כיצד ניתן לכמת את השבר של Photoactivated פלורסנט חלבונים בכמות גדולה, תאים חיים

אנו מציגים כאן פרוטוקול הכולל חלבונים מובחנים מבחינה גנטית הניתנים להפעלה באמצעות פוטו ופלורסנט. שליטים פנימיים אלה מאפשרים לכמת את שבר ה-PAFP המופעל באמצעות תמונה כדי להיות פלואורסצנטי. עד כה, לא הייתה שיטה זמינה לכמת בכמויות גדולות בתאי החיים כמה מה-PAFP המובעים הם תמונה המופעלת ל פלואורסצנטיה. הכימות המוצג של יעילות הפעלת תמונות בא לידי ביטוי עבור PA-GFP ו- PA Cherry בתאים חיים, אך הוא ישים באופן עקרוני וניתן להשתמש בו עבור כל חלבון פלואורסצנטי הניתן להפעלה פוטו בכל תנאי ניסיוני. בכל פעם עבודה עם חלבונים פלואורסצנטיים מקודדים גנטית, הכמות המוחלטת של חלבונים לידי ביטוי משתנה מתא לתא וזה לא ידוע. כדי לתקנן את הביטוי בין התאים, אנו מציגים סרגלים פנימיים של חלבונים פלואורסצנטיים מובחנים מבחינה גנטית. על ידי צימוד המידע הגנטי של חלבון פלורסנט הניתן להפעלה פוטו לנבדל ספקטרלי תמיד על סרגלים פנימיים של חלבון פלואורסצנטי נוצרים שעדיין יבואו לידי ביטוי בכמות כוללת לא ידועה אך בכמות יחסית ידועה קבועה של אחד לאחד. כדי להתחיל לבנות את הפלסמידים כמתואר בפרוטוקול הטקסט הנלווה. כמו כן, תרבות בקו התא הסטנדרטי במדיום הפרספקטיבה שלה באמצעות הגרסה פנול אדום חינם. כאשר מוכן להתחיל את הניסוי, לקצור את התאים באמצעות טריפסין ללא פנול אדום כדי להפחית את הפלורציה ברקע. לאחר הקציר, למלא פיפטה 2 מ"ל עם ההשעיה התא מתרבות תאים confluent גדל בבקבוק תרבות תא T 12.5. הוסף טיפה אחת לכל תא של מגלשת זכוכית תאית שמונה. הדגירה את השקופית בתנאי תרבות תאים סטנדרטיים במשך 24 שעות. לאחר מכן, התפנית הבאה תדביק את התאים באמצעות רייגנטים מסחריים בהתאם לפרוטוקול המפיצים. להדביק את התאים עם דובדבן GFP, PA-GFP דובדבן ו GFPPA שרי כימרות. לאחר מכן החזירו את התאים לחממה כדי לאפשר ביטוי חלבון, קיפול והתבגרות. לאחר 20 שעות לאחר ההתמזגות, העבירו את התאים לשלב של מיקרוסקופ פלורסנטי קונפוקאלי המצויד בתא הסביבתי הלח והחומם שהתחמם מראש ל-37