Die Autoren möchten Drs danken. Philine S. Lee und Alan D. Grossman für zunächst Ausbildung LAS in der Fluoreszenzmikroskopie. Die Autoren danken Drs. Melanie Berkmen und Hajime Kobayashi um Hilfe und Tipps für die Bildgebung. Diese Arbeit wurde durch eine Anschubfinanzierung aus dem College of Literature, Science &amp; Arts und vom Department of Molecular, Cellular, und Entwicklungsbiologie an der University of Michigan unterstützt.

Wachsende Kulturen von Zellen für die Mikroskopie 1. Ein oder zwei Tage vor der Bildgebung, bereiten die B. subtilis Stamm, der translationalen Fusionsprotein Sie zu visualisieren. Testversion Runden Schritte 1A und 1B wird notwendig sein, um festzustellen, welche das Wachstum Zustand die besten Bilder Ihres Stammes zur Verfügung stellt. In den meisten Fällen sollten die Zellen während der exponentiellen Wachstumsphase abgebildet werden. <ol class="ualpha"><li> Für einige B. subtilis-Stämme (insbesondere Stämme, die schlecht wachsen, durch die Integration der translationale Fusion zwischen dem Gen von Interesse und GFP in seiner endogenen Locus), anfängliche Wachstum für zwei Tage vor der Bildgebung ist notwendig für qualitativ hochwertige Bilder. Am ersten Tag, Streifen der B. subtilis-Stamm, auf LB-Agar mit selektiven Antibiotikum (s) abgebildet werden beimpft und über Nacht bei 30 ° C. Am zweiten Tag, impfen 100 ul von 0,85% Kochsalzlösung mit einer einzelnen Kolonie, und führen Sie drei 10-fache serielle Verdünnungen auf LB-Agarplatten (mit selektiven Antibiotika), Plattieren 100 ul jeder Verdünnung durch Inkubation über Nacht bei 30 ° C. Am dritten Tag, wählen Sie die Verdünnung Platte mit Licht konfluenten Wachstum der Zellen. Licht konfluenten Wachstum auf einer Platte wird das Nährmedium mit einer gesunden, exponentiell wachsenden Starter Inokulum potenziell ergeben exzellente Bildergebnisse (siehe Schritt 4) liefern. Dieser Schritt ist besonders nützlich für die höchste Qualität Membran-Bildgebung mit der Fleck FM4-64. </li><li> Andere B. subtilis-Stämmen kann einfach auf selektive LB-Agar-Medium für einzelne Kolonien mit einer sterilen Stick am Tag vor der Bildgebung angewendet werden beimpft und über Nacht bei 30 ° C. Am folgenden Tag werden die Zellen auf dieser Platte ausreichend sein, um als Inokulum für die Bildgebung zu verwenden (siehe Schritt 4). HINWEIS: B. subtilis, werden über Nacht Kulturen in flüssigem Medium nicht angemessen auf eine Kombination der Sporenbildung und die Beschlussfähigkeit Antworten, die über einen längeren Zeitraum Lag-Phase Wachstum 1 führen wird. </li></ol> 2. Am Morgen des Imaging, 10 ml S7 50 3.1 Medium in einem 125 ml sterilen Erlenmeyerkolben. 3. Resuspendieren der Zellen in bis zu 2 mL der S7 50 mittelgroßen aus dem LB-Agar-Platte mit einzelnen Kolonien oder das Licht konfluenten Zellen zu einem Inokulum erhalten. 4. Fügen Sie genug S7 50 mittelgroßen Zelle Inokulum auf die Erlenmeyerkolben mit 10 mL S7 50 mittelgroßen für eine Kultur mit einer anfänglichen optischen Dichte bei 600 nm gemessen (OD 600) von ~ 0,08 bis 0,1. Bei diesem Schritt ist es wichtig, mindestens eine 10-fache Luft bis mittlere Verhältnis haben. So verwenden wir 10 bis 12,5 ml beimpft Medium in einem 125 mL Erlenmeyerkolben. 5. Wachsen jeder Kultur bei 30 ° C bis die Kultur eine OD 600 erreicht ~ 0,5-0,8. Schüttelwasserbäder mit Umdrehungen pro Minute 150 bis 200 bevorzugt. Kulturen mit DNA-schädigenden oder mismatch induzierende Mittel herausgefordert sollten in einem frühen exponentiellen Wachstumsphase werden OD 600, so dass die Zellen das Ziel zu erreichen OD 600 mit der zusätzlichen Zeit des Wachstums, die für die Behandlung erforderlich ist (siehe Tabelle 1) Zum Beispiel erfordert 2-Amino einer Stunde Behandlung und damit eine Kultur mit 2-Amino behandelt werden, sollten bei OD 600 ~ 0,3-0,4 werden, so dass die eine Stunde Behandlung / Wachstum führt zu einer OD 600 ~ 0,5-0,8, wobei Zellen sind bereit für die Bildgebung. Probenvorbereitung 1. Pipette 300 pl kultivierten Zellen in ein 1,5 ml Reaktionsgefäß. 2. Wenn Bildgebung von Zell-Membranen gewünscht wird, fügen 1:1000 Verdünnung von FM4-64 Membran-Färbung (Invitrogen) zu jeder Probe aus einer 1 mg / ml Stammlösung. Eine Titration von FM4-64 erforderlich, um die gewünschte Fluoreszenz-Signal zu erzielen. Ein typisches Titration Bereich liegt bei 1:100, 1:1000 und 1:10.000. 3. Lassen Sie die Proben bei Raumtemperatur für bis zu 10 Minuten oder zu sitzen, während die Folie wird mit 1% Agarose in 1X Spizizens Medium hergestellt, wie unten beschrieben (siehe Schritt 1 unter &quot;Präparat&quot;). 4. Wenn die Konzentration der Zellen erforderlich ist, bevorzugen wir Filterung Zellen unter Verwendung eines 0,2 um-Filter mit einer Vakuumapparatur. Die Zellen können dann leicht von der Oberfläche des Filters mit PBS, eine andere geeignete Puffer oder Medium vor Visualisierung gewaschen werden. Slide Vorbereitung 1. Bereiten Sie 1% Agarose mit 1X Spizizens. 5 ml 10X Spizizens Lager bis 45 ml ddH2O zusammen mit 0,5 g Agarose und Mikrowelle zu schmelzen. Hot geschmolzene Agarose ist schwierig, Pipette, und erstarrte Agarose wird nicht in die Pipettenspitze. Die Agarose sollte in einem Wasserbad äquilibriert auf eine Temperatur von ~ 55-65 ° C für sie die Pipettenspitze geben, ohne Verfestigung in der<html> tip. 2. Draw 20 ul Spizizens mit 1% geschmolzener Agarose in die Pipettenspitze. Pipette einen Tropfen (etwa 1-2 ul) der Agarose-Lösung in jede Folie gut (wir benutzen 15-gut gleitet, siehe Tabelle 2) zu seicht Agarose Pads bilden. Die Agarose wird sofort erstarren. Folien müssen auch unmittelbar vor der Applikation der Zellen sein. Wenn die Agarose Pads bei Raumtemperatur allein gelassen werden, können sie innerhalb weniger Minuten austrocknen und unbrauchbar werden. Agarose-Pads sollten zentriert und füllen jedes Loch aber minimale Höhe zu verhindern, dass das Deckglas, wenn Tröpfchen sind zu hoch (bubble-like) oder wenn die Probe breitet sich über die gut Grenze, einfach streichen die auch sauber und mit einer Kimwipe und anwenden neue Agarose-Pad. 3. Übernehmen Sie die gesamte 300 ul Probe (siehe Schritt 6), um die Folie, auf der Oberseite jeder Agarose Pad verteilt. Diese Menge an Zellen sollte ausreichen, um jedes Loch auf der Folie abdecken. 4. Lassen Sie die Folie mit Zellen geladen werden, um bei Raumtemperatur stehen lassen (23 ° C) für etwa 10 Minuten. Dieser Schritt wird für die Zellen auf dem Agarose-Pad zu unbeweglich und bereit für die Bildgebung niederlassen können. Für spezielle Bedürfnisse dieser Temperatur müssen möglicherweise geändert werden, zum Beispiel werden bei der Durchführung von Experimenten, die einen Temperatur-Shift 4 erfordern. 5. Absaugen entfernt das überschüssige Medium aus jeder Vertiefung, ohne die Pads selber. 6. Wenden Sie das Deckglas auf die Folie, Pressen fest und gleichmäßig, aber vorsichtig, über den Bereich der Folie. Vergewissern Sie sich, dass das Deckglas vor dem Schlitten und dass das Deckglas ist nicht über die Folie angehoben wird. Visualisierung von Zellen 1. Viele verschiedene Fluoreszenz-Mikroskopen wird gut funktionieren. Es ist wichtig, zu einem 100X Ölimmersion haben. Die Simmons Lab verwendet: <ul><li> Olympus BX61 Mikroskop mit 1,45 NA TIRFM 100X Ölimmersionsobjektiv Objektiv ausgestattet </li><li> Hamamatsu ORCAR 2 CCD gekühlte Kamera </li><li> Lumen 200 Bogen Metall (Vor-) Lichtquelle. </li><li> Für die Detektion von GFP (FITC), Filter Anregung 460-500 und 510-560 Emission </li><li> Für den Nachweis von FM4-64 (TRITC), Filter Anregung 510-560 und 572-648 Emission. </li><li> Die Bilder wurden aufgenommen mit SlideBook 4,2 (Abbildung 1) </li></ul> 2. Bringen Sie die Zellen in den Fokus mit weißem Licht. 3. Nehmen Sie das Bild mit Hilfe geeigneter Filter für jedes Fluorophor. Repräsentative Ergebnisse Repräsentative Bilder angezeigt werden (Abbildung 1). GFP Brennpunkte sollte gut definiert, während FM4-64-Färbung sollte hell und klar, 4-7. GFP oder Membran Bilder können pseudo-farbig mit einer beliebigen Farbe, um die höchste Bildqualität, ohne dass Daten verloren gehen vorgestellt werden können. <img src="/files/ftp_upload/1736/1736fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1: Repräsentative GFP Bilder von B. subtilis translationale Fusionsproteine. GFP-Proteine ​​sind in grün dargestellt, während FM4-64 Membranfärbung in rot dargestellt wird. Der weiße Maßstab zeigt 3 mu m (A) MutS-GFP [relevant Genotyp: mutS - gfp (SPC), amyE: Pspac mutL (cat)]. In Gegenwart von 600 ug / mL 2-Amino-und 1 mM IPTG. FM4-64-Signal wird nicht dargestellt, um deutlicher zu zeigen, die MutS-GFP Brennpunkte (B) MutL-GFP [relevant Genotyp: mutL: mutL-GFP (SPC)].. In Gegenwart von 2-Amino (C) DnaX-GFP [relevant Genotyp: DnaX: DnaX-GFP (SPC)]. (D) RecA-GFP [relevant Genotyp: recA:: recA-GFP (SPC)] in Gegenwart von 20 ng / mL Mitomycin C (E) tagC-GFP [relevant Genotyp: tagC: tagC-GFP (SPC) ] in Gegenwart von 1 pg / mL Mitomycin C. <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td> Treatment / Konzentration oder Menge </td><td> Funktion </td><td> Die Zeit der Inkubation </td></tr><tr><td> Mitomycin C (MMC) [20 bis 150 ng / mL] </td><td> DNA Alkylierungsmittel </td><td> 1 Stunde </td></tr><tr><td> 2-Amino (2-AP) [600 ug / mL] </td><td> Missverhältnis zu induzieren </td><td> 1 Stunde </td></tr><tr><td> Hydroxyurea (HU) </td><td> erschöpft dNTPs </td><td> 3 Stunden </td></tr><tr><td> ultraviolettem Licht (UV) 20 J/m2 </td><td> Thymin-Thymin-Dimeren und 6-4 Photoprodukte </td><td> variiert je nach Quelle, in der Regel 20 Sekunden </td></tr><tr><td> Grau (ionisierende Strahlung) von 5 bis 100 Gy </td><td> Doppelstrangbrüche, Einzel-Strangbrüchen und Grundschaden Websites </td><td> variiert je nach Quelle </td></tr></tbody></table>&quot;&gt; Tabelle 1. Zusammenfassung von DNA-schädigenden und Mismatch induzierenden Behandlungen <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare (optional) </td></tr><tr><td> Multitest Rutsche, 15-gut </td><td> MP Biomedicals </td><td> 6041505E </td><td></td></tr><tr><td> Mikroskop Deckglas </td><td> Fischer </td><td> 12 bis 544-B </td><td></td></tr><tr><td> Agarose </td><td> Fischer </td><td> BP160-500 </td><td></td></tr><tr><td> Mitomycin C </td><td> Sigma </td><td> M0503-2MG </td><td> mutagen, Handschuhe tragen </td></tr><tr><td> 2-Amino </td><td> Sigma </td><td> A3509-250MG </td><td> Handschuhe </td></tr><tr><td> Hydroxyurea </td><td> Sigma </td><td> H8627-25G </td><td> Handschuhe </td></tr><tr><td> FM4-64 </td><td> Invitrogen </td><td> T13320 </td><td> lichtempfindlich </td></tr></tbody></table> Tabelle 2. Liste der spezifischen Reagenzien und Geräte:

<ol>
	<li>Hardwood, C. R., Cutting, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Biological Methods for Bacillus. , (1990).</li><li>Berkmen, M. B., Grossman, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+and+temporal+organization+of+the+Bacillus+subtilis+replication+cycle.">Spatial and temporal organization of the Bacillus subtilis replication cycle.</a> Mol. Microbiol. 62, 57-71 (2006).</li><li>Simmons, L. A., Grossman, A. D., Walker, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clp+and+Lon+proteases+occupy+distinct+subcellular+positions+in+Bacillus+subtilis.">Clp and Lon proteases occupy distinct subcellular positions in Bacillus subtilis.</a> J. Bacteriol. 190, 6758-6768 (2008).</li><li>Simmons, L. A., Grossman, A. D., Walker, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+is+required+for+the+RecA+localization+response+to+DNA+damage+in+Bacillus+subtilis.">Replication is required for the RecA localization response to DNA damage in Bacillus subtilis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 104, 1360-1365 (2007).</li><li>Simmons, L. A., Davies, B. W., Grossman, A. D., Walker, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=b+Clamp+Directs+Localization+of+Mismatch+Repair+in+Bacillus+subtilis.">b Clamp Directs Localization of Mismatch Repair in Bacillus subtilis.</a> Mol. Cell. 29, 291-301 (2008).</li><li>Simmons, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+responses+to+double-strand+breaks+between+Escherichia+coli+and+Bacillus+subtilis+reveals+different+requirements+for+SOS+induction.">Comparison of responses to double-strand breaks between Escherichia coli and Bacillus subtilis reveals different requirements for SOS induction.</a> J. Bacteriol. 191, 1152-1161 (2009).</li><li>Smith, B. T., Grossman, A. D., Walker, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+mismatch+repair+in+bacterial+cells.">Visualization of mismatch repair in bacterial cells.</a> Mol. Cell. 8, 1197-1206 (2001).</li></ol>

Versuch und Irrtum sind erforderlich, um die Exposition Bedingungen für die Bilder von höchster Qualität für jeden Stamm zu finden, finden wir, dass 1 Millisekunde geeignet für weißes Licht Bilder, während die Exposition von 100 bis 2000 ms für GFP (FITC) und FM4-64 geeignet sind (TRITC ) Bilder. Belichtungszeit hängt von der Imaging-Geräte verwendet. Wir empfehlen die Verwendung eines Stammes pro 15-well Objektträger für die einfachsten Bildgebung, wie pad Qualität und Verbreitung von Zellen aus dem Pad Gr...

Spezielle Lösung Rezepte 1: 10x S7 50 Salze 0,5 M MOPS 100 mM Ammoniumsulfat 50 mM Kaliumphosphat Einbasisches Filter sterilisieren, und wickeln S7 50 Medien in der Folie vor der Lagerung 100x Metals 0,2 M MgCl 2 70 mM CaCl 2 5 mM MnCl 2 0,1 mM ZnCl 2 100 ug / ml Thiamin HCl 2 mM HCl 0,5 mM FeCl 3 * dH 2 O auf Endvolumen * FeCl 3 dauern sollte hinzugefügt werden, um Niederschlag zu verhindern. Nach Sterilfiltration, wickeln 100x Metall-Lösung in Folie. S7 50 Medien 1x S7 50 Salze 1x Metall 1% Glucose 0,1% Glutamat 40 ug / mL Tryptophan 40 ug / mL Phenylalanin destilliertem H 2 O auf Endvolumen 10x Spizizens (g / L) 151,4 mM Ammoniumsulfat (20 g / L) 803,8 mM Kaliumphosphat Einbasisches (140g / L) 440,9 mM Kaliumphosphat dibasisch (60g / L) 34,0 mm Natriumcitrat (10g / L) 16,6 mM MgSO 4 (2g / l) dH 2 O auf Endvolumen Filter sterilisieren

imaging mismatch repair and cellular responses to dna damage in bacillus subtilis

Prokaryoten und Eukaryoten zu DNA-Schäden reagieren, durch eine komplexe Reihe von physiologischen Veränderungen. Veränderungen der Genexpression, die Umverteilung der vorhandenen Proteine ​​und die Montage neuer Protein-Komplexe können durch eine Vielzahl von DNA-Schäden und nicht übereinstimmende DNA-Basenpaare stimuliert werden. Fluoreszenzmikroskopie ist als leistungsfähiges experimentelles Werkzeug zur Visualisierung und Quantifizierung von diesen und anderen Reaktionen auf DNA-Schäden und DNA-Replikation Status innerhalb der komplexen subzellulären Architektur einer lebenden Zelle zu überwachen verwendet worden. Translational Fusionen zwischen fluoreszierenden Reporter-Proteinen und Komponenten der DNA-Replikation und Reparatur Maschinen wurden verwendet, um die Signale zu bestimmen, die auf DNA-Reparatur-Proteine ​​an ihre spezifischen Läsionen<em&gt; In vivo</em&gt; Und zu verstehen, wie diese Proteine ​​in bakteriellen Zellen organisiert sind. Darüber hinaus haben der Transkription und Translation Fusionen im Zusammenhang mit DNA-Schäden Promotoren zeigten die Zellen innerhalb einer Population haben genotoxischen Stress-Reaktionen aktiviert. In diesem Beitrag stellen wir ein detailliertes Protokoll für die Verwendung von Fluoreszenz-Mikroskopie zur Abbildung der Montage der DNA-Reparatur und DNA-Replikation Komplexe in einzelnen Bakterienzellen. Insbesondere konzentriert sich diese Arbeit auf die Bildgebung Mismatch-Reparatur-Proteine, die homologe Rekombination, DNA-Replikation und eine SOS-induzierbare Protein in<em&gt; Bacillus subtilis</em&gt;. Alle hier beschriebenen Verfahren leicht zugänglich sind für die Bildgebung Protein-Komplexe in einer Vielzahl von Bakterienarten.

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Imaging Mismatch Repair and Cellular Responses to DNA Damage in Bacillus subtilis

Ein detailliertes Protokoll ist für die Darstellung der Echtzeit Bildung von DNA-Reparatur-Komplexe beschrieben<em&gt; Bacillus subtilis</em&gt; Zellen.

Imaging Mismatch Reparatur und zellulären Reaktionen auf DNA-Schäden in Bacillus subtilis</em

Both prokaryotes and eukaryotes respond to DNA damage through a complex set of physiological changes. Alterations in gene expression, the redistribution ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Imaging Mismatch Repair and Cellular Responses to DNA Damage in Bacillus subtilis

10.9K Aufrufe.  University of Michigan-Ann Arbor. Ein detailliertes Protokoll ist für die Darstellung der Echtzeit Bildung von DNA-Reparatur-Komplexe beschrieben Bacillus subtilis Zellen.

Serie: Imaging Mismatch Repair and Cellular Responses to DNA Damage in Bacillus subtilis

Application of Laser Micro-irradiation for Examination of Single and Double Strand Break Repair in Mammalian Cells

Highly coordinated DNA repair pathways exist to detect, excise and replace damaged DNA bases, and coordinate repair of DNA strand breaks. While molecular biology techniques have clarified structure, enzymatic functions, and kinetics of repair proteins, there is still a need to understand how repair is coordinated within the nucleus. Laser micro-irradiation offers a powerful tool for inducing DNA damage and monitoring the recruitment of repair proteins. Induction of DNA damage by laser micro-irradiation can occur with a range of wavelengths, and users can reliably induce single strand breaks, base lesions and double strand breaks with a range of doses. Here, laser micro-irradiation is used to examine repair of single and double strand breaks induced by two common confocal laser wavelengths, 355 nm and 405 nm. Further, proper characterization of the applied laser dose for inducing specific damage mixtures is described, so users can reproducibly perform laser micro-irradiation data acquisition and analysis.

Confocal fluorescence microscopy and laser micro-irradiation offer tools for inducing DNA damage and monitoring the response of DNA repair proteins in selected sub-nuclear areas. This technique has significantly advanced our knowledge of damage detection, signaling, and recruitment. This manuscript demonstrates these technologies to examine single and double strand break repair.

Anwendung von Mikro-Laserbestrahlung zur Prüfung von einzelnen und doppelt Strand Break Repair in Säugerzellen

Highly coordinated DNA repair pathways exist to detect, excise and replace damaged DNA bases, and coordinate repair of DNA strand breaks. While molecular ...

Forschung

Krebsforschung

Laser Microirradiation to Study In Vivo Cellular Responses to Simple and Complex DNA Damage

DNA damage induces specific signaling and repair responses in the cell, which is critical for protection of genome integrity. Laser microirradiation became a valuable experimental tool to investigate the DNA damage response (DDR) in vivo. It allows real-time high-resolution single-cell analysis of macromolecular dynamics in response to laser-induced damage confined to a submicrometer region in the cell nucleus. However, various laser conditions have been used without appreciation of differences in the types of damage induced. As a result, the nature of the damage is often not well characterized or controlled, causing apparent inconsistencies in the recruitment or modification profiles. We demonstrated that different irradiation conditions (i.e., different wavelengths as well as different input powers (irradiances) of a femtosecond (fs) near-infrared (NIR) laser) induced distinct DDR and repair protein assemblies. This reflects the type of DNA damage produced. This protocol describes how titration of laser input power allows induction of different amounts and complexities of DNA damage, which can easily be monitored by detection of base and crosslinking damages, differential poly (ADP-ribose) (PAR) signaling, and pathway-specific repair factor assemblies at damage sites. Once the damage conditions are determined, it is possible to investigate the effects of different damage complexity and differential damage signaling as well as depletion of upstream factor(s) on any factor of interest.

Laser Microirradiation to Study In Vivo Cellular Responses to Simple and Complex DNA Damage

The goal of this protocol is to describe how to use laser microirradiation to induce different types of DNA damage, including relatively simple strand breaks and complex damage, to study DNA damage signaling and repair factor assembly at damage sites in vivo.

Laser Microirradiation In Vivo zellulären Reaktionen auf einfache und komplexe DNA-Schäden zu studieren

DNA damage induces specific signaling and repair responses in the cell, which is critical for protection of genome integrity. Laser microirradiation ...

Genetik

Investigation of Protein Recruitment to DNA Lesions Using 405 Nm Laser Micro-irradiation

The DNA Damage Response (DDR) uses a plethora of proteins to detect, signal, and repair DNA lesions. Delineating this response is critical to understand genome maintenance mechanisms. Since recruitment and exchange of proteins at lesions are highly dynamic, their study requires the ability to generate DNA damage in a rapid and spatially-delimited manner. Here, we describe procedures to locally induce DNA damage in human cells using a commonly available laser-scanning confocal microscope equipped with a 405 nm laser line. Accumulation of genome maintenance factors at laser stripes can be assessed by immunofluorescence (IF) or in real-time using proteins tagged with fluorescent reporters. Using phosphorylated histone H2A.X (&#947;-H2A.X) and Replication Protein A (RPA) as markers, the method provides sufficient resolution to discriminate locally-recruited factors from those that spread on adjacent chromatin. We further provide ImageJ-based scripts to efficiently monitor the kinetics of protein relocalization at DNA damage sites. These refinements greatly simplify the study of the DDR dynamics.

Studying DNA damage repair kinetics requires a system to induce lesions at defined sub-nuclear regions. We describe a method to create localized double-stranded breaks using a laser-scanning confocal microscope equipped with a 405 nm laser and provide automated procedures to quantify the dynamics of repair factors at these lesions.

Untersuchung von Protein-Rekrutierung, DNA-Läsionen mit 405 Nm Micro-Laserbestrahlung

The DNA Damage Response (DDR) uses a plethora of proteins to detect, signal, and repair DNA lesions. Delineating this response is critical to understand ...

Characterizing DNA Repair Processes at Transient and Long-lasting Double-strand DNA Breaks by Immunofluorescence Microscopy

The repair of double-stranded breaks (DSBs) in DNA is a highly coordinated process, necessitating the formation and resolution of multi-protein repair complexes. This process is regulated by a myriad of proteins that promote the association and disassociation of proteins to these lesions. Thanks in large part to the ability to perform functional screens of a vast library of proteins, there is a greater appreciation of the genes necessary for the double-strand DNA break repair. Often knockout or chemical inhibitor screens identify proteins involved in repair processes by using increased toxicity as a marker for a protein that is required for DSB repair. Although useful for identifying novel cellular proteins involved in maintaining genome fidelity, functional analysis requires the determination of whether the protein of interest promotes localization, formation, or resolution of repair complexes. 
The accumulation of repair proteins can be readily detected as distinct nuclear foci by immunofluorescence microscopy. Thus, association and disassociation of these proteins at sites of DNA damage can be accessed by observing these nuclear foci at representative intervals after the induction of double-strand DNA breaks. This approach can also identify mis-localized repair factor proteins, if repair defects do not simultaneously occur with incomplete delays in repair. In this scenario, long-lasting double-strand DNA breaks can be engineered by expressing a rare cutting endonuclease (e.g., I-SceI) in cells where the recognition site for the said enzyme has been integrated into the cellular genome. The resulting lesion is particularly hard to resolve as faithful repair will reintroduce the enzyme's recognition site, prompting another round of cleavage. As a result, differences in the kinetics of repair are eliminated. If repair complexes are not formed, localization has been impeded. This protocol describes the methodology necessary to identify changes in repair kinetics as well as repair protein localization.

Repair of double-strand DNA breaks is a dynamic process, requiring not only formation of repair complexes at the breaks, but also their resolution after the lesion is addressed. Here, we use immunofluorescence microscopy for transient and long-lasting double-stranded breaks as a tool to dissect this genome maintenance mechanism.

Charakterisierung von DNA-Reparaturprozesse bei Transienten und langlebige Doppel-Strang DNA-Brüchen durch Immunfluoreszenz-Mikroskopie

The repair of double-stranded breaks (DSBs) in DNA is a highly coordinated process, necessitating the formation and resolution of multi-protein repair ...

Immunofluorescence Imaging of DNA Damage and Repair Foci in Human Colon Cancer Cells

The purpose of the manuscript is to provide a step-by-step protocol for performing immunofluorescence microscopy to study the radiation-induced DNA damage response induced by neutron-gamma mixed-beam used in boron neutron capture therapy (BNCT). Specifically, the proposed methodology is applied for the detection of repair proteins activation which can be visualized as foci using antibodies specific to DNA double-strand breaks (DNA-DSBs). DNA repair foci were assessed by immunofluorescence in colon cancer cells (HCT-116) after irradiation with the neutron-mixed beam. DNA-DSBs are the most genotoxic lesions and are repaired in mammalian cells by two major pathways: non-homologous end-joining pathway (NHEJ) and homologous recombination repair (HRR). The frequencies of foci, immunochemically stained, for commonly used markers in radiobiology like &#947;-H2AX, 53BP1 are associated with DNA-DSB number and are considered as efficient and sensitive markers for monitoring the induction and repair of DNA-DSBs. It was established that &#947;-H2AX foci attract repair proteins, leading to a higher concentration of repair factors near a DSB. To monitor DNA damage at the cellular level, immunofluorescence analysis for the presence of DNA-PKcs representative repair protein foci from the NHEJ pathway and Rad52 from the HRR pathway was planned. We have developed and introduced a reliable immunofluorescence staining protocol for the detection of radiation-induced DNA damage response with antibodies specific for repair factors from NHEJ and HRR pathways and observed radiation-induced foci (RIF). The proposed methodology can be used for investigating repair protein that is highly activated in the case of neutron-mixed beam radiation, thereby indicating the dominance of the repair pathway.

Radiation-induced DNA damage response activated by neutron mixed-beam used in boron neutron capture therapy (BNCT) has not been fully established. This protocol provides a step-by-step procedure to detect radiation-induced foci (RIF) of repair proteins by immunofluorescence staining in human colon cancer cell lines after irradiation with the neutron-mixed beam.

Immunfluoreszenz Bildgebung von DNA-Schäden und Reparatur-Fozien in menschlichen Darmkrebszellen

The purpose of the manuscript is to provide a step-by-step protocol for performing immunofluorescence microscopy to study the radiation-induced DNA damage ...

Using Next Generation Sequencing to Identify Mutations Associated with Repair of a CAS9-induced Double Strand Break Near the CD4 Promoter

Double strand breaks (DSBs) in DNA are the most cytotoxic type of DNA damage. Because a myriad of insults can result in these lesions (e.g., replication stress, ionizing radiation, unrepaired UV damage), DSBs occur in most cells each day. In addition to cell death, unrepaired DSBs reduce genome integrity and the resulting mutations can drive tumorigenesis. These risks and the prevalence of DSBs motivate investigations into the mechanisms by which cells repair these lesions. Next generation sequencing can be paired with the induction of DSBs by ionizing radiation to provide a powerful tool to precisely define the mutations associated with DSB repair defects. However, this approach requires computationally challenging and cost prohibitive whole genome sequencing to detect the repair of the randomly occurring DSBs associated with ionizing radiation. Rare cutting endonucleases, such as I-Sce1, provide the ability to generate a single DSB, but their recognition sites must be inserted into the genome of interest. As a result, the site of repair is inherently artificial. Recent advances allow guide RNA (sgRNA) to direct a Cas9 endonuclease to any genome locus of interest. This could be applied to the study of DSB repair making next generation sequencing more cost effective by allowing it to be focused on the DNA flanking the Cas9-induced DSB. The goal of the manuscript is to demonstrate the feasibility of this approach by presenting a protocol that can define mutations that stem from the repair of a DSB upstream of the CD4 gene. The protocol can be adapted to determine changes in the mutagenic potential of DSB associated with exogenous factors, such as repair inhibitors, viral protein expression, mutations, and environmental exposures with relatively limited computation requirements. Once an organism's genome has been sequenced, this method can be theoretically employed at any genomic locus and in any cell culture model of that organism that can be transfected. Similar adaptations of the approach could allow comparisons of repair fidelity between different loci in the same genetic background.

Presented here is sgRNA/CAS9 endonuclease and next-generation sequencing protocol that can be used to identify the mutations associated with double strand break repair near the CD4 promoter.

Verwendung der Next-Generation-Sequenzierung zur Identifizierung von Mutationen, die mit der Reparatur eines CAS9-induzierten Doppelstrangbruchs in der Nähe des CD4-Promotors verbunden sind

Double strand breaks (DSBs) in DNA are the most cytotoxic type of DNA damage. Because a myriad of insults can result in these lesions (e.g., replication ...

Visualization of UV-induced Replication Intermediates in E. coli using Two-dimensional Agarose-gel Analysis

Inaccurate replication in the presence of DNA damage is responsible for the majority of cellular rearrangements and mutagenesis observed in all cell types and is widely believed to be directly associated with the development of cancer in humans. DNA damage, such as that induced by UV irradiation, severely impairs the ability of replication to duplicate the genomic template accurately. A number of gene products have been identified that are required when replication encounters DNA lesions in the template. However, a remaining challenge has been to determine how these proteins process lesions during replication in vivo. Using Escherichia coli as a model system, we describe a procedure in which two-dimensional agarose-gel analysis can be used to identify the structural intermediates that arise on replicating plasmids in vivo following UV-induced DNA damage. This procedure has been used to demonstrate that replication forks blocked by UV-induced damage undergo a transient reversal that is stabilized by RecA and several gene products associated with the RecF pathway. The technique demonstrates that these replication intermediates are maintained until a time that correlates with the removal of the lesions by nucleotide excision repair and replication resumes.

Visualization of UV-induced Replication Intermediates in E. coli using Two-dimensional Agarose-gel Analysis

We present a procedure by which two-dimensional agarose-gel analysis can be used to identify the structure of replication intermediates that occur following UV irradiation.

Visualisierung der UV-induzierten Replikation Zwischenprodukte in E. coli Mit Hilfe von zweidimensionalen Agarose-Gel-Analyse

Inaccurate replication in the presence of DNA damage is responsible for the majority of cellular rearrangements and mutagenesis observed in all cell types ...

Biologie

Visualization of miniSOG Tagged DNA Repair Proteins in Combination with Electron Spectroscopic Imaging (ESI)

The limits to optical resolution and the challenge of identifying specific protein populations in transmission electron microscopy have been obstacles in cell biology. Many phenomena cannot be explained by in vitro analysis in simplified systems and need additional structural information in situ, particularly in the range between 1 nm and 0.1 &#181;m, in order to be fully understood. Here, electron spectroscopic imaging, a transmission electron microscopy technique that allows simultaneous mapping of the distribution of proteins and nucleic acids, and an expression tag, miniSOG, are combined to study the structure and organization of DNA double-strand break repair foci.

Visualization of miniSOG Tagged DNA Repair Proteins in Combination with Electron Spectroscopic Imaging ESI

Electron spectroscopic imaging can image and distinguish nucleic acid from protein at nanometer resolution. It can be combined with the miniSOG system, which is able to specifically label tagged proteins in transmission electron microscopy samples. We illustrate the use of these technologies using double-strand break repair foci as an example.

Visualisierung von miniSOG Tagged DNA Reparaturproteine ​​in Kombination mit Electron spektroskopischen Bildgebung (ESI)

The limits to optical resolution and the challenge of identifying specific protein populations in transmission electron microscopy have been obstacles in ...

Visualization of DNA Repair Proteins Interaction by Immunofluorescence

Mammalian cells are constantly exposed to chemicals, radiations, and naturally occurring metabolic by-products, which create specific types of DNA insults. Genotoxic agents can damage the DNA backbone, break it, or modify the chemical nature of individual bases. Following DNA insult, DNA damage response (DDR) pathways are activated and proteins involved in the repair are recruited. A plethora of factors are involved in sensing the type of damage and activating the appropriate repair response. Failure to correctly activate and recruit DDR factors can lead to genomic instability, which underlies many human pathologies including cancer. Studies of DDR proteins can provide insights into genotoxic drug response and cellular mechanisms of drug resistance.
There are two major ways of visualizing&#160;proteins in vivo: direct observation, by tagging the protein of interest with a fluorescent protein and following it by live imaging, or indirect immunofluorescence on fixed samples. While visualization of fluorescently tagged proteins allows precise monitoring over time, direct tagging in N- or C-terminus can interfere with the protein localization or function. Observation of proteins in their unmodified, endogenous version is preferred. When DNA repair proteins are recruited to the DNA insult, their concentration increases locally and they form groups, or &#8220;foci&#8221;, that can be visualized by indirect immunofluorescence using specific antibodies.
Although detection of protein foci does not provide a definitive proof of direct interaction, co-localization of proteins in cells indicates that they regroup to the site of damage and can inform of the sequence of events required for complex formation. Careful analysis of foci spatial overlap in cells expressing wild type or mutant versions of a protein can provide precious clues on functional domains important for DNA repair function. Last, co-localization of proteins indicates possible direct interactions that can be verified by co-immunoprecipitation in cells, or direct pulldown using purified proteins.

Following DNA damage, human cells activate essential repair pathways to restore the integrity of their genome. Here, we describe the method of indirect immunofluorescence as a means to detect DNA repair proteins, analyze their spatial and temporal recruitment, and help interrogate protein-protein interaction at the sites of DNA damage.

Visualisierung der DNA-Reparaturproteine Interaktion durch Immunfluoreszenz

Mammalian cells are constantly exposed to chemicals, radiations, and naturally occurring metabolic by-products, which create specific types of DNA ...

Visualizing and Quantifying Endonuclease-Based Site-Specific DNA Damage

Cells are continuously exposed to various DNA damaging agents, inducing different cellular responses. Applying biochemical and genetic approaches is essential in revealing cellular events associated with the recruitment and assembly of DNA repair complexes at the site of DNA damage. In the last few years, several powerful tools have been developed to induce site-specific DNA damage. Moreover, novel seminal techniques allow us to study these processes at the single-cell resolution level using both fixed and living cells. Although these techniques have been used to study various biological processes, herein we present the most widely used protocols in the field of DNA repair, Fluorescence Immunostaining (IF) and Chromatin Immunoprecipitation (ChIP), which in combination with endonuclease-based site-specific DNA damage make it possible to visualize and quantify the genomic occupancy of DNA repair factors in a directed and regulated fashion, respectively. These techniques provide powerful tools for the researchers to identify novel proteins bound to the damaged genomic locus as well as their post-translational modifications necessary for their fine-tune regulation during DNA repair.

This article introduces essential steps of immunostaining and chromatin immunoprecipitation. These protocols are commonly used to study DNA damage-related cellular processes and to visualize and quantify the recruitment of proteins implicated in DNA repair.

Visualisierung und Quantifizierung endonukleasebasierter ortsspezifischer DNA-Schäden

Cells are continuously exposed to various DNA damaging agents, inducing different cellular responses. Applying biochemical and genetic approaches is ...

Imaging Mismatch Reparatur und zellulären Reaktionen auf DNA-Schäden in Bacillus subtilis

Zusammenfassung

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Kapitel in diesem Video

Anwendung von Mikro-Laserbestrahlung zur Prüfung von einzelnen und doppelt Strand Break Repair in Säugerzellen

Laser Microirradiation In Vivo zellulären Reaktionen auf einfache und komplexe DNA-Schäden zu studieren

Untersuchung von Protein-Rekrutierung, DNA-Läsionen mit 405 Nm Micro-Laserbestrahlung

Charakterisierung von DNA-Reparaturprozesse bei Transienten und langlebige Doppel-Strang DNA-Brüchen durch Immunfluoreszenz-Mikroskopie

Immunfluoreszenz Bildgebung von DNA-Schäden und Reparatur-Fozien in menschlichen Darmkrebszellen

Verwendung der Next-Generation-Sequenzierung zur Identifizierung von Mutationen, die mit der Reparatur eines CAS9-induzierten Doppelstrangbruchs in der Nähe des CD4-Promotors verbunden sind

Visualisierung der UV-induzierten Replikation Zwischenprodukte in E. coli Mit Hilfe von zweidimensionalen Agarose-Gel-Analyse

Visualisierung von miniSOG Tagged DNA Reparaturproteine in Kombination mit Electron spektroskopischen Bildgebung (ESI)

Visualisierung der DNA-Reparaturproteine Interaktion durch Immunfluoreszenz

Visualisierung und Quantifizierung endonukleasebasierter ortsspezifischer DNA-Schäden

Imaging Mismatch Reparatur und zellulären Reaktionen auf DNA-Schäden in Bacillus subtilis

Zusammenfassung

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Anwendung von Mikro-Laserbestrahlung zur Prüfung von einzelnen und doppelt Strand Break Repair in Säugerzellen

Laser Microirradiation In Vivo zellulären Reaktionen auf einfache und komplexe DNA-Schäden zu studieren

Untersuchung von Protein-Rekrutierung, DNA-Läsionen mit 405 Nm Micro-Laserbestrahlung

Charakterisierung von DNA-Reparaturprozesse bei Transienten und langlebige Doppel-Strang DNA-Brüchen durch Immunfluoreszenz-Mikroskopie

Immunfluoreszenz Bildgebung von DNA-Schäden und Reparatur-Fozien in menschlichen Darmkrebszellen

Verwendung der Next-Generation-Sequenzierung zur Identifizierung von Mutationen, die mit der Reparatur eines CAS9-induzierten Doppelstrangbruchs in der Nähe des CD4-Promotors verbunden sind

Visualisierung der UV-induzierten Replikation Zwischenprodukte in E. coli Mit Hilfe von zweidimensionalen Agarose-Gel-Analyse

Visualisierung von miniSOG Tagged DNA Reparaturproteine ​​in Kombination mit Electron spektroskopischen Bildgebung (ESI)

Visualisierung der DNA-Reparaturproteine Interaktion durch Immunfluoreszenz

Visualisierung und Quantifizierung endonukleasebasierter ortsspezifischer DNA-Schäden

Visualisierung von miniSOG Tagged DNA Reparaturproteine in Kombination mit Electron spektroskopischen Bildgebung (ESI)