Anyaporn Sawasdichai وNazefah عبد الحميد ممتنون للحكومة التايلاندية الملكية وحكومة ماليزيا على التوالي للحصول على الدكتوراه المنح الدراسية. وقد تم تمويل هذا العمل من خلال منحة ويلكوم ترست منحت لمشروع PSJ والروضة. ونحن ممتنون أيضا لجامعة بريستول مرفق Bioimaging ولفسون.

أولا التحضير للتجزيء هذا المقطع يصف إعداد بولي - L - يسين coverslips المجهر المغلفة والمرفق من الخلايا قبل التجزئة. يمكن إذا اقتضى الأمر أن تكون الخلايا transfected عابر مع ناقلات بروتين تعبير إما قبل أو بعد المرفق. A. إعداد بولي - L - يسين coverslips المغلفة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يعد حل 1mg/ml بولي - L - يسين في الماء المقطر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> coverslips معطف نظيفة مع بولي يسين - L التي تفرخ لهم في حل ما لا يقل عن 1 ساعة على منصة هزاز عند 22 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل coverslips المغلفة مع الماء المقطر المعقم مرتين واتبع مع غسل واحد مع الايثانول 96 ٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الهواء الجاف coverslips المغلفة على قطعة من ورق الترشيح والاحتفاظ بها في وعاء جاف لاستخدامها في المستقبل (الجاف مرة واحدة يمكن أن تكون مكدسة منها). </li></ol> باء الخلايا المرتبطة coverslips غير ملتصقة الخلايا (وهنا نستخدم خلايا K562) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان ساترة بولي - L - يسين المغلفة في بئر في لوحة 6 - جيدا مع السطح المطلي مواجهة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> K562 البذور في مناطق ذات كثافة الخلايا من الخلايا 7x10 5 / Dulbecco جيدا في متوسطة والنسور التعديل (DMEM) تستكمل مع مصل بقري جنيني من 10 ٪ (FBS) ، و PS (البنسلين 100units/ml ، 100mg/ml الستربتوميسين). ويمكن في حالة الخلايا K562 أن يؤديها ترنسفكأيشن عابرة باستخدام electroporation (cuvettes electroporation 0.4cm مع 1x10 7 200μl الخلايا في وسائل الإعلام في 250V / 975μF) قبل البذر الخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الخلايا لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية في 5 ٪ CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مخزنة من أجل المتوسط ​​وقبالة غسل الخلايا مرتين مع الفوسفات الجليد الباردة المالحة (PBS). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اتبع مع بروتوكول تجزيء التحت خلوية. </li></ol> ملتصق الخلايا (وهنا نستخدم خلايا كوس - 7) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع علامة ساترة غير المصقول في بئر في لوحة 6 - جيدا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> prewarmed يغسل مرتين في برنامج تلفزيوني في 37 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فصل الخلايا عن طريق هضم مع التربسين (0.03 ٪ EDTA ، 0.25 ٪ التربسين) في برنامج تلفزيوني في 37 درجة مئوية لمدة 2 إلى 5 دقائق. فمن المهم عدم الإفراط في هضم الخلايا ووقف عملية الهضم بمجرد الخلايا الفردية عائمة في الغالب موجودة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> توقف عملية الهضم من خلال زرع خلايا في مناطق ذات كثافة الخلايا 3x10 5 / جيد في لوحة 6 - جيدا في DMEM تستكمل مع FBS 10 ٪ وباريس سان جيرمان (البنسلين 100 وحدة / مل ، والستربتوميسين 100ug/ml 292ug/ml L - الجلوتامين) يوم coverslips العادي. الخلايا الملتصقة بشكل جيد عموما نعلق على coverslips المجهر العادي ، ومع ذلك ، يمكن استخدام بولي - L - يسين coverslips المغلفة إذا لزم الأمر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الخلايا لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية و 5 ٪ CO 2. ويمكن في حالة كوس - 7 خلايا يتم تنفيذ ترنسفكأيشن عابرة باستخدام Fugene 6 (روش) إذا لزم الأمر وترك الخلايا لاستعادة لمدة 24 ساعة أخرى في 37 درجة مئوية و 5 ٪ CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخلصي من المتوسط ​​وغسل خلايا مرتين مع الثلج الباردة برنامج تلفزيوني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اتبع مع بروتوكول تجزيء التحت خلوية. </li></ol> II. التحت خلوية تجزيء كسر في الموقع يتم تنفيذ وفقا لالتخطيطي هو مبين في الشكل (1) ويستند على الطريقة الموصوفة سابقا 5 مع التعديلات المذكورة سابقا في 7 و بروتوكول المفصلة أدناه. فمن المستحسن لنقل coverslips إلى لوحة 6 - جيدا بعد كل خطوة جديدة تجزيء إزالة ساترة قبل إزالة السائل. على الرغم من أن هناك حاجة سوى أربعة coverslips التصوير ، وهناك حاجة إضافية لإنتاج coverslips كله استخراج الخلايا والكسور مصفوفة النووية للغرب النشاف إذا كان هذا هو المراد تنفيذها بالتوازي. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد وتصفية العازلة الهيكل الخلوي (CSK) : PIPES 10MM ، السكروز 300mM ، كلوريد الصوديوم 100mM ، MgCl 3mM 2 ، 1MM EGTA. وينبغي CSK العازلة الطازجة يوم تجزئة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يمكن إذا لزم الأمر يمكن استخدام خلايا من ساترة لإعداد كامل لاستخراج الخلايا الغربية التنشيف برفق عن طريق وضع 200ul TES العازلة (1 ٪ SDS ، 2mm وEDTA ، 20mM تريس حمض الهيدروكلوريك ، الرقم الهيدروجيني 7.4) مباشرة على ساترة واحتضان ل1 أو 2 دقيقة في 22 درجة مئوية. يمكن ثم استخراج الخلايا كلها تتم إزالة البروتينات وعجلت بإضافة 250ul من 1M (NH 4) 2 SO 4 وتفرخ على الجليد حتى عينات أخرى غربية جاهزة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل coverslips المتبقية مع 1ml الجليد الباردة PBS مرتين حتى 22 درجة مئوية بحلول إمالة لوحة 6 جيدا مرتين أو ثلاث مرات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الخلايا ساترة تمثل كلها ونقلها إلى لوحة 6 - جيدا الطازجة. اتبع مع تثبيت الخلية المناعية والبروتوكول مضان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة بلطف PBS من الآبار المتبقية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخراج البروتينات السيتوبلازمية النووية ، وعقد فضفاضة عن طريق وضع بلطف 200ul CSK عازلة + 0.1 ٪ (V / V) تريتون X - 100 مباشرة على كل ساترة المتبقية وعلى احتضانالثلج لمدة 1 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة استخراج حشوية ، وعقد فضفاضة النووية ويعجل كما هو موضح في الخطوة 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل coverslips مع الثلج الباردة 1ml PBS مرتين من قبل في 22 إمالة 6 جيدا وحة درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة ساترة تمثل المواد النووية التي عقدت بإحكام ومتابعة مع تثبيت الخلية المناعية والبروتوكول مضان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة بلطف PBS من الآبار المتبقية ثم استخراج البروتينات التي عقدت بإحكام عن طريق وضع بلطف 200ul CSK عازلة + 0.5 ٪ (V / V) تريتون X - 100 مباشرة على كل ساترة المتبقية وتفرخ على الجليد لمدة 20 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة استخراج عقد بإحكام ويعجل كما هو موضح في الخطوة 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل coverslips مع الثلج الباردة 1ml PBS مرتين من قبل في 22 إمالة 6 جيدا وحة درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة ساترة تمثل جزءا لونين والمتابعة مع تثبيت الخلايا المناعية والبروتوكول مضان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة بلطف PBS من الآبار المتبقية ثم ضع 200ul CSK عازلة + 100ug/ml من الدناز وأنا على coverslips المتبقية واحتضان لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة انتزاع لونين ويعجل كما هو موضح في الخطوة 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل coverslips مع الثلج الباردة PBS مرتين في 22 درجة مئوية بحلول إمالة 6 جيدا للصفيحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة ساترة تمثل جزءا مصفوفة النووية ومتابعة مع تثبيت الخلية المناعية والبروتوكول مضان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يمكن إذا لزم الأمر يمكن إزالة البروتينات المصفوفة من مصفوفة ساترة إضافية للغرب النشاف باستخدام 200ul TES العازلة كما هو موضح في الخطوة 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يجب طرد عينات لطخة غربية في 13000 دورة في الدقيقة في المقعد العلوي في microcentrifuge 4 درجات مئوية ، والكريات معلق في تحميل 40ul العازلة SDS (62.5mM تريس ، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 6.8 ، 2 ٪ SDS (ث / ت) ، 50 ملي DTT ، 10 ٪ الجلسرين ، 0.01 ٪ زرقة البروموفينول (ث / ت)) قبل تحليل SDS - PAGE. <img src="/files/ftp_upload/1958/1958fig1.jpg" alt="الشكل 1" /> الشكل 1. تمثيل تخطيطي للتجزيء التحت خلوية في الموقع. الهيكل الخلوي العازلة (CSK) ويتكون من أنابيب 10MM ، السكروز 300mM ، كلوريد الصوديوم 100mM ، MgCl 3mM 2 ، 1MM EGTA. TES العازلة يتكون من 1 ٪ SDS ، 2mm وEDTA ، 20mM تريس - 7.4 درجة الحموضة حمض الهيدروكلوريك. </li></ol> III. تثبيت الخلية والومضان المناعي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة بلطف 1ml من 4 ٪ الفورمالديهايد / PBS إلى كل ساترة واحتضان عند 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغسل كل ساترة بلطف 2-3 مرات مع 1ml من برنامج تلفزيوني في 22 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 400ul X-100/PBS تريتون من 0.1 ٪ إلى احتضان كل ساترة وعلى 22 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغسل كل ساترة بلطف 2-3 مرات مع 1ml من برنامج تلفزيوني في 22 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 400ul من الأبقار مصل الزلال 3 ٪ PBS / (BSA) ، واحتضان على 22 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة للحد من احتمال تلوين الخلفية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغسل كل ساترة بلطف 2-3 مرات مع 1ml من برنامج تلفزيوني في 22 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 100ul بدلا من الأجسام المضادة الأولية في برنامج تلفزيوني مباشر على احتضان وساترة في 22 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. وينبغي أن تضعف الأضداد الابتدائية والثانوية في برنامج تلفزيوني على التركيز المطلوب. هذا قد تحتاج إلى أن يكون الأمثل لكل جسم المستخدم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغسل كل ساترة بلطف 2-3 مرات مع 1ml من برنامج تلفزيوني في 22 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 200ul مكان الأجسام المضادة الثانوية في برنامج تلفزيوني واحتضان عند 22 درجة مئوية بعيدا عن الضوء لمدة 1 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغسل كل ساترة بلطف 2-3 مرات مع 1ml من برنامج تلفزيوني في 22 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كل جبل ساترة (خلايا لأسفل) على شريحة ميكروسكوب زجاجية باستخدام Vectashield المتوسطة المتزايدة التي تحتوي على دابي (4 &#39;،6 - diamidino - 2 - phenylindole هيدروكلوريد). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يمسح الزائدة المتوسطة المتزايدة من مختلف أنحاء ساترة باستخدام منشفة ورقية ، واحتضان الشريحة على 22 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 30 دقيقة بعيدا عن الضوء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إصلاح ساترة إلى الشريحة الزجاجية باستخدام طلاء الأظافر واضحة الاكريليك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يبقي بعيدا عن الضوء الشرائح قبل التصور بواسطة المجهر مضان. </li></ol> رابعا. ممثل النتائج <img src="/files/ftp_upload/1958/1958fig2.jpg" alt="الشكل 2" /> الشكل 2. تم إصلاح تجزئة التحت خلوية من الخلايا COS - 7 غير transfected. مجزأ كوس - 7 مع الخلايا باستخدام الفورمالدهيد وimmunostained α - تويولين ، H1 - α هيستون أو α امين - A / C الأضداد مترافق لTRITC تلتها المعاملة مع تصاعد المتوسط ​​تحتوي على دابي . تم الحصول على الصور مع عدسة العين عدسة 63x 10x والهدف باستخدام المجهر مبائر ايكا. وكانت نواة الخلية تصور باستخدام مجموعة تصفية دابي بينما في نفس المجال الخلايا ملطخة الأضداد علامة وتصور باستخدام مجموعة TRITC التصفية. <img src="/files/ftp_upload/1958/1958fig3.jpg" alt="الشكل 3" /> الشكل 3. ويرتبط البروتين GFP - 6E2 الانصهار مع مصفوفة النووية. التحت خلوية من الخلايا تجزيء - 7 كوس تعبر عن انصهار بروتين تتكون من بروتين الفلورية الخضراء (GFP) تنصهر لفيروس الورم الحليمي البشري (HPV) نوع 6E2 البروتين (GFP - 6E2). وكانت نواة الخلية عبر تصور تلطيخ دابي بينما توطين GFP - 6E2 في الخلايا transfected كان تصور مباشرة عن طريق مضان GFP. وكان امين A / C - α تصور به لامين A / C مترافق الأجسام المضادة لTRITC ومجموعة TRITC التصفية. دمج الصور تكشف عن أن يرتبط بعض من البروتين GFP - 6E2 مع مصفوفة النووية (اللوحة السفلية اليمنى). تم الحصول على الصور كما هو موضح في الشكل 2.

<ol>
	<li>Donaldson, M. M., Boner, W., Morgan, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TopBP1+regulates+human+papillomavirus+type+16+E2+interaction+with+chromatin.">TopBP1 regulates human papillomavirus type 16 E2 interaction with chromatin.</a> J Virol. 81, 4338-4342 (2007).</li><li>Javed, A., Guo, B., Hiebert, S., Choi, J. Y., Green, J., Zhao, S. C., Osborne, M. A., Stifani, S., Stein, J. L., Lian, J. B., van Wijnen, A. J., Stein, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Groucho/TLE/R-esp+proteins+associate+with+the+nuclear+matrix+and+repress+RUNX+(CBF(alpha)/AML/PEBP2(alpha))+dependent+activation+of+tissue-specific+gene+transcription.">Groucho/TLE/R-esp proteins associate with the nuclear matrix and repress RUNX (CBF(alpha)/AML/PEBP2(alpha)) dependent activation of tissue-specific gene transcription.</a> J Cell Sci. 113, 2221-2231 (2000).</li><li>Kowalczyk, A. M., Roeder, G. E., Green, K., Stephens, D. J., Gaston, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+the+induction+or+inhibition+of+apoptosis+by+HPV+proteins.">Measuring the induction or inhibition of apoptosis by HPV proteins.</a> Methods Mol. Med. 119, 419-432 (2005).</li><li>McLarren, K. W., Theriault, F. M., Stifani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+with+the+nuclear+matrix+and+interaction+with+Groucho+and+RUNX+proteins+regulate+the+transcription+repression+activity+of+the+basic+helix+loop+helix+factor+Hes1.">Association with the nuclear matrix and interaction with Groucho and RUNX proteins regulate the transcription repression activity of the basic helix loop helix factor Hes1.</a> J Biol. Chem. 276, 1578-1584 (2001).</li><li>McNeil, S., Guo, B., Stein, J. L., Lian, J. B., Bushmeyer, S., Seto, E., Atchison, M. L., Penman, S., van Wijnen, A. J., Stein, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+of+the+YY1+transcription+factor+to+the+nucleolus+and+the+nuclear+matrix+in+situ:+the+C-terminus+is+a+principal+determinant+for+nuclear+trafficking.">Targeting of the YY1 transcription factor to the nucleolus and the nuclear matrix in situ: the C-terminus is a principal determinant for nuclear trafficking.</a> J Cell Biochem. 68, 500-510 (1998).</li><li>Melan, M. A., Sluder, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redistribution+and+differential+extraction+of+soluble+proteins+in+permeabilized+cultured+cells.+Implications+for+immunofluorescence+microscopy.">Redistribution and differential extraction of soluble proteins in permeabilized cultured cells. Implications for immunofluorescence microscopy.</a> J Cell Sci. 101, 731-743 (1992).</li><li>Zou, N., Lin, B. Y., Duan, F., Lee, K. Y., Jin, G., Guan, R., Yao, G., Lefkowitz, E. J., Broker, T. R., Chow, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hinge+of+the+human+papillomavirus+type+11+E2+protein+contains+major+determinants+for+nuclear+localization+and+nuclear+matrix+association.">The hinge of the human papillomavirus type 11 E2 protein contains major determinants for nuclear localization and nuclear matrix association.</a> J. Virol. 74, 3761-3770 (2000).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

مشترك المشاكل والاقتراحات : وفقدت كل أو معظم الخلايا أثناء الغسل. ويجب غسل خلال الخطوات تضاف السوائل ببطء الى جانب لوحة 6 - جيدا تجنب ساترة. وبالمثل ، ينبغي إزالة السوائل من خلال إمالة لوحة pipetting بعناية وببطء قبالة السوائل الزائدة. و?...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>BSA</td>
<td>Chemical</td>
<td>Sigma</td>
<td>A9647-100G</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DNase I</td>
<td>Chemical</td>
<td>Sigma</td>
<td>DN25-1G</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>poly-L-Lysine</td>
<td>Chemical</td>
<td>Sigma</td>
<td>P-8920</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Trypsin</td>
<td>Chemical</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>EGTA</td>
<td>Chemical</td>
<td>Sigma</td>
<td>E4378-25G </td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fomaldehyde</td>
<td>Chemical</td>
<td>BDH</td>
<td>284216N</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PIPES</td>
<td>Chemical</td>
<td>Sigma</td>
<td>P-6757</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sucrose</td>
<td>Chemical</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>S/8600/53</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Triton X-100</td>
<td>Chemical</td>
<td>Sigma</td>
<td>T-6876</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Mounting Medium with DAPI</td>
<td>Chemical</td>
<td>Vector Laboratories</td>
<td>H-1200</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fugene 6 Transfection Reagent</td>
<td>Chemical</td>
<td>Roche </td>
<td>11814443001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Histone H1</td>
<td>Antibodies</td>
<td>Santa Cruz</td>
<td>SC-8030</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Lamin A/C</td>
<td>Antibodies</td>
<td>Santa Cruz</td>
<td>SC-20681</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tubulin-&alpha;</td>
<td>Antibodies</td>
<td>Santa Cruz</td>
<td>SC-32293</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

in situ subcellular fractionation of adherent and non-adherent mammalian cells

ويقترن ثيقا لتوطين وظيفة البروتين البروتين. على الرغم من تقييد بعض البروتينات لموقع معين أو مقصورة التحت خلوية ، العديد من البروتينات موجودة في عدد السكان نشرها بحرية في التبادل الحر مع مجموعة من السكان دون أن يرتبط بشكل وثيق مع ملك التحت خلوية معينة أو هيكل في تجزيء التحت خلوية الموقع يسمح التصور من ويمكن تقسيم البروتين تكشف أيضا البروتين الفرعي لتوطين السكان الذين هياكل محددة. على سبيل المثال ، يمكن إزالة بروتينات هيولي قابلة للذوبان والبروتينات النووية التي عقدت رابطة فضفاضة تكشف مستقرة لبعض عوامل النسخ مع لونين. يمكن هضم لاحقة من الحمض النووي في بعض الحالات تكشف بالتعاون مع شبكة من البروتينات والرناوات التي تسمى مجتمعة سقالة النووية أو مصفوفة النووية. نحن هنا وصف الخطوات المطلوبة خلال تجزيء في الوضع الطبيعي للخلايا الثدييات وغير ملتصقة ملتصقة على اساس coverslips المجهر. ويمكن تحقيق التصور البروتين باستخدام أجسام مضادة معينة أو البروتينات الفلورية والانصهار المجهري مضان. الأضداد و / أو الأصباغ الفلورية والتي تكون بمثابة علامات للمقصورات محددة أو هياكل تسمح ليتم تعيينها توطين البروتين بالتفصيل. تجزيء في الموقع ويمكن أيضا أن يقترن الغربية النشاف لمقارنة كميات من البروتين موجودة في كل جزء. ويمكن هذا النهج بسيطة تكشف البيوكيميائية الجمعيات التي لم يتم كشفها إلا ستبقى.

Watch this Scientific Journal Video about In situ Subcellular Fractionation of Adherent and Non-adherent Mammalian Cells at JoVE.com

In situ Subcellular Fractionation of Adherent and Non-adherent Mammalian Cells

في الوضع الطبيعي للتجزيء التحت خلوية خلايا الثدييات على coverslips المجهر يسمح التصور من توطين البروتين.

في تقطير التحت خلوية الموقع من خلايا الثدييات وغير ملتصقة منتسب -

Protein function is intimately coupled to protein localization. Although some proteins are restricted to a specific location or subcellular compartment, ...

in-situ-subcellular-fractionation-adherent-non-adherent-mammalian

Research

JoVE Journal

Biology

In situ Subcellular Fractionation of Adherent and Non-adherent Mammalian Cells

15.7K Views.  University of Bristol. في الوضع الطبيعي للتجزيء التحت خلوية خلايا الثدييات على coverslips المجهر يسمح التصور من توطين البروتين.

Video: In situ Subcellular Fractionation of Adherent and Non-adherent Mammalian Cells

Trypsinizing and Subculturing Mammalian Cells

As cells reach confluency, they must be subcultured or passaged. Failure to subculture confluent cells results in reduced mitotic index and eventually in cell death. The first step in subculturing is to detach cells from the surface of the primary culture vessel by trypsinization or mechanical means. The resultant cell suspension is then subdivided, or reseeded, into fresh cultures. Secondary cultures are checked for growth and fed periodically, and may be subsequently subcultured to produce tertiary cultures. The time between passaging of cells varies with the cell line and depends on the growth rate.

As cells reach confluency, they must be subcultured or passaged. This video will demonstrate a procedure for subculturing both adherent and suspension cells.

Trypsinizing Subculturing وخلايا الثدييات

As cells reach confluency, they must be subcultured or passaged. Failure to subculture confluent cells results in reduced mitotic index and eventually in ...

MISSION esiRNA for RNAi Screening in Mammalian Cells

RNA interference (RNAi) is a basic cellular mechanism for the control of gene expression. RNAi is induced by short double-stranded RNAs also known as small interfering RNAs (siRNAs). The short double-stranded RNAs originate from longer double stranded precursors by the activity of Dicer, a protein of the RNase III family of endonucleases. The resulting fragments are components of the RNA-induced silencing complex (RISC), directing it to the cognate target mRNA. RISC cleaves the target mRNA thereby reducing the expression of the encoded protein1,2,3. RNAi has become a powerful and widely used experimental method for loss of gene function studies in mammalian cells utilizing small interfering RNAs.
Currently two main methods are available for the production of small interfering RNAs. One method involves chemical synthesis, whereas an alternative method employs endonucleolytic cleavage of target specific long double-stranded RNAs by RNase III in vitro. Thereby, a diverse pool of siRNA-like oligonucleotides is produced which is also known as endoribonuclease-prepared siRNA or esiRNA. A comparison of efficacy of chemically derived siRNAs and esiRNAs shows that both triggers are potent in target-gene silencing. Differences can, however, be seen when comparing specificity. Many single chemically synthesized siRNAs produce prominent off-target effects, whereas the complex mixture inherent in esiRNAs leads to a more specific knockdown10.
In this study, we present the design of genome-scale MISSION esiRNA libraries and its utilization for RNAi screening exemplified by a DNA-content screen for the identification of genes involved in cell cycle progression. We show how to optimize the transfection protocol and the assay for screening in high throughput. We also demonstrate how large data-sets can be evaluated statistically and present methods to validate primary hits. Finally, we give potential starting points for further functional characterizations of validated hits.

Here we use a human esiRNA library in a high-throughput screen for genes involved in cell division. We demonstrate how to set up and conduct an esiRNA screens, as well as how to analyze and validate the results.

esiRNA بعثة لفحص رني في خلايا الثدييات

RNA interference (RNAi) is a basic cellular mechanism for the control of gene expression. RNAi is induced by short double-stranded RNAs also known as ...

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying potassium (referred to as GIRK) channels, which are important for regulating the excitability of neurons. There are four different mammalian GIRK channel subunits (GIRK1-GIRK4) - we focus on GIRK2 because it forms a homotetramer. Stimulation of different types of G protein-coupled receptors (GPCRs), such as the muscarinic receptor (M2R), leads to activation of GIRK channels. Alcohol also directly activates GIRK channels. We will show how to mutate one amino acid by specifically changing one or more nucleotides in the cDNA for the GIRK channel. This mutated cDNA sequence will be amplified in bacteria, purified, and the presence of the point mutation will be confirmed by DNA sequencing. The cDNAs for the mutated and wild-type GIRK channels will be transfected into human embryonic kidney HEK293T cells cultured in vitro. Lastly, whole-cell patch-clamp electrophysiology will be used to study the macroscopic potassium currents through the ectopically expressed wild-type or mutated GIRK channels. In this experiment, we will examine the effect of a L257W mutation in GIRK2 channels on M2R-dependent and alcohol-dependent activation.

We will demonstrate how to study the effect of a single point mutation on the function of an ion channel.

الطفرات والتحليل الوظيفي للقنوات ايون أعربت Heterologously في خلايا الثدييات

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

Clonogenic Assay: Adherent Cells

The clonogenic (or colony forming) assay has been established for more than 50 years; the original paper describing the technique was published in 19561. Apart from documenting the method, the initial landmark study generated the first radiation-dose response curve for X-ray irradiated mammalian (HeLa) cells in culture1. Basically, the clonogenic assay enables an assessment of the differences in reproductive viability (capacity of cells to produce progeny; i.e. a single cell to form a colony of 50 or more cells) between control untreated cells and cells that have undergone various treatments such as exposure to ionising radiation, various chemical compounds (e.g. cytotoxic agents) or in other cases genetic manipulation. The assay has become the most widely accepted technique in radiation biology and has been widely used for evaluating the radiation sensitivity of different cell lines. Further, the clonogenic assay is commonly used for monitoring the efficacy of radiation modifying compounds and for determining the effects of cytotoxic agents and other anti-cancer therapeutics on colony forming ability, in different cell lines. A typical clonogenic survival experiment using adherent cells lines involves three distinct components, 1) treatment of the cell monolayer in tissue culture flasks, 2) preparation of single cell suspensions and plating an appropriate number of cells in petri dishes and 3) fixing and staining colonies following a relevant incubation period, which could range from 1-3 weeks, depending on the cell line. Here we demonstrate the general procedure for performing the clonogenic assay with adherent cell lines with the use of an immortalized human keratinocyte cell line (FEP-1811)2. Also, our aims are to describe common features of clonogenic assays including calculation of the plating efficiency and survival fractions after exposure of cells to radiation, and to exemplify modification of radiation-response with the use of a natural antioxidant formulation.

The applicability of the clonogenic assay for evaluating reproductive viability has been established for more than 50 years. Here we demonstrate the general procedure for performing the clonogenic assay with adherent cells.

مولد الرمع الفحص : خلايا منتسب

The clonogenic (or colony forming) assay has been established for more than 50 years; the original paper describing the technique was published in 19561. ...

Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of cell proliferation underlies the pathology of diseases like cancer. As such there is great need to be able to investigate cell proliferation and quantitate the proportion of cells in each phase of the cell cycle. It is also of vital importance to indistinguishably identify cells that are replicating their DNA within a larger population. Since a cell&prime;s decision to proliferate is made in the G1 phase immediately before initiating DNA synthesis and progressing through the rest of the cell cycle, detection of DNA synthesis at this stage allows for an unambiguous determination of the status of growth regulation in cell culture experiments.
DNA content in cells can be readily quantitated by flow cytometry of cells stained with propidium iodide, a fluorescent DNA intercalating dye. Similarly, active DNA synthesis can be quantitated by culturing cells in the presence of radioactive thymidine, harvesting the cells, and measuring the incorporation of radioactivity into an acid insoluble fraction. We have considerable expertise with cell cycle analysis and recommend a different approach. We Investigate cell proliferation using bromodeoxyuridine/fluorodeoxyuridine (abbreviated simply as BrdU) staining that detects the incorporation of these thymine analogs into recently synthesized DNA. Labeling and staining cells with BrdU, combined with total DNA staining by propidium iodide and analysis by flow cytometry1 offers the most accurate measure of cells in the various stages of the cell cycle. It is our preferred method because it combines the detection of active DNA synthesis, through antibody based staining of BrdU, with total DNA content from propidium iodide. This allows for the clear separation of cells in G1 from early S phase, or late S phase from G2/M. Furthermore, this approach can be utilized to investigate the effects of many different cell stimuli and pharmacologic agents on the regulation of progression through these different cell cycle phases.
In this report we describe methods for labeling and staining cultured cells, as well as their analysis by flow cytometry. We also include experimental examples of how this method can be used to measure the effects of growth inhibiting signals from cytokines such as TGF-&beta;1, and proliferative inhibitors such as the cyclin dependent kinase inhibitor, p27KIP1. We also include an alternate protocol that allows for the analysis of cell cycle position in a sub-population of cells within a larger culture5. In this case, we demonstrate how to detect a cell cycle arrest in cells transfected with the retinoblastoma gene even when greatly outnumbered by untransfected cells in the same culture. These examples illustrate the many ways that DNA staining and flow cytometry can be utilized and adapted to investigate fundamental questions of mammalian cell cycle control.

Determining the cell cycle position of a population of cells, or understanding how signals affect proliferation, can be readily measured by flow cytometry using this protocol. We report a simple experimental approach to staining cells and quantifying their position in the cell cycle.

تحليل المركز دورة الخلية في خلايا الثدييات

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of ...

Visualization of Endoplasmic Reticulum Localized mRNAs in Mammalian Cells

In eukaryotes, most of the messenger RNAs (mRNAs) that encode secreted and membrane proteins are localized to the surface of the endoplasmic reticulum (ER). However, the visualization of these mRNAs can be challenging. This is especially true when only a fraction of the mRNA is ER-associated and their distribution to this organelle is obstructed by non-targeted (i.e. "free") transcripts. In order to monitor ER-associated mRNAs, we have developed a method in which cells are treated with a short exposure to a digitonin extraction solution that selectively permeabilizes the plasma membrane, and thus removes the cytoplasmic contents, while simultaneously maintaining the integrity of the ER. When this method is coupled with fluorescent in situ hybridization (FISH), one can clearly visualize ER-bound mRNAs by fluorescent microscopy. Using this protocol the degree of ER-association for either bulk poly(A) transcripts or specific mRNAs can be assessed and even quantified. In the process, one can use this assay to investigate the nature of mRNA-ER interactions.

Here we describe a method to visualize endoplasmic reticulum-associated mRNAs in mammalian tissue culture cells. This technique involves the selective permeabilization of the plasma membrane with digitonin to remove cytoplasmic contents followed by fluorescent in situ hybridization to detect either bulk poly(A) mRNA or specific transcripts.

تصور mRNAs والشبكة الإندوبلازمية في خلايا الثدييات المترجمة

In eukaryotes, most of the messenger RNAs (mRNAs) that encode secreted and membrane proteins are localized to the surface of the endoplasmic reticulum ...

Polysome Fractionation and Analysis of Mammalian Translatomes on a Genome-wide Scale

mRNA translation plays a central role in the regulation of gene expression and represents the most energy consuming process in mammalian cells. Accordingly, dysregulation of mRNA translation is considered to play a major role in a variety of pathological states including cancer. Ribosomes also host chaperones, which facilitate folding of nascent polypeptides, thereby modulating function and stability of newly synthesized polypeptides. In addition, emerging data indicate that ribosomes serve as a platform for a repertoire of signaling molecules, which are implicated in a variety of post-translational modifications of newly synthesized polypeptides as they emerge from the ribosome, and/or components of translational machinery. Herein, a well-established method of ribosome fractionation using sucrose density gradient centrifugation is described. In conjunction with the in-house developed &#8220;anota&#8221; algorithm this method allows direct determination of differential translation of individual mRNAs on a genome-wide scale. Moreover, this versatile protocol can be used for a variety of biochemical studies aiming to dissect the function of ribosome-associated protein complexes, including those that play a central role in folding and degradation of newly synthesized polypeptides.

Ribosomes play a central role in protein synthesis. Polyribosome (polysome) fractionation by sucrose density gradient centrifugation allows direct determination of translation efficiencies of individual mRNAs on a genome-wide scale. In addition, this method can be used for biochemical analysis of ribosome- and polysome-associated factors such as chaperones and signaling molecules.

Polysome تجزئة وتحليل الثدييات Translatomes على مقياس الجينوم على نطاق

mRNA translation plays a central role in the regulation of gene expression and represents the most energy consuming process in mammalian cells. ...

Measurement of Heme Synthesis Levels in Mammalian Cells

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in various molecular and cellular processes such as gene transcription, translation, cell differentiation and cell proliferation. The biosynthesis levels of heme vary across different tissues and cell types and is altered in diseased conditions such as anemia, neuropathy and cancer. This technique uses [4-14C] 5-aminolevulinic acid ([14C] 5-ALA), one of the early precursors in the heme biosynthesis pathway to measure the levels of heme synthesis in mammalian cells. This assay involves incubation of cells with [14C] 5-ALA followed by extraction of heme and measurement of the radioactivity incorporated into heme. This procedure is accurate and quick. This method measures the relative levels of heme biosynthesis rather than the total heme content. To demonstrate the use of this technique the levels of heme biosynthesis were measured in several mammalian cell lines.

Altered intracellular heme levels are associated with common diseases such as cancer. Thus, there is a need to measure heme biosynthesis levels in diverse cells. The goal of this protocol is to provide a fast and sensitive method to measure and compare the levels of heme synthesis in different cells.

قياس مستويات هيم في تخليق خلايا الثدييات

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in ...

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Cytosolic Ca2+ ions regulate numerous aspects of cellular activity in almost all cell types, controlling processes as wide-ranging as gene transcription, electrical excitability and cell proliferation. The diversity and specificity of Ca2+ signaling derives from mechanisms by which Ca2+ signals are generated to act over different time and spatial scales, ranging from cell-wide oscillations and waves occurring over the periods of minutes to local transient Ca2+ microdomains (Ca2+ puffs) lasting milliseconds. Recent advances in electron multiplied CCD (EMCCD) cameras now allow for imaging of local Ca2+ signals with a 128 x 128 pixel spatial resolution at rates of &#62;500 frames sec-1 (fps). This approach is highly parallel and enables the simultaneous monitoring of hundreds of channels or puff sites in a single experiment. However, the vast amounts of data generated (ca. 1 Gb per min) render visual identification and analysis of local Ca2+ events impracticable. Here we describe and demonstrate the procedures for the acquisition, detection, and analysis of local IP3-mediated Ca2+ signals in intact mammalian cells loaded with Ca2+ indicators using both wide-field epi-fluorescence (WF) and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. Furthermore, we describe an algorithm developed within the open-source software environment Python that automates the identification and analysis of these local Ca2+ signals. The algorithm localizes sites of Ca2+ release with sub-pixel resolution; allows user review of data; and outputs time sequences of fluorescence ratio signals together with amplitude and kinetic data in an Excel-compatible table.

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Here we present techniques for imaging local IP3-mediated Ca2+ events using fluorescence microscopy in intact mammalian cells loaded with Ca2+ indicators together with an algorithm that automates identification and analysis of these events.

التصوير المحلية الكالسيوم<sup&gt; 2+</sup&gt; الإشارات في خلايا الثدييات مثقف

Cytosolic Ca2+ ions regulate numerous aspects of cellular activity in almost all cell types, controlling processes as wide-ranging as gene transcription, ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex signaling mechanisms underlying filopodial initiation, elongation and subsequent stabilization or retraction, it is crucial to determine the spatio-temporal protein activity in these dynamic structures. To analyze protein function in filopodia, we recently developed a semi-automated tracking algorithm that adapts to filopodial shape-changes, thus allowing parallel analysis of protrusion dynamics and relative protein concentration along the whole filopodial length. Here, we present a detailed step-by-step protocol for optimized cell handling, image acquisition and software analysis. We further provide instructions for the use of optional features during image analysis and data representation, as well as troubleshooting guidelines for all critical steps along the way. Finally, we also include a comparison of the described image analysis software with other programs available for filopodia quantification. Together, the presented protocol provides a framework for accurate analysis of protein dynamics in filopodial protrusions using image analysis software.

We present a software solution for semi-automated tracking of relative protein concentration along the length of dynamic cellular protrusions.

واجهة المستخدم الرسومية لتتبع بمساعدة برنامج تركيز البروتين في النتوءات الخلوية الديناميكية

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...