הריונות רבים נכשלים בשלב מוקדם בהתפתחות העובר האנושי סביב שבע או שמונה לאחר ההפריה. פרוטוקול זה מציע הזדמנויות לחוקרים לגדל מושגים אנושיים במבחנה במהלך חלון ההשתלה המסתורי הזה. זה מאפשר לנו להבין את המנגנונים העומדים ביסוד ההצלחה של השתלה אנושית היווצרות שליה מוקדמת.
שימוש במערכת תרבות מורחבת לגידול עוברים אנושיים בשלב פרי-השתלה במבחנה הוא כנראה הדרך היחידה להשיג חומרים אותנטיים לחקר השתלה והתמדה מוקדמת של טרופובלסט. טכניקה פשוטה זו היא כלי רב עוצמה המאפשר לנו לענות על שאלות בסיסיות רבות על ההתפתחות המוקדמת האנושית. מחקר שנערך עם השימוש בפרוטוקול זה יתרום במידה רבה להבנת אובדן הריון מוקדם, כשל בהשתלה חוזרת ונשנית ופתולוגיות שליה.
הפגנת ההליך תהיה דירדרה לוגסון, סטודנטית לדוקטורט ממעבדה. יום אחד לפני התחממות העובר, הכינו את לוחות התקשורת וההתאוששות במכסה המנוע של זרימה למינארית סטרילית. מלאו שתי מנות שטיפת תרבות איברים מרכזיות היטב ב-500 מיקרוליטרים של BM עם 10%SPS, ולאחר מכן כסו את ה-BM ב-500 מיקרוליטרים של שמן ברמת תרבות העוברים.
בצלחת תרבות רקמה 16 מילימטר, שכבה שמונה מיליליטר של שמן תרבות העובר עוגן 20 טיפות microliter של BM עם 10% SPS לתחתית. לצייד את כלים לשטוף צלחת התאוששות באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס, 6% פחמן דו חמצני ו 5% חמצן לפחות ארבע שעות. Aliquot כארבעה מיליליטר של IVC 1 לתוך צינור כובע הצמד חמישה מיליליטר ולהכין צלחת כביסה אחת עם 500 microliters של IVC 1 ללא כיסוי שמן.
יש לצייד את המנה והצינור באינקובטור למשך ארבע שעות לפחות. לדלל פיברונאטין מנסיוב אנושי ב PBS ל 30 מיקרוגרם למיליליטר. פתח את שמונה חבילת כיסויים תאים היטב דואג לא לגעת בארות, ואז בעדינות pipette 250 microliters של fibronectin לתוך כל באר.
החלף את המכסה על כיסוי הדגירה אותו בארבע מעלות צלזיוס במשך 20 עד 24 שעות. הכינו את צלחת התרבות המורחבת בבוקר של התחממות העוברים. אחזר את החלקת הכיסוי התאית עם פיברונקין והצב אותה במכסה המנוע של הזרימה למינארית.
לאחר מכן להסיר את תערובת fibronectin עם פיפטה מיליליטר אחד להשליך אותו. פיפטה 300 microliters של IVC שיווי משקל 1 לתוך כל באר ולמקום את הכיסוי לתוך החממה עד הסרת שונה pellucida. לאחר התחממות והתאוששות של העוברים האנושיים D5, להעריך אותם להתרחבות מחדש ולצלם של כל עובר.
העבר כל עובר ל- 500 מיקרוליטרים של אמצעי טיפול במאגר MOPS עם 5%FCS. ואז לטפל בו עם הפתרון של טיירוד חומצי כמתואר בכתב היד טקסט. מיד להזיז את העובר עם zona מתמוסס לתוך 300 microliters של מדיום חנית MOPS מחומם כדי להרווה את הפתרון של טירודה.
ואז להעביר את העובר לתוך צלחת רקמת איברים באר מרכזית המכילה את BM משובץ עם 10% SPS תחת שמן כיתה תרבות העובר. ואז להחזיר את העובר לירידה 20 התאוששות microliter. בנפרד להעביר את העוברים לצלחת לשטוף עם המדיה IVC 1 שיווי משקל, ואז בזהירות להעביר כל עובר ל הבאר של כיסוי התא, הקפדה לעקוב אחר זיהוי העובר.
החזירו את הכיסויים הקאמריים לאנקובטור שנקבע ל-37 מעלות צלזיוס, 6% פחמן דו-חמצני וחמצן אטמוספרי למשך יומיים. ביום השני, בחנו היטב את ההחזקה של העוברים מתחת למיקרוסקופ והחליפו את התקשורת. לדעת איזה עובר מחובר לצלחת על ידי הקשה עדין על הצלחת.
כדי לשנות את התקשורת, להסיר את המכסה בזהירות שאפו 150 microliters של IVC 1, דואג לא להפריע העובר המצורף. אם העובר עדיין לא מחובר לצלחת, אל תחליף את התקשורת מכיוון שהנסיוב ב- IVC 1 יסייע בהחזקה. לאט לאט pipette 150 microliters של מדיה תרבותית מורחבת שווה, IVC 2 לתוך כל באר ולהחליף את המכסה על כיסוי.
החזיר בזהירות את הכיסויים הקאמריים לאנקובטור. חזור על חילופי מדיה ובדיקה מצורפת כל יום עד העוברים מוכנים קיבעון או עיכול תא יחיד. אם אוסף של מדיה בילה הכרחי לניתוח נוסף, הצמד להקפיא את 150 microliters של IVC הוסר 1 לתוך צינור סטרילי נמוך לאגד 0.5 מיליליטר.
לשטוף כל עובר פעם אחת עם 200 microliters של PBS, ולאחר מכן להוסיף 200 microliters של פתרון טריפסין לכל באר. החזירו את הכיסויים הקאמריים לאנקובטור לחמש דקות. השתמש פיפטה קטנה או פיפטה בפה משוך דק להרים MTB בודדים ואז להשתמש פיפטה גדולה יותר בעדינות לנתק את העובר על ידי שאיפה למעלה ולמטה.
המשך לשאוב את העובר בעדינות ושוב ושוב באמצעות קצה פיפטה בקוטר קטן יותר עד שהעובר הודגר במשך סך של 10 דקות ב טריפסין. כדי לבצע בחירת תא יחיד, להעביר את התאים דיסוציאציה דרך 320 טיפות לשטוף microliter של PBS ו 0.1% PVP תחת שמן תרבות העובר, דואג לא לאבד תאים. לאחר שטיפת התאים להשתמש פיפטה זכוכית משוך דק כדי לבחור תא אחד.
בזהירות pipette התא הבודד לתוך צינור קשירה נמוך סטרילי 0.2 מיליליטר עם נפח מינימלי של PBS ו PVP. הצמד תאים בודדים חינם בחנקן נוזלי ולאחסן אותם ב 80 מעלות צלזיוס שלילי לשימוש נוסף. עוברים בריאים הפגינו התפשטות מתמשכת במהלך התרבות המורחבת, בעוד עוברים חריגים החלו לסגת מהקצוות החיצוניים שלהם להתפורר.
ביום שמונה לאחר ההפריה, רוב התאים בעוברים היו ציטוטרופיבלסט או CTBs, שהיו חיוביים עבור סמן trophoblast GATA-3. בפריפריה של העובר, CTBs כבר התבהר לתוך סינקטיוטרופיבלסטים מרובי גרעינים, אשר היה גיליון כמו המראה מוכתם חיובי עבור בני אדם CGB. ביום 10, היווצרותם של תאי טרופובלסט נודדים חיוביים של CGB הייתה מקסימלית, אשר אושרה על ידי העלייה בייצור HCG בשלב זה.
טרופובלסטים נודדים שהכתימו חיובי עבור HLA-G, החלו גם הם לצאת ולהגר הרחק מגוף העובר. ביום 12, התמדת STB הייתה בירידה וייצור MTB הפך בולט יותר, מה שמרמז על שינוי של דגש מייצור הורמון ביום 10 להגירה סלולרית ביום 12. שינויים אלה ניתן לראות וידאו לשגות זמן של תקופת ההשתלה פרי.
הסרטון מדגים את קריסתו של blastocele, היווצרות STB, ואת ההתברמות וההגירה בסופו של דבר של MTB. הדבר החשוב ביותר שיש לזכור בעת השלמת הליך זה הוא שאתה עובד עם עוברים חיים רגישים לשינויים בטמפרטורה, osmolality ו- pH. צמצום משך הזמן שהמנות יוצאות מהאינקובטור הוא קריטי לשמירה על בריאות העובר.
לאחר השלמת הליך זה, החוקרים יכולים להשתמש בתאים בודדים מבודדים עבור בדיקות omics תא יחיד במורד הזרם, כגון רצף RNA תא יחיד רצף דו-קוטבי הגנום כולו כדי להבין טוב יותר שינויים אפיגנטיים ותעתיקים במהלך ההשתלה האנושית היווצרות השליה המוקדמת.
