המחברים מבקשים להודות בני הזוג. Philina ס לי אלן ד גרוסמן עבור בתחילה הכשרה LAS ב מיקרוסקופ פלואורסצנטי. המחברים מודים גם בני הזוג. מלאני Berkmen ו האג&#39;ימה קוביאשי לעזרה וטיפים הדמיה. עבודה זו נתמכה על ידי הזנק וקרנות מהמכללה, ספרות מדע אמנות מהמחלקה לביולוגיה מולקולרית, נייד, ו התפתחותית באוניברסיטת מישיגן.

גידול תרביות של תאים עבור מיקרוסקופיה 1. אחד או יומיים לפני ההדמיה, להכין את B. subtilis זן המכיל את החלבון היתוך translational אתם רוצים לדמיין. סיבובים משפט 1A ו-1B צעדים יהיה צורך לקבוע אילו תנאי גידול מספק את התמונות הטובות ביותר של זן שלך. ברוב המקרים, התאים צריכים להיות צילמו במהלך שלב הצמיחה המעריכית. <ol class="ualpha" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור חלק ב &#39; subtilis זנים (ב, זנים מסוימים הגדלים גרוע עקב שילוב של היתוך translational בין הגן של ריבית ה-GFP על מוקד אנדוגני שלה), צמיחה ראשונית יומיים לפני הדמיה הוא הכרחי עבור תמונות באיכות גבוהה. ביום הראשון, פס ב subtilis להתאמץ כדי להיות צילמו על אגר LB עם אנטיביוטיקה סלקטיבית (ים) ו דגירה לילה בשעה 30 ° C. ביום השני, לחסן 100 μl של 0.85% עם מלח מושבת יחיד לבצע שלוש דילולים סדרתי של פי 10 על צלחות אגר LB (עם אנטיביוטיקה סלקטיבית), ציפוי 100 μL של דילול כל, ואחריו הדגירה לילה בשעה 30 ° C. ביום השלישי, בחר את צלחת דילול עם צמיחה ומחוברות אור של תאים. צמיחה ומחוברות אור על צלחת תספק צמיחה בינוני עם inoculum בריא המתנע אקספוננציאלית גדל פוטנציאל להניב תוצאות הדמיה מעולה (ראה שלב 4). צעד זה שימושי במיוחד עבור הדמיה באיכות הגבוהה ביותר קרום עם כתם FM4-64. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרים ב זנים subtilis יכול פשוט להיות מיושם בינוני אגר סלקטיבי LB עבור מושבות יחיד עם מקל סטרילי יום לפני הדמיה דגירה לילה בשעה 30 ° C. למחרת, תאים על הצלחת זה יהיה מספיק כדי לשמש inoculum הדמיה (ראה שלב 4). הערה: לקבלת B. subtilis, תרבויות לילה במדיום נוזלי אינם מתאימים עקב שילוב של יצירת הנבגים ותגובות המניין, אשר יגרום תקופה ממושכת של צמיחה בפיגור שלב 1. </li></ol> 2. בבוקרו של הדמיה, מקום 10 מ&quot;ל של מדיום 50 S7 1-3 לתוך בקבוק 125 מ&quot;ל Erlenmeyer סטרילי. 3. Resuspend התאים עד 2 מ&quot;ל של מדיום 50 S7 מהצלחת LB אגר עם מושבות יחיד או בתאי אור ומחוברות להשיג inoculum. 4. הוסף מספיק S7 50 בינוני תא inoculum אל הבקבוק המכיל 10 מ&quot;ל Erlenmeyer S7 50 בינוני תרבות עם צפיפות אופטית הראשונית נמדד ב 600 nm (OD 600) של ~ 0.08-0.1. בשלב זה חשוב לי לפחות אוויר של פי 10 יחס בינוני. לפיכך, אנו משתמשים 10-12.5 מ&quot;ל של מדיום מחוסן בתוך בקבוק 125 מ&quot;ל Erlenmeyer. 5. לגדול בכל תרבות ב 30 ° C עד התרבות מגיע OD 600 ~ 0.5-0.8. אמבטיות מים רועד עדיפים עם סיבובים לדקה 150-200. תרבויות תיגר עם סוכני ה-DNA אי התאמה או גרימת נזק צריך להיות בשלב מוקדם הצמיחה המעריכית OD 600 תאים כאלה יגיעו ליעד OD 600 לתקופה נוספת של צמיחה הנדרש לטיפול (ראה לוח 1) לדוגמה, 2-aminopurine דורש שעה אחת של טיפול, ולכן תרבות שטופלו aminopurine-2 צריך להיות 600 ~ OD 0.3-0.4, כך שעה אחת של טיפול / תוצאות הצמיחה OD 600 ~ 0.5-0.8, לפיו תאים מוכנים הדמיה. לדוגמא הכנה 1. פיפטה 300 μl של תאים בתרבית לתוך צינור microcentrifuge 1.5 מ&quot;ל. 2. אם הדמיה של ממברנות הסלולר הוא הרצוי, להוסיף 1:1000 דילול של קרום FM4-64 כתם (Invitrogen) לדגום כל מפתרון מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​1 המניות. טיטרציה של FM4-64 עשויים להידרש כדי להשיג את אותות הקרינה הרצויה. מגוון טיטרציה טיפוסית היא 1:100, 1:1000, ו 1:10,000. 3. אפשר הדגימות לשבת בטמפרטורת החדר לתקופה של עד עשר דקות או בעוד שקופית מכינים עם agarose 1% בטווח הבינוני Spizizens 1X כמתואר להלן (ראה שלב 1 של &quot;הכנת שקופית&quot;). 4. אם ריכוז של התאים נדרשת, אנו מעדיפים תאים סינון באמצעות מסנן 0.2 מיקרומטר עם מנגנון ואקום. תאים לאחר מכן ניתן לשטוף בעדינות מפני השטח של המסנן עם PBS, עוד חיץ מתאים או בינוני לפני להדמיה. הכנת שקופיות 1. הכן agarose 1% עם 1X Spizizens. הוסף 5 מ&quot;ל של המניה Spizizens 10X ל 45 מ&quot;ל ddH2O יחד עם 0.5 גרם agarose, ומיקרוגל להינמס. Agarose מותכת חמה קשה פיפטה, ביסוס agarose לא ייכנסו קצה פיפטה. Agarose צריך להיות equilibrated באמבט מים בטמפרטורה של 55-65 ° C ~ את זה כדי להזין את קצה פיפטה ללא לחיזוק בתוך<html> טיפ. 2. צייר 20 μl של Spizizens עם agarose מומסת 1% אל קצה פיפטה. פיפטה טיפה אחת (כ 1-2 μL) של הפתרון agarose לתוך שקופית היטב (אנחנו משתמשים גם 15 שקופיות, ראה טבלה 2) כדי ליצור רדוד רפידות agarose. Agarose יהיה לגבש באופן מיידי. שקופיות חייב להיות גם מיד לפני יישום של התאים. אם כריות agarose נותרים בטמפרטורת החדר לבד, הם יכולים תוך דקות מייבשים ולהיות שמיש. רפידות agarose צריך להיות מרוכז ומלא כל טוב אבל יש גובה מינימום כדי למנוע שיבוש coverslip, אם הטיפות הן גבוהות מדי (כמו בועה) או אם המדגם מתפשט גם מעבר לגבול, פשוט לסחוב לנקות היטב עם Kimwipe ולהחיל חדש agarose כרית. 3. החל המדגם כולו 300 μl (ראה שלב 6) לשקופית, מופץ על החלק העליון של כל משטח agarose. זו כמות של תאים אמור להיות מספיק כדי לכסות את כל טוב בשקופית. 4. אפשר להחליק עמוסה התאים לשבת בטמפרטורת החדר (23 מעלות צלזיוס) במשך כ עשר דקות. צעד זה יאפשר את התאים להתיישב על כרית agarose להיות נייח ומוכן הדמיה. עבור צרכים מיוחדים בטמפרטורה זו ייתכן שיהיה צורך לשנות, למשל, בעת ביצוע הניסויים הדורשים שינוי הטמפרטורה 4. 5. לשאוב משם את המדיום עודף גם מבלי להסיר את כל הרפידות עצמם. 6. החל את coverslip לשקופית, לחיצה בחוזקה ובאופן שווה, אבל בעדינות, על פני שטח של השקופית. ודא כי להחליק כיסוי נגד לשקופית וכי להחליק לכסות לא עולה מעל השקופית. ויזואליזציה של תאים 1. רבים מיקרוסקופים פלואורסצנציה שונים יעבדו היטב. זה קריטי יש עדשה 100x טבילה שמן. המעבדה סימונס משתמש: <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אולימפוס BX61 מיקרוסקופ המצויד 1,45 NA TIRFM העדשה 100x טבילה שמן אובייקטיבי </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Hamamatsu ORCAR 2 CCD מקורר מצלמה </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Lumen 200 מתכת קשת (לפני) מקור אור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לצורך זיהוי של ה-GFP (FITC), עירור לסנן 460-500 ופליטה 510-560 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לצורך זיהוי של FM4-64 (TRITC), עירור לסנן 510-560 ופליטה 572-648. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמונות שנתפסו באמצעות SlideBook 4.2 (איור 1) </li></ul> 2. תביאו את התאים אל המוקד באמצעות אור לבן. 3. צלמו את התמונה באמצעות מסננים מתאים fluorophore כל אחד. נציג תוצאות תמונות נציג מוצגים (איור 1). GFP מוקדים צריך להיות מוגדר היטב, בעוד FM4-64 מכתים צריך להיות בהיר 4-7. תמונות GFP או קרום יכול להיות פסאודו בצבע עם כל צבע, על מנת לאפשר את התמונה באיכות הגבוהה ביותר שיוצגו מבלי לאבד נתונים. <img src="/files/ftp_upload/1736/1736fig1.jpg" alt="איור 1" /> איור 1: תמונות GFP נציג B. subtilis חלבונים היתוך translational. חלבוני ה-GFP מוצגים ירוק, בעוד מכתים FM4-64 ממברנה מוצג באדום. סרגל סולם לבן מציין 3 מיקרומטר (א) MutS-GFP [גנוטיפ רלוונטיים: mutS - GFP (SPC), amyE: Pspac mutL (חתול)]. בנוכחותו של 600 מיקרוגרם / מ&quot;ל 2-aminopurine ו IPTG 1 מ&quot;מ. FM4-64 אות לא מוצגת על מנת להראות בצורה ברורה יותר MutS-GFP מוקדים (ב) MutL-GFP [גנוטיפ רלוונטיים: mutL: mutL-GFP (SPC)].. בנוכחות aminopurine-2 (C) DnaX-GFP [גנוטיפ רלוונטיים: dnaX: dnaX-GFP (SPC)]. (ד) RecA-GFP [גנוטיפ רלוונטיים: recA: recA-GFP (SPC)] בנוכחות של 20 ng / mL mitomycin ג (E) TagC-GFP [גנוטיפ רלוונטיים: tagC: tagC-GFP (SPC) ] בנוכחות של 1 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​mitomycin ג <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> טיפול / ריכוז או כמות </td><td> פונקציה </td><td> זמן הדגירה של </td></tr><tr><td> Mitomycin C (MMC) [20-150 ng / mL] </td><td> סוכן ה-DNA אלקילציה </td><td> 1 שעה </td></tr><tr><td> 2-aminopurine (2-AP) [600 מיקרוגרם / מ&quot;ל] </td><td> גרימת אי התאמה </td><td> 1 שעה </td></tr><tr><td> Hydroxyurea (האוניברסיטה העברית) </td><td> מכלה dNTPs </td><td> 3 שעות </td></tr><tr><td> אור אולטרה סגול (UV) 20 J/m2 </td><td> תימין, תימין הדימרים ו 6-4 photoproducts </td><td> משתנה בהתאם למקור, בדרך כלל 20 שניות </td></tr><tr><td> אפור (קרינה מייננת) 5-100 Gy </td><td> גדיל שוברת פעמיים, הפסקות גדיל יחיד נזק אתרי בסיס </td><td> משתנה בהתאם למקור </td></tr></tbody></table>&quot;&gt; בטבלה 1. סיכום של ה-DNA ואת גרימת נזק טיפולים אי התאמה <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> הערות (אופציונלי) </td></tr><tr><td> שקופית Multitest, 15-היטב </td><td> MP Biomedicals </td><td> 6041505E </td><td></td></tr><tr><td> כיסוי זכוכית מיקרוסקופ </td><td> דיג </td><td> 12-544-B </td><td></td></tr><tr><td> Agarose </td><td> דיג </td><td> BP160-500 </td><td></td></tr><tr><td> Mitomycin C </td><td> סיגמא </td><td> M0503-2MG </td><td> mutagen, ללבוש כפפות </td></tr><tr><td> 2-Aminopurine </td><td> סיגמא </td><td> A3509-טבליות של 250 </td><td> כפפות </td></tr><tr><td> Hydroxyurea </td><td> סיגמא </td><td> H8627-25 גרם </td><td> כפפות </td></tr><tr><td> FM4-64 </td><td> Invitrogen </td><td> T13320 </td><td> אור רגיש </td></tr></tbody></table> טבלה 2. רשימת ריאגנטים ספציפיים ציוד:

<ol>
	<li>Hardwood, C. R., Cutting, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Biological Methods for Bacillus. , (1990).</li><li>Berkmen, M. B., Grossman, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+and+temporal+organization+of+the+Bacillus+subtilis+replication+cycle.">Spatial and temporal organization of the Bacillus subtilis replication cycle.</a> Mol. Microbiol. 62, 57-71 (2006).</li><li>Simmons, L. A., Grossman, A. D., Walker, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clp+and+Lon+proteases+occupy+distinct+subcellular+positions+in+Bacillus+subtilis.">Clp and Lon proteases occupy distinct subcellular positions in Bacillus subtilis.</a> J. Bacteriol. 190, 6758-6768 (2008).</li><li>Simmons, L. A., Grossman, A. D., Walker, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+is+required+for+the+RecA+localization+response+to+DNA+damage+in+Bacillus+subtilis.">Replication is required for the RecA localization response to DNA damage in Bacillus subtilis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 104, 1360-1365 (2007).</li><li>Simmons, L. A., Davies, B. W., Grossman, A. D., Walker, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=b+Clamp+Directs+Localization+of+Mismatch+Repair+in+Bacillus+subtilis.">b Clamp Directs Localization of Mismatch Repair in Bacillus subtilis.</a> Mol. Cell. 29, 291-301 (2008).</li><li>Simmons, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+responses+to+double-strand+breaks+between+Escherichia+coli+and+Bacillus+subtilis+reveals+different+requirements+for+SOS+induction.">Comparison of responses to double-strand breaks between Escherichia coli and Bacillus subtilis reveals different requirements for SOS induction.</a> J. Bacteriol. 191, 1152-1161 (2009).</li><li>Smith, B. T., Grossman, A. D., Walker, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+mismatch+repair+in+bacterial+cells.">Visualization of mismatch repair in bacterial cells.</a> Mol. Cell. 8, 1197-1206 (2001).</li></ol>

ניסוי וטעייה נדרשים למצוא את התנאים החשיפה לתמונות באיכות הגבוהה ביותר עבור כל זן, אנו מוצאים כי 1 אלפית השנייה מתאים תמונות אור לבן, תוך חשיפה של 100-2000 ms המתאימים GFP (FITC) ו FM4-64 (TRITC ) תמונות. זמן חשיפה ישתנו בהתאם לציוד הדמיה בשימוש. אנו ממליצים להשתמש זן אחד לכל שקופית 15 גם מיקרוסקופ הדמיה הפשוטה ביותר, כמו איכות פנקס דיפוזיה של תאים מהגבול כרית עלולה לסבך בידול זן אם זנים רבים נמצאים בשקופית אחת. איכות תמונה ישירות תלוי באיכות של כרית agarose שבו החיידקים נחים. התמונות באיכות הגבוהה ביותר יהיה שנתפסו מ agarose רפידות שבו חיידקים נמצאים זה לצד זה. רפידות שגורמים תאים חיידקיים אל סבך, מניעת monolayer, תפיק תמונות עניים. רפידות כי הם עבים מדי יפיק אות רקע גבוה פלורסנט, בעוד רפידות כי הם לא יאפשרו מיובש עבור התאים לנוח כמו שצריך. אלה כרית פגמים agarose יהיה בדרך כלל תוצאה של איכות תמונה גרועה מאוד. אם גם הוא לייצר דימויים עני, פשוט לעבור הבא היטב. הוא אידיאלי כדי ללכוד את בין 50 ל 200 תאים לכל תמונה. מיקרוסקופ פלואורסצנטי סיפקה שפע של מידע המפרט את הרמזים הסלולר לכוון את הרכבה של תיקון דנ&quot;א וחלבונים שכפול לתוך מוקדי in vivo. בעזרת תרגול, טכניקה זו יכולה להיות מיושם בהצלחה במגוון רחב של קומפלקסים חלבונים במינים חיידקים רבים.

פתרון מתכונים ספציפיים 1: 10x S7 50 מלחים 0.5 מ מגבים 100 mM אמוניום סולפט 50 מ&quot;מ פוספט אשלגן Monobasic סנן לעקר, ועוטפים S7 50 מדיה בנייר לפני אחסון 100x מתכות 0.2 מ MgCl 2 70 mM CaCl 2 5 מ&quot;מ MnCl 2 0.1 מ&quot;מ ZnCl 2 100 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​תיאמין HCl 2 מ&quot;מ HCl 0.5 mM FeCl 3 * DH 2 O לנפח סופי * FeCl 3 יש להוסיף שעברה, על מנת למנוע משקעים. לאחר עיקור לסנן, לעטוף 100x פתרון מתכת בנייר כסף. S7 50 מדיה 1x S7 50 מלחים 1x מתכת 1% גלוקוז 0.1% גלוטמט 40 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​טריפטופן 40 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​פנילאלנין מזוקקים H 2 O לנפח סופי Spizizens 10x (גרם / ליטר) 151.4 mM אמוניום סולפט (20 גרם / L) 803.8 mM אשלגן פוספט Monobasic (140g / L) 440.9 mM אשלגן פוספט Dibasic (60G / L) 34.0 נתרן mM ציטראט (10g / L) 16.6 mM MgSO 4 (2G / L) DH 2 O לנפח סופי סנן לעקר

imaging mismatch repair and cellular responses to dna damage in bacillus subtilis

שני ו אאוקריוטים פרוקריוטים להגיב נזק לדנ&quot;א באמצעות מערכת מורכבת של שינויים פיזיולוגיים. שינויים בביטוי הגנים, חלוקה מחדש של החלבונים הקיימים, ואת הרכבה של קומפלקסים חלבונים חדשים יכול להיות מגורה על ידי מגוון של נגעים דנ&quot;א תואמים בסיס זוגות DNA. מיקרוסקופ פלואורסצנטי שימש ככלי ניסיוני רב עוצמה המאפשר הדמיה לכימות תגובות אלה ואחרים נגעים דנ&quot;א כדי לפקח על שכפול ה-DNA מעמד בתוך הארכיטקטורה subcellular המורכב של התא החי. Fusions Translational בין חלבונים כתב ניאון ורכיבים של שכפול ה-DNA ואת מנגנון תיקון שימשו כדי לקבוע את הרמזים כי ה-DNA היעד לתיקון חלבונים נגעים שלהם מאותו מקור<em&gt; In vivo</em&gt; כדי להבין כיצד חלבונים אלו מאורגנים בתוך תאים חיידקיים. בנוסף, fusions תעתיק ו translational קשורה נזק היזמים ועין מתנהלת DNA חשפו שבו תאים בתוך אוכלוסיה שהפעלת תגובות דחק genotoxic. בסקירה זו, אנו מספקים פרוטוקול מפורט באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי לתמונה הרכבה של תיקון דנ&quot;א שכפול הדנ&quot;א קומפלקסים של תאים חיידקיים יחיד. בפרט, עבודה זו מתמקדת לתקן הדמיה חלבונים אי התאמה, הומולוגיים רקומבינציה, שכפול הדנ&quot;א ואת החלבונים SOS-ועין מתנהלת ב<em&gt; Bacillus subtilis</em&gt;. כל ההליכים המתוארים כאן ניתנים בקלות מתחמי הדמיה חלבון במגוון מינים חיידקי.

Watch this Scientific Journal Video about Imaging Mismatch Repair and Cellular Responses to DNA Damage in Bacillus subtilis at JoVE.com

Imaging Mismatch Repair and Cellular Responses to DNA Damage in Bacillus subtilis

פרוטוקול מפורט מתואר הדמיה בזמן אמת היווצרות של קומפלקסים לתקן דנ&quot;א<em&gt; Bacillus subtilis</em&gt; תאים.

הדמיה תיקון Mismatch ותגובות נייד נזק לדנ&quot;א Bacillus subtilis</em

Both prokaryotes and eukaryotes respond to DNA damage through a complex set of physiological changes. Alterations in gene expression, the redistribution ...

imaging-mismatch-repair-cellular-responses-to-dna-damage-bacillus

Google

Research

JoVE Journal

Biology

Imaging Mismatch Repair and Cellular Responses to DNA Damage in Bacillus subtilis

10.9K Views.  University of Michigan-Ann Arbor. פרוטוקול מפורט מתואר הדמיה בזמן אמת היווצרות של קומפלקסים לתקן דנ"א Bacillus subtilis תאים.

Video: Imaging Mismatch Repair and Cellular Responses to DNA Damage in Bacillus subtilis

Two- and Three-Dimensional Live Cell Imaging of DNA Damage Response Proteins

Double-strand breaks (DSBs) are the most deleterious DNA lesions a cell can encounter. If left unrepaired, DSBs harbor great potential to generate mutations and chromosomal aberrations1. To prevent this trauma from catalyzing genomic instability, it is crucial for cells to detect DSBs, activate the DNA damage response (DDR), and repair the DNA. When stimulated, the DDR works to preserve genomic integrity by triggering cell cycle arrest to allow for repair to take place or force the cell to undergo apoptosis. The predominant mechanisms of DSB repair occur through nonhomologous end-joining (NHEJ) and homologous recombination repair (HRR) (reviewed in2). There are many proteins whose activities must be precisely orchestrated for the DDR to function properly. Herein, we describe a method for 2- and 3-dimensional (D) visualization of one of these proteins, 53BP1.
The p53-binding protein 1 (53BP1) localizes to areas of DSBs by binding to modified histones3,4, forming foci within 5-15 minutes5. The histone modifications and recruitment of 53BP1 and other DDR proteins to DSB sites are believed to facilitate the structural rearrangement of chromatin around areas of damage and contribute to DNA repair6. Beyond direct participation in repair, additional roles have been described for 53BP1 in the DDR, such as regulating an intra-S checkpoint, a G2/M checkpoint, and activating downstream DDR proteins7-9. Recently, it was discovered that 53BP1 does not form foci in response to DNA damage induced during mitosis, instead waiting for cells to enter G1 before localizing to the vicinity of DSBs6. DDR proteins such as 53BP1 have been found to associate with mitotic structures (such as kinetochores) during the progression through mitosis10.
In this protocol we describe the use of 2- and 3-D live cell imaging to visualize the formation of 53BP1 foci in response to the DNA damaging agent camptothecin (CPT), as well as 53BP1's behavior during mitosis. Camptothecin is a topoisomerase I inhibitor that primarily causes DSBs during DNA replication. To accomplish this, we used a previously described 53BP1-mCherry fluorescent fusion protein construct consisting of a 53BP1 protein domain able to bind DSBs11. In addition, we used a histone H2B-GFP fluorescent fusion protein construct able to monitor chromatin dynamics throughout the cell cycle but in particular during mitosis12. Live cell imaging in multiple dimensions is an excellent tool to deepen our understanding of the function of DDR proteins in eukaryotic cells.

This protocol describes a method for visualizing a DNA double-strand break signaling protein activated in response to DNA damage as well as its localization during mitosis.

שתי והדמית תא חייה תלת ממדית של חלבוני תגובת ניזק לדנ&quot;א

Double-strand breaks (DSBs) are the most deleterious DNA lesions a cell can encounter. If left unrepaired, DSBs harbor great potential to generate ...

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the development of diverse techniques to visualize individual RNA transcripts in single living cells. One promising technique that has recently been described utilizes an oligonucleotide-based optical probe, ratiometric bimolecular beacon (RBMB), to detect RNA transcripts that were engineered to contain at least four tandem repeats of the RBMB target sequence in the 3&#8217;-untranslated region. RBMBs are specifically designed to emit a bright fluorescent signal upon hybridization to complementary RNA, but otherwise remain quenched. The use of a synthetic probe in this approach allows photostable, red-shifted, and highly emissive organic dyes to be used for imaging. Binding of multiple RBMBs to the engineered RNA transcripts results in discrete fluorescence spots when viewed under a wide-field fluorescent microscope. Consequently, the movement of individual RNA transcripts can be readily visualized in real-time by taking a time series of fluorescent images. Here we describe the preparation and purification of RBMBs, delivery into cells by microporation and live-cell imaging of single RNA transcripts.

Ratiometric bimolecular beacons (RBMBs) can be used to image single engineered RNA transcripts in living cells. Here, we describe the preparation and purification of RBMBs, delivery of RBMBs into cells by microporation and fluorescent imaging of single RNA transcripts in real-time.

הדמיה בזמן אמת של יחיד תכנון הנדסי RNA תמלילים בתאים חיים באמצעות משואות bimolecular רציומטרי

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

gDNA Enrichment by a Transposase-based Technology for NGS Analysis of the Whole Sequence of BRCA1, BRCA2, and 9 Genes Involved in DNA Damage Repair

The widespread use of Next Generation Sequencing has opened up new avenues for cancer research and diagnosis. NGS will bring huge amounts of new data on cancer, and especially cancer genetics. Current knowledge and future discoveries will make it necessary to study a huge number of genes that could be involved in a genetic predisposition to cancer. In this regard, we developed a Nextera design to study 11 complete genes involved in DNA damage repair. This protocol was developed to safely study 11 genes (ATM, BARD1, BRCA1, BRCA2, BRIP1, CHEK2, PALB2, RAD50, RAD51C, RAD80, and TP53) from promoter to 3&#39;-UTR in 24 patients simultaneously. This protocol, based on transposase technology and gDNA enrichment, gives a great advantage in terms of time for the genetic diagnosis thanks to sample multiplexing. This protocol can be safely used with blood gDNA.

gDNA Enrichment by a Transposase-based Technology for NGS Analysis of the Whole Sequence of BRCA1, BRCA2, and 9 Genes Involved in DNA Damage Repair

gDNA enrichment for NGS sequencing is an easy and powerful tool for the study of constitutional mutations. In this article, we present the procedure to analyse simply the complete sequence of 11 genes involved in DNA damage repair.

gDNA העשרה על ידי טכנולוגיה מבוססת Transposase לניתוח NGS של הרצף השלם של<em&gt; BRCA1</em&gt;,<em&gt; BRCA2</em&gt;, ו -9 גנים המעורבים בתיקון נזק לדנ&quot;א

The widespread use of Next Generation Sequencing has opened up new avenues for cancer research and diagnosis. NGS will bring huge amounts of new data on ...

Visualization of miniSOG Tagged DNA Repair Proteins in Combination with Electron Spectroscopic Imaging (ESI)

The limits to optical resolution and the challenge of identifying specific protein populations in transmission electron microscopy have been obstacles in cell biology. Many phenomena cannot be explained by in vitro analysis in simplified systems and need additional structural information in situ, particularly in the range between 1 nm and 0.1 &#181;m, in order to be fully understood. Here, electron spectroscopic imaging, a transmission electron microscopy technique that allows simultaneous mapping of the distribution of proteins and nucleic acids, and an expression tag, miniSOG, are combined to study the structure and organization of DNA double-strand break repair foci.

Visualization of miniSOG Tagged DNA Repair Proteins in Combination with Electron Spectroscopic Imaging ESI

Electron spectroscopic imaging can image and distinguish nucleic acid from protein at nanometer resolution. It can be combined with the miniSOG system, which is able to specifically label tagged proteins in transmission electron microscopy samples. We illustrate the use of these technologies using double-strand break repair foci as an example.

הדמיה של חלבונים תיקון ה- DNA miniSOG תייג בשילוב עם אלקטרונים Spectroscopic הדמיה (ESI)

The limits to optical resolution and the challenge of identifying specific protein populations in transmission electron microscopy have been obstacles in ...

Measuring DNA Damage and Repair in Mouse Splenocytes After Chronic In Vivo Exposure to Very Low Doses of Beta- and Gamma-Radiation

Low dose radiation exposure may produce a variety of biological effects that are different in quantity and quality from the effects produced by high radiation doses. Addressing questions related to environmental, occupational and public health safety in a proper and scientifically justified manner heavily relies on the ability to accurately measure the biological effects of low dose pollutants, such as ionizing radiation and chemical substances. DNA damage and repair are the most important early indicators of health risks due to their potential long term consequences, such as cancer. Here we describe a protocol to study the effect of chronic in vivo exposure to low doses of &#947;- and &#946;-radiation on DNA damage and repair in mouse spleen cells. Using a commonly accepted marker of DNA double-strand breaks, phosphorylated histone H2AX called &#947;H2AX, we demonstrate how it can be used to evaluate not only the levels of DNA damage, but also changes in the DNA repair capacity potentially produced by low dose in vivo exposures. Flow cytometry allows fast, accurate and reliable measurement of immunofluorescently labeled &#947;H2AX in a large number of samples. DNA double-strand break repair can be evaluated by exposing extracted splenocytes to a challenging dose of 2 Gy to produce a sufficient number of DNA breaks to trigger repair and by measuring the induced (1 hr post-irradiation) and residual DNA damage (24 hrs post-irradiation). Residual DNA damage would be indicative of incomplete repair and the risk of long-term genomic instability and cancer. Combined with other assays and end-points that can easily be measured in such in vivo studies (e.g., chromosomal aberrations, micronuclei frequencies in bone marrow reticulocytes, gene expression, etc.), this approach allows an accurate and contextual evaluation of the biological effects of low level stressors.

Measuring DNA Damage and Repair in Mouse Splenocytes After Chronic In Vivo Exposure to Very Low Doses of Beta- and Gamma-Radiation

A protocol to evaluate changes in DNA damage levels and DNA repair capacity that may be induced by chronic in vivo low dose irradiation in mouse spleen lymphocytes, by measuring phosphorylated histone H2AX, a marker of DNA double-strand breaks, using flow cytometry is presented.

מדידת נזק לדנ&quot;א ותיקון בSplenocytes העכבר לאחר כרוני<em&gt; In vivo</em&gt; חשיפה למינונים נמוכים מאוד של בטא וגמא-קרינה

Low dose radiation exposure may produce a variety of biological effects that are different in quantity and quality from the effects produced by high ...

In Vivo Alkaline Comet Assay and Enzyme-modified Alkaline Comet Assay for Measuring DNA Strand Breaks and Oxidative DNA Damage in Rat Liver

Unrepaired DNA damage can lead to genetic instability, which in turn may enhance cancer development. Therefore, identifying potential DNA damaging agents is important for protecting public health. The in vivo alkaline comet assay, which detects DNA damage as strand breaks, is especially relevant for assessing the genotoxic hazards of xenobiotics, as its responses reflect the in vivo absorption, tissue distribution, metabolism and excretion (ADME) of chemicals, as well as DNA repair process. Compared to other in vivo DNA damage assays, the assay is rapid, sensitive, visual and inexpensive, and, by converting oxidative DNA damage into strand breaks using specific repair enzymes, the assay can measure oxidative DNA damage in an efficient and relatively artifact-free manner. Measurement of DNA damage with the comet assay can be performed using both acute and subchronic toxicology study designs, and by integrating the comet assay with other toxicological assessments, the assay addresses animal welfare requirements by making maximum use of animal resources. Another major advantage of the assays is that they only require a small amount of cells, and the cells do not have to be derived from proliferating cell populations. The assays also can be performed with a variety of human samples obtained from clinically or occupationally exposed individuals.

In Vivo Alkaline Comet Assay and Enzyme-modified Alkaline Comet Assay for Measuring DNA Strand Breaks and Oxidative DNA Damage in Rat Liver

The alkaline comet assay measures DNA strand breaks in eukaryotic cells. By adding an Endonuclease III or human 8-oxoguanine-DNA-N-glycosylase digestion step, the assay can efficiently detect oxidative DNA damage. We describe methods for using these assays to detect DNA damage in rat liver.

In vivo אלקליין השביט Assay ואנזים-modified אלקליין השביט Assay עבור מדידת Breaks Strand דנ&quot;א נזק חמצוני דנ&quot;א עכברוש הכבד

Unrepaired DNA damage can lead to genetic instability, which in turn may enhance cancer development. Therefore, identifying potential DNA damaging agents ...

Investigating the Detrimental Effects of Low Pressure Plasma Sterilization on the Survival of Bacillus subtilis Spores Using Live Cell Microscopy

Plasma sterilization is a promising alternative to conventional sterilization methods for industrial, clinical, and spaceflight purposes. Low pressure plasma (LPP) discharges contain a broad spectrum of active species, which lead to rapid microbial inactivation. To study the efficiency and mechanisms of sterilization by LPP, we use spores of the test organism Bacillus subtilis because of their extraordinary resistance against conventional sterilization procedures. We describe the production of B. subtilis spore monolayers, the sterilization process by low pressure plasma in a double inductively coupled plasma reactor, the characterization of spore morphology using scanning electron microscopy (SEM), and the analysis of germination and outgrowth of spores by live cell microscopy. A major target of plasma species is genomic material (DNA) and repair of plasma-induced DNA lesions upon spore revival is crucial for survival of the organism. Here, we study the germination capacity of spores and the role of DNA repair during spore germination and outgrowth after treatment with LPP by tracking fluorescently-labelled DNA repair proteins (RecA) with time-resolved confocal fluorescence microscopy. Treated and untreated spore monolayers are activated for germination and visualized with an inverted confocal live cell microscope over time to follow the reaction of individual spores. Our observations reveal that the fraction of germinating and outgrowing spores is dependent on the duration of LPP-treatment reaching a minimum after 120 s. RecA-YFP (yellow fluorescence protein) fluorescence was detected only in few spores and developed in all outgrowing cells with a slight elevation in LPP-treated spores. Moreover, some of the vegetative bacteria derived from LPP-treated spores showed an increase in cytoplasm and tended to lyse. The described methods for analysis of individual spores could be exemplary for the study of other aspects of spore germination and outgrowth.

Investigating the Detrimental Effects of Low Pressure Plasma Sterilization on the Survival of Bacillus subtilis Spores Using Live Cell Microscopy

This protocol illustrates the important consecutive steps required to assess the relevance of monitoring vitality parameter and DNA repair processes in reviving Bacillus subtilis spores after treatment with low pressure plasma by tracking fluorescence-labelled DNA repair proteins via time-resolved confocal microscopy and scanning electron microscopy.

חוקרים את מזיקה אפקטים של נמוך לחץ פלזמה עיקור על ההישרדות של Bacillus subtilis הנבגים באמצעות Live התא מיקרוסקופ

Plasma sterilization is a promising alternative to conventional sterilization methods for industrial, clinical, and spaceflight purposes. Low pressure ...

Single-cell Microfluidic Analysis of Bacillus subtilis

Microfluidic technology overcomes many of the limitations to traditional analytical methods in microbiology. Unlike bulk-culture methods, it offers single-cell resolution and long observation times spanning hundreds of generations; unlike agarose pad-based microscopy, it has uniform growth conditions that can be tightly controlled. Because the continuous flow of growth medium isolates the cells in a microfluidic device from unpredictable variations in the local chemical environment caused by cell growth and metabolism, authentic changes in gene expression and cell growth in response to specific stimuli can be more confidently observed. Bacillus subtilis is used here as a model bacterial species to demonstrate a &#34;mother machine&#34;-type method for cellular analysis. We show how to construct and plumb a microfluidic device, load it with cells, initiate microscopic imaging, and expose cells to a stimulus by switching from one growth medium to another. A stress-responsive reporter is used as an example to reveal the type of data that may be obtained by this method. We also briefly discuss further applications of this method for other types of experiments, such as analysis of bacterial sporulation.

Single-cell Microfluidic Analysis of Bacillus subtilis

We present a method for the microfluidic analysis of individual bacterial cell lineages using Bacillus subtilis as an example. The method overcomes shortcomings of traditional analytical methods in microbiology by allowing observation of hundreds of cell generations under tightly controllable and uniform growth conditions.

ניתוח Microfluidic תא בודד של Bacillus subtilis

Microfluidic technology overcomes many of the limitations to traditional analytical methods in microbiology. Unlike bulk-culture methods, it offers ...

Visualizing and Quantifying Endonuclease-Based Site-Specific DNA Damage

Cells are continuously exposed to various DNA damaging agents, inducing different cellular responses. Applying biochemical and genetic approaches is essential in revealing cellular events associated with the recruitment and assembly of DNA repair complexes at the site of DNA damage. In the last few years, several powerful tools have been developed to induce site-specific DNA damage. Moreover, novel seminal techniques allow us to study these processes at the single-cell resolution level using both fixed and living cells. Although these techniques have been used to study various biological processes, herein we present the most widely used protocols in the field of DNA repair, Fluorescence Immunostaining (IF) and Chromatin Immunoprecipitation (ChIP), which in combination with endonuclease-based site-specific DNA damage make it possible to visualize and quantify the genomic occupancy of DNA repair factors in a directed and regulated fashion, respectively. These techniques provide powerful tools for the researchers to identify novel proteins bound to the damaged genomic locus as well as their post-translational modifications necessary for their fine-tune regulation during DNA repair.

This article introduces essential steps of immunostaining and chromatin immunoprecipitation. These protocols are commonly used to study DNA damage-related cellular processes and to visualize and quantify the recruitment of proteins implicated in DNA repair.

הדמיה וכימות נזק DNA ספציפי לאתר מבוסס אנדונוקלאז

Cells are continuously exposed to various DNA damaging agents, inducing different cellular responses. Applying biochemical and genetic approaches is ...

In Vitro Analysis of E3 Ubiquitin Ligase Function

The covalent attachment of ubiquitin (Ub) to internal lysine residue(s) of a substrate protein, a process termed ubiquitylation, represents one of the most important post-translational modifications in eukaryotic organisms. Ubiquitylation is mediated by a sequential cascade of three enzyme classes including ubiquitin-activating enzymes (E1 enzymes), ubiquitin-conjugating enzymes (E2 enzymes), and ubiquitin ligases (E3 enzymes), and sometimes, ubiquitin-chain elongation factors (E4 enzymes). Here, in vitro protocols for ubiquitylation assays are provided, which allow the assessment of E3 ubiquitin ligase activity, the cooperation between E2-E3 pairs, and substrate selection. Cooperating E2-E3 pairs can be screened by monitoring the generation of free poly-ubiquitin chains and/or auto-ubiquitylation of the E3 ligase. Substrate ubiquitylation is defined by selective binding of the E3 ligase and can be detected by western blotting of the in vitro reaction. Furthermore, an E2~Ub discharge assay is described, which is a useful tool for the direct assessment of functional E2-E3 cooperation. Here, the E3-dependent transfer of ubiquitin is followed from the corresponding E2 enzyme onto free lysine amino acids (mimicking substrate ubiquitylation) or internal lysines of the E3 ligase itself (auto-ubiquitylation). In conclusion, three different in vitro protocols are provided that are fast and easy to perform to address E3 ligase catalytic functionality.

In Vitro Analysis of E3 Ubiquitin Ligase Function

The present study provides detailed in vitro ubiquitylation assay protocols for the analysis of E3 ubiquitin ligase catalytic activity. Recombinant proteins were expressed using prokaryotic systems such as Escherichia coli culture.

במבחנה ניתוח של E3 אוביקוויטין פונקציית ליגאז

The covalent attachment of ubiquitin (Ub) to internal lysine residue(s) of a substrate protein, a process termed ubiquitylation, represents one of the ...