Gli autori desiderano ringraziare Drs. Philina S. Lee e Alan D. Grossman per la formazione inizialmente LAS in microscopia a fluorescenza. Gli autori hanno anche ringraziare Drs. Melanie Berkmen e Hajime Kobayashi aiuto e suggerimenti per l&#39;imaging. Questo lavoro è stato supportato da start-up fondi del Collegio di Letteratura, Scienze e Arti e dal Dipartimento di Biologia Molecolare, Cellulare e dello Sviluppo presso l&#39;Università del Michigan.

Colture di cellule in crescita per microscopia 1. Uno o due giorni prima di imaging, preparare la B. subtilis ceppo contenente la proteina di fusione traslazionale che si desidera visualizzare. Turni di prova di 1A e 1B passi saranno necessari per determinare quale condizione di crescita fornisce le migliori immagini del vostro sforzo. Nella maggior parte dei casi, le cellule dovrebbero essere esposte durante la fase di crescita esponenziale. <ol class="ualpha"><li> Per alcune B. ceppi subtilis (in particolare, i ceppi che crescono poco, grazie all&#39;integrazione della fusione traslazionale tra il gene di interesse e GFP al suo locus endogena), la crescita iniziale per due giorni precedenti l&#39;imaging è necessario per immagini di alta qualità. Il primo giorno, striscia la B. subtilis ceppo di essere ripreso su agar LB con antibiotico selettivo (s) e incubare una notte a 30 ° C. Il secondo giorno, inoculare 100 l di soluzione salina allo 0,85% con una singola colonia ed eseguire tre diluizioni di 10 volte seriale su piastre di agar LB (con antibiotici selettivi), placcatura 100 l di ogni diluizione, seguita dalla notte di incubazione a 30 ° C. Il terzo giorno, selezionare la piastra di diluizione con luce crescita confluente di cellule. Luce crescita confluente su un piatto fornirà il terreno di coltura con una sana e in crescita esponenziale inoculo starter per produrre potenzialmente ottimi risultati di imaging (vedi punto 4). Questa fase è particolarmente utile per l&#39;imaging di altissima qualità a membrana con la macchia FM4-64. </li><li> Altri B. ceppi subtilis possono semplicemente essere applicate a terreno selettivo agarizzato LB per singole colonie con un bastone sterile il giorno prima di imaging e incubare una notte a 30 ° C. Il giorno seguente, le celle su questa piastra sarà sufficiente utilizzare come inoculo per l&#39;imaging (vedi punto 4). NOTA: per B. subtilis, culture durante la notte in mezzo liquido non sono adatti a causa di una combinazione di formazione di spore e le risposte del quorum, che farà un lungo periodo di crescita ritardo di fase 1. </li></ol> 2. La mattina di imaging versare 10 ml di S7 50 media 1-3 in un pallone da 125 ml Erlenmeyer sterile. 3. Risospendere le cellule in un massimo di 2 ml di S7 50 di media dalla piastra LB agar con singole colonie o le cellule confluenti luce per ottenere un inoculo. 4. Aggiungi sufficiente S7 50 medio-cell inoculo per la beuta contenente 10 ml S7 50 di media per una cultura con una densità iniziale ottica misurata a 600 nm (OD 600) di ~ 0,08-0,1. A questo punto è importante avere almeno 10 volte l&#39;aria al rapporto medio. Quindi, utilizziamo 10-12,5 mL di terreno inoculato in un pallone di 125 ml Erlenmeyer. 5. Crescono ogni cultura a 30 ° C fino a quando la cultura raggiunge un diametro esterno 600 ~ 0,5-0,8. Bagni di acqua agitazione sono da preferire con giri al minuto da 150-200. Culture sfidato con gli agenti che danneggiano il DNA inducendo o mancata corrispondenza dovrebbe essere in una fase iniziale di crescita esponenziale OD 600 in modo tale che le cellule raggiungerà l&#39;obiettivo OD 600 con l&#39;ulteriore periodo di crescita che è necessario per il trattamento (vedi tabella 1) Per esempio, 2-aminopurine richiede un&#39;ora di trattamento, e quindi una cultura trattati con 2-aminopurine dovrebbe essere di 0,3-0,4 OD 600 ~, tale che l&#39;un&#39;ora di trattamento / risultati di crescita in un OD 600 ~ 0,5-0,8, per cui le cellule sono pronte per l&#39;imaging. Preparazione del campione 1. Pipettare 300 ul di cellule in coltura in una provetta per microcentrifuga da 1,5 ml. 2. Se l&#39;imaging delle membrane cellulari si desidera, aggiungere 1:1000 diluizione di FM4-64 membrana macchia (Invitrogen) per ogni campione da un mg / 1 ml soluzione madre. Una titolazione di FM4-64 può essere richiesto per ottenere il segnale di fluorescenza desiderato. Una gamma titolazione tipica è 1:100, 1:1000 e 1:10.000. 3. Lasciare i campioni a temperatura ambiente fino a una decina di minuti, mentre la diapositiva si sta preparando con 1% di agarosio in 1X medio Spizizens come descritto di seguito (vedi punto 1 di &quot;preparazione del vetrino&quot;). 4. Se la concentrazione di cellule è richiesto, noi preferiamo celle filtranti con filtro da 0,2 micron con un apparato vuoto. Le celle possono poi essere lavati delicatamente dalla superficie del filtro con PBS, un altro tampone appropriato o medio prima di visualizzazione. Far scorrere la preparazione 1. Preparare l&#39;1% di agarosio con 1X Spizizens. Aggiungere 5 ml di 10X magazzino Spizizens a 45 ml ddH2O con 0,5 g di agarosio, e forno a microonde a sciogliersi. Agarosio fuso a caldo è difficile da pipetta, e solidificato agarosio non entrerà la punta della pipetta. L&#39;agarosio devono essere equilibrati in un bagno d&#39;acqua ad una temperatura di circa 55-65 ° C, per entrare la punta della pipetta senza solidificazione all&#39;interno del<html> punta. 2. Disegna 20 l di Spizizens con 1% di agarosio fuso nella punta della pipetta. Pipetta una goccia (circa 1-2 mL) della soluzione di agarosio in ogni pozzetto (usiamo pure 15-diapositive, vedi Tabella 2) per formare superficiale pastiglie agarosio. L&#39;agarosio si solidificano immediatamente. Le diapositive devono essere fatte immediatamente prima dell&#39;applicazione delle cellule. Se le pastiglie di agarosio vengono lasciati a temperatura ambiente da soli, possono disidratarsi in pochi minuti e diventano inutilizzabili. Pastiglie agarosio deve essere centrato e riempire ogni bene, ma hanno l&#39;altezza minima per evitare di interrompere il coprioggetto, se le gocce sono troppo elevati (bubble-simili) o se il campione si estende al di là del confine bene, è sufficiente passare il bene pulire con un Kimwipe e applicare un agarosio nuovo pad. 3. Applicare l&#39;intero campione di 300 microlitri (vedi punto 6) alla diapositiva, distribuiti in cima ad ogni pad agarosio. Questa quantità di cellule dovrebbe essere sufficiente a coprire ogni pozzetto nella diapositiva. 4. Lasciare il vetrino caricato con celle a temperatura ambiente (23 ° C) per circa dieci minuti. Questo passo consentirà alle cellule di stabilirsi sul pad agarosio diventando immobile e pronto per l&#39;imaging. Per esigenze specifiche questa temperatura può avere bisogno di essere cambiato, per esempio, durante l&#39;esecuzione di esperimenti che richiedono un cambiamento di temperatura 4. 5. Aspirare via del mezzo in eccesso da ogni pozzetto senza rimuovere le pastiglie stesse. 6. Applicare il coprioggetto alla diapositiva, premendo con decisione e in modo uniforme, ma delicatamente, tutta l&#39;area della diapositiva. Verificare che la polizza di copertura è contro la diapositiva e che la polizza di copertura non viene sollevata sopra il vetrino. Visualizzazione di cellule 1. Molti microscopi a fluorescenza diversi funzionerà bene. E &#39;fondamentale avere un 100X lente immersione in olio. Il laboratorio utilizza Simmons: <ul><li> Olympus BX61 microscopio dotato di 1,45 lente NA TIRFM olio obiettivo 100X ad immersione </li><li> Hamamatsu ORCAR 2 telecamera CCD raffreddata </li><li> Lumen 200 arco in metallo (Prima) fonte di luce. </li><li> Per il rilevamento di GFP (CIC), filtro eccitazione ed emissione 460-500 510-560 </li><li> Per il rilevamento di FM4-64 (TRITC), filtro eccitazione ed emissione 510-560 572-648. </li><li> Le immagini sono state catturate usando SlideBook 4,2 (Figura 1) </li></ul> 2. Portare le cellule a fuoco con luce bianca. 3. Catturare l&#39;immagine con filtri appropriati per ciascun fluoroforo. Rappresentante Risultati Immagini rappresentative sono (Figura 1). GFP focolai devono essere ben definiti, mentre FM4-64 colorazione deve essere brillante e chiaro 4-7. Immagini GFP o membrana possono essere pseudo-colorato con qualsiasi colore, per consentire la massima qualità dell&#39;immagine che sarà presentato senza perdere alcun dato. <img src="/files/ftp_upload/1736/1736fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1: le immagini GFP Rappresentante di B. subtilis proteine ​​di fusione traslazionale. proteine ​​GFP sono mostrati in verde, mentre FM4-64 membrana colorazione è mostrato in rosso. La barra di scala bianca indica 3 micron (A) muts-GFP [rilevanti genotipo: muts - GFP (SPC), amyE:: Pspac mutL (gatto)]. In presenza di 600 mg / ml 2-aminopurine e 1 mM IPTG. FM4-64 segnale non viene presentato per mostrare più chiaramente le foci muts-GFP (B) MutL-GFP [rilevanti genotipo: mutL:: mutL-GFP (SPC)].. In presenza di 2-aminopurine (C) DnaX-GFP [rilevanti genotipo: dnaX:: dnaX-GFP (SPC)]. (D) Reca-GFP [rilevanti genotipo: recA:: recA-GFP (SPC)] in presenza di 20 ng / mL mitomicina C. (E) TagC-GFP [rilevanti genotipo: tagC:: tagC-GFP (SPC) ] in presenza di 1 mg / mL mitomicina C. <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td> Trattamento / concentrazione o importo </td><td> Funzione </td><td> Tempo di incubazione </td></tr><tr><td> Mitomicina C (MMC) [20 e 150 ng / ml] </td><td> DNA agente alchilante </td><td> 1 ora </td></tr><tr><td> 2-aminopurine (2-AP) [600 mg / ml] </td><td> mancata corrispondenza inducendo </td><td> 1 ora </td></tr><tr><td> Idrossiurea (HU) </td><td> esaurisce dNTP </td><td> 3 ore </td></tr><tr><td> luce ultravioletta (UV) 20 J/m2 </td><td> Timina-timina dimeri e 6-4 fotoprodotti </td><td> varia a seconda della fonte, di solito 20 secondi </td></tr><tr><td> grigi (radiazioni ionizzanti) da 5 a 100 Gy </td><td> Rompe doppio filamento, le interruzioni di singolo filamento e siti danno base </td><td> varia a seconda della fonte </td></tr></tbody></table>&quot;&gt; Tabella 1. Sintesi dei trattamenti che danneggiano il DNA e indurre mancata corrispondenza <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti (opzionale) </td></tr><tr><td> Multitest scivolo, 15-oltre </td><td> MP Biomedicals </td><td> 6041505E </td><td></td></tr><tr><td> Microscopio copertura in vetro </td><td> Pescatore </td><td> 12-544-B </td><td></td></tr><tr><td> Agarosio </td><td> Pescatore </td><td> BP160-500 </td><td></td></tr><tr><td> Mitomicina C </td><td> Sigma </td><td> M0503-2MG </td><td> mutageno, indossare guanti </td></tr><tr><td> 2-Aminopurine </td><td> Sigma </td><td> A3509-250mg </td><td> guanti </td></tr><tr><td> Idrossiurea </td><td> Sigma </td><td> H8627-25G </td><td> guanti </td></tr><tr><td> FM4-64 </td><td> Invitrogen </td><td> T13320 </td><td> sensibile alla luce </td></tr></tbody></table> Tabella 2. Lista dei reagenti e attrezzature specifiche:

<ol>
	<li>Hardwood, C. R., Cutting, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Biological Methods for Bacillus. , (1990).</li><li>Berkmen, M. B., Grossman, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+and+temporal+organization+of+the+Bacillus+subtilis+replication+cycle.">Spatial and temporal organization of the Bacillus subtilis replication cycle.</a> Mol. Microbiol. 62, 57-71 (2006).</li><li>Simmons, L. A., Grossman, A. D., Walker, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clp+and+Lon+proteases+occupy+distinct+subcellular+positions+in+Bacillus+subtilis.">Clp and Lon proteases occupy distinct subcellular positions in Bacillus subtilis.</a> J. Bacteriol. 190, 6758-6768 (2008).</li><li>Simmons, L. A., Grossman, A. D., Walker, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+is+required+for+the+RecA+localization+response+to+DNA+damage+in+Bacillus+subtilis.">Replication is required for the RecA localization response to DNA damage in Bacillus subtilis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 104, 1360-1365 (2007).</li><li>Simmons, L. A., Davies, B. W., Grossman, A. D., Walker, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=b+Clamp+Directs+Localization+of+Mismatch+Repair+in+Bacillus+subtilis.">b Clamp Directs Localization of Mismatch Repair in Bacillus subtilis.</a> Mol. Cell. 29, 291-301 (2008).</li><li>Simmons, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+responses+to+double-strand+breaks+between+Escherichia+coli+and+Bacillus+subtilis+reveals+different+requirements+for+SOS+induction.">Comparison of responses to double-strand breaks between Escherichia coli and Bacillus subtilis reveals different requirements for SOS induction.</a> J. Bacteriol. 191, 1152-1161 (2009).</li><li>Smith, B. T., Grossman, A. D., Walker, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+mismatch+repair+in+bacterial+cells.">Visualization of mismatch repair in bacterial cells.</a> Mol. Cell. 8, 1197-1206 (2001).</li></ol>

Tentativi ed errori sono necessari per trovare condizioni di esposizione per immagini di altissima qualità per ogni ceppo, troviamo che 1 millisecondo è appropriato per le immagini a luce bianca, mentre l&#39;esposizione da 100 a 2000 ms sono appropriati per GFP (FITC) e FM4-64 (TRITC ) le immagini. Tempo di esposizione variano a seconda delle apparecchiature di imaging utilizzate. Si consiglia l&#39;uso di un ceppo per 15 pozzetti vetrino da microscopio per il più semplice di imaging, come la qualità pad e la diffu...

Ricette soluzione specifica 1: S7 10x 50 sali 0,5 M MOPS 100 mM di solfato di ammonio 50 mM di potassio fosfato monobasico Filtro sterilizzare, e avvolgere S7 50 supporti in fogli prima di stoccaggio Metalli 100x 0,2 M MgCl 2 70 mM CaCl 2 5 mM MnCl 2 0.1 mM ZnCl 2 100 mg / ml tiamina HCl 2 mM HCl 0.5 mM FeCl 3 * dH 2 O a volume finale * FeCl 3 deve essere aggiunto all&#39;ultimo, per evitare la precipitazione. Dopo la sterilizzazione del filtro, avvolgere 100x soluzione in un foglio di metallo. S7 50 mezzi 1x S7 50 sali 1x metallo 1% di glucosio 0,1% glutammato 40 mcg / mL triptofano 40 mcg / mL Fenilalanina H 2 O distillata a volume finale Spizizens 10x (grammi / L) 151,4 solfato di ammonio mM (20 g / L) 803,8 mM di potassio fosfato monobasico (140 g / L) 440,9 mM di potassio fosfato bibasico (60g / L) 34,0 mM citrato di sodio (10 g / L) 16,6 mM MgSO 4 (2g / L) dH 2 O a volume finale Filtro sterilizzare

imaging mismatch repair and cellular responses to dna damage in bacillus subtilis

Sia procarioti ed eucarioti rispondere a danni al DNA attraverso una complessa serie di cambiamenti fisiologici. Alterazioni nell&#39;espressione genica, la redistribuzione delle proteine ​​esistenti e l&#39;assemblaggio di complessi proteici nuovo può essere stimolata da una varietà di lesioni del DNA e non corrispondenti coppie di basi del DNA. Microscopia a fluorescenza è stato utilizzato come un potente strumento sperimentale per visualizzare e quantificare le risposte a queste ed altre lesioni del DNA e per monitorare lo stato replicazione del DNA all&#39;interno della complessa architettura subcellulare di una cellula vivente. Fusioni traduzionali tra proteine ​​fluorescenti giornalista e componenti della replicazione del DNA e riparazione macchinari sono stati utilizzati per determinare i segnali che l&#39;obiettivo del DNA proteine ​​di riparazione delle lesioni ai loro affini<em&gt; In vivo</em&gt; E per capire come queste proteine ​​sono organizzati all&#39;interno delle cellule batteriche. Inoltre, fusioni trascrizionale e traslazionale legata ai promotori inducibili danni al DNA hanno rivelato che le cellule all&#39;interno di una popolazione hanno attivato le risposte allo stress genotossico. In questa recensione, forniamo un protocollo dettagliato per l&#39;utilizzo di microscopia a fluorescenza per l&#39;immagine del montaggio di riparazione del DNA e complessi di replicazione del DNA in singole cellule batteriche. In particolare, questo lavoro si concentra sulle proteine ​​mancata corrispondenza riparazione di imaging, ricombinazione omologa, replicazione del DNA e un SOS-inducibile proteina<em&gt; Bacillus subtilis</em&gt;. Tutte le procedure descritte qui sono facilmente suscettibili di complessi proteici di imaging in una varietà di specie batteriche.

Watch this Scientific Journal Video about Imaging Mismatch Repair and Cellular Responses to DNA Damage in Bacillus subtilis at JoVE.com

Imaging Mismatch Repair and Cellular Responses to DNA Damage in Bacillus subtilis

Un protocollo dettagliato è descritto per l&#39;imaging in tempo reale la formazione di complessi di riparazione del DNA in<em&gt; Bacillus subtilis</em&gt; Cellule.

Imaging mismatch repair e risposte cellulari al danno del DNA in Bacillus subtilis</em

Both prokaryotes and eukaryotes respond to DNA damage through a complex set of physiological changes. Alterations in gene expression, the redistribution ...

imaging-mismatch-repair-cellular-responses-to-dna-damage-bacillus

Research

JoVE Journal

Biology

Imaging Mismatch Repair and Cellular Responses to DNA Damage in Bacillus subtilis

10.9K Views.  University of Michigan-Ann Arbor. Un protocollo dettagliato è descritto per l'imaging in tempo reale la formazione di complessi di riparazione del DNA in Bacillus subtilis Cellule.

Video: Imaging Mismatch Repair and Cellular Responses to DNA Damage in Bacillus subtilis

Application of Laser Micro-irradiation for Examination of Single and Double Strand Break Repair in Mammalian Cells

Highly coordinated DNA repair pathways exist to detect, excise and replace damaged DNA bases, and coordinate repair of DNA strand breaks. While molecular biology techniques have clarified structure, enzymatic functions, and kinetics of repair proteins, there is still a need to understand how repair is coordinated within the nucleus. Laser micro-irradiation offers a powerful tool for inducing DNA damage and monitoring the recruitment of repair proteins. Induction of DNA damage by laser micro-irradiation can occur with a range of wavelengths, and users can reliably induce single strand breaks, base lesions and double strand breaks with a range of doses. Here, laser micro-irradiation is used to examine repair of single and double strand breaks induced by two common confocal laser wavelengths, 355 nm and 405 nm. Further, proper characterization of the applied laser dose for inducing specific damage mixtures is described, so users can reproducibly perform laser micro-irradiation data acquisition and analysis.

Confocal fluorescence microscopy and laser micro-irradiation offer tools for inducing DNA damage and monitoring the response of DNA repair proteins in selected sub-nuclear areas. This technique has significantly advanced our knowledge of damage detection, signaling, and recruitment. This manuscript demonstrates these technologies to examine single and double strand break repair.

Applicazione di Micro-irradiazione del Laser per l'esame di Single e Double Strand Break Repair in cellule di mammifero

Highly coordinated DNA repair pathways exist to detect, excise and replace damaged DNA bases, and coordinate repair of DNA strand breaks. While molecular ...

Ricerca

Ricerca sul cancro

Laser Microirradiation to Study In Vivo Cellular Responses to Simple and Complex DNA Damage

DNA damage induces specific signaling and repair responses in the cell, which is critical for protection of genome integrity. Laser microirradiation became a valuable experimental tool to investigate the DNA damage response (DDR) in vivo. It allows real-time high-resolution single-cell analysis of macromolecular dynamics in response to laser-induced damage confined to a submicrometer region in the cell nucleus. However, various laser conditions have been used without appreciation of differences in the types of damage induced. As a result, the nature of the damage is often not well characterized or controlled, causing apparent inconsistencies in the recruitment or modification profiles. We demonstrated that different irradiation conditions (i.e., different wavelengths as well as different input powers (irradiances) of a femtosecond (fs) near-infrared (NIR) laser) induced distinct DDR and repair protein assemblies. This reflects the type of DNA damage produced. This protocol describes how titration of laser input power allows induction of different amounts and complexities of DNA damage, which can easily be monitored by detection of base and crosslinking damages, differential poly (ADP-ribose) (PAR) signaling, and pathway-specific repair factor assemblies at damage sites. Once the damage conditions are determined, it is possible to investigate the effects of different damage complexity and differential damage signaling as well as depletion of upstream factor(s) on any factor of interest.

Laser Microirradiation to Study In Vivo Cellular Responses to Simple and Complex DNA Damage

The goal of this protocol is to describe how to use laser microirradiation to induce different types of DNA damage, including relatively simple strand breaks and complex damage, to study DNA damage signaling and repair factor assembly at damage sites in vivo.

Laser Microirradiation per lo Studio In Vivo delle risposte cellulari al danno al DNA semplici e complesse

DNA damage induces specific signaling and repair responses in the cell, which is critical for protection of genome integrity. Laser microirradiation ...

Genetica

Investigation of Protein Recruitment to DNA Lesions Using 405 Nm Laser Micro-irradiation

The DNA Damage Response (DDR) uses a plethora of proteins to detect, signal, and repair DNA lesions. Delineating this response is critical to understand genome maintenance mechanisms. Since recruitment and exchange of proteins at lesions are highly dynamic, their study requires the ability to generate DNA damage in a rapid and spatially-delimited manner. Here, we describe procedures to locally induce DNA damage in human cells using a commonly available laser-scanning confocal microscope equipped with a 405 nm laser line. Accumulation of genome maintenance factors at laser stripes can be assessed by immunofluorescence (IF) or in real-time using proteins tagged with fluorescent reporters. Using phosphorylated histone H2A.X (&#947;-H2A.X) and Replication Protein A (RPA) as markers, the method provides sufficient resolution to discriminate locally-recruited factors from those that spread on adjacent chromatin. We further provide ImageJ-based scripts to efficiently monitor the kinetics of protein relocalization at DNA damage sites. These refinements greatly simplify the study of the DDR dynamics.

Studying DNA damage repair kinetics requires a system to induce lesions at defined sub-nuclear regions. We describe a method to create localized double-stranded breaks using a laser-scanning confocal microscope equipped with a 405 nm laser and provide automated procedures to quantify the dynamics of repair factors at these lesions.

Indagine di assunzione di proteine per lesioni del DNA utilizzando 405 Nm Laser Micro-irradiazione

The DNA Damage Response (DDR) uses a plethora of proteins to detect, signal, and repair DNA lesions. Delineating this response is critical to understand ...

Characterizing DNA Repair Processes at Transient and Long-lasting Double-strand DNA Breaks by Immunofluorescence Microscopy

The repair of double-stranded breaks (DSBs) in DNA is a highly coordinated process, necessitating the formation and resolution of multi-protein repair complexes. This process is regulated by a myriad of proteins that promote the association and disassociation of proteins to these lesions. Thanks in large part to the ability to perform functional screens of a vast library of proteins, there is a greater appreciation of the genes necessary for the double-strand DNA break repair. Often knockout or chemical inhibitor screens identify proteins involved in repair processes by using increased toxicity as a marker for a protein that is required for DSB repair. Although useful for identifying novel cellular proteins involved in maintaining genome fidelity, functional analysis requires the determination of whether the protein of interest promotes localization, formation, or resolution of repair complexes. 
The accumulation of repair proteins can be readily detected as distinct nuclear foci by immunofluorescence microscopy. Thus, association and disassociation of these proteins at sites of DNA damage can be accessed by observing these nuclear foci at representative intervals after the induction of double-strand DNA breaks. This approach can also identify mis-localized repair factor proteins, if repair defects do not simultaneously occur with incomplete delays in repair. In this scenario, long-lasting double-strand DNA breaks can be engineered by expressing a rare cutting endonuclease (e.g., I-SceI) in cells where the recognition site for the said enzyme has been integrated into the cellular genome. The resulting lesion is particularly hard to resolve as faithful repair will reintroduce the enzyme's recognition site, prompting another round of cleavage. As a result, differences in the kinetics of repair are eliminated. If repair complexes are not formed, localization has been impeded. This protocol describes the methodology necessary to identify changes in repair kinetics as well as repair protein localization.

Repair of double-strand DNA breaks is a dynamic process, requiring not only formation of repair complexes at the breaks, but also their resolution after the lesion is addressed. Here, we use immunofluorescence microscopy for transient and long-lasting double-stranded breaks as a tool to dissect this genome maintenance mechanism.

Che caratterizzano i processi di riparazione del DNA alle rotture del DNA transitori e duraturo doppio filo da microscopia di immunofluorescenza

The repair of double-stranded breaks (DSBs) in DNA is a highly coordinated process, necessitating the formation and resolution of multi-protein repair ...

Immunofluorescence Imaging of DNA Damage and Repair Foci in Human Colon Cancer Cells

The purpose of the manuscript is to provide a step-by-step protocol for performing immunofluorescence microscopy to study the radiation-induced DNA damage response induced by neutron-gamma mixed-beam used in boron neutron capture therapy (BNCT). Specifically, the proposed methodology is applied for the detection of repair proteins activation which can be visualized as foci using antibodies specific to DNA double-strand breaks (DNA-DSBs). DNA repair foci were assessed by immunofluorescence in colon cancer cells (HCT-116) after irradiation with the neutron-mixed beam. DNA-DSBs are the most genotoxic lesions and are repaired in mammalian cells by two major pathways: non-homologous end-joining pathway (NHEJ) and homologous recombination repair (HRR). The frequencies of foci, immunochemically stained, for commonly used markers in radiobiology like &#947;-H2AX, 53BP1 are associated with DNA-DSB number and are considered as efficient and sensitive markers for monitoring the induction and repair of DNA-DSBs. It was established that &#947;-H2AX foci attract repair proteins, leading to a higher concentration of repair factors near a DSB. To monitor DNA damage at the cellular level, immunofluorescence analysis for the presence of DNA-PKcs representative repair protein foci from the NHEJ pathway and Rad52 from the HRR pathway was planned. We have developed and introduced a reliable immunofluorescence staining protocol for the detection of radiation-induced DNA damage response with antibodies specific for repair factors from NHEJ and HRR pathways and observed radiation-induced foci (RIF). The proposed methodology can be used for investigating repair protein that is highly activated in the case of neutron-mixed beam radiation, thereby indicating the dominance of the repair pathway.

Radiation-induced DNA damage response activated by neutron mixed-beam used in boron neutron capture therapy (BNCT) has not been fully established. This protocol provides a step-by-step procedure to detect radiation-induced foci (RIF) of repair proteins by immunofluorescence staining in human colon cancer cell lines after irradiation with the neutron-mixed beam.

Immunofluorescenza Immagini di danno al DNA e riparazione Foci nelle cellule tumorali del colon umano

The purpose of the manuscript is to provide a step-by-step protocol for performing immunofluorescence microscopy to study the radiation-induced DNA damage ...

Using Next Generation Sequencing to Identify Mutations Associated with Repair of a CAS9-induced Double Strand Break Near the CD4 Promoter

Double strand breaks (DSBs) in DNA are the most cytotoxic type of DNA damage. Because a myriad of insults can result in these lesions (e.g., replication stress, ionizing radiation, unrepaired UV damage), DSBs occur in most cells each day. In addition to cell death, unrepaired DSBs reduce genome integrity and the resulting mutations can drive tumorigenesis. These risks and the prevalence of DSBs motivate investigations into the mechanisms by which cells repair these lesions. Next generation sequencing can be paired with the induction of DSBs by ionizing radiation to provide a powerful tool to precisely define the mutations associated with DSB repair defects. However, this approach requires computationally challenging and cost prohibitive whole genome sequencing to detect the repair of the randomly occurring DSBs associated with ionizing radiation. Rare cutting endonucleases, such as I-Sce1, provide the ability to generate a single DSB, but their recognition sites must be inserted into the genome of interest. As a result, the site of repair is inherently artificial. Recent advances allow guide RNA (sgRNA) to direct a Cas9 endonuclease to any genome locus of interest. This could be applied to the study of DSB repair making next generation sequencing more cost effective by allowing it to be focused on the DNA flanking the Cas9-induced DSB. The goal of the manuscript is to demonstrate the feasibility of this approach by presenting a protocol that can define mutations that stem from the repair of a DSB upstream of the CD4 gene. The protocol can be adapted to determine changes in the mutagenic potential of DSB associated with exogenous factors, such as repair inhibitors, viral protein expression, mutations, and environmental exposures with relatively limited computation requirements. Once an organism's genome has been sequenced, this method can be theoretically employed at any genomic locus and in any cell culture model of that organism that can be transfected. Similar adaptations of the approach could allow comparisons of repair fidelity between different loci in the same genetic background.

Presented here is sgRNA/CAS9 endonuclease and next-generation sequencing protocol that can be used to identify the mutations associated with double strand break repair near the CD4 promoter.

Utilizzo del sequenziamento di nuova generazione per identificare le mutazioni associate alla riparazione di una rottura a doppio filamento indotta da CAS9 vicino al promotore CD4

Double strand breaks (DSBs) in DNA are the most cytotoxic type of DNA damage. Because a myriad of insults can result in these lesions (e.g., replication ...

Visualization of UV-induced Replication Intermediates in E. coli using Two-dimensional Agarose-gel Analysis

Inaccurate replication in the presence of DNA damage is responsible for the majority of cellular rearrangements and mutagenesis observed in all cell types and is widely believed to be directly associated with the development of cancer in humans. DNA damage, such as that induced by UV irradiation, severely impairs the ability of replication to duplicate the genomic template accurately. A number of gene products have been identified that are required when replication encounters DNA lesions in the template. However, a remaining challenge has been to determine how these proteins process lesions during replication in vivo. Using Escherichia coli as a model system, we describe a procedure in which two-dimensional agarose-gel analysis can be used to identify the structural intermediates that arise on replicating plasmids in vivo following UV-induced DNA damage. This procedure has been used to demonstrate that replication forks blocked by UV-induced damage undergo a transient reversal that is stabilized by RecA and several gene products associated with the RecF pathway. The technique demonstrates that these replication intermediates are maintained until a time that correlates with the removal of the lesions by nucleotide excision repair and replication resumes.

Visualization of UV-induced Replication Intermediates in E. coli using Two-dimensional Agarose-gel Analysis

We present a procedure by which two-dimensional agarose-gel analysis can be used to identify the structure of replication intermediates that occur following UV irradiation.

Visualizzazione dei raggi UV-indotta Intermedi replica in E. coli Utilizzando bidimensionale agarosio-gel Analisi

Inaccurate replication in the presence of DNA damage is responsible for the majority of cellular rearrangements and mutagenesis observed in all cell types ...

Biologia

Visualization of miniSOG Tagged DNA Repair Proteins in Combination with Electron Spectroscopic Imaging (ESI)

The limits to optical resolution and the challenge of identifying specific protein populations in transmission electron microscopy have been obstacles in cell biology. Many phenomena cannot be explained by in vitro analysis in simplified systems and need additional structural information in situ, particularly in the range between 1 nm and 0.1 &#181;m, in order to be fully understood. Here, electron spectroscopic imaging, a transmission electron microscopy technique that allows simultaneous mapping of the distribution of proteins and nucleic acids, and an expression tag, miniSOG, are combined to study the structure and organization of DNA double-strand break repair foci.

Visualization of miniSOG Tagged DNA Repair Proteins in Combination with Electron Spectroscopic Imaging ESI

Electron spectroscopic imaging can image and distinguish nucleic acid from protein at nanometer resolution. It can be combined with the miniSOG system, which is able to specifically label tagged proteins in transmission electron microscopy samples. We illustrate the use of these technologies using double-strand break repair foci as an example.

Visualizzazione di miniSOG Tagged proteine ​​di riparazione del DNA, in combinazione con Electron spettroscopica Imaging (ESI)

The limits to optical resolution and the challenge of identifying specific protein populations in transmission electron microscopy have been obstacles in ...

Visualization of DNA Repair Proteins Interaction by Immunofluorescence

Mammalian cells are constantly exposed to chemicals, radiations, and naturally occurring metabolic by-products, which create specific types of DNA insults. Genotoxic agents can damage the DNA backbone, break it, or modify the chemical nature of individual bases. Following DNA insult, DNA damage response (DDR) pathways are activated and proteins involved in the repair are recruited. A plethora of factors are involved in sensing the type of damage and activating the appropriate repair response. Failure to correctly activate and recruit DDR factors can lead to genomic instability, which underlies many human pathologies including cancer. Studies of DDR proteins can provide insights into genotoxic drug response and cellular mechanisms of drug resistance.
There are two major ways of visualizing&#160;proteins in vivo: direct observation, by tagging the protein of interest with a fluorescent protein and following it by live imaging, or indirect immunofluorescence on fixed samples. While visualization of fluorescently tagged proteins allows precise monitoring over time, direct tagging in N- or C-terminus can interfere with the protein localization or function. Observation of proteins in their unmodified, endogenous version is preferred. When DNA repair proteins are recruited to the DNA insult, their concentration increases locally and they form groups, or &#8220;foci&#8221;, that can be visualized by indirect immunofluorescence using specific antibodies.
Although detection of protein foci does not provide a definitive proof of direct interaction, co-localization of proteins in cells indicates that they regroup to the site of damage and can inform of the sequence of events required for complex formation. Careful analysis of foci spatial overlap in cells expressing wild type or mutant versions of a protein can provide precious clues on functional domains important for DNA repair function. Last, co-localization of proteins indicates possible direct interactions that can be verified by co-immunoprecipitation in cells, or direct pulldown using purified proteins.

Following DNA damage, human cells activate essential repair pathways to restore the integrity of their genome. Here, we describe the method of indirect immunofluorescence as a means to detect DNA repair proteins, analyze their spatial and temporal recruitment, and help interrogate protein-protein interaction at the sites of DNA damage.

Visualizzazione dell'interazione delle proteine di riparazione del DNA per immunofluorescenza

Mammalian cells are constantly exposed to chemicals, radiations, and naturally occurring metabolic by-products, which create specific types of DNA ...

Visualizing and Quantifying Endonuclease-Based Site-Specific DNA Damage

Cells are continuously exposed to various DNA damaging agents, inducing different cellular responses. Applying biochemical and genetic approaches is essential in revealing cellular events associated with the recruitment and assembly of DNA repair complexes at the site of DNA damage. In the last few years, several powerful tools have been developed to induce site-specific DNA damage. Moreover, novel seminal techniques allow us to study these processes at the single-cell resolution level using both fixed and living cells. Although these techniques have been used to study various biological processes, herein we present the most widely used protocols in the field of DNA repair, Fluorescence Immunostaining (IF) and Chromatin Immunoprecipitation (ChIP), which in combination with endonuclease-based site-specific DNA damage make it possible to visualize and quantify the genomic occupancy of DNA repair factors in a directed and regulated fashion, respectively. These techniques provide powerful tools for the researchers to identify novel proteins bound to the damaged genomic locus as well as their post-translational modifications necessary for their fine-tune regulation during DNA repair.

This article introduces essential steps of immunostaining and chromatin immunoprecipitation. These protocols are commonly used to study DNA damage-related cellular processes and to visualize and quantify the recruitment of proteins implicated in DNA repair.

Visualizzazione e quantificazione dei danni al DNA specifici del sito basati sull'endonucleasi

Cells are continuously exposed to various DNA damaging agents, inducing different cellular responses. Applying biochemical and genetic approaches is ...

Imaging mismatch repair e risposte cellulari al danno del DNA in Bacillus subtilis

Riepilogo

Esplora Altri Video

Capitoli in questo video

Applicazione di Micro-irradiazione del Laser per l'esame di Single e Double Strand Break Repair in cellule di mammifero

Laser Microirradiation per lo Studio In Vivo delle risposte cellulari al danno al DNA semplici e complesse

Indagine di assunzione di proteine per lesioni del DNA utilizzando 405 Nm Laser Micro-irradiazione

Che caratterizzano i processi di riparazione del DNA alle rotture del DNA transitori e duraturo doppio filo da microscopia di immunofluorescenza

Immunofluorescenza Immagini di danno al DNA e riparazione Foci nelle cellule tumorali del colon umano

Utilizzo del sequenziamento di nuova generazione per identificare le mutazioni associate alla riparazione di una rottura a doppio filamento indotta da CAS9 vicino al promotore CD4

Visualizzazione dei raggi UV-indotta Intermedi replica in E. coli Utilizzando bidimensionale agarosio-gel Analisi

Visualizzazione di miniSOG Tagged proteine di riparazione del DNA, in combinazione con Electron spettroscopica Imaging (ESI)

Visualizzazione dell'interazione delle proteine di riparazione del DNA per immunofluorescenza

Visualizzazione e quantificazione dei danni al DNA specifici del sito basati sull'endonucleasi

Imaging mismatch repair e risposte cellulari al danno del DNA in Bacillus subtilis

Riepilogo

Esplora Altri Video

Capitoli in questo video

Applicazione di Micro-irradiazione del Laser per l'esame di Single e Double Strand Break Repair in cellule di mammifero

Laser Microirradiation per lo Studio In Vivo delle risposte cellulari al danno al DNA semplici e complesse

Indagine di assunzione di proteine per lesioni del DNA utilizzando 405 Nm Laser Micro-irradiazione

Che caratterizzano i processi di riparazione del DNA alle rotture del DNA transitori e duraturo doppio filo da microscopia di immunofluorescenza

Immunofluorescenza Immagini di danno al DNA e riparazione Foci nelle cellule tumorali del colon umano

Utilizzo del sequenziamento di nuova generazione per identificare le mutazioni associate alla riparazione di una rottura a doppio filamento indotta da CAS9 vicino al promotore CD4

Visualizzazione dei raggi UV-indotta Intermedi replica in E. coli Utilizzando bidimensionale agarosio-gel Analisi

Visualizzazione di miniSOG Tagged proteine ​​di riparazione del DNA, in combinazione con Electron spettroscopica Imaging (ESI)

Visualizzazione dell'interazione delle proteine di riparazione del DNA per immunofluorescenza

Visualizzazione e quantificazione dei danni al DNA specifici del sito basati sull'endonucleasi

Visualizzazione di miniSOG Tagged proteine di riparazione del DNA, in combinazione con Electron spettroscopica Imaging (ESI)