Anyaporn Sawasdichai und Nazefah Abdul Hamid sind dankbar, dass die thailändische Regierung und der Regierung von Malaysia jeweils für Ph.D. Stipendien. Diese Arbeit wurde durch eine Wellcome Trust Projekt Zuschuss für PSJ und KG finanziert. Wir sind auch dankbar für die University of Bristol Wolfson Bioimaging Facility.

I. Vorbereitung für die Fraktionierung Dieser Abschnitt beschreibt die Herstellung von Poly-L-Lysin beschichtet Mikroskop Deckglas und die Anheftung von Zellen vor der Fraktionierung. Bei Bedarf können die Zellen transient mit Expressionsvektoren Protein entweder vor oder nach der Befestigung transfiziert. A. Herstellung von Poly-L-Lysin beschichtete Deckgläser <ol><li> Bereiten Sie eine Lösung von 1mg/ml Poly-L-Lysin in destilliertem Wasser. </li><li> Coat saubere Deckgläser mit Poly-L-Lysin durch Inkubation in der Lösung für mindestens 1 Stunde auf einem Wippschüttler bei 22 ° C. </li><li> Waschen Sie die beschichtete Deckgläser mit sterilem destilliertem Wasser zweimal und folgen mit einmaligem Waschen mit 96% Ethanol. </li><li> An der Luft trocknen beschichtete Deckgläser auf einem Stück Filterpapier und halten sie in einem trockenen Behältnis für die zukünftige Verwendung (nach dem Trocknen können sie gestapelt werden). </li></ol> B. Anbringen Zellen Deckgläser Nicht adhärente Zellen (hier benutzen wir K562-Zellen) <ol><li> Legen Sie eine Poly-L-Lysin beschichtet Deckglas in einem Brunnen in einem 6-Well-Platte mit der beschichteten Seite nach oben weisend. </li><li> Seed K562-Zellen bei einer Dichte von 7x10 5 Zellen / well in Dulbecco Modified Eagles Medium (DMEM) ergänzt mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) und PS (Penizillin 100units/ml, Streptomycin 100mg/ml). Im Falle von K562-Zellen transiente Transfektion kann mittels Elektroporation (0.4cm Elektroporationsküvetten mit 1x10 7 Zellen in 200 ul von Medien bei 250V / 975μF) vor der Aussaat der Zellen sein. </li><li> Inkubieren Sie die Zellen für 24 Stunden bei 37 ° C in 5% CO 2. </li><li> Abgießen des Mediums und waschen Sie die Zellen zweimal mit eiskaltem Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS). </li><li> Folgen Sie mit der subzellulären Fraktionierung Protokoll. </li></ol> Adhärente Zellen (hier benutzen wir Cos-7-Zellen) <ol><li> Ein unbeschichtetes Deckglas in einem Brunnen in einem 6-Well-Platte. </li><li> Zweimal waschen in PBS vorgewärmt auf 37 ° C. </li><li> Lösen Sie die Zellen durch Verdau mit Trypsin (0,03% EDTA, 0,25% Trypsin) in PBS bei 37 ° C für 2 bis 5 Minuten. Es ist wichtig, nicht zu stark zu verdauen die Zellen und die Verdauung an, sobald überwiegend einzelnen schwimmenden Zellen vorhanden sind. </li><li> Stoppen Sie die Verdauung durch Aussaat der Zellen bei einer Dichte von 3x10 5 Zellen / Well in einer 6-Well-Platte in DMEM mit 10% FBS und PSG (Penicillin 100 Einheiten / ml, Streptomycin 100ug/ml und L-Glutamin 292ug/ml) ergänzt auf normale Deckgläser. Adhärenten Zellen im Allgemeinen gut befestigen auf normalen Mikroskop Deckgläser jedoch Poly-L-Lysin beschichtete Deckgläser verwendet werden können, wenn erforderlich. </li><li> Inkubieren Sie die Zellen für 24 Stunden bei 37 ° C und 5% CO 2. Im Falle von Cos-7-Zellen transiente Transfektion kann mit Fugene 6 (Roche), falls erforderlich, und die Zellen von links nach für weitere 24 Stunden bei 37 ° C zu erholen und 5% CO 2. </li><li> Abgießen des Mediums und waschen Sie die Zellen zweimal mit eiskaltem PBS. </li><li> Folgen Sie mit der subzellulären Fraktionierung Protokoll. </li></ol> II. Subzelluläre Fraktionierung In situ-Fraktion wird nach dem Schema in Abbildung 1 dargestellt durchgeführt und basiert auf einer Methode zuvor beschriebenen 5 mit Änderungen zuvor beschrieben 7 und in der detaillierten Protokoll unten. Es wird empfohlen, die Deckgläschen in ein frisches 6-Well-Platte übertragen nach jeder Fraktionierung Schritt Entfernen des Deckglases vor dem Entfernen der Flüssigkeit. Obwohl nur vier Deckgläser für die Bildgebung erforderlich sind, werden zusätzliche Deckgläser müssen Ganzzellextrakt und Kernmatrix Fraktionen für Western-Blot, wenn dies parallel durchgeführt werden produzieren. <ol><li> Vorbereiten und Filter Zytoskelett-Puffer (CSK): 10mm PIPES, 300mm Saccharose, 100 mM NaCl, 3 mM MgCl 2, 1 mM EGTA. CSK-Puffer sollte frisch am Tag der Fraktionierung vorbereitet werden. </li><li> Bei Bedarf kann die Zellen von einem Deckglas kann verwendet werden, um Ganzzellextrakt für Western-Blot vorbereitet durch sanftes Auflegen 200 &amp;mgr; l TES-Puffer (1% SDS, 2 mM EDTA, 20 mM Tris-HCl pH 7,4) direkt auf das Deckglas und Inkubation für 1 oder 2 Minuten werden bei 22 ° C. Die Ganzzellextrakt kann dann entfernt werden und die Proteine ​​durch Zugabe von 250ul von 1M (NH 4) 2 SO 4 und Inkubieren auf Eis, bis die anderen westlichen Proben bereit sind. </li><li> Waschen Sie den verbleibenden Deckgläser mit 1 ml eiskaltem PBS zweimal bei 22 ° C durch Kippen des 6-Well-Platte zwei-oder dreimal. </li><li> Entfernen Sie das Deckglas für ganze Zellen und Überführung in ein frisches 6-Well-Platte. Folgen Sie mit der Zelle Fixierung und Immun-Fluoreszenz-Protokoll. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig das PBS aus den übrigen Bohrlöchern. </li><li> Entpacken Sie die zytoplasmatische und locker gehaltenen nuklearen Proteinen durch sanftes Auflegen 200 &amp;mgr; l CSK-Puffer + 0,1% (V / V) Triton X-100 direkt auf jede verbleibende Deckglas und Inkubation aufEis für 1 Minute. </li><li> Entfernen Sie die zytoplasmatische und locker gehalten Kernextrakt und Niederschlag wie in Schritt 2 beschrieben. </li><li> Waschen Sie die Deckgläser mit 1 ml eiskaltem PBS zweimal bei 22 ° C durch Kippen des 6-Well-Platte. </li><li> Entfernen Sie das Deckglas vertreten dicht gehalten Kernmaterial und folgen mit der Zelle Fixierung und Immun-Fluoreszenz-Protokoll. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig das PBS aus den übrigen Bohrlöchern extrahieren Sie dann die dicht gehalten Proteine ​​durch sanftes Auflegen 200 &amp;mgr; l CSK-Puffer + 0,5% (V / V) Triton X-100 direkt auf jede verbleibende Deckglas und Inkubation auf Eis für 20 Minuten. </li><li> Entfernen Sie die dicht gehalten extrahieren und Niederschlag wie in Schritt 2 beschrieben. </li><li> Waschen Sie die Deckgläser mit 1 ml eiskaltem PBS zweimal bei 22 ° C durch Kippen des 6-Well-Platte. </li><li> Entfernen Sie das Deckglas vertreten Chromatin-Fraktion und folgen mit der Zelle Fixierung und Immun-Fluoreszenz-Protokoll. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig das PBS aus den übrigen Bohrlöchern dann statt 200 &amp;mgr; l CSK-Puffer + 100ug/ml von DNase I auf die restlichen Deckgläser und Inkubation für 30 Minuten bei 37 ° C. </li><li> Entfernen Sie die Chromatin-Extrakt und Niederschlag wie in Schritt 2 beschrieben. </li><li> Waschen Sie die Deckgläser mit eiskaltem PBS zweimal bei 22 ° C durch Kippen des 6-Well-Platte. </li><li> Entfernen Sie das Deckglas, die die Kernmatrix-Fraktion und folgen mit der Zelle Fixierung und Immun-Fluoreszenz-Protokoll. </li><li> Bei Bedarf kann die Matrix-Proteinen kann von einer zusätzlichen Matrix Deckglas für Western-Blot mit 200 &amp;mgr; l TES-Puffer, wie in Schritt 2 beschrieben entfernt werden. </li><li> Proben für die Western-Blot sollte bei 13000 rpm in einer Tischplatte Mikrozentrifuge bei 4 ° C zentrifugiert und die Pellets in 40ul SDS-Ladepuffer (62.5mm Tris-HCl pH 6,8, 2% SDS (w / v), 50 mM DTT resuspendiert, 10% Glycerin, 0,01% Bromphenolblau (w / v)) vor der Analyse durch SDS-PAGE. <img src="/files/ftp_upload/1958/1958fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Eine schematische Darstellung der in situ subzelluläre Fraktionierung. Zytoskelett-Puffer (CSK) besteht aus 10 mM PIPES, 300mm Saccharose, 100 mM NaCl, 3 mM MgCl 2, 1 mM EGTA. TES-Puffer besteht aus 1% SDS, 2 mM EDTA, 20 mM Tris-HCl pH 7,4. </li></ol> III. Zell-Fixierung und Immunfluoreszenz <ol><li> Vorsichtig 1ml von 4% Formaldehyd / PBS in jedes Deckglas und inkubieren Sie bei 4 ° C für 30 Minuten. </li><li> Waschen Sie jeden Deckglas vorsichtig 2-3 mal mit 1 ml PBS bei 22 ° C. </li><li> Add 400ul von 0,1% Triton X-100/PBS jedem Deckglas und Inkubieren bei 22 ° C für 10 Minuten. </li><li> Waschen Sie jeden Deckglas vorsichtig 2-3 mal mit 1 ml PBS bei 22 ° C. </li><li> Add 400ul von 3% Rinderserumalbumin (BSA) / PBS und Inkubation bei 22 ° C für 20 Minuten, um mögliche Hintergrundfärbung zu reduzieren. </li><li> Waschen Sie jeden Deckglas vorsichtig 2-3 mal mit 1 ml PBS bei 22 ° C. </li><li> Legen Sie 100 ul des primären Antikörpers in PBS direkt auf das Deckglas und Inkubieren bei 22 ° C für 1 Stunde. Primäre und sekundäre Antikörper sollten in PBS auf die gewünschte Konzentration verdünnt werden. Eventuell müssen Sie diese für jeden Antikörper verwendet optimiert werden. </li><li> Waschen Sie jeden Deckglas vorsichtig 2-3 mal mit 1 ml PBS bei 22 ° C. </li><li> Legen Sie 200 &amp;mgr; l des sekundären Antikörpers in PBS und Inkubation bei 22 ° C vor Licht für 1 Stunde. </li><li> Waschen Sie jeden Deckglas vorsichtig 2-3 mal mit 1 ml PBS bei 22 ° C. </li><li> Berg jedes Deckglas (Zellen nach unten) auf einem Glasobjektträger mit Vectashield Montage-Medium mit DAPI (4 &#39;,6-Diamino-2-phenylindole Hydrochlorid). </li><li> Überschüssiges Eindeckmedium aus der ganzen Deckglas mit einem Papiertuch und inkubieren die Folie bei 22 ° C für mindestens 30 Minuten entfernt vom Licht. </li><li> Befestigen Sie das Deckglas auf den Objektträger mit klarem Acryl Nagellack. </li><li> Halten Sie die Folien vom Licht, bevor Visualisierung mittels Fluoreszenzmikroskopie. </li></ol> IV. Repräsentative Ergebnisse <img src="/files/ftp_upload/1958/1958fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2. Subzellulären Fraktionierung von nicht-transfizierten COS-7-Zellen. Fraktionierte Cos-7-Zellen wurden mit Formaldehyd fixiert und immunhistochemisch mit α-Tubulin, α-Histon H1 oder α-Lamin A / C-Antikörper, konjugiert mit TRITC durch die Behandlung mit Montage-Medium mit DAPI gefolgt . Die Bilder wurden mit 10x Okular und 63x Objektiv mit einer Leica konfokalen Mikroskops erworben. Zellkerne wurden visualisiert mit einem DAPI-Filter gesetzt, während in dem gleichen Gebiet Zellen mit Marker-Antikörper gefärbt wurden visualisiert mit einem TRITC-Filter eingestellt. <img src="/files/ftp_upload/1958/1958fig3.jpg" alt="Abbildung 3" /> Abbildung 3. Eine GFP-6E2-Fusionsprotein mit der Kernmatrix assoziiert. Subzelluläre Fraktionierung von Cos-7 Zellen, die ein Fusionsprotein bestehend aus grün fluoreszierende Protein (GFP) fusioniert mit dem humanen Papillomavirus (HPV) Typ 6E2-Protein (GFP-6E2). Zellkerne wurden visualisiert via DAPI-Färbung, während Lokalisation von GFP-6E2 in den transfizierten Zellen wurde direkt visualisiert via GFP-Fluoreszenz. Lamin A / C wurde unter Verwendung α-Lamin A / C-Antikörper, konjugiert mit TRITC und einem TRITC-Filter eingestellt. Die Zusammenführung Bilder zeigen, dass einige der GFP-6E2-Protein mit der Kernmatrix (untere rechte Tafel) verbunden ist. Bilder wurden wie in Abbildung 2 beschrieben.

<ol>
	<li>Donaldson, M. M., Boner, W., Morgan, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TopBP1+regulates+human+papillomavirus+type+16+E2+interaction+with+chromatin.">TopBP1 regulates human papillomavirus type 16 E2 interaction with chromatin.</a> J Virol. 81, 4338-4342 (2007).</li><li>Javed, A., Guo, B., Hiebert, S., Choi, J. Y., Green, J., Zhao, S. C., Osborne, M. A., Stifani, S., Stein, J. L., Lian, J. B., van Wijnen, A. J., Stein, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Groucho/TLE/R-esp+proteins+associate+with+the+nuclear+matrix+and+repress+RUNX+(CBF(alpha)/AML/PEBP2(alpha))+dependent+activation+of+tissue-specific+gene+transcription.">Groucho/TLE/R-esp proteins associate with the nuclear matrix and repress RUNX (CBF(alpha)/AML/PEBP2(alpha)) dependent activation of tissue-specific gene transcription.</a> J Cell Sci. 113, 2221-2231 (2000).</li><li>Kowalczyk, A. M., Roeder, G. E., Green, K., Stephens, D. J., Gaston, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+the+induction+or+inhibition+of+apoptosis+by+HPV+proteins.">Measuring the induction or inhibition of apoptosis by HPV proteins.</a> Methods Mol. Med. 119, 419-432 (2005).</li><li>McLarren, K. W., Theriault, F. M., Stifani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+with+the+nuclear+matrix+and+interaction+with+Groucho+and+RUNX+proteins+regulate+the+transcription+repression+activity+of+the+basic+helix+loop+helix+factor+Hes1.">Association with the nuclear matrix and interaction with Groucho and RUNX proteins regulate the transcription repression activity of the basic helix loop helix factor Hes1.</a> J Biol. Chem. 276, 1578-1584 (2001).</li><li>McNeil, S., Guo, B., Stein, J. L., Lian, J. B., Bushmeyer, S., Seto, E., Atchison, M. L., Penman, S., van Wijnen, A. J., Stein, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+of+the+YY1+transcription+factor+to+the+nucleolus+and+the+nuclear+matrix+in+situ:+the+C-terminus+is+a+principal+determinant+for+nuclear+trafficking.">Targeting of the YY1 transcription factor to the nucleolus and the nuclear matrix in situ: the C-terminus is a principal determinant for nuclear trafficking.</a> J Cell Biochem. 68, 500-510 (1998).</li><li>Melan, M. A., Sluder, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redistribution+and+differential+extraction+of+soluble+proteins+in+permeabilized+cultured+cells.+Implications+for+immunofluorescence+microscopy.">Redistribution and differential extraction of soluble proteins in permeabilized cultured cells. Implications for immunofluorescence microscopy.</a> J Cell Sci. 101, 731-743 (1992).</li><li>Zou, N., Lin, B. Y., Duan, F., Lee, K. Y., Jin, G., Guan, R., Yao, G., Lefkowitz, E. J., Broker, T. R., Chow, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hinge+of+the+human+papillomavirus+type+11+E2+protein+contains+major+determinants+for+nuclear+localization+and+nuclear+matrix+association.">The hinge of the human papillomavirus type 11 E2 protein contains major determinants for nuclear localization and nuclear matrix association.</a> J. Virol. 74, 3761-3770 (2000).</li></ol>

Häufige Probleme und Anregungen: Alle oder die meisten Zellen sind beim Waschen verloren. Während Waschschritte Flüssigkeiten müssen langsam auf die Seite der 6-Well-Platte zu vermeiden das Deckglas hinzugefügt werden. Auch Flüssigkeiten sollten durch vorsichtiges Kippen der Platte entfernt werden und langsam Abpipettieren überschüssige Flüssigkeit. Zelladhäsion vergrößert Verwendung von Poly-L-Lysin beschichtete Deckgläser werden. Genomic DNA nicht vol...

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		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>BSA</td>
<td>Chemical</td>
<td>Sigma</td>
<td>A9647-100G</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DNase I</td>
<td>Chemical</td>
<td>Sigma</td>
<td>DN25-1G</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>poly-L-Lysine</td>
<td>Chemical</td>
<td>Sigma</td>
<td>P-8920</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Trypsin</td>
<td>Chemical</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>EGTA</td>
<td>Chemical</td>
<td>Sigma</td>
<td>E4378-25G </td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fomaldehyde</td>
<td>Chemical</td>
<td>BDH</td>
<td>284216N</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PIPES</td>
<td>Chemical</td>
<td>Sigma</td>
<td>P-6757</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sucrose</td>
<td>Chemical</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>S/8600/53</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Triton X-100</td>
<td>Chemical</td>
<td>Sigma</td>
<td>T-6876</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Mounting Medium with DAPI</td>
<td>Chemical</td>
<td>Vector Laboratories</td>
<td>H-1200</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fugene 6 Transfection Reagent</td>
<td>Chemical</td>
<td>Roche </td>
<td>11814443001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Histone H1</td>
<td>Antibodies</td>
<td>Santa Cruz</td>
<td>SC-8030</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Lamin A/C</td>
<td>Antibodies</td>
<td>Santa Cruz</td>
<td>SC-20681</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tubulin-&alpha;</td>
<td>Antibodies</td>
<td>Santa Cruz</td>
<td>SC-32293</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

in situ subcellular fractionation of adherent and non-adherent mammalian cells

Protein-Funktion ist eng mit Proteinlokalisierung gekoppelt. Obwohl einige Proteine ​​an einen bestimmten Ort oder subzellulären Kompartiment beschränkt sind, sind viele Proteine ​​als frei diffundierenden Bevölkerung in freien Austausch mit einer Sub-Population, die eng mit einem bestimmten subzellulären Domäne oder der Struktur verbunden ist. In situ subzelluläre Fraktionierung ermöglicht die Visualisierung von Protein Kompartimentierung und kann auch zeigen, Protein Sub-Populationen, die auf bestimmte Strukturen zu lokalisieren. Zum Beispiel kann die Entfernung der löslichen zytoplasmatischen Proteine ​​und locker gehaltenen nuklearen Proteine ​​zeigen die stabile Assoziation von einigen Transkriptionsfaktoren mit Chromatin. Nachfolgende Verdauung von DNA kann in vielen Fällen den Zusammenhang mit dem Netzwerk von Proteinen und RNA, die zusammen den nuklearen Gerüst oder Kernmatrix bezeichnet wird. Hier beschreiben wir die Schritte während der in situ-Fraktionierung von adhärenten und nicht adhärenten Säugetierzellen auf Mikroskop-Deckgläser erforderlich. Protein-Visualisierung kann mit Hilfe spezifischer Antikörper oder fluoreszierende Fusionsproteine ​​und Fluoreszenz-Mikroskopie werden. Antikörper und / oder fluoreszierende Farbstoffe, die als Marker für spezifische Abteilungen oder Strukturen zu agieren Proteinlokalisierung im Detail abgebildet werden. In situ-Fraktionierung kann auch mit Western-Blot auf die Mengen an Protein, das in jeder Fraktion vergleichen kombiniert werden. Diese einfache biochemische Verfahren deckt Verbände, die sonst bliebe unerkannt.

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In situ Subcellular Fractionation of Adherent and Non-adherent Mammalian Cells

In situ subzellulären Fraktionierung von Säugetierzellen auf Mikroskop-Deckgläser ermöglicht die Visualisierung von Protein-Lokalisierung.

In situ subzelluläre Fraktionierung von adhärenten und nicht adhärenten Säugetierzellen

Protein function is intimately coupled to protein localization. Although some proteins are restricted to a specific location or subcellular compartment, ...

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Research

JoVE Journal

Biology

In situ Subcellular Fractionation of Adherent and Non-adherent Mammalian Cells

15.7K Aufrufe.  University of Bristol. In situ subzellulären Fraktionierung von Säugetierzellen auf Mikroskop-Deckgläser ermöglicht die Visualisierung von Protein-Lokalisierung.

Serie: In situ Subcellular Fractionation of Adherent and Non-adherent Mammalian Cells

Trypsinizing and Subculturing Mammalian Cells

As cells reach confluency, they must be subcultured or passaged. Failure to subculture confluent cells results in reduced mitotic index and eventually in cell death. The first step in subculturing is to detach cells from the surface of the primary culture vessel by trypsinization or mechanical means. The resultant cell suspension is then subdivided, or reseeded, into fresh cultures. Secondary cultures are checked for growth and fed periodically, and may be subsequently subcultured to produce tertiary cultures. The time between passaging of cells varies with the cell line and depends on the growth rate.

As cells reach confluency, they must be subcultured or passaged. This video will demonstrate a procedure for subculturing both adherent and suspension cells.

Trypsinizing und Subkultivierung Säugerzellen

As cells reach confluency, they must be subcultured or passaged. Failure to subculture confluent cells results in reduced mitotic index and eventually in ...

Forschung

Biologie

MISSION esiRNA for RNAi Screening in Mammalian Cells

RNA interference (RNAi) is a basic cellular mechanism for the control of gene expression. RNAi is induced by short double-stranded RNAs also known as small interfering RNAs (siRNAs). The short double-stranded RNAs originate from longer double stranded precursors by the activity of Dicer, a protein of the RNase III family of endonucleases. The resulting fragments are components of the RNA-induced silencing complex (RISC), directing it to the cognate target mRNA. RISC cleaves the target mRNA thereby reducing the expression of the encoded protein1,2,3. RNAi has become a powerful and widely used experimental method for loss of gene function studies in mammalian cells utilizing small interfering RNAs.
Currently two main methods are available for the production of small interfering RNAs. One method involves chemical synthesis, whereas an alternative method employs endonucleolytic cleavage of target specific long double-stranded RNAs by RNase III in vitro. Thereby, a diverse pool of siRNA-like oligonucleotides is produced which is also known as endoribonuclease-prepared siRNA or esiRNA. A comparison of efficacy of chemically derived siRNAs and esiRNAs shows that both triggers are potent in target-gene silencing. Differences can, however, be seen when comparing specificity. Many single chemically synthesized siRNAs produce prominent off-target effects, whereas the complex mixture inherent in esiRNAs leads to a more specific knockdown10.
In this study, we present the design of genome-scale MISSION esiRNA libraries and its utilization for RNAi screening exemplified by a DNA-content screen for the identification of genes involved in cell cycle progression. We show how to optimize the transfection protocol and the assay for screening in high throughput. We also demonstrate how large data-sets can be evaluated statistically and present methods to validate primary hits. Finally, we give potential starting points for further functional characterizations of validated hits.

Here we use a human esiRNA library in a high-throughput screen for genes involved in cell division. We demonstrate how to set up and conduct an esiRNA screens, as well as how to analyze and validate the results.

MISSION esiRNA für RNAi-Screening in Säugerzellen

RNA interference (RNAi) is a basic cellular mechanism for the control of gene expression. RNAi is induced by short double-stranded RNAs also known as ...

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying potassium (referred to as GIRK) channels, which are important for regulating the excitability of neurons. There are four different mammalian GIRK channel subunits (GIRK1-GIRK4) - we focus on GIRK2 because it forms a homotetramer. Stimulation of different types of G protein-coupled receptors (GPCRs), such as the muscarinic receptor (M2R), leads to activation of GIRK channels. Alcohol also directly activates GIRK channels. We will show how to mutate one amino acid by specifically changing one or more nucleotides in the cDNA for the GIRK channel. This mutated cDNA sequence will be amplified in bacteria, purified, and the presence of the point mutation will be confirmed by DNA sequencing. The cDNAs for the mutated and wild-type GIRK channels will be transfected into human embryonic kidney HEK293T cells cultured in vitro. Lastly, whole-cell patch-clamp electrophysiology will be used to study the macroscopic potassium currents through the ectopically expressed wild-type or mutated GIRK channels. In this experiment, we will examine the effect of a L257W mutation in GIRK2 channels on M2R-dependent and alcohol-dependent activation.

We will demonstrate how to study the effect of a single point mutation on the function of an ion channel.

Mutagenese und funktionale Analyse von Ionenkanälen heterolog in Säugerzellen exprimierten

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

Clonogenic Assay: Adherent Cells

The clonogenic (or colony forming) assay has been established for more than 50 years; the original paper describing the technique was published in 19561. Apart from documenting the method, the initial landmark study generated the first radiation-dose response curve for X-ray irradiated mammalian (HeLa) cells in culture1. Basically, the clonogenic assay enables an assessment of the differences in reproductive viability (capacity of cells to produce progeny; i.e. a single cell to form a colony of 50 or more cells) between control untreated cells and cells that have undergone various treatments such as exposure to ionising radiation, various chemical compounds (e.g. cytotoxic agents) or in other cases genetic manipulation. The assay has become the most widely accepted technique in radiation biology and has been widely used for evaluating the radiation sensitivity of different cell lines. Further, the clonogenic assay is commonly used for monitoring the efficacy of radiation modifying compounds and for determining the effects of cytotoxic agents and other anti-cancer therapeutics on colony forming ability, in different cell lines. A typical clonogenic survival experiment using adherent cells lines involves three distinct components, 1) treatment of the cell monolayer in tissue culture flasks, 2) preparation of single cell suspensions and plating an appropriate number of cells in petri dishes and 3) fixing and staining colonies following a relevant incubation period, which could range from 1-3 weeks, depending on the cell line. Here we demonstrate the general procedure for performing the clonogenic assay with adherent cell lines with the use of an immortalized human keratinocyte cell line (FEP-1811)2. Also, our aims are to describe common features of clonogenic assays including calculation of the plating efficiency and survival fractions after exposure of cells to radiation, and to exemplify modification of radiation-response with the use of a natural antioxidant formulation.

The applicability of the clonogenic assay for evaluating reproductive viability has been established for more than 50 years. Here we demonstrate the general procedure for performing the clonogenic assay with adherent cells.

Klonogene Test: adhärenter Zellen

The clonogenic (or colony forming) assay has been established for more than 50 years; the original paper describing the technique was published in 19561. ...

Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of cell proliferation underlies the pathology of diseases like cancer. As such there is great need to be able to investigate cell proliferation and quantitate the proportion of cells in each phase of the cell cycle. It is also of vital importance to indistinguishably identify cells that are replicating their DNA within a larger population. Since a cell&prime;s decision to proliferate is made in the G1 phase immediately before initiating DNA synthesis and progressing through the rest of the cell cycle, detection of DNA synthesis at this stage allows for an unambiguous determination of the status of growth regulation in cell culture experiments.
DNA content in cells can be readily quantitated by flow cytometry of cells stained with propidium iodide, a fluorescent DNA intercalating dye. Similarly, active DNA synthesis can be quantitated by culturing cells in the presence of radioactive thymidine, harvesting the cells, and measuring the incorporation of radioactivity into an acid insoluble fraction. We have considerable expertise with cell cycle analysis and recommend a different approach. We Investigate cell proliferation using bromodeoxyuridine/fluorodeoxyuridine (abbreviated simply as BrdU) staining that detects the incorporation of these thymine analogs into recently synthesized DNA. Labeling and staining cells with BrdU, combined with total DNA staining by propidium iodide and analysis by flow cytometry1 offers the most accurate measure of cells in the various stages of the cell cycle. It is our preferred method because it combines the detection of active DNA synthesis, through antibody based staining of BrdU, with total DNA content from propidium iodide. This allows for the clear separation of cells in G1 from early S phase, or late S phase from G2/M. Furthermore, this approach can be utilized to investigate the effects of many different cell stimuli and pharmacologic agents on the regulation of progression through these different cell cycle phases.
In this report we describe methods for labeling and staining cultured cells, as well as their analysis by flow cytometry. We also include experimental examples of how this method can be used to measure the effects of growth inhibiting signals from cytokines such as TGF-&beta;1, and proliferative inhibitors such as the cyclin dependent kinase inhibitor, p27KIP1. We also include an alternate protocol that allows for the analysis of cell cycle position in a sub-population of cells within a larger culture5. In this case, we demonstrate how to detect a cell cycle arrest in cells transfected with the retinoblastoma gene even when greatly outnumbered by untransfected cells in the same culture. These examples illustrate the many ways that DNA staining and flow cytometry can be utilized and adapted to investigate fundamental questions of mammalian cell cycle control.

Determining the cell cycle position of a population of cells, or understanding how signals affect proliferation, can be readily measured by flow cytometry using this protocol. We report a simple experimental approach to staining cells and quantifying their position in the cell cycle.

Analyse des Zellzyklus Position in Säugerzellen

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of ...

Visualization of Endoplasmic Reticulum Localized mRNAs in Mammalian Cells

In eukaryotes, most of the messenger RNAs (mRNAs) that encode secreted and membrane proteins are localized to the surface of the endoplasmic reticulum (ER). However, the visualization of these mRNAs can be challenging. This is especially true when only a fraction of the mRNA is ER-associated and their distribution to this organelle is obstructed by non-targeted (i.e. "free") transcripts. In order to monitor ER-associated mRNAs, we have developed a method in which cells are treated with a short exposure to a digitonin extraction solution that selectively permeabilizes the plasma membrane, and thus removes the cytoplasmic contents, while simultaneously maintaining the integrity of the ER. When this method is coupled with fluorescent in situ hybridization (FISH), one can clearly visualize ER-bound mRNAs by fluorescent microscopy. Using this protocol the degree of ER-association for either bulk poly(A) transcripts or specific mRNAs can be assessed and even quantified. In the process, one can use this assay to investigate the nature of mRNA-ER interactions.

Here we describe a method to visualize endoplasmic reticulum-associated mRNAs in mammalian tissue culture cells. This technique involves the selective permeabilization of the plasma membrane with digitonin to remove cytoplasmic contents followed by fluorescent in situ hybridization to detect either bulk poly(A) mRNA or specific transcripts.

Visualisierung von endoplasmatischen Retikulum lokalisierte mRNAs in Säugerzellen

In eukaryotes, most of the messenger RNAs (mRNAs) that encode secreted and membrane proteins are localized to the surface of the endoplasmic reticulum ...

Polysome Fractionation and Analysis of Mammalian Translatomes on a Genome-wide Scale

mRNA translation plays a central role in the regulation of gene expression and represents the most energy consuming process in mammalian cells. Accordingly, dysregulation of mRNA translation is considered to play a major role in a variety of pathological states including cancer. Ribosomes also host chaperones, which facilitate folding of nascent polypeptides, thereby modulating function and stability of newly synthesized polypeptides. In addition, emerging data indicate that ribosomes serve as a platform for a repertoire of signaling molecules, which are implicated in a variety of post-translational modifications of newly synthesized polypeptides as they emerge from the ribosome, and/or components of translational machinery. Herein, a well-established method of ribosome fractionation using sucrose density gradient centrifugation is described. In conjunction with the in-house developed &#8220;anota&#8221; algorithm this method allows direct determination of differential translation of individual mRNAs on a genome-wide scale. Moreover, this versatile protocol can be used for a variety of biochemical studies aiming to dissect the function of ribosome-associated protein complexes, including those that play a central role in folding and degradation of newly synthesized polypeptides.

Ribosomes play a central role in protein synthesis. Polyribosome (polysome) fractionation by sucrose density gradient centrifugation allows direct determination of translation efficiencies of individual mRNAs on a genome-wide scale. In addition, this method can be used for biochemical analysis of ribosome- and polysome-associated factors such as chaperones and signaling molecules.

Polysomprofile Fraktionierung und Analyse von Säuger Translatomes auf einer Genom-weite Skala

mRNA translation plays a central role in the regulation of gene expression and represents the most energy consuming process in mammalian cells. ...

Measurement of Heme Synthesis Levels in Mammalian Cells

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in various molecular and cellular processes such as gene transcription, translation, cell differentiation and cell proliferation. The biosynthesis levels of heme vary across different tissues and cell types and is altered in diseased conditions such as anemia, neuropathy and cancer. This technique uses [4-14C] 5-aminolevulinic acid ([14C] 5-ALA), one of the early precursors in the heme biosynthesis pathway to measure the levels of heme synthesis in mammalian cells. This assay involves incubation of cells with [14C] 5-ALA followed by extraction of heme and measurement of the radioactivity incorporated into heme. This procedure is accurate and quick. This method measures the relative levels of heme biosynthesis rather than the total heme content. To demonstrate the use of this technique the levels of heme biosynthesis were measured in several mammalian cell lines.

Altered intracellular heme levels are associated with common diseases such as cancer. Thus, there is a need to measure heme biosynthesis levels in diverse cells. The goal of this protocol is to provide a fast and sensitive method to measure and compare the levels of heme synthesis in different cells.

Die Messung der Hämsynthese Levels in Säugerzellen

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in ...

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Cytosolic Ca2+ ions regulate numerous aspects of cellular activity in almost all cell types, controlling processes as wide-ranging as gene transcription, electrical excitability and cell proliferation. The diversity and specificity of Ca2+ signaling derives from mechanisms by which Ca2+ signals are generated to act over different time and spatial scales, ranging from cell-wide oscillations and waves occurring over the periods of minutes to local transient Ca2+ microdomains (Ca2+ puffs) lasting milliseconds. Recent advances in electron multiplied CCD (EMCCD) cameras now allow for imaging of local Ca2+ signals with a 128 x 128 pixel spatial resolution at rates of &#62;500 frames sec-1 (fps). This approach is highly parallel and enables the simultaneous monitoring of hundreds of channels or puff sites in a single experiment. However, the vast amounts of data generated (ca. 1 Gb per min) render visual identification and analysis of local Ca2+ events impracticable. Here we describe and demonstrate the procedures for the acquisition, detection, and analysis of local IP3-mediated Ca2+ signals in intact mammalian cells loaded with Ca2+ indicators using both wide-field epi-fluorescence (WF) and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. Furthermore, we describe an algorithm developed within the open-source software environment Python that automates the identification and analysis of these local Ca2+ signals. The algorithm localizes sites of Ca2+ release with sub-pixel resolution; allows user review of data; and outputs time sequences of fluorescence ratio signals together with amplitude and kinetic data in an Excel-compatible table.

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Here we present techniques for imaging local IP3-mediated Ca2+ events using fluorescence microscopy in intact mammalian cells loaded with Ca2+ indicators together with an algorithm that automates identification and analysis of these events.

Imaging Lokale Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Signale in kultivierten Säugetierzellen

Cytosolic Ca2+ ions regulate numerous aspects of cellular activity in almost all cell types, controlling processes as wide-ranging as gene transcription, ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex signaling mechanisms underlying filopodial initiation, elongation and subsequent stabilization or retraction, it is crucial to determine the spatio-temporal protein activity in these dynamic structures. To analyze protein function in filopodia, we recently developed a semi-automated tracking algorithm that adapts to filopodial shape-changes, thus allowing parallel analysis of protrusion dynamics and relative protein concentration along the whole filopodial length. Here, we present a detailed step-by-step protocol for optimized cell handling, image acquisition and software analysis. We further provide instructions for the use of optional features during image analysis and data representation, as well as troubleshooting guidelines for all critical steps along the way. Finally, we also include a comparison of the described image analysis software with other programs available for filopodia quantification. Together, the presented protocol provides a framework for accurate analysis of protein dynamics in filopodial protrusions using image analysis software.

We present a software solution for semi-automated tracking of relative protein concentration along the length of dynamic cellular protrusions.

Eine grafische Benutzeroberfläche für die softwaregestützte Verfolgung der Proteinkonzentration in dynamischen zellulären Vorsprüngen

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...