EJV נתמך על ידי מענק מן ה-S &amp; קרוהן קוליטיס קרן של אמריקה (CCFA). JRM הוא נתמך על ידי מענקים CCFA, Cancer Research Institute (CRI), הווארד ח גודמן (MGH), מסצ&#39;וסטס Life Science Center (MLSC) ואת פרס ממציא ניו NIH של המנהל.

1. Ex vivo הדור של תאים T מעיים ביות ושליטה (ראה תרשים 1) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בודד splenocytes מוחצים one טחול מעכברים סוג בר. Resuspend ההשעיה תאים PBS ו צנטריפוגות במשך 5 &#39;ב 400 x ז הסר את supernatant ו lyse את כדוריות הדם האדומות על ידי resuspending התא גלולה של 4 מ&quot;ל של חיץ תמוגה ACK עבור 2-3 דקות. לאחר מכן, להוסיף 5 מ&quot;ל של PBS. צנטריפוגה עבור 5 &#39;ב XG 400 ולהסיר את supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend splenocytes סך של 1 x 10 6 / מ&quot;ל ב IMDM + 10% FBS + 50 מ&quot;מ + 2-mercaptoethanol פניצילין / סטרפטומיצין (IMDM מלא). הפרד את התאים לשתי קבוצות, שאחת מהן היא להשלים עם RA (או סינתטיים RAR-אגוניסטים, כגון Am80 או Am580) לריכוז סופי של nM 100-200 3. בתאי T מופעל בנוכחות של RA או RAR-אגוניסטים יהיה upregulate a4b7and CCR9 ויהפוך מעיים טרופי בתאי T, בעוד שתאי T מופעלים ללא RA יהפכו T תאים שליטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1.5-2.0 מ&quot;ל של ההשעיה התא היטב בכל צלחת 24 באר מצופה בעבר עם אנטי CD3 (10 מ&quot;ג / מ&quot;ל) אנטי CD28 (10 מ&quot;ג / מ&quot;ל) ו לדגור על 37 מעלות צלזיוס CO 5% 2 (לציפוי הצלחת להוסיף 500 מ&quot;ל / היטב אנטי CD3 בתוספת אנטי CD28 ב PBS ו דגירה עבור 2 שעות 37 ˚ C ולאחר מכן לשטוף פעמיים עם 2 מ&quot;ל PBS). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי למנוע גירוי יתר תא T, לאחר 2-3 ימים להעביר את המתלים התא לתוך צלחת חדשה 24 גם ללא ציפוי. דגירה של 2-3 ימים נוספים. בהתאם צפיפות התאים ואת ריבוי כלי התקשורת עלול להיות חומצה (צהוב), ובמקרה זה עשוי להיות נחוץ כדי להחליף מחצית התקשורת עם IMDM שלם טרי. קציר התאים לאחר 4-5 ימים (הספירה מהיום 0). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התשואות הסופי אופייניות הן 1-2 x 10 6 תאים T מפעיל / היטב. לכן, מינימום של 9-12 בארות של כל המעי, ותאי T טרופי ושליטה בתאי T צריך להיות מצופה על מנת בסופו של דבר עם 10-20 x 10 6 תאים T לכל מצב. </li></ol> 2. ניתוח מעיים ביות על הפעלת קולטנים בתאי T לאחר 4-5 ימים של תרבות אנחנו צריכים לצפות ביטוי גבוה של רצפטורים מעיים ביות a4b7and CCR9 על שתאי T מופעלים בנוכחות אגוניסטים RA או RAR, בעוד בקרה בתאי T צריך להביע רמות נמוכות מאוד של קולטנים אלה 4. Cytometry זרימה (FACS) ניתוח. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף בין 0.2-0.5 x10 6 תאים בצנטריפוגה במשך 5 דק &#39;ב 300 גר&#39; ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה עם אנטי CD4-FITC, אנטי a4b7-PE (BD Biosciences), אנטי CCR9-APC (eBiosciences) ואנטי CD8-PercP במשך 15 דקות ב 4 ° C בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר דגירה, צנטריפוגות במשך 5 דקות ב 300 גרם 4 ° C. לשטוף ו resuspend התאים מכתים חיץ ולנתח ידי FACS. </li></ol> 3. תיוג תא T עם עוקבים CFSE ו CMTMR תא <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור את כל הפתרונות על 37 מעלות צלזיוס לפני שמתחילים. לשטוף מעיים טרופי ותאי T (a4b7 גבוהה CCR9 גבוהה) ושליטה בתאי T (a4b7 נמוכה / נג CCR9 נמוכה / נג) פעמיים עם PBS להסיר את בסרום. התאם את הריכוז תא T ל 10-15 x 10 6 / מ&quot;ל PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף CFSE (Carboxyfluorescein succinimidyl אסתר) או CMTMR (chloromethyl-בנזואיל-amino-tetramethylrhodamine) fluorophores אל T-טרופי או בטן מלאה בתאי T ריכוז סופי של 5 מ&quot;מ ו 10 מ&quot;מ, בהתאמה, מערבולת בעדינות דגירה של 20 דקות בשעה 37 ° C. מומלץ להחליף את labelings באותו או בניסוי נפרד על מנת למנוע תופעות מהותי הפוטנציאל של fluorophores על נדידת תאים טי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר דגירה, להרוות עם נפח של 1 FBS ו דגירה של 1-5 דקות בטמפרטורת החדר. מדולל 10 פעמים עם PBS חם צנטריפוגות 5 דקות ב 300 גרם שטפו פעמיים עם PBS ו resuspend ב IMDM להשלים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באופן אידיאלי, 10-20 x 10 6 התאים של כל האוכלוסייה T צריכה להיות מעורבת ביחס של 1:1 ולאחר מכן centrifuged XG ב 300 דקות 5. לבסוף, resuspend התאים 200-250 מ&quot;ל של PBS חמה מזריקים דרך וריד הזנב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לחשב את יחס קלט המדויק (רצוי קרוב ל 1) לחסוך 5-10 מ&quot;ל של השעיה התא שהוחדר ו לדלל עם 300 מ&quot;ל של PBS ולנתח ידי FACS. </li></ol> 4. ניתוח של תא T ביות אמנם בעכברים ניתן לנתח בנקודות זמן שונות (בין 1 שעות שלאחר מספר ימים הזרקת תא T), ביות של המעיים ותאי T-טרופי מתועדת הטוב ביותר בין 12-24 שעות שלאחר ההזרקה. נקודות זמן רב יותר להגדיל את ההשפעות האפשריות של משתנים אחרים המשפיעים על התא האחרון מספרים / יחסי, כמו אפופטוזיס תא T ו-T תא יציאה מן הרקמה. לאחר בעכברים מורדמים, השעיות תאים מרקמות כמה צריך להיות מבודד ללא דיחוי על מנת להקטין מוות של תאים, אשר עשויים להשפיע על התשואות הסופי ואת התוצאות. רקמות של עניין הם המעי הגס קטן, הטחול, בלוטות הלימפה, תיקונים של Peyer, כבד, ריאות ודם. אםבתאי T מוזרק הם בתום לב מעיים טרופי בתאי T, הם צריכים בית על פי 50-10 בממוצע טוב יותר (או יותר) על רירית המעי הדק לעומת בקרה בתאי T. עם זאת, רקמות אחרות, כגון דם הטחול, לא צריך להציג הגירה מועדף תא T. בידוד של לימפוציטים מתוך lamina propria במעי תא intraepithelial תוארה בעבר 5. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכתים FACS: דוגמאות הן resuspended תלוי במספר התאים שנאספו, בצפיפות לא גבוהה יותר מאשר 3.0 x 10 6 תאים / מ&quot;ל. אם congenic CD45.1 + + או Thy1.1 עכברים ששימשו נמענים, התאים הם מוכתמים סמן congenic המתאים (למשל, CD45.2 או Thy1.2) בשילוב עם סמן כמה השושלת (למשל, TCRbchain, CD4, CD8 , CD45.1 + / CD45.2 +). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך ניתוח FACS, תאים מגודרת על סמן congenic (למשל CD45.1) ולאחר מכן על סמנים ספציפיים השושלת (למשל CD4/CD8) ונותחו על היחסים בין CMTMR ותאי CFSE חיובית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנתונים בא לידי ביטוי בדרך כלל מדד ביות (HI), אשר מחושב CFSE היחס / CMTMR (או CMTMR / CFSE) ברקמות בכל חלקי יחס הקלט המתאים (ראה להלן). אם יחס קלט קרוב מאוד 1, ולאחר מכן את רקמת היחסים יהיה שווה ערך ל HI. </li></ol> היי = רקמה / CMTMR רקמות CFSE: קלט / קלט CMTMR CFSE דם צריך גם להיות מנותח על מנת לקבוע אם הן אוכלוסיות תאים T מיוצגים באופן שווה במחזור הדם או אם אוכלוסיית תאים T יורדת ביחס אחרות (למשל, על ידי לכידה מועדף בריאות / כבד או הכדאיות ירד). זה עלול לקרות כאשר משווים נאיבי או מנוחה לתאי T זיכרון לעומת הופעל לאחרונה בתאי T מפעיל, שכן האחרון עלול להיות לכודים במידה רבה יותר בתוך הריאות. אם HI בדם היא שונה משמעותית מ 1, אפשר לנרמל HI ברקמות ידי HI בדם. דם ניתן להשיג באמצעות לנקב לב מעכברים הרדים (עם המתת חסד Avertin או isofluorane מראש) ויש lysed פעמיים לפני השימוש בו מכתים FACS עם חיץ ACK. נורמליזציה דם = HI רקמה / HI דם 5. נציג תוצאות עכברים נמען (Thy1.1 +) היו תאים euthanized18h הזרקת הודעה. המתלים Cell נוצרו מן הטחול, בלוטות הלימפה ההיקפית (PLN), בלוטות לימפה mesenteric (mln) ובמעי הדק lamina propia (LP). לאחר שהתאים היו מוכתמים עבור Thy1.2 ו CD8 ולאחר מכן נותחו על ידי FACS gating על ידי קיימא Thy1.2 + CD8 + תאים, אשר נבדקו לבסוף על היחס בין CMTMR תאים + (מעיים טרופי ותאי T) ו CFSE + תאים (שליטה ותאי T) מחולק יחס קלט. התוצאות יכול להיות מוצג כפי שמוצג באיור 2, שבו ניתן להעריך כי מעיים טרופי ושליטה בתאי T התבייתו שווה על הטחול (HI קרוב to1, ציין עם קו אדום). לעומת זאת, הבטן טרופי בתאי T היגרו כ -10 פעמים יותר ביעילות LP לעומת בקרה בתאי T. <img src="/files/ftp_upload/2619/2619fig1.jpg" alt="איור 1" /> Figure1:. דיאגרמה המציגה את הדור וסימון של טרופי בטן ולא במעיים טרופי T לתאים ותאי T מבודדים מעכברים סוג בר מופעל עם anti-CD3/anti-CD28 ועל נוכחות או היעדר של 100-200 nM כל - טרנס retinoic חומצה (ע&quot;ר). לאחר 4-5 ימים RA שטופלו תא T תרכוש את הביטוי של קולטנים ביות בטן CCR9 ו a4b7. ואז, מעיים טרופי ושליטה בתאי T מסומנים באופן דיפרנציאלי עם CFSE או CMTMR, שטף, מעורבת ביחס של 1:1 ו מוזרק עכבר לנמען דרך וריד הזנב. תאים מסוימים שכותרתו משמשות כדי לקבוע את היחס CFSE / CMTMR קלט (יש קרוב ל 1). <img src="/files/ftp_upload/2619/2619fig2.jpg" alt="איור 2" /> Figure2:. עכברים דוגמה של ניתוח ביות ניתח 12-18 שעות שלאחר הזרקת T התא השעיות תא בודד מתקבלים איברים של עניין. התאים הם מוכתמים אנטי Thy1.2 (סמן congenic) בתוספת אנטי CD8 ואז Thy1.2 + CD8 + T תאים מנותחים על יחס של CMTMR + + ו CFSE תאים ברקמות על ידי כל FACS. CMTMR / CFSE יחסי רקמה מנורמל אז לפי היחס בין קלט CMTMR / CFSE כדי להשיג את מדדי ביות (HI). ב + דוגמה זו CMTMR ו CFSE תאים + הם מעיים טרופי ועל מפעיל בקרה בתאי T, בהתאמה.

<ol>
	<li>Butcher, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte-endothelial+cell+recognition:+Three+(or+more)+steps+to+specificity+and+diversity.">Leukocyte-endothelial cell recognition: Three (or more) steps to specificity and diversity.</a> Cell. 67, 1033-1036 (1991).</li><li>Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traffic+signals+for+lymphocyte+recirculation+and+leukocyte+emigration:+the+multistep+paradigm.">Traffic signals for lymphocyte recirculation and leukocyte emigration: the multistep paradigm.</a> Cell. 76, 301-314 (1994).</li><li>Iwata, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid+imprints+gut-homing+specificity+on+T+cells.">Retinoic acid imprints gut-homing specificity on T cells.</a> Immunity. 21, 527-538 (2004).</li><li>Mora, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reciprocal+and+dynamic+control+of+CD8+T+cell+homing+by+dendritic+cells+from+skin-+and+gut-associated+lymphoid+tissues.">Reciprocal and dynamic control of CD8 T cell homing by dendritic cells from skin- and gut-associated lymphoid tissues.</a> J Exp Med. 201, 303-316 (2005).</li><li>Mora, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+imprinting+of+gut-homing+T+cells+by+Peyer's+patch+dendritic+cells.">Selective imprinting of gut-homing T cells by Peyer's patch dendritic cells.</a> Nature. 424, 88-93 (2003).</li><li>Mempel, T. R., Scimone, M. L., Mora, J. R., von Andrian, U. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+leukocyte+trafficking+in+blood+vessels+and+tissues.">In vivo imaging of leukocyte trafficking in blood vessels and tissues.</a> Curr Opin Immunol. 16, 406-417 (2004).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

למרות ניסויים ביות לספק מידע בעל ערך רב על הגירה של אוכלוסיות תאים ברקמות סך נתון, יש לזכור כי מבחני אלו אינן ישירות לנתח הידבקות האנדותל, ולכן לא להפלות שבו צעד (ים) של הידבקות רב שלבי אשד (קשירה / מתגלגל, הפעלה או דבק) קולטן ביות נתון פועל. תקן הזהב להגדיר את התפקיד הספצ...

בעלי חיים: C57BL עכברים / 6 משמשים בדרך כלל עבור בידוד תא T. בנוסף, CD45.1 ו Thy1.1 זנים congenic זמינים דרך ג&#39;קסון מעבדות (בר הרבור, ME). תרבות התקשורת: IMDM (Medium השתנה Iscove של של Dulbecco + L-גלוטמין + Hepes) בתוספת 10% חום מומת FBS (עוברית שור רעלן פנימי סרום, נמוך, Gibco ®, Invitrogen, בקרלסבד, קליפורניה) בתוספת 100 U / ml פניצילין, 100 מ&quot;ג / ml סטרפטומיצין (אנטיביוטיקה HyClone, Waltham, MA), 0.5 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​fungizone / amphotericin B (Gibco), ו - 50 מ&quot;מ ב-mercaptoethanol. תא דם אדום ACK תמוגה חיץ (RBC, 10 mM KHCO 3, 150 מ&quot;מ NH 4 Cl, 0.1 mM EDTA, pH 8.0), כדי להתאים את pH 7.2-7.4 ולאחסן בטמפרטורת החדר). PBS (פוספט בופר, Hyclone, Waltham, MA). Cytometry זרימה (FACS) מדיה (PBS או IMDM + 2% FBS + 5 mM EDTA). כאשר מכתים באמצעות selectin-Fc מפלצות, התקשורת עם 2 mM Ca + + יש להשתמש בכל האמצעים (כולל רכישת FACS). IMDM מומלץ במקרה זה. T תיוג תא ולהעביר המאמצת: CFSE (diacetate carboxyfluorescein, succinimidyl אסתר), CMTMR ((5 - (ו-6 )-((( 4-chloromethyl) בנזואיל) אמינו) tetramethylrhodamine) מתוך בדיקות מולקולריות ®, Invitrogen, בקרלסבד, קליפורניה ). 1000 x במניות צריכה להתבצע DMSO (5 CFSE מ&quot;מ, 20 מ&quot;מ CMTMR) ומאוחסנים ב -20 ° C. Polyclonal הפעלת תא T: 24-96-יפה או גם צלחות (רקמות תרבות מטופלים, קלקר, שטוחות תחתית עם מכסה, BD פלקון, פרנקלין לייקס, ניו ג&#39;רזי) מודגרת עבור 2 שעות על 37 מעלות צלזיוס עם 50 מ&quot;ל PBS, בהתאמה , המכיל אנטי CD3 בתוספת אנטי CD28 נוגדנים (10 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​כל אחד). ואז, צלחות תרבות נשטפים פעמיים עם PBS ומשומשים מיד לתרבות תא T. לחלופין, Dynabeads מצופה anti-CD3/anti-CD28 (Dynal, Invitrogen, בקרלסבד, קליפורניה) יכול לשמש להפעלת תא T במקום צלחת הנכנס נוגדנים. תזרים cytometry (FACS) מכתים: הפעלת polyclonal: CD3 (1452C11), CD28 (37.51). Lineage MAB: CD4 (L3T4), CD8a (Ly-2), Thy1.2 (CD90.2/53-1.2), CD45.2 (104). Gut-ביות קולטנים: מטוהרים CCR9 (CD199/eBioCW-1.2, eBioscience, סן דייגו, קליפורניה), a4b7 (LPAM-1/DATK3), אלוטיפ שליטה (IgG2a, יא). עור ביות קולטנים: P-selectin-Fc (מטוהרים מאוס P-selectin - חלבון IgG Fusion, BD Pharmingen, בסן חוזה, קליפורניה), E-selectin-Fc (E-Selectin/Fc עכבר רקומביננטי כימרה, R &amp; D מערכות, מיניאפוליס, MN) בתוספת עז המקביל משני מגיב F (ab &#39;) 2 אנטי אנושי IgG R-PE (Invitrogen, בקרלסבד, קליפורניה). All-טרנס החומצה הרטינואית (Sigma, סנט לואיס, מיזורי) הוא resuspended באתנול DMSO מוחלטת או באמצעות נורה צהובה או מקור אור עקיף במהלך הכנת. Aliquots חנות בתוך צלוחיות זכוכית -80 מעלות צלזיוס ומוגן מפני אור בכל עת. Synthetic-RAR אגוניסטים: Am80 (Wako כימיקלים, ריצ&#39;מונד, VA).

competitive homing assays to study gut-tropic t cell migration

על מנת להפעיל לימפוציטים תפקידם צריכים לעזוב את הדם ולנדוד לרקמות שונות בגוף. הידבקות הלימפוציטים לתאי האנדותל extravasation רקמות הוא תהליך רב שלבי נשלט על ידי מולקולות הדבקה שונות (קולטנים ביות) הביע על לימפוציטים ו ligands שלהם (addressins) מוצג לתאי אנדותל 1 2. אף על פי פונקציה של קולטנים אלה הדבקה ניתן ללמוד באופן חלקי לשעבר vivo, את המבחן האולטימטיבי רלוונטיות פיזיולוגיים שלהם הוא להעריך את תפקידם במהלך הידבקות ב לימפוציטים הגירה vivo ו. שתי אסטרטגיות משלימות שימשו למטרה זו: מיקרוסקופיה intravital (IVM) וניסויים ביות. למרות IVM כבר חיוני להגדיר את התרומה המדויקת של הידבקות קולטנים ספציפיים במהלך מפל הידבקות בזמן אמת ברקמות שונות, IVM היא זמן רב ועבודה אינטנסיבית, לעתים קרובות מחייב פיתוח של שיטות ניתוח מתוחכם, הוא צריך בידוד מראש של הומוגנית אוכלוסיות תאים וזה מאפשר ניתוח של איבר אחד בלבד רקמה / בכל זמן נתון. לעומת זאת, ניסויים ביות תחרותי לאפשר השוואה ישירה סימולטני הגירה של שני (או אפילו יותר) תת תא העכבר אותו והם גם היתר ניתוח של רקמות רבות של מספר גבוה של תאים בניסוי זהה. כאן אנו מתארים את פרוטוקול קלאסית ביות תחרותי בשימוש כדי לקבוע את היתרון / חיסרון של סוג תא נתון לבית לרקמות ספציפיות לעומת האוכלוסייה תא שליטה. בחרנו להדגים את מאפייני הנדידה של טרופי בטן לעומת הלא קרביים טרופי בתאי T, כי רירית המעי הוא משטח הגוף הגדול ביותר במגע עם הסביבה החיצונית, והיא גם רקמת הלימפה במיוחד עם מיטב מוגדרים דרישות הנדידה . יתר על כן, העבודה האחרונה קבעה כי הוויטמין חומצה המטבוליט כל טרנס retinoic (ע&quot;ר) הוא המנגנון המולקולרי האחראי העיקרי גרימת בטן ספציפי קולטנים הידבקות (integrin קולטן a4b7and chemokine CCR9) על לימפוציטים. לפיכך, אנו יכולים בקלות ליצור מספר רב של vivo לשעבר מעיים טרופי ולא מעיים טרופי ידי הפעלת לימפוציטים ותאי T בנוכחות או היעדרו של RA, בהתאמה, אשר ניתן להשתמש בהם בסופו של דבר בניסויים ביות תחרותי המתואר כאן.

Watch this Scientific Journal Video about Competitive Homing Assays to Study Gut-tropic T Cell Migration at JoVE.com

Competitive Homing Assays to Study Gut-tropic T Cell Migration

ניסויים ביות תחרותי לאפשר ישירות להעריך את מאפייני הנדידה של שתי אוכלוסיות תאים שונות עכבר אחת. כאן אנו מדגימים הליך זה על ידי השוואת ההגירה לשעבר טרופי-vivo הבטן שנוצר לעומת אי - טי בטן תאים טרופי.

מבחני ביות תחרותי לחקר נדידת גוט-טרופי T Cell

In order to exert their function lymphocytes need to leave the blood and migrate into different tissues in the body. Lymphocyte adhesion to endothelial ...

competitive-homing-assays-to-study-gut-tropic-t-cell-migration

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

12.4K Views.  Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School. ניסויים ביות תחרותי לאפשר ישירות להעריך את מאפייני הנדידה של שתי אוכלוסיות תאים שונות עכבר אחת. כאן אנו מדגימים הליך זה על ידי השוואת ההגירה לשעבר טרופי-vivo הבטן שנוצר לעומת אי - טי בטן תאים טרופי.

Video: Competitive Homing Assays to Study Gut-tropic T Cell Migration

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

The migration of T lymphocytes involves the adhesive interaction of cell surface integrins with ligands expressed on other cells or with extracellular matrix proteins. The precise spatiotemporal activation of integrins from a low affinity state to a high affinity state at the cell leading edge is important for T lymphocyte migration 1. Likewise, retraction of the cell trailing edge, or uropod, is a necessary step in maintaining persistent integrin-dependent T lymphocyte motility 2. Many therapeutic approaches to autoimmune or inflammatory diseases target integrins as a means to inhibit the excessive recruitment and migration of leukocytes 3. To study the molecular events that regulate human T lymphocyte migration, we have utilized an in vitro system to analyze cell migration on a two-dimensional substrate that mimics the environment that a T lymphocyte encounters during recruitment from the vasculature. T lymphocytes are first isolated from human donors and are then stimulated and cultured for seven to ten days. During the assay, T lymphocytes are allowed to adhere and migrate on a substrate coated with intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1), a ligand for integrin LFA-1, and stromal cell-derived factor-1 (SDF-1). Our data show that T lymphocytes exhibit a migratory velocity of ~15 &mu;m/min. T lymphocyte migration can be inhibited by integrin blockade 1 or by inhibitors of the cellular actomyosin machinery that regulates cell migration 2.

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

T lymphocyte migration occurs during homing to lymphoid organs, exit from the vasculature, and entering into peripheral tissues. Here, we describe a protocol that can be used to analyze T lymphocyte migration in vitro.

האדם בידוד T לימפוציטים, התרבות ניתוח של הגירה במבחנה</em

The migration of T lymphocytes involves the adhesive interaction of cell surface integrins with ligands expressed on other cells or with extracellular ...

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists. The value of 2P microscopy is that it provides rich spatiotemporal information regarding cell behaviors within intact tissues and in live mice. Leukocyte recruitment plays a significant role in host defense against infection and when unchecked, can contribute to inflammatory and autoimmune diseases. Studying leukocyte recruitment in vivo is technically challenging since cells are moving rapidly within vessels located deep within light scattering tissues. To date, most intravital imaging studies require surgical preparation to expose the blood vessels and tissues. To avoid the tissue damage and inflammation induced by surgery itself, here, we describe a non-invasive single-cell imaging approach that can be used to study leukocyte trafficking in the mouse footpad and phalanges. We discuss the technical aspects of our 2P imaging preparation and walk the reader through a typical experiment from initial set up to execution and data collection.

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Here, we describe a non-invasive two-photon (2P) microscopy approach to study leukocyte homing in the mouse footpad. We discuss the technical aspects of our tissue imaging preparation and walk the reader through a typical experiment from initial set up to execution and data collection.

לא פולשני הדמיה של ביות ליקוציט והגירה In vivo</em

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists.  The value of 2P microscopy is that it ...

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen presenting cells (APCs)1. This recognition leads to the activation of T-cells and a series of functional outcomes (e.g. cytokine production, killing of the target cells). Understanding the functional role of TCRs is critical to harness the power of the immune system to treat a variety of immunology related diseases (e.g. cancer or autoimmunity).
It is convenient to study TCRs in mouse models, which can be accomplished in several ways. Making TCR transgenic mouse models is costly and time-consuming and currently there are only a limited number of them available2-4. Alternatively, mice with antigen-specific T-cells can be generated by bone marrow chimera. This method also takes several weeks and requires expertise5. Retroviral transduction of TCRs into in vitro activated mouse T-cells is a quick and relatively easy method to obtain T-cells of desired peptide-MHC specificity. Antigen-specific T-cells can be generated in one week and used in any downstream applications. Studying transduced T-cells also has direct application to human immunotherapy, as adoptive transfer of human T-cells transduced with antigen-specific TCRs is an emerging strategy for cancer treatment6.
Here we present a protocol to retrovirally transduce TCRs into in vitro activated mouse T-cells. Both human and mouse TCR genes can be used. Retroviruses carrying specific TCR genes are generated and used to infect mouse T-cells activated with anti-CD3 and anti-CD28 antibodies. After in vitro expansion, transduced T-cells are analyzed by flow cytometry.

We present a protocol to produce antigen-specific mouse T-cells using retroviral transduction

התמרה retroviral של T-cell קולטנים עכבר מתאי T

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

A Quantitative Evaluation of Cell Migration by the Phagokinetic Track Motility Assay

Cellular motility is an important biological process for both unicellular and multicellular organisms. It is essential for movement of unicellular organisms towards a source of nutrients or away from unsuitable conditions, as well as in multicellular organisms for tissue development, immune surveillance and wound healing, just to mention a few roles1,2,3. Deregulation of this process can lead to serious neurological, cardiovascular and immunological diseases, as well as exacerbated tumor formation and spread4,5. Molecularly, actin polymerization and receptor recycling have been shown to play important roles in creating cellular extensions (lamellipodia), that drive the forward movement of the cell6,7,8. However, many biological questions about cell migration remain unanswered.
The central role for cellular motility in human health and disease underlines the importance of understanding the specific mechanisms involved in this process and makes accurate methods for evaluating cell motility particularly important. Microscopes are usually used to visualize the movement of cells. However, cells move rather slowly, making the quantitative measurement of cell migration a resource-consuming process requiring expensive cameras and software to create quantitative time-lapsed movies of motile cells. Therefore, the ability to perform a quantitative measurement of cell migration that is cost-effective, non-laborious, and that utilizes common laboratory equipment is a great need for many researchers.
The phagokinetic track motility assay utilizes the ability of a moving cell to clear gold particles from its path to create a measurable track on a colloidal gold-coated glass coverslip9,10. With the use of freely available software, multiple tracks can be evaluated for each treatment to accomplish statistical requirements. The assay can be utilized to assess motility of many cell types, such as cancer cells11,12, fibroblasts9, neutrophils13, skeletal muscle cells14, keratinocytes15, trophoblasts16, endothelial cells17, and monocytes10,18-22. The protocol involves the creation of slides coated with gold nanoparticles (Au&deg;) that are generated by a reduction of chloroauric acid (Au3+) by sodium citrate. This method was developed by Turkevich et al. in 195123 and then improved in the 1970s by Frens et al.24,25. As a result of this chemical reduction step, gold particles (10-20 nm in diameter) precipitate from the reaction mixture and can be applied to glass coverslips, which are then ready for use in cellular migration analyses9,26,27.
In general, the phagokinetic track motility assay is a quick, quantitative and easy measure of cellular motility. In addition, it can be utilized as a simple high-throughput assay, for use with cell types that are not amenable to time-lapsed imaging, as well as other uses depending on the needs of the researcher. Together, the ability to quantitatively measure cellular motility of multiple cell types without the need for expensive microscopes and software, along with the use of common laboratory equipment and chemicals, make the phagokinetic track motility assay a solid choice for scientists with an interest in understanding cellular motility.

The phagokinetic motility track assay is a method used to assess the movement of cells. Specifically, the assay measures chemokinesis (random cell motility) over time in a quantitative manner. The assay takes advantage of the ability of cells to create a measurable track of their movement on colloidal gold-coated coverslips.

הערכה כמותית של נדידת תאים על ידי Assay כושר תנועת המסלול Phagokinetic

Cellular motility is an important biological process for both unicellular and multicellular organisms. It is essential for movement of unicellular ...

Adenoviral Transduction of Naive CD4 T Cells to Study Treg Differentiation

Regulatory T cells (Tregs) are essential to provide immune tolerance to self as well as to certain foreign antigens. Tregs can be generated from naive CD4 T cells in vitro with TCR- and co-stimulation in the presence of TGF&beta; and IL-2. This bears enormous potential for future therapies, however, the molecules and signaling pathways that control differentiation are largely unknown.
Primary T cells can be manipulated through ectopic gene expression, but common methods fail to target the most important naive state of the T cell prior to primary antigen recognition. Here, we provide a protocol to express ectopic genes in naive CD4 T cells in vitro before inducing Treg differentiation. It applies transduction with the replication-deficient adenovirus and explains its generation and production. The adenovirus can take up large inserts (up to 7 kb) and can be equipped with promoters to achieve high and transient overexpression in T cells. It effectively transduces naive mouse T cells if they express a transgenic Coxsackie adenovirus receptor (CAR). Importantly, after infection the T cells remain naive (CD44low, CD62Lhigh) and resting (CD25-, CD69-) and can be activated and differentiated into Tregs similar to non-infected cells. Thus, this method enables manipulation of CD4 T cell differentiation from its very beginning. It ensures that ectopic gene expression is already in place when early signaling events of the initial TCR stimulation induces cellular changes that eventually lead into Treg differentiation.

Adenoviral gene transfer into naive CD4 T cells with transgenic expression of the Coxsackie adenovirus receptor enables the molecular analysis of regulatory T cell differentiation in vitro.

התמרה adenoviral של CD4 תמימים תאי T ללמוד בידול Treg

Regulatory T cells (Tregs) are essential to provide immune tolerance to self as well as to certain foreign antigens. Tregs can be generated from naive CD4 ...

Transplantation of Tail Skin to Study Allogeneic CD4 T Cell Responses in Mice

The study of T cell responses and their consequences during allo-antigen recognition requires a model that enables one to distinguish between donor and host T cells, to easily monitor the graft, and to adapt the system in order to answer different immunological questions. Medawar and colleagues established allogeneic tail-skin transplantation in mice in 1955. Since then, the skin transplantation model has been continuously modified and adapted to answer specific questions. The use of tail-skin renders this model easy to score for graft rejection, requires neither extensive preparation nor deep anesthesia, is applicable to animals of all genetic background, discourages ischemic necrosis, and permits chemical and biological intervention. 
In general, both CD4+ and CD8+ allogeneic T cells are responsible for the rejection of allografts since they recognize mismatched major histocompatibility antigens from different mouse strains. Several models have been described for activating allogeneic T cells in skin-transplanted mice. The identification of major histocompatibility complex (MHC) class I and II molecules in different mouse strains including C57BL/6 mice was an important step toward understanding and studying T cell-mediated alloresponses. In the tail-skin transplantation model described here, a three-point mutation (I-Abm12) in the antigen-presenting groove of the MHC-class II (I-Ab) molecule is sufficient to induce strong allogeneic CD4+ T cell activation in C57BL/6 mice. Skin grafts from I-Abm12 mice on C57BL/6 mice are rejected within 12-15 days, while syngeneic grafts are accepted for up to 100 days. The absence of T cells (CD3-/- and Rag2-/- mice) allows skin graft acceptance up to 100 days, which can be overcome by transferring 2 x 104 wild type or transgenic T cells. Adoptively transferred T cells proliferate and produce IFN-&#947; in I-Abm12-transplanted Rag2-/- mice.

Tail-skin transplantation is a powerful model for studying T cell-dependent rejection and tolerance induction during allogeneic immune responses in mice. The advantages of this protocol are minor invasive surgery, and ease of monitoring with no need to sacrifice the recipient mouse.

השתלה של עור זנב לחקר תגובות תא Allogeneic T מסוג CD4 בעכברים

The study of T cell responses and their consequences during allo-antigen recognition requires a model that enables one to distinguish between donor and ...

Imaging CD4 T Cell Interstitial Migration in the Inflamed Dermis

The ability of CD4 T cells to carry out effector functions is dependent upon the rapid and efficient migration of these cells in inflamed peripheral tissues through an as-yet undefined mechanism. The application of multiphoton microscopy to the study of the immune system provides a tool to measure the dynamics of immune responses within intact tissues. Here we present a protocol for non-invasive intravital multiphoton imaging of CD4 T cells in the inflamed mouse ear dermis. Use of a custom imaging platform and a venous catheter allows for the visualization of CD4 T cell dynamics in the dermal interstitium, with the ability to interrogate these cells in real-time via the addition of blocking antibodies to key molecular components involved in motility. This system provides advantages over both in vitro models and surgically invasive imaging procedures. Understanding the pathways used by CD4 T cells for motility may ultimately provide insight into the basic function of CD4 T cells as well as the pathogenesis of both autoimmune diseases and pathology from chronic infections.

The mechanisms that govern the interstitial motility of CD4 effector T cells at sites of inflammation are relatively unknown. We present a non-invasive approach to visualize and manipulate in vitro-primed CD4 T cells in the inflamed ear dermis, allowing for study of the dynamic behavior of these cells in situ.

הדמית תא CD4 T גירת ביניים בדרמיס המוסת

The ability of CD4 T cells to carry out effector functions is dependent upon the rapid and efficient migration of these cells in inflamed peripheral ...

A CFSE-based Assay to Study the Migration of Murine Skin Dendritic Cells into Draining Lymph Nodes During Infection with Mycobacterium bovis Bacille Calmette-Gu&#233;rin

Dendritic cells (DCs) are important for initiating immune responses, in part through their ability to acquire and shuttle antigen to the draining lymph node (DLN). The mobilization of DCs to the DLN is complex and remains to be fully elucidated during infection. Herein described is the use of an innovative, simple assay that relies on the fluorochrome 5- and 6-carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) to track the migration of DCs during footpad infection with Mycobacterium bovis Bacille Calmette-Gu&#233;rin (BCG) in C57BL/6 mice. This assay enables the characterization of skin DC sub-populations that actively relocate to the draining, popliteal LN in response to BCG. This protocol originates from a BCG model where migratory skin DCs were identified by flow cytometry. The assay is amiable to the study and identification of DCs or other cells that home to the popliteal LN after inoculation of microbes, their metabolites or other inflammatory stimuli in the footpad, and consequently to study factors that regulate the migration of these cells.

An assay in mice to track cell migration from skin to draining lymph node is described which enables the characterization of skin Dendritic cells mobilized to the lymph node after footpad infection with Bacille Calmette-Gu&#233;rin.

Assay CFSE המבוסס לחקר נדידת תאי דנדריטים עור Murine לתוך ניקוז בלוטות הלימפה במהלך זיהום<em&gt; Mycobacterium בוביס</em&gt; Bacille Calmette-גרן

Dendritic cells (DCs) are important for initiating immune responses, in part through their ability to acquire and shuttle antigen to the draining lymph ...

Using X-ray Crystallography, Biophysics, and Functional Assays to Determine the Mechanisms Governing T-cell Receptor Recognition of Cancer Antigens

Human CD8+ cytotoxic T lymphocytes (CTLs) are known to play an important role in tumor control. In order to carry out this function, the cell surface-expressed T-cell receptor (TCR) must functionally recognize human leukocyte antigen (HLA)-restricted tumor-derived peptides (pHLA). However, we and others have shown that most TCRs bind sub-optimally to tumor antigens. Uncovering the molecular mechanisms that define this poor recognition could aid in the development of new targeted therapies that circumnavigate these shortcomings. Indeed, present therapies that lack this molecular understanding have not been universally effective. Here, we describe methods that we commonly employ in the laboratory to determine how the nature of the interaction between TCRs and pHLA governs T-cell functionality. These methods include the generation of soluble TCRs and pHLA and the use of these reagents for X-ray crystallography, biophysical analysis, and antigen-specific T-cell staining with pHLA multimers. Using these approaches and guided by structural analysis, it is possible to modify the interaction between TCRs and pHLA and to then test how these modifications impact T-cell antigen recognition. These findings have already helped to clarify the mechanism of T-cell recognition of a number of cancer antigens and could direct the development of altered peptides and modified TCRs for new cancer therapies.

Here, we describe methods that we commonly employ in the laboratory to determine how the nature of the interaction between the T-cell receptor and tumor antigens, presented by human leukocyte antigens, governs T-cell functionality; these methods include protein production, X-ray crystallography, biophysics, and functional T-cell experiments.

באמצעות רנטגן קריסטלוגרפיה, ביופיזיקה, מבחנים תפקודיים לקביעת הכרת קולטן מנגנוני שלטון תאי T של אנטיגנים הסרטן

Human CD8+ cytotoxic T lymphocytes (CTLs) are known to play an important role in tumor control. In order to carry out this function, the cell ...

A Novel In Vitro Wound Healing Assay to Evaluate Cell Migration

The aim of this work is to show a novel method to evaluate the ability of some immunomodulatory molecules, such as antimicrobial peptides (AMPs), to stimulate cell migration. Importantly, cell migration is a rate-limiting event during the wound-healing process to re-establish the integrity and normal function of tissue layers after injury. The advantage of this method over the classical assay, which is based on a manually made scratch in a cell monolayer, is the usage of special silicone culture inserts providing two compartments to create a cell-free pseudo-wound field with a well-defined width (500 &#956;m). In addition, due to an automated image analysis platform, it is possible to rapidly obtain quantitative data on the speed of wound closure and cell migration. More precisely, the effect of two frog-skin AMPs on the migration of bronchial epithelial cells will be shown. Furthermore, pretreatment of these cells with specific inhibitors will provide information on the molecular mechanisms underlying such events.

A Novel In Vitro Wound Healing Assay to Evaluate Cell Migration

Here, we present a protocol to evaluate the effect of peptides on the migration of bronchial epithelial cells. This method allows for the rapid and highly reproducible obtainment of quantitative data on the speed of cell migration and wound closure.

הרומן במבחנה פצע ריפוי הנועד להעריך את נדידת תאים

The aim of this work is to show a novel method to evaluate the ability of some immunomodulatory molecules, such as antimicrobial peptides (AMPs), to ...

מבחני ביות תחרותי לחקר נדידת גוט-טרופי T Cell

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

האדם בידוד T לימפוציטים, התרבות ניתוח של הגירה במבחנה

לא פולשני הדמיה של ביות ליקוציט והגירה In vivo