הפרוטוקול שלנו חוקר את מגוון השמרים והעובש בקרקע באמצעות דגימות קרקע המתקבלות מאזורי אקלים שונים. זה מספק תובנות על מגוון השמרים הסביבתיים ועוזר לעקוב אחר מינים פתוגניים. הפרוטוקול מציע שיטה חסכונית ומהירה לקטיף שמרים ועובש מהאדמה.
דגימות קרקע יכולות להיות מעובדות במלואן כדי לקבל מבודדים תוך שבעה ימים בלבד. מערך ניסויי מאורגן היטב, כגון תיוג צינורות תרבות והכנת מדיה יום אחד מראש הוא המפתח להימנע מתחושת הצפה במהלך הניסוי. התחילו בהכנת סט של צינורות תרבית סטריליים של 13 מיליליטר.
על ידי תיוגם עם מזהה דגימת אדמה, לאחר מכן השתמש בפיפטה סרולוגית כדי להוסיף חמישה מיליליטרים של מרק תמצית שמרים-פפטון-דקסטרוז בתוספת כלורמפניקול ובנומיל בכל צינור. בתוך ארון בטיחות ביולוגית לאורגניזמים ברמה שתיים, מעבירים כ-0.1 גרם אדמה לתוך צינור התרבית המתאים באמצעות אפליקטור קצה מישור עץ סטרילי. מכסים את הצינור היטב לתחנה הראשונה, ומונעים שפיכה תוך מתן אפשרות לחילופי אוויר במהלך הדגירה.
לאחר מכן דגירו את צינורות התרבית בתוף רולר למשך 24 שעות בטמפרטורה הנחשבת אופטימלית למקסום צמיחת השמרים. לאחר מכן סמן את לוחות האגר של כלורמפניקול ובנומיל בתוספת תוספת שמרים עם לוחות אגר פפטון-דקסטרוז עם מזהה דגימת הקרקע לפני העברת הסופרנטנט לתווך המוצק. הסר את שפופרות התרבות מתוף הרולר.
לאחר מכן, בתוך ארון בטיחות ביולוגית לאורגניזמים ברמה שתיים, מערבלו לזמן קצר את הצינור כדי למשוך חלקיקי אדמה ותאים שאולי התיישבו בתחתית בחזרה לתרחיף. לאחר מכן, העבר 100 מיקרוליטרים של הסופרנאטנט לצלחת באמצעות מיקרופיפט. השתמשו במפיץ תאים רב-פעמי סטרילי כדי לפזר את הנוזל ביסודיות ובאופן שווה על פני השטח של האגר.
לאחר שאפשרו זמן דגירה מספיק של יומיים-שלושה, בדקו את הצלחות לאיתור כל גידול שמרים בתוך ארון בטיחות ביולוגית עבור אורגניזמים ברמה שתיים. חפשו שמרים קרמיים, עגולים, דמויי מט, שניתן להבחין ביניהם בקלות לבין מושבות חיידקים ועובש. בחרו מושבה אחת דמוית שמרים מכל צלחת באמצעות מקלות אפליקטור סטריליים מעץ פשוט.
מעבירים כל מושבה שנבחרה לתמצית שמרים טרייה צלחות פפטון-דקסטרו אגר עם תוספת של כלורמפניקול ובנומיל ופס למושבות בודדות. בצעו שלושה פסים נפרדים והשתמשו במקל אפליקטור חדש לכל פס. לאחר מכן, השתמש בתאים טריים שפותחו על צלחת כדי לבצע תגובת שרשרת של פולימראז מושבה.
השתמש בפריימרים המתועתקים הפנימיים ITS1 ו- ITS4 כדי להגביר את הגן המקודד של בר פטרייתי. השווה את רצף הספייסרים המתועתק הפנימי שהתקבל של זני השמרים, שני רצפים שהופקדו במאגרי מידע ציבוריים, כגון המרכז הלאומי למידע ביוטכנולוגי GenBank ו- UNITE כדי לקבוע את זהות המין. מוסיפים אדמה לצינורות מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר המכילים מיליליטר אחד של מרק דקסטרוז סאבוראוד ודגירה בטמפרטורה של 50 מעלות צלזיוס למשך יומיים עד ארבעה ימים.
כדי להעביר את התפטיר מהמרק המחוסן באדמה אל לוחות אגר של תמצית מאלט, ראשית, זהה את האינוקולומים של הקרקע שיש להם צמיחה תפטירית נראית לעין, מוסיפים את מרק ה-Sabouraud dextrose לגבול האוויר. לאחר מכן השתמשו במקלות אפליקטור עם קצה פשוט מעץ מעוקר כדי להעביר את התפטירים למרכז צלחת אגר של תמצית מאלט ולדגום את צלחת האגר של תמצית הלתת שנקבעה ב-37 מעלות צלזיוס במשך שלושה ימים. לצורך בחירת התיסליה, עם תכונות מורפולוגיות של Aspergillus fumigatus, זהה את מושבות העובש שיש להן צמיחה ירוקה אופיינית דמוית נדנדה.
בתוך ארון בטיחות ביולוגית לאורגניזמים ברמה שתיים, קוצרים קונידיה או תפטיליה על ידי גירוד המשטח פעם אחת באמצעות מקלות אפליקטור קצה מישור מעץ מעוקרים או לולאת חיסון ומעבירים אותו למרכז צלחת אגר של תמצית מאלט על ידי פסים על האגר למושבות בודדות. דגירה של הצלחות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך יומיים. באמצעות מקל יישום סטרילי או לולאת חיסון, תת-תרבות מושבה אחת שנוצרה על אגר תמצית מאלט על ידי פסים של המושבה פעם אחת.
מפזרים את הנבגים שנקטפו למרכז הצלחת. הכינו תמיסת גליצרול סטרילית של 30% כדי לקצור את נבגי Aspergillus fumigatus או תמיסות לאחסון תרבית. לאחר יומיים של דגירה של לוחות אגר ב 37 מעלות צלזיוס, לשאוף מיליליטר אחד של תמיסת 30% גליצרול באמצעות פיפטה ולפזר אותו על מושבת אספרגילוס fumigatus.
לזיהוי פנוטיפי של זני אספרגילוס פומיגטוס, שאפו 10 מיקרוליטרים של מלאי התפטיר והנבגים כדי להוסיף 990 מיקרוליטרים של מים. מערבולת מתלה נבגים מדולל זה ומחלקת 10 מיקרוליטרים של המתלים על שקופית מיקרוסקופ סטנדרטית. לאחר מכן באמצעות מיקרוסקופ מורכב בהגדלה 400X לראות את המתלים ולאתר conidiophores.
השווה את המורפולוגיה הקונידיופורית הנצפית עם מורפולוגיה של אספרגילוס פומיגטוס קונדיופור. כדי לקבוע את גודל השבר הנכון עבור כל אחד מתשעת מוקדי המיקרו-לוויינים, השתמש בתוכנה המסוגלת לנתח שברים. אסוף את הנתונים הגולמיים המתקבלים מאלקטרופורזה נימית ונקב את גודל השברים בהתבסס על השיא הגדול ביותר באמצעות תוכנת האנליזה המקוטעת.
לאחר מכן, המר את גדלי השברים למספרים חוזרים עבור כל אחד מתשעת הנמוכים השתמש בגדלים השברים של המספרים החוזרים של זן הייחוס Af293. מתוך 3, 826 דגימות קרקע שנאספו מ-53 אתרים בתשע מדינות, בודדו 1, 473 זני שמרים. טמפרטורת הדגירה הטובה ביותר עבור כל מדינה נקבעה על סמך הטמפרטורה השנתית הממוצעת שלה.
בניתוח נדיר של כל מדינה, מדד המגוון של שאנון שימש כמדד למגוון שמרי הקרקע. עקומות הנדירות שנוצרו כתוצאה מכך התקרבו לאסימפטוטת הרוויה, מה שמצביע על כך שדגימה נוספת לא הניבה ככל הנראה מגוון שמרים גדול יותר. צמיחת התפטיר על הלוחות יצרה את המורפולוגיה המתנדנדת הירוקה האופיינית לאספרגילוס פומיגטוס.
מינים פטרייתיים תרמוטולרנטיים אחרים יכולים להיות נוכחים באותה דגימת אדמה ולגדל את Aspergillus fumigatus על אותה צלחת או על ידי עצמם. מבנה Aspergillus fumigatus conidiophore שנצפה וזיהה באמצעות מיקרוסקופיית אור גילה כי לקונידיופורים יש כדור על המורפולוגיה של המקל וקונידיופורים הם יוניסריים, כאשר הפילידים המחוברים לשרשראות הקונידיה מחוברים ישירות לשלפוחית הכדורית. כרומטוגרמה שנוצרה ביסריאטים חשפה את שלושת הערוצים המדמיינים את אורכי השברים של אספרגילוס פומיגטוס דינוקלאוטיד, טרינוקלאוטיד וטטרנוקלאוטיד טנדם קצר חוזר על לוקוסים.
ניתן ליצור רשת מורחבת מינימלית באיכות גבוהה באמצעות סקריפט R plot_poppr_msn או imsn. ניתוח מפלה של מרכיבי העיקרון הוא שיטה נוספת להמחשת הקשרים הגנטיים בין זנים. הוספת בנומיל וכלורמפניקול למדיית גדילה מונעת עובש וצמיחת חיידקים, בהתאמה, ומעדיפה את בחירת השמרים.
כלוראמפניקול גם מפחית את התסיסה במדיה, ומוריד את הצטברות הגז בצינורות הדגירה. ביצוע מטא-גנומיקה על דגימות קרקע יספק מידע נוסף על המגוון התרבותי. בדיקות רגישות של זני A.fumigatus יזהו נוכחות של גנוטיפים של עמידות.
פרוטוקול זה יכול להיות מיושם על מערכות שמרים ועובש אחרות עם שינוי קטן. היא אפשרה את חקירת מגוון שמרי הקרקע התרבותיים ומנבאיו בקנה מידה עולמי.
