescent protein (GFP) was then injected subpially. After injections, neurological function (motor and sensory) was assessed periodically, and animals were perfusion-fixed 14 days after AAV9 delivery with 4% paraformaldehyde. Analysis of horizontal or transverse spinal cord sections showed transgene expression throughout the entire spinal cord, in both gray and white matter. In addition, intense retrogradely-mediated GFP expression was seen in the descending motor axons and neurons in the motor cortex, nucleus ruber, and formatio reticularis. No neurological dysfunction was noted in any animals. These data show that the subpial vector delivery technique can successfully be used in adult mice, without causing procedure-related spinal cord injury, and is associated with highly potent transgene expression throughout the spinal neuraxis.

Subpial Adeno-associated Virus 9 AAV9 Vector Delivery in Adult Mice

The goal of the present study was to develop and validate the potency and safety of spinal adeno-associated virus 9 (AAV9)-mediated gene delivery by using a novel subpial gene delivery technique in adult mice.

Subnial Adeno הקשורים וירוסים 9 (AAV9) וקטור משלוח ב עכברים למבוגרים

The successful development of a subpial adeno-associated virus 9 (AAV9) vector delivery technique in adult rats and pigs has been reported on previously. ...

Adeno-associated Virus-mediated Transgene Expression in Genetically Defined Neurons of the Spinal Cord

Selective manipulation of spinal neuronal subpopulations has mainly been achieved by two different methods: 1) Intersectional genetics, whereby double or triple transgenic mice are generated in order to achieve selective expression of a reporter or effector gene (e.g., from the Rosa26 locus) in the desired spinal population. 2) Intraspinal injection of Cre-dependent recombinant adeno-associated virus (rAAV); here Cre-dependent AAV vectors coding for the reporter or effector gene of choice are injected into the spinal cord of mice expressing Cre recombinase in the desired neuronal subpopulation. This protocol describes how to generate Cre-dependent rAAV vectors and how to transduce neurons in the dorsal horn of the lumbar spinal cord segments L3-L5 with rAAVs. As the lumbar spinal segments L3-L5 are innervated by those peripheral sensory neurons that transmit sensory information from the hindlimbs, spontaneous behavior and responses to sensory tests applied to the hindlimb ipsilateral to the injection side can be analyzed in order to interrogate the function of the manipulated neurons in sensory processing. We provide examples of how this technique can be used to analyze genetically defined subsets of spinal neurons. The main advantages of virus-mediated transgene expression in Cre transgenic mice compared to classical reporter mouse-induced transgene expression are the following: 1) Different Cre-dependent rAAVs encoding various reporter or effector proteins can be injected into a single Cre transgenic line, thus overcoming the need to create several multiple transgenic mouse lines. 2) Intraspinal injection limits manipulation of Cre-expressing cells to the injection site and to the time after injection. The main disadvantages are: 1) Reporter gene expression from rAAVs is more variable. 2) Surgery is required to transduce the spinal neurons of interest. Which of the two methods is more appropriate depends on the neuron population and research question to be addressed.

Intraspinal injection of recombinase dependent recombinant adeno-associated virus (rAAV) can be used to manipulate any genetically labelled cell type in the spinal cord. Here we describe how to transduce neurons in the dorsal horn of the lumbar spinal cord. This technique enables functional interrogation of the manipulated neuron subtype.

הביטוי Adeno-הקשורים Transgene וירוס בתיווך בנוירונים מבחינה גנטית מוגדרים של חוט השדרה

Selective manipulation of spinal neuronal subpopulations has mainly been achieved by two different methods: 1) Intersectional genetics, whereby double or ...

Direct Intrathecal Injection of Recombinant Adeno-associated Viruses in Adult Mice

Intrathecal (IT) injection of adeno-associated virus (AAV) has drawn considerable interest in CNS gene therapy by virtue of its safety, noninvasiveness, and excellent transduction efficacy in the CNS.&#160;Previous studies have demonstrated the therapeutic potency of AAV-delivered gene therapy in neurodegenerative disorders by IT administration. However, high rates of unpredictable failure due to the technical limitation of IT administration in small animals have been reported. Here, we established a scoring system to indicate the success extent of lumbar puncture in small animals by adding 1% lidocaine hydrochloride into the injection solution. We further show that the extent of transient weakness following injection can predict the transduction efficiency of AAV. Thus, this IT injection method can be used to optimize therapeutic trials in mouse models of CNS diseases that afflict wide regions of the CNS.

Here we present a direct intrathecal injection technique using 1% lidocaine hydrochloride in a viral solution to ensure efficient adeno-associated virus delivery to small animals and establish a scoring system to predict transduction efficiency in the central nervous system according to the degree of transient weakness induced by lidocaine.

במחלה ישירה הזרקה של וירוסים Adeno-הקשורים רקומביננטי בעכברים מבוגרים

Intrathecal (IT) injection of adeno-associated virus (AAV) has drawn considerable interest in CNS gene therapy by virtue of its safety, noninvasiveness, ...

Production, Purification, and Quality Control for Adeno-associated Virus-based Vectors

Gene delivery tools based on adeno-associated viruses (AAVs) are a popular choice for the delivery of transgenes to the central nervous system (CNS), including gene therapy applications. AAV vectors are non-replicating, able to infect both dividing and non-dividing cells&#160;and provide long-term transgene expression. Importantly, some serotypes, such as the newly described PHP.B, can cross the blood-brain-barrier (BBB) in animal models, following systemic delivery. AAV vectors can be efficiently produced in the laboratory. However, robust and reproducible protocols are required to obtain AAV vectors with sufficient purity levels and titer values high enough for in vivo applications. This protocol describes an efficient and reproducible strategy for AAV vector production, based on an iodixanol gradient purification strategy. The iodixanol purification method is suitable for obtaining batches of high-titer AAV vectors of high purity, when compared to other purification methods. Furthermore, the protocol is generally faster than other methods currently described. In addition, a quantitative polymerase chain reaction (qPCR)-based strategy is described for a fast and accurate determination of the vector titer, as well as a silver staining method to determine the purity of the vector batch. Finally, representative results of gene delivery to the CNS, following systemic administration of AAV-PHP.B, are presented. Such results should be possible in all labs using the protocols described in this article.

Here, we describe an efficient and reproducible strategy to produce, titer, and quality-control batches of adeno-associated virus vectors. It allows the user to obtain a vector preparation with high-titer&#160;(&#8805;1 x 1013 vector genomes/mL) and a high purity, ready for in vitro or in vivo use.

הפקה, טיהור, ובקרת איכות על Adeno-הקשורים וקטורים מבוסס-וירוס

Gene delivery tools based on adeno-associated viruses (AAVs) are a popular choice for the delivery of transgenes to the central nervous system (CNS), ...

Convection Enhanced Delivery of Optogenetic Adeno-associated Viral Vector to the Cortex of Rhesus Macaque Under Guidance of Online MRI Images

In non-human primate (NHP) optogenetics, infecting large cortical areas with viral vectors is often a difficult and time-consuming task. Here, we demonstrate the use of magnetic resonance (MR)-guided convection enhanced delivery (CED) of optogenetic viral vectors into primary somatosensory (S1) and motor (M1) cortices of macaques to obtain efficient, widespread cortical expression of light-sensitive ion channels. Adeno-associated viral (AAV) vectors encoding the red-shifted opsin C1V1 fused to yellow fluorescent protein (EYFP) were injected into the cortex of rhesus macaques under MR-guided CED. Three months post-infusion, epifluorescent imaging confirmed large regions of optogenetic expression (&#62;130 mm2) in M1 and S1 in two macaques. Furthermore, we were able to record reliable light-evoked electrophysiology responses from the expressing areas using micro-electrocorticographic arrays. Later histological analysis and immunostaining against the reporter revealed widespread and dense optogenetic expression in M1 and S1 corresponding to the distribution indicated by epifluorescent imaging. This technique enables us to obtain expression across large areas of the cortex within a shorter period of time with minimal damage compared to the traditional techniques and can be an optimal approach for optogenetic viral delivery in large animals such as NHPs. This approach demonstrates great potential for network-level manipulation of neural circuits with cell-type specificity in animal models evolutionarily close to humans.&#160;

Here, we demonstrate magnetic resonance (MR)-guided convection enhanced delivery (CED) of viral vectors into the cortex as an efficient and simplified approach for achieving optogenetic expression across large cortical areas in the macaque brain.

הסעה משופר משלוח אלקטרואופטיקה Adeno-וקטור ויראלי הקשורים לקליפת מקוק רזוס תחת הדרכה של תמונות MRI מקוונות

In non-human primate (NHP) optogenetics, infecting large cortical areas with viral vectors is often a difficult and time-consuming task. Here, we ...

In Vivo Direct Reprogramming of Resident Glial Cells into Interneurons by Intracerebral Injection of Viral Vectors

Converting resident glia in the brain into functional and subtype-specific neurons in vivo provides a step forward towards the development of alternative cell replacement therapies while also creating tools to study cell fate in situ. To date, it has been possible to obtain neurons via in vivo reprogramming, but the precise phenotype of these neurons or how they mature has not been analyzed in detail. In this protocol, we describe a more efficient conversion and cell-specific identification of the in vivo reprogrammed neurons, using an AAV-based viral vector system. We also provide a protocol for functional assessment of the reprogrammed cells&#8217; neuronal maturation. By injecting flip-excision (FLEX) vectors, containing the reprogramming and synapsin-driven reporter genes&#160;to specific cell types in the brain that serve as the target for cell reprogramming. This technique allows for the easy identification of newly reprogrammed neurons. Results show that the obtained reprogrammed neurons functionally mature over time, receive synaptic contacts and show electrophysiological properties of different types of interneurons. Using the transcription factors Ascl1, Lmx1a and Nurr1, the majority of the reprogrammed cells have properties of fast-spiking, parvalbumin-containing interneurons.

This protocol aims at generating directly reprogrammed interneurons in vivo, using an AAV-based viral system in the brain and a FLEX synapsin-driven GFP reporter, which allows for cell identification and further analysis in vivo.

בתוך Vivo ישיר של תאים Glial תושב לתוך Interneurons על ידי הזרקת גרם של וקטורים ויראלי

Converting resident glia in the brain into functional and subtype-specific neurons in vivo provides a step forward towards the development of alternative ...

Electrocorticographic Recording of Cerebral Cortex Areas Manipulated Using an Adeno-Associated Virus Targeting Cofilin in Mice

The use of electrocorticographic (ECoG) recordings in rodents is relevant to sleep research and to the study of a wide range of neurological conditions. Adeno-associated viruses (AAVs) are increasingly used to improve understanding of brain circuits and their functions. The AAV-mediated manipulation of specific cell populations and/or of precise molecular components has been tremendously useful to identify new sleep regulatory circuits/molecules and key proteins contributing to the adverse effects of sleep loss. For instance, inhibiting activity of the filamentous actin-severing protein&#160;cofilin&#160;using AAV prevents sleep deprivation-induced memory impairment. Here, a protocol is&#160;described that combines the manipulation of cofilin function in a cerebral cortex area with the recording of ECoG activity to examine whether cortical cofilin modulates the wakefulness and sleep ECoG signals. AAV injection is performed during the same surgical procedure as the implantation of ECoG and electromyographic (EMG) electrodes in adult male and female mice. Mice are anesthetized, and their heads are shaved. After skin cleaning and incision, stereotaxic coordinates of the motor cortex are determined, and the skull is pierced at this location. A cannula prefilled with an AAV expressing cofilinS3D, an inactive form of cofilin, is slowly positioned in the cortical tissue. After AAV infusion, gold-covered screws (ECoG electrodes) are screwed through the skull and cemented to the skull with gold wires inserted in the neck muscles (EMG electrodes). The animals are allowed three weeks to recover and to ensure sufficient expression of cofilinS3D. The infected area and cell type are verified using immunohistochemistry, and the ECoG is analyzed using visual identification of vigilance states and spectral analysis. In summary, this combined methodological approach allows the investigation of the precise contribution of molecular components regulating neuronal morphology and connectivity to the regulation of synchronized cerebral cortex activity during wakefulness and sleep.

This article describes a protocol for the manipulation of molecular targets in the cerebral cortex using adeno-associated viruses and for monitoring the effects of this manipulation during wakefulness and sleep using electrocorticographic recordings.

הקלטה אלקטרוקורטיקוגרפית של אזורי קליפת המוח מניפולציה באמצעות וירוס הקשור אדנו מיקוד Cofilin בעכברים

The use of electrocorticographic (ECoG) recordings in rodents is relevant to sleep research and to the study of a wide range of neurological conditions. ...

Analyzing the Parkinson's Disease Mouse Model Induced by Adeno-associated Viral Vectors Encoding Human &#945;-Synuclein

Parkinson&#39;s disease is a neurodegenerative disorder that involves the death of the dopaminergic neurons of the nigrostriatal pathway and, consequently, the progressive loss of control of voluntary movements. This neurodegenerative process is triggered by the deposition of protein aggregates in the brain, which are mainly constituted of &#945;-synuclein. Several studies have indicated that neuroinflammation is required to develop the neurodegeneration associated with Parkinson&#39;s disease. Notably, the neuroinflammatory process involves microglial activation as well as the infiltration of peripheral T cells into the substantia nigra (SN). This work analyzes a mouse model of Parkinson&#39;s disease that recapitulates microglial activation, T-cell infiltration into the SN, the neurodegeneration of nigral dopaminergic neurons, and motor impairment. This mouse model of Parkinson&#39;s disease is induced by the stereotaxic delivery of adeno-associated viral vectors encoding the human wild-type &#945;-synuclein (AAV-h&#945;Syn) into the SN. The correct delivery of viral vectors into the SN was confirmed using control vectors encoding green fluorescent protein (GFP). Afterward, how the dose of AAV-h&#945;Syn administered in the SN affected the extent of h&#945;Syn expression, the loss of nigral dopaminergic neurons, and motor impairment were evaluated. Moreover, the dynamics of h&#945;Syn expression, microglial activation, and T-cell infiltration were determined throughout the time course of disease development. Thus, this study provides critical time points that may be useful for targeting synuclein pathology and neuroinflammation in this preclinical model of Parkinson&#39;s disease.

This work analyzes the vector dose and exposure time required to induce neuroinflammation, neurodegeneration, and motor impairment in this preclinical model of Parkinson&#39;s disease. These vectors encoding the human &#945;-synuclein are delivered into the substantia nigra&#160;to recapitulate the synuclein pathology associated with Parkinson&#39;s disease.