Anyaporn Sawasdichai ו Nazefah עבדול חמיד מודים לממשלת רויאל תאילנדי ממשלת מלזיה בהתאמה Ph.D. מלגות. עבודה זו מומנה על ידי קרן Wellcome הפרויקט להעניק הוענק PSJ ו KG. אנחנו גם מודה לאוניברסיטת מתקן bioimaging וולפסון בריסטול.

I. הכנה חלוקה סעיף זה מתאר את ההכנה של פולי-L-ליזין coverslips מיקרוסקופ מצופה את הקובץ המצורף של תאים לפני חלוקה. אם יש צורך בתאים ניתן transfected transiently עם וקטורים ביטוי חלבון לפני או אחרי המצורף. א הכנת poly-L-ליזין coverslips מצופה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון של 1mg/ml poly-L-ליזין במים מזוקקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעיל coverslips נקי עם פולי-L-ליזין ידי דוגרים להם בפתרון לפחות שעה 1 על פלטפורמה מתנדנדת על 22 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את coverslips מצופה מים מזוקקים סטריליים פעמיים ובצע עם לשטוף יחיד עם אתנול 96%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> האוויר היבש coverslips מצופה על פיסת נייר לסנן ולשמור אותם במיכל יבש לשימוש עתידי (יבש פעם אחת הם יכולים להערם). </li></ol> B. תאים צירוף coverslips Non-חסיד תאים (כאן אנו משתמשים בתאי K562) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים coverslip poly-L-ליזין מצופה בבאר בצלחת 6-היטב עם משטח מצופה פונה כלפי מעלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> K562 Seed תאים בצפיפות של 7x10 5 תאים / היטב השתנה Dulbecco של הנשרים בינוני (DMEM) בתוספת 10% בסרום שור העובר (FBS), ו - PS (פניצילין 100units/ml, 100mg/ml סטרפטומיצין). במקרה של K562 תאים transfection חולף יכול להתבצע באמצעות electroporation (0.4cm cuvettes electroporation עם 1x10 7 תאים 200μl של התקשורת על 250V / 975μF) לפני זריעת התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה התאים למשך 24 שעות על 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים מעל בינוני לשטוף את התאים פעמיים עם פוספט קרים שנאגרו מלוחים (PBS). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פעל עם פרוטוקול חלוקה subcellular. </li></ol> תאים חסיד (כאן אנו משתמשים קוס-7 תאים) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הצב coverslip ציפוי בבאר בצלחת 6 באר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף פעמיים PBS prewarmed על 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוק התאים על ידי עיכול עם טריפסין (0.03% EDTA, טריפסין 0.25%) ב-PBS על 37 מעלות צלזיוס למשך 2 עד 5 דקות. חשוב לא להפריז לעכל את התאים כדי לעצור את העיכול בהקדם תאים בודדים צפים בעיקר נוכחים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עצור את מערכת העיכול על ידי זריעת התאים בצפיפות של 3x10 5 תאים / היטב צלחת 6-באר DMEM בתוספת 10% FBS ו PSG (פניצילין 100 יחידות / מ&quot;ל, סטרפטומיצין 100ug/ml ו-L-גלוטמין 292ug/ml) , על coverslips נורמלי. התאים בדרך כלל חסיד לצרף גם על coverslips מיקרוסקופ רגיל, לעומת זאת, פולי-L-ליזין coverslips מצופה ניתן להשתמש לפי הצורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה התאים למשך 24 שעות ב 37 ° C ו 5% CO 2. במקרה של קוס-7 תאים transfection חולף יכול להתבצע באמצעות Fugene 6 (Roche), אם נדרש התאים שמאל להתאושש במשך 24 שעות נוספות על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים מעל בינוני לשטוף את התאים פעמיים עם קרח קר PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פעל עם פרוטוקול חלוקה subcellular. </li></ol> השנייה. Subcellular חלוקה בשבריר באתרו נעשה על פי סכימטי שמוצג באיור 1 והיא מבוססת על שיטה שתואר לעיל 5 עם שינויים שתואר לעיל 7 ו בפרוטוקול כמפורט להלן. מומלץ להעביר את coverslips לצלחת 6-היטב טרי הבאים כל צעד חלוקה הסרת coverslip לפני הסרת נוזל. אמנם רק ארבע coverslips נדרשים עבור הדמיה, coverslips נוספים נדרשים כדי לייצר תמצית התא כולו שברים מטריצה ​​גרעינית המערבי סופג אם זה להתבצע במקביל. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן ולסנן cytoskeleton חיץ (CSK): צינורות 10mm, סוכרוז 300 מ&quot;מ, 100 מ&quot;מ NaCl, 3mm MgCl 2, 1mm EGTA. חיץ CSK צריכים להיות מוכנים טרי ביום החלוקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם יש צורך בתאים מ coverslip אחד יכול לשמש כדי להכין תמצית התא כולו המערבי סופג בעדינות על ידי הצבת TES 200ul חיץ (1% SDS, EDTA 2 מ&quot;מ, 20 מ&quot;מ טריס-HCl pH 7.4) ישירות על גבי coverslip ו דוגרים על 1 או 2 דקות בשעה 22 ° C. תמצית התא כולו לאחר מכן ניתן להסיר את החלבונים זירז ידי הוספת 250ul של 1M (NH 4) 2 SO 4 ו דוגרים על הקרח עד דגימות מערביות אחרות מוכנים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את coverslips הנותרים עם 1ml קרים PBS פעמיים ב 22 ° C על ידי הטיית 6 היטב צלחת פעמיים או שלוש פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את coverslip המייצג תאים שלמים ולהעביר לצלחת 6-גם טרי. פעל עם קיבוע התא חיסונית הקרינה פרוטוקול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות להסיר את PBS מבארות הנותרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חלץ את החלבונים גרעיני cytoplasmic והחזיק בעדינות רופף על ידי הצבת חיץ CSK 200ul + 0.1% (V / V) טריטון X-100 ישירות על גבי coverslip כל שאר דוגרים עלקרח למשך דקה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את תמצית גרעיני cytoplasmic והחזיק ברפיון לזרז כמתואר בשלב 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את coverslips עם 1ml קרים PBS פעמיים ב 22 ° C על ידי הטיית 6 היטב צלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את coverslip המייצגים חומר גרעיני בחוזקה ופעל עם קיבוע התא חיסונית הקרינה פרוטוקול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות להסיר את PBS מבארות הנותרים ואז לחלץ את החלבונים בעדינות החזיקו בחוזקה על ידי הצבת חיץ CSK 200ul + 0.5% (V / V) טריטון X-100 ישירות על גבי coverslip כל שאר דוגרים על קרח במשך 20 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את תמצית החזיקה בחוזקה לזרז כמתואר בשלב 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את coverslips עם 1ml קרים PBS פעמיים ב 22 ° C על ידי הטיית 6 היטב צלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את coverslip המייצג חלק הכרומטין ופעל עם קיבוע התא חיסונית הקרינה פרוטוקול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות להסיר את PBS מבארות הנותרים אז 200ul מקום CSK חיץ + 100ug/ml של DNase אני אל coverslips הנותרים דגירה במשך 30 דקות על 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את תמצית הכרומטין לזרז כמתואר בשלב 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את coverslips עם קרח קר PBS פעמיים ב 22 ° C על ידי הטיית 6 היטב צלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את coverslip המייצג את חלק מטריצה ​​גרעיני ופעל עם קיבוע התא חיסונית הקרינה פרוטוקול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם יש צורך חלבונים המטריצה ​​ניתן להסיר coverslip מטריצה ​​נוספת המערבי סופג באמצעות TES חיץ 200ul כמתואר בשלב 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דוגמאות עבור כתם המערבי צריך להיות centrifuged בסל&quot;ד 13000 ב microcentrifuge ספסל העליון על 4 מעלות צלזיוס, את כדורי resuspended ב 40ul SDS טוען חיץ (62.5mM טריס-HCl pH 6.8, SDS 2% (w / v), 50 מ&quot;מ DTT, גליצרול 10%, 0.01% bromophenol כחול (w / v)) לפני הניתוח על ידי-SDS. <img src="/files/ftp_upload/1958/1958fig1.jpg" alt="איור 1" /> באיור 1. ייצוג סכמטי של חלוקה ב subcellular באתרה. Cytoskeleton חיץ (CSK) מורכב צינורות 10mm, סוכרוז 300 מ&quot;מ, 100 מ&quot;מ NaCl, 3mm MgCl 2, 1mm EGTA. TES המאגר מורכב של 1% SDS, EDTA 2 מ&quot;מ, 20 מ&quot;מ טריס-HCl pH 7.4. </li></ol> ג. תא קיבעון ו חיסונית פלואורסצנטי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות להוסיף 1ml של פורמלדהיד 4% / PBS כדי coverslip כל דגירה על 4 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף כל coverslip בעדינות 2-3 פעמים עם 1ml של PBS על 22 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 400ul של X-100/PBS טריטון 0.1% ל coverslip כל לדגור על 22 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף כל coverslip בעדינות 2-3 פעמים עם 1ml של PBS על 22 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 400ul של 3% שור סרום אלבומין (BSA) / PBS ו לדגור על 22 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות כדי להפחית מכתים רקע פוטנציאליים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף כל coverslip בעדינות 2-3 פעמים עם 1ml של PBS על 22 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המקום 100ul של הנוגדן העיקרי PBS ישירות על גבי coverslip ו דגירה על 22 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. נוגדנים ראשוניים ומשניים צריך להיות מדולל PBS לריכוז הנדרש. זה אולי צריך להיות מותאם עבור נוגדן כל שימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף כל coverslip בעדינות 2-3 פעמים עם 1ml של PBS על 22 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המקום 200ul של נוגדנים משני PBS ו לדגור על 22 ° C מן האור למשך שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף כל coverslip בעדינות 2-3 פעמים עם 1ml של PBS על 22 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר כל coverslip (תאים למטה) על גבי זכוכית נושאת מיקרוסקופ באמצעות מדיום Vectashield הרכבה המכיל DAPI (4 &#39;,6-diamidino-2-phenylindole hydrochloride). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נגב בינוני הרכבה עודף מרחבי coverslip בעזרת מגבת נייר דגירה את השקופית על 22 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות לפחות מן האור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן את coverslip לשקופית באמצעות זכוכית ללטש ברור מסמר אקרילי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור את השקופיות מן האור לפני להדמיה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. </li></ol> IV. נציג תוצאות <img src="/files/ftp_upload/1958/1958fig2.jpg" alt="איור 2" /> איור 2. חלוקה subcellular הלא transfected COS-7 תאים. מופרדים קוס-7 תאים תוקנו עם פורמאלדהיד immunostained באמצעות α-טובולין, α-היסטון H1 או α-lamin A / C נוגדנים מצומדות כדי TRITC ואחריו טיפול בינוני הרכבה המכיל DAPI . תמונות שנרכשו עם עדשה עינית 10x ו 63x עדשה אובייקטיבי באמצעות מיקרוסקופ confocal לייקה. גרעין התא היו דמיינו באמצעות מערכת סינון DAPI בעוד התאים אותו שדה מוכתם נוגדנים סמן היו דמיינו באמצעות מערכת סינון TRITC. <img src="/files/ftp_upload/1958/1958fig3.jpg" alt="איור 3" /> איור 3. חלבון ה-GFP-6E2 היתוך קשורה המטריצה ​​גרעיני. Subcellular חלוקה של קוס-7 תאים לבטא חלבון איחוי המכיל חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) התמזגו וירוס הפפילומה האנושי (HPV) סוג 6E2 חלבון (GFP-6E2). גרעין התא היו דמיינו באמצעות מכתים DAPI בעוד לוקליזציה של ה-GFP-6E2 בתאי transfected היה דמיינו ישירות דרך ה-GFP פלואורסצנטי. Lamin / C היה דמיינו באמצעות α-lamin A / C נוגדנים מצומדות כדי TRITC ומערכת סינון TRITC. התמונות למזג לגלות כי חלק של חלבון ה-GFP-6E2 קשורה המטריצה ​​גרעיני (הפאנל הימנית התחתונה). תמונות התקבלו כמתואר באיור 2.

<ol>
	<li>Donaldson, M. M., Boner, W., Morgan, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TopBP1+regulates+human+papillomavirus+type+16+E2+interaction+with+chromatin.">TopBP1 regulates human papillomavirus type 16 E2 interaction with chromatin.</a> J Virol. 81, 4338-4342 (2007).</li><li>Javed, A., Guo, B., Hiebert, S., Choi, J. Y., Green, J., Zhao, S. C., Osborne, M. A., Stifani, S., Stein, J. L., Lian, J. B., van Wijnen, A. J., Stein, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Groucho/TLE/R-esp+proteins+associate+with+the+nuclear+matrix+and+repress+RUNX+(CBF(alpha)/AML/PEBP2(alpha))+dependent+activation+of+tissue-specific+gene+transcription.">Groucho/TLE/R-esp proteins associate with the nuclear matrix and repress RUNX (CBF(alpha)/AML/PEBP2(alpha)) dependent activation of tissue-specific gene transcription.</a> J Cell Sci. 113, 2221-2231 (2000).</li><li>Kowalczyk, A. M., Roeder, G. E., Green, K., Stephens, D. J., Gaston, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+the+induction+or+inhibition+of+apoptosis+by+HPV+proteins.">Measuring the induction or inhibition of apoptosis by HPV proteins.</a> Methods Mol. Med. 119, 419-432 (2005).</li><li>McLarren, K. W., Theriault, F. M., Stifani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+with+the+nuclear+matrix+and+interaction+with+Groucho+and+RUNX+proteins+regulate+the+transcription+repression+activity+of+the+basic+helix+loop+helix+factor+Hes1.">Association with the nuclear matrix and interaction with Groucho and RUNX proteins regulate the transcription repression activity of the basic helix loop helix factor Hes1.</a> J Biol. Chem. 276, 1578-1584 (2001).</li><li>McNeil, S., Guo, B., Stein, J. L., Lian, J. B., Bushmeyer, S., Seto, E., Atchison, M. L., Penman, S., van Wijnen, A. J., Stein, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+of+the+YY1+transcription+factor+to+the+nucleolus+and+the+nuclear+matrix+in+situ:+the+C-terminus+is+a+principal+determinant+for+nuclear+trafficking.">Targeting of the YY1 transcription factor to the nucleolus and the nuclear matrix in situ: the C-terminus is a principal determinant for nuclear trafficking.</a> J Cell Biochem. 68, 500-510 (1998).</li><li>Melan, M. A., Sluder, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redistribution+and+differential+extraction+of+soluble+proteins+in+permeabilized+cultured+cells.+Implications+for+immunofluorescence+microscopy.">Redistribution and differential extraction of soluble proteins in permeabilized cultured cells. Implications for immunofluorescence microscopy.</a> J Cell Sci. 101, 731-743 (1992).</li><li>Zou, N., Lin, B. Y., Duan, F., Lee, K. Y., Jin, G., Guan, R., Yao, G., Lefkowitz, E. J., Broker, T. R., Chow, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hinge+of+the+human+papillomavirus+type+11+E2+protein+contains+major+determinants+for+nuclear+localization+and+nuclear+matrix+association.">The hinge of the human papillomavirus type 11 E2 protein contains major determinants for nuclear localization and nuclear matrix association.</a> J. Virol. 74, 3761-3770 (2000).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

בעיות נפוצות והצעות: כל או רוב התאים הם איבדו במהלך הכביסה. במהלך השלבים כביסה נוזלים יש להוסיף באיטיות לצד צלחת 6-היטב את הימנעות coverslip. כמו כן נוזלים יש להסיר על ידי הטיית הצלחת בזהירות ולאט לאט pipetting את הנוזלים העודפים. הידבקות התא...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>BSA</td>
<td>Chemical</td>
<td>Sigma</td>
<td>A9647-100G</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DNase I</td>
<td>Chemical</td>
<td>Sigma</td>
<td>DN25-1G</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>poly-L-Lysine</td>
<td>Chemical</td>
<td>Sigma</td>
<td>P-8920</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Trypsin</td>
<td>Chemical</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>EGTA</td>
<td>Chemical</td>
<td>Sigma</td>
<td>E4378-25G </td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fomaldehyde</td>
<td>Chemical</td>
<td>BDH</td>
<td>284216N</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PIPES</td>
<td>Chemical</td>
<td>Sigma</td>
<td>P-6757</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sucrose</td>
<td>Chemical</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>S/8600/53</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Triton X-100</td>
<td>Chemical</td>
<td>Sigma</td>
<td>T-6876</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Mounting Medium with DAPI</td>
<td>Chemical</td>
<td>Vector Laboratories</td>
<td>H-1200</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fugene 6 Transfection Reagent</td>
<td>Chemical</td>
<td>Roche </td>
<td>11814443001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Histone H1</td>
<td>Antibodies</td>
<td>Santa Cruz</td>
<td>SC-8030</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Lamin A/C</td>
<td>Antibodies</td>
<td>Santa Cruz</td>
<td>SC-20681</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tubulin-&alpha;</td>
<td>Antibodies</td>
<td>Santa Cruz</td>
<td>SC-32293</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

in situ subcellular fractionation of adherent and non-adherent mammalian cells

תפקוד החלבון מצמידים הדוק לוקליזציה חלבון. למרות שחלק חלבונים מוגבלים במיקום מסוים או תא subcellular, חלבונים רבים נמצאים כאוכלוסייה לשדר באופן חופשי בתמורה חופשי עם האוכלוסייה משנה הקשור באופן הדוק עם תחום מבנה subcellular מסוים. חלוקה ב subcellular באתרו מאפשרת ויזואליזציה של חלבון מידור יכול גם לגלות חלבון תת אוכלוסיות למקם מבנים ספציפיים. למשל, הסרת חלבונים מסיסים cytoplasmic וחלבונים גרעיני שנערך רופף יכול לחשוף את הקשר היציב של כמה גורמי שעתוק עם הכרומטין. לאחר העיכול של דנ&quot;א יכולה במקרים מסוימים לחשוף בשיתוף עם רשת של חלבונים RNAs אשר נקרא קולקטיבי הפיגום גרעיני או מטריצה ​​גרעיני. כאן אנו מתארים את השלבים הנדרשים במהלך של חלוקה באתרו של בתאי יונקים חסיד ולא חסיד על coverslips מיקרוסקופ. ויזואליזציה חלבון יכולה להיות מושגת באמצעות נוגדנים ספציפיים או חלבונים היתוך ניאון מיקרוסקופ פלואורסצנטי. נוגדנים ו / או צבעי ניאון כי לשמש סמנים של תאים או מבנים ספציפיים לאפשר לוקליזציה חלבון למפות בפירוט. חלוקה ב באתרו ניתן גם לשלב עם המערבי סופג להשוות את כמויות החלבון הנמצאים בכל חלק. גישה זו ביוכימי פשוט יכול לחשוף עמותות שאחרת להישאר מבלי שיבחינו בו.

Watch this Scientific Journal Video about In situ Subcellular Fractionation of Adherent and Non-adherent Mammalian Cells at JoVE.com

In situ Subcellular Fractionation of Adherent and Non-adherent Mammalian Cells

ב חלוקה subcellular באתרו של בתאי יונקים על coverslips מיקרוסקופ מאפשר הדמיה של לוקליזציה חלבון.

ב ההיפוך חלוקה subcellular באתרו של בתאי יונקים חסיד שאינן חסיד

Protein function is intimately coupled to protein localization. Although some proteins are restricted to a specific location or subcellular compartment, ...

in-situ-subcellular-fractionation-adherent-non-adherent-mammalian

Research

JoVE Journal

Biology

In situ Subcellular Fractionation of Adherent and Non-adherent Mammalian Cells

15.6K Views.  University of Bristol. ב חלוקה subcellular באתרו של בתאי יונקים על coverslips מיקרוסקופ מאפשר הדמיה של לוקליזציה חלבון.

Video: In situ Subcellular Fractionation of Adherent and Non-adherent Mammalian Cells

Trypsinizing and Subculturing Mammalian Cells

As cells reach confluency, they must be subcultured or passaged. Failure to subculture confluent cells results in reduced mitotic index and eventually in cell death. The first step in subculturing is to detach cells from the surface of the primary culture vessel by trypsinization or mechanical means. The resultant cell suspension is then subdivided, or reseeded, into fresh cultures. Secondary cultures are checked for growth and fed periodically, and may be subsequently subcultured to produce tertiary cultures. The time between passaging of cells varies with the cell line and depends on the growth rate.

As cells reach confluency, they must be subcultured or passaged. This video will demonstrate a procedure for subculturing both adherent and suspension cells.

Trypsinizing ו Subculturing בתאי יונקים

As cells reach confluency, they must be subcultured or passaged. Failure to subculture confluent cells results in reduced mitotic index and eventually in ...

MISSION esiRNA for RNAi Screening in Mammalian Cells

RNA interference (RNAi) is a basic cellular mechanism for the control of gene expression. RNAi is induced by short double-stranded RNAs also known as small interfering RNAs (siRNAs). The short double-stranded RNAs originate from longer double stranded precursors by the activity of Dicer, a protein of the RNase III family of endonucleases. The resulting fragments are components of the RNA-induced silencing complex (RISC), directing it to the cognate target mRNA. RISC cleaves the target mRNA thereby reducing the expression of the encoded protein1,2,3. RNAi has become a powerful and widely used experimental method for loss of gene function studies in mammalian cells utilizing small interfering RNAs.
Currently two main methods are available for the production of small interfering RNAs. One method involves chemical synthesis, whereas an alternative method employs endonucleolytic cleavage of target specific long double-stranded RNAs by RNase III in vitro. Thereby, a diverse pool of siRNA-like oligonucleotides is produced which is also known as endoribonuclease-prepared siRNA or esiRNA. A comparison of efficacy of chemically derived siRNAs and esiRNAs shows that both triggers are potent in target-gene silencing. Differences can, however, be seen when comparing specificity. Many single chemically synthesized siRNAs produce prominent off-target effects, whereas the complex mixture inherent in esiRNAs leads to a more specific knockdown10.
In this study, we present the design of genome-scale MISSION esiRNA libraries and its utilization for RNAi screening exemplified by a DNA-content screen for the identification of genes involved in cell cycle progression. We show how to optimize the transfection protocol and the assay for screening in high throughput. We also demonstrate how large data-sets can be evaluated statistically and present methods to validate primary hits. Finally, we give potential starting points for further functional characterizations of validated hits.

Here we use a human esiRNA library in a high-throughput screen for genes involved in cell division. We demonstrate how to set up and conduct an esiRNA screens, as well as how to analyze and validate the results.

המשימה esiRNA עבור הקרנת RNAi בתאי יונקים

RNA interference (RNAi) is a basic cellular mechanism for the control of gene expression. RNAi is induced by short double-stranded RNAs also known as ...

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying potassium (referred to as GIRK) channels, which are important for regulating the excitability of neurons. There are four different mammalian GIRK channel subunits (GIRK1-GIRK4) - we focus on GIRK2 because it forms a homotetramer. Stimulation of different types of G protein-coupled receptors (GPCRs), such as the muscarinic receptor (M2R), leads to activation of GIRK channels. Alcohol also directly activates GIRK channels. We will show how to mutate one amino acid by specifically changing one or more nucleotides in the cDNA for the GIRK channel. This mutated cDNA sequence will be amplified in bacteria, purified, and the presence of the point mutation will be confirmed by DNA sequencing. The cDNAs for the mutated and wild-type GIRK channels will be transfected into human embryonic kidney HEK293T cells cultured in vitro. Lastly, whole-cell patch-clamp electrophysiology will be used to study the macroscopic potassium currents through the ectopically expressed wild-type or mutated GIRK channels. In this experiment, we will examine the effect of a L257W mutation in GIRK2 channels on M2R-dependent and alcohol-dependent activation.

We will demonstrate how to study the effect of a single point mutation on the function of an ion channel.

Mutagenesis וניתוח פונקציונלי של תעלות יונים הביעו Heterologously בתאי יונקים

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

Clonogenic Assay: Adherent Cells

The clonogenic (or colony forming) assay has been established for more than 50 years; the original paper describing the technique was published in 19561. Apart from documenting the method, the initial landmark study generated the first radiation-dose response curve for X-ray irradiated mammalian (HeLa) cells in culture1. Basically, the clonogenic assay enables an assessment of the differences in reproductive viability (capacity of cells to produce progeny; i.e. a single cell to form a colony of 50 or more cells) between control untreated cells and cells that have undergone various treatments such as exposure to ionising radiation, various chemical compounds (e.g. cytotoxic agents) or in other cases genetic manipulation. The assay has become the most widely accepted technique in radiation biology and has been widely used for evaluating the radiation sensitivity of different cell lines. Further, the clonogenic assay is commonly used for monitoring the efficacy of radiation modifying compounds and for determining the effects of cytotoxic agents and other anti-cancer therapeutics on colony forming ability, in different cell lines. A typical clonogenic survival experiment using adherent cells lines involves three distinct components, 1) treatment of the cell monolayer in tissue culture flasks, 2) preparation of single cell suspensions and plating an appropriate number of cells in petri dishes and 3) fixing and staining colonies following a relevant incubation period, which could range from 1-3 weeks, depending on the cell line. Here we demonstrate the general procedure for performing the clonogenic assay with adherent cell lines with the use of an immortalized human keratinocyte cell line (FEP-1811)2. Also, our aims are to describe common features of clonogenic assays including calculation of the plating efficiency and survival fractions after exposure of cells to radiation, and to exemplify modification of radiation-response with the use of a natural antioxidant formulation.

The applicability of the clonogenic assay for evaluating reproductive viability has been established for more than 50 years. Here we demonstrate the general procedure for performing the clonogenic assay with adherent cells.

Assay Clonogenic: תאים חסיד

The clonogenic (or colony forming) assay has been established for more than 50 years; the original paper describing the technique was published in 19561. ...

Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of cell proliferation underlies the pathology of diseases like cancer. As such there is great need to be able to investigate cell proliferation and quantitate the proportion of cells in each phase of the cell cycle. It is also of vital importance to indistinguishably identify cells that are replicating their DNA within a larger population. Since a cell&prime;s decision to proliferate is made in the G1 phase immediately before initiating DNA synthesis and progressing through the rest of the cell cycle, detection of DNA synthesis at this stage allows for an unambiguous determination of the status of growth regulation in cell culture experiments.
DNA content in cells can be readily quantitated by flow cytometry of cells stained with propidium iodide, a fluorescent DNA intercalating dye. Similarly, active DNA synthesis can be quantitated by culturing cells in the presence of radioactive thymidine, harvesting the cells, and measuring the incorporation of radioactivity into an acid insoluble fraction. We have considerable expertise with cell cycle analysis and recommend a different approach. We Investigate cell proliferation using bromodeoxyuridine/fluorodeoxyuridine (abbreviated simply as BrdU) staining that detects the incorporation of these thymine analogs into recently synthesized DNA. Labeling and staining cells with BrdU, combined with total DNA staining by propidium iodide and analysis by flow cytometry1 offers the most accurate measure of cells in the various stages of the cell cycle. It is our preferred method because it combines the detection of active DNA synthesis, through antibody based staining of BrdU, with total DNA content from propidium iodide. This allows for the clear separation of cells in G1 from early S phase, or late S phase from G2/M. Furthermore, this approach can be utilized to investigate the effects of many different cell stimuli and pharmacologic agents on the regulation of progression through these different cell cycle phases.
In this report we describe methods for labeling and staining cultured cells, as well as their analysis by flow cytometry. We also include experimental examples of how this method can be used to measure the effects of growth inhibiting signals from cytokines such as TGF-&beta;1, and proliferative inhibitors such as the cyclin dependent kinase inhibitor, p27KIP1. We also include an alternate protocol that allows for the analysis of cell cycle position in a sub-population of cells within a larger culture5. In this case, we demonstrate how to detect a cell cycle arrest in cells transfected with the retinoblastoma gene even when greatly outnumbered by untransfected cells in the same culture. These examples illustrate the many ways that DNA staining and flow cytometry can be utilized and adapted to investigate fundamental questions of mammalian cell cycle control.

Determining the cell cycle position of a population of cells, or understanding how signals affect proliferation, can be readily measured by flow cytometry using this protocol. We report a simple experimental approach to staining cells and quantifying their position in the cell cycle.

ניתוח של עמדת מחזור התא בתאי יונקים

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of ...

Polysome Fractionation and Analysis of Mammalian Translatomes on a Genome-wide Scale

mRNA translation plays a central role in the regulation of gene expression and represents the most energy consuming process in mammalian cells. Accordingly, dysregulation of mRNA translation is considered to play a major role in a variety of pathological states including cancer. Ribosomes also host chaperones, which facilitate folding of nascent polypeptides, thereby modulating function and stability of newly synthesized polypeptides. In addition, emerging data indicate that ribosomes serve as a platform for a repertoire of signaling molecules, which are implicated in a variety of post-translational modifications of newly synthesized polypeptides as they emerge from the ribosome, and/or components of translational machinery. Herein, a well-established method of ribosome fractionation using sucrose density gradient centrifugation is described. In conjunction with the in-house developed &#8220;anota&#8221; algorithm this method allows direct determination of differential translation of individual mRNAs on a genome-wide scale. Moreover, this versatile protocol can be used for a variety of biochemical studies aiming to dissect the function of ribosome-associated protein complexes, including those that play a central role in folding and degradation of newly synthesized polypeptides.

Ribosomes play a central role in protein synthesis. Polyribosome (polysome) fractionation by sucrose density gradient centrifugation allows direct determination of translation efficiencies of individual mRNAs on a genome-wide scale. In addition, this method can be used for biochemical analysis of ribosome- and polysome-associated factors such as chaperones and signaling molecules.

Polysome היפוך חלוק וניתוח של יונקי Translatomes בקנה מידת הגנום

mRNA translation plays a central role in the regulation of gene expression and represents the most energy consuming process in mammalian cells. ...

Measurement of Heme Synthesis Levels in Mammalian Cells

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in various molecular and cellular processes such as gene transcription, translation, cell differentiation and cell proliferation. The biosynthesis levels of heme vary across different tissues and cell types and is altered in diseased conditions such as anemia, neuropathy and cancer. This technique uses [4-14C] 5-aminolevulinic acid ([14C] 5-ALA), one of the early precursors in the heme biosynthesis pathway to measure the levels of heme synthesis in mammalian cells. This assay involves incubation of cells with [14C] 5-ALA followed by extraction of heme and measurement of the radioactivity incorporated into heme. This procedure is accurate and quick. This method measures the relative levels of heme biosynthesis rather than the total heme content. To demonstrate the use of this technique the levels of heme biosynthesis were measured in several mammalian cell lines.

Altered intracellular heme levels are associated with common diseases such as cancer. Thus, there is a need to measure heme biosynthesis levels in diverse cells. The goal of this protocol is to provide a fast and sensitive method to measure and compare the levels of heme synthesis in different cells.

מדידה של רמות הרן סינתזה בתאי יונקים

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in ...

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Cytosolic Ca2+ ions regulate numerous aspects of cellular activity in almost all cell types, controlling processes as wide-ranging as gene transcription, electrical excitability and cell proliferation. The diversity and specificity of Ca2+ signaling derives from mechanisms by which Ca2+ signals are generated to act over different time and spatial scales, ranging from cell-wide oscillations and waves occurring over the periods of minutes to local transient Ca2+ microdomains (Ca2+ puffs) lasting milliseconds. Recent advances in electron multiplied CCD (EMCCD) cameras now allow for imaging of local Ca2+ signals with a 128 x 128 pixel spatial resolution at rates of &#62;500 frames sec-1 (fps). This approach is highly parallel and enables the simultaneous monitoring of hundreds of channels or puff sites in a single experiment. However, the vast amounts of data generated (ca. 1 Gb per min) render visual identification and analysis of local Ca2+ events impracticable. Here we describe and demonstrate the procedures for the acquisition, detection, and analysis of local IP3-mediated Ca2+ signals in intact mammalian cells loaded with Ca2+ indicators using both wide-field epi-fluorescence (WF) and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. Furthermore, we describe an algorithm developed within the open-source software environment Python that automates the identification and analysis of these local Ca2+ signals. The algorithm localizes sites of Ca2+ release with sub-pixel resolution; allows user review of data; and outputs time sequences of fluorescence ratio signals together with amplitude and kinetic data in an Excel-compatible table.

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Here we present techniques for imaging local IP3-mediated Ca2+ events using fluorescence microscopy in intact mammalian cells loaded with Ca2+ indicators together with an algorithm that automates identification and analysis of these events.

ההדמיה המקומית Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; אותות בתאי יונקים בתרבית

Cytosolic Ca2+ ions regulate numerous aspects of cellular activity in almost all cell types, controlling processes as wide-ranging as gene transcription, ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex signaling mechanisms underlying filopodial initiation, elongation and subsequent stabilization or retraction, it is crucial to determine the spatio-temporal protein activity in these dynamic structures. To analyze protein function in filopodia, we recently developed a semi-automated tracking algorithm that adapts to filopodial shape-changes, thus allowing parallel analysis of protrusion dynamics and relative protein concentration along the whole filopodial length. Here, we present a detailed step-by-step protocol for optimized cell handling, image acquisition and software analysis. We further provide instructions for the use of optional features during image analysis and data representation, as well as troubleshooting guidelines for all critical steps along the way. Finally, we also include a comparison of the described image analysis software with other programs available for filopodia quantification. Together, the presented protocol provides a framework for accurate analysis of protein dynamics in filopodial protrusions using image analysis software.

We present a software solution for semi-automated tracking of relative protein concentration along the length of dynamic cellular protrusions.

ממשק משתמש גרפי למעקב בסיוע תוכנה של ריכוז חלבון בהפרעות ניידות דינמיות

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...

In Situ Immunofluorescent Staining of Autophagy in Muscle Stem Cells

Increasing evidence points to autophagy as a crucial regulatory process to preserve tissue homeostasis. It is known that autophagy is involved in skeletal muscle development and regeneration, and the autophagic process has been described in several muscular pathologies and age-related muscle disorders. A recently described block of the autophagic process that correlates with the functional exhaustion of satellite cells during muscle repair supports the notion that active autophagy is coupled with productive muscle regeneration. These data uncover the crucial role of autophagy in satellite cell activation during muscle regeneration in both normal and pathological conditions, such as muscular dystrophies. Here, we provide a protocol to monitor the autophagic process in the adult Muscle Stem Cell (MuSC) compartment during muscle regenerative conditions. This protocol describes the setup methodology to perform in situ immunofluorescence imaging of LC3, an autophagy marker, and MyoD, a myogenic lineage marker, in muscle tissue sections from control and injured mice. The methodology reported allows for monitoring the autophagic process in one specific cell compartment, the MuSC compartment, which plays a central role in orchestrating muscle regeneration.

In Situ Immunofluorescent Staining of Autophagy in Muscle Stem Cells

Active autophagy is associated with productive muscle regeneration, which is essential for Muscle Stem Cell (MuSC) activation. Here, we provide a protocol for the in situ detection of LC3, an autophagy marker in MyoD-positive MuSCs of muscle tissue sections from control and injured mice.

ב Situ Immunofluorescent מכתים של autophagy בתאי גזע שריר

Increasing evidence points to autophagy as a crucial regulatory process to preserve tissue homeostasis. It is known that autophagy is involved in skeletal ...