Diese Arbeit wurde ermöglicht durch Zuschüsse aus dem NIH (EY012977), ein Career Award in der Biomedizin von der Burroughs Wellcome Fund, der Whitehall-Stiftung, und die Sloan Foundation (AKM).

1. Virus Handhabung und Lagerung <ol><li> Richtiger Schutz und Umgang mit Techniken sollten auf der Grundlage der biologischen Sicherheit des Virus verwendet werden gewählt werden. Diese Praktiken können in Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories 5. Auflage, auf der CDC-Website gefunden werden ( <a href="http://www.cdc.gov/od/OHS/biosfty/bmbl5/bmbl5toc.htm">http://www.cdc.gov/od/OHS/biosfty/bmbl5/bmbl5toc.htm</a> ). Die Verwendung von AAV-Vektoren für Biosafety Level 1 (BSL-1) genehmigt. Für das Experiment hier gezeigt, wird ein Laborkittel und Handschuhe bei der Handhabung des Virus sein, in Übereinstimmung mit Verfahren für den Umgang mit BSL-1-Agenten. </li><li> Zur Wahrung der Aktivität des Virus ist es am besten, um sie in kleinen Portionen zu teilen, um wiederholtes Einfrieren und Auftauen zu vermeiden. </li><li> Bereiten Sie eine Biosicherheitswerkbank (BSC) Klasse II für Aliquotierung Virus durch das Löschen des BSC von unnötigen Gegenständen und Sterilisieren der Oberfläche mit 70% EtOH. Legen Sie ein Becherglas mit 10% Bleichmittel-Lösung in der Haube zum Sammeln AAV-kontaminierten Abfällen. Auch in der BSC gesetzt sind sterile 0,5 ml Röhrchen und einen Behälter mit Trockeneis. </li><li> Thaw virale Lager auf Eis außerhalb des BSC. </li><li> Vortex-Virus und öffnen Sie den Schlauch in die BSC. </li><li> Pipette die gewünschte aliquoten Volumen (zB 5 ul) in ein 0,5 ml Röhrchen, in der Nähe der Röhre und legen Sie sie in das Trockeneis zur flash-freeze des Virus. </li><li> Wenn alle Virus wurde aliquotiert, des Virus Rohr und Pipettenspitzen in den Abfallbehälter mit 10% Bleichmittel zu entsorgen. </li><li> Entfernen Sie die Abfallbehälter von der Motorhaube und fügen Sie zusätzliche 10% Bleichmittel, gießen Sie dann das Bleichmittel in den Ausguss. Entsorgen von Kunststoffabfällen in einem Behälter für biologischen wie von Ihrem Institut die Biologische Sicherheit angewiesen. </li><li> Reinigen Sie alle Geräte oder Oberflächen, die in Kontakt mit dem Virus mit 10% Bleiche kam. Entsorgen Sie Handschuhe. </li><li> Shop-Aliquots in -80 ° C Gefrierschrank. </li></ol> 2. Chirurgie <ol><li> Bedecken Sie den OP-Bereich mit einem saugfähigen Labortisch Papier. Chirurgische Instrumente sollten sterilisiert werden und Chirurgie erfolgen unter aseptischen Bedingungen in Einklang mit Ihrer Einrichtung Biosicherheit und Nutzung von Tieren Richtlinien. </li><li> Wählen Sie einen Bereich neben dem chirurgischen Bereich, gewidmet dem Laden der Mikropipetten mit Virus werden, und decken Sie es mit einem saugfähigen Labortisch Papier. Einen aliquoten Teil-Virus in einen Behälter mit Eis in diesem Bereich und damit das Virus auf Eis auftauen, wie die Operation durchgeführt wird. </li><li> Einrichten eines Abfallbehälters von 10% Bleichmittel in den dedizierten Virus Handling-Bereich für die Entsorgung von Pipettenspitzen, etc., die in Kontakt mit dem Virus kommen. </li><li> Ziehen Sie ein Glas Wiretrol Mikropipette zu einer Spitze Durchmesser von etwa 20 Mikrometern. Setzen Sie einen kleinen Tropfen Mineralöl auf dem stumpfen Ende der Mikropipette und legen Sie den Draht Kolben mit den Mikropipetten zur Verfügung gestellt. </li><li> Sichern Sie die Mikropipette in die Klemme der Mikropumpe Arm. </li><li> Inject eine Maus subkutan mit Buprenorphin bei einer Dosis von 0,5 mg / kg. Anesthetize die Maus mit Avertin durch intraperitoneale Injektion mit einer Dosis von 200 mg / kg und entfernen Sie die Haare von der Spitze des Kopfes mit chirurgischer Schere, achten Sie darauf, die Margen groß genug, um Haare aus der Eingabe der Schnitt verhindern lassen. </li><li> Bringen Sie eine Heizdecke auf der Basis eines stereotax eine Körpertemperatur von 37 ° C während der Operation zu erhalten und sichern Sie die Maus in die stereotax. </li><li> Bathe den Kopf mit drei wechselnden scrubs von Ethanol und betadine, um den Bereich zu sterilisieren. </li><li> Geben Sie einen Tropfen Tobradex Augensalbe an jedem Auge zu halten die Augen feucht während der Operation. </li><li> Machen Sie einen Schnitt nach der Mittellinie des Kopfes und ziehen die Haut zurück zu den Schädel freizulegen. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig die Faszie vom Schädel spitzen Pinzette. </li><li> Suchen Sie den Bereich injiziert mit stereotaktischen Koordinaten werden und markieren den Schädel mit einem chirurgischen Stift. </li><li> Mit einem zahnärztlichen Bohrer mit 1,4 mm Grat, dünne einer Fläche des Schädels ca. 2mm im Durchmesser, bis der Schädel Risse, indem die verdünnte Bereich in mehrere Segmente. </li><li> In diesem Verfahren behalten die Schädel feucht mit Anwendungen von steriler Kochsalzlösung. </li><li> Führen Sie eine Kraniotomie durch sanftes Entfernen der ausgedünnt Schädel Segmente mit extra-feinen Spitzen einer Pinzette. </li></ol> 3. Injection Vorbereitung <ol><li> Mit einem Kimwipe über den Deckel gelegt, öffnen Sie das Rohr des Virus und Pipette 1.5uL (für eine 1UL Injektion) des Virus auf einem kleinen Stück Parafilm. </li><li> Setzen Sie die Spitze der Mikropipette in das virale Lager und manuell zurückzuziehen den Kolben. Wenn Schwierigkeit besteht darin, erfahrene Zeichnung virale Lager in der Mikropipette kann die Spitze vergrößert leicht sein piercing einem Kimwipe mit der Mikropipette auf einen kleinen Teil des Glases zu brechen. </li><li> Lower Mikropumpe Arm auf Kolben, bis eine kleine Menge des Virus von der Spitze der Mikropipette ausgeräumt. Entfernen Sie diese kleinen Tropfen mit einem Wattestäbchen und verwerfen Applikator in waste-Container. </li><li> Tragen Sie einen Tropfen Mineralöl auf die Spitze der Mikropipette zur Vermeidung von Verstopfungen, wie die Mikropipette in das Gehirn gesenkt wird. </li></ol> 4. Virus Injection <ol><li> Mit X-und Y-Koordinaten stereotaktischen, Position der Mikropipette über den Bereich injiziert werden. In diesem Experiment koordiniert die stereotaktische zur primären visuellen Kortex zu finden sind 2,7 mm posterior zu Bregma und 2,5 mm lateral der Mittellinie. Sehr langsam niedriger die Mikropipette (mit einer ungefähren Rate von 1mm/1minute) auf die richtige Z-Position. </li><li> Geben Sie die gewünschte Einspritzparameter in die SYS Micro4 Mikropumpe Controller-Box und starten Sie die Injektion. Für dieses Experiment wird 1 Mikroliter über 10 Minuten als einer Rate von Injektion verwendet werden. </li><li> Wenn die Injektion beendet ist, verlassen Sie die Pipette für 1-2 Minuten auf Efflux von Viren bei der Entnahme zu verhindern ruhen. Nach diesem Zeitraum sehr langsam entfernen Sie die Mikropipette aus dem Gehirn (gleiche Geschwindigkeit wie oben). </li><li> Suture der Kopfhaut und verschließen Sie diese mit Gewebekleber. Spritzen Sie das Tier subkutan mit Buprenorphin bei einer Dosis von 0,1 mg / kg alle 8-12 Stunden in den nächsten 72 Stunden oder so lange wie das Tier Anzeichen von Schmerz. Lassen Sie das Tier unter einer Wärmelampe erholen, bis es ambulating ist und bereit, in seinen Käfig zurückgebracht werden. Imaging Experimente können nach der gewünschten Inkubationszeit (Tage bis Wochen nach einer viralen Injektion) eingeleitet werden. </li></ol> 5. Cleanup <ol><li> Spülen Sie die Mikropipette mit 10% Bleichmittel und entsorgen Sie sie in einem für spitze Gegenstände aufbewahren. </li><li> Entsorgen von Abfall-Container in der gleichen Weise wie Abschnitt 1. </li><li> Discard Labortisch Papier in biohazard bin und wischen Sie alle Oberflächen und Instrumente, die in Kontakt mit dem Virus mit 10% Bleichmittel kommen kann. </li><li> Ungenutzte Virus kann wieder eingefroren werden, wenn man bedenkt, dass die wiederholte Frost / Tau-Zyklen Abbau des Virus führen. </li></ol> 6. Repräsentative Ergebnisse <img src="/files/ftp_upload/2140/2140fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Transduzierten Neuron nach der Injektion von doppelsträngiger Adeno-assoziierten Virus Serotyp 1 (dsAAV S1) trägt grün fluoreszierende Protein (GFP) unter Kontrolle des CMV-Promotor. Der Zellkörper sowie proximalen und distalen Dendriten sind deutlich sichtbar in festen Abschnitten aufgenommen mit einer epifluoreszenten Mikroskop. Maßstab = 100 um. <img src="/files/ftp_upload/2140/2140fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2. Labeling typisch für eine intrakranielle Virus Injektion in primären visuellen Kortex mittels dsAAV S1 zeigt das Ausmaß der viralen Verbreitung sowie markierten Neuronen, Glia und Prozesse. Maßstab = 250 pm. <img src="/files/ftp_upload/2140/2140fig3.jpg" alt="Abbildung 3" /> Abbildung 3. Labeling der Zellen im Hippokampus mit dsAAV S1. Maßstab = 250 pm. Diese Zahlen stammen aus Lowery et al angepasst. 2009 1

<ol>
	<li>Kaplitt, M. G., Leone, P., Samulski, R. J., Xiao, X., Pfaff, D. W., O'Malley, K. L., During, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+gene+expression+and+phenotypic+correction+using+adeno-associated+virus+vectors+in+the+mammalian+brain.">Long-term gene expression and phenotypic correction using adeno-associated virus vectors in the mammalian brain.</a> Nat Genet. 8, 148-154 (1994).</li><li>Harding, T. C., Dickinson, P. J., Roberts, B. N., Yendluri, S., Gonzalez-Edick, M., Lecouteur, R. A., Jooss, K. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+gene+transfer+efficiency+in+the+murine+striatum+and+an+orthotopic+glioblastoma+tumor+model,+using+AAV-7-+and+AAV-8-pseudotyped+vectors.">Enhanced gene transfer efficiency in the murine striatum and an orthotopic glioblastoma tumor model, using AAV-7- and AAV-8-pseudotyped vectors.</a> Hum Gene Ther. 17, 807-820 (2006).</li><li>Lo, W. D., Qu, G., Sferra, T. J., Clark, R., Chen, R., Johnson, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus-mediated+gene+transfer+to+the+brain:+duration+and+modulation+of+expression.">Adeno-associated virus-mediated gene transfer to the brain: duration and modulation of expression.</a> Hum Gene Ther. 10, 201-213 (1999).</li><li>Lowery, R. L., Zhang, Y., Kelly, E. A., Lamantia, C. E., Harvey, B. K., Majewska, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+long-term+labeling+of+cells+in+the+developing+and+adult+rodent+visual+cortex+using+double-stranded+adeno-associated+viral+vectors.">Rapid long-term labeling of cells in the developing and adult rodent visual cortex using double-stranded adeno-associated viral vectors.</a> Dev Neurobiol. 69, 674-688 (2009).</li></ol>

Die Tier-und experimentelle Protokolle wurden von der University of Rochester University Committee on Animal Resources (UCAR) im Einklang mit dem PHS-Politik auf Humane Pflege und Verwendung von Labortieren genehmigt.

Viral-vermittelte Gentransfer birgt ein großes Potenzial für die Untersuchung der neurologischen Prozesse und Behandlung von Störungen des Gehirns 1,2,3. Die große Vielseitigkeit dieser Technik kann auch genutzt werden, um Fluoreszenz-Label-Zellen für die Bildgebung sowohl in vitro und in vivo 4 sein. Hier zeigen wir ein detailliertes Verfahren für die Transduktion von Neuronen und Gliazellen in Maus visuellen Kortex mit einer doppelsträngigen Adeno-Verein Virus, das Enhanc...

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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Stoelting Mouse and Neonatal Rat Adaptor</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Stoelting</td>
<td>51625</td>
<td>Regular stereotax for securing animals for surgery may be substituted</td>
</tr>
<tr>
<td>Extra Fine Bonn Scissors, 8.5cm, straight tip, cutting edge 13mm</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>14084-08</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Eye Dressing Forceps, 10cm, tip width 0.5mm, curved</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>11152-10</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dumont #5/45 Forceps- Dumoxel Standard Tip, 11cm, angled</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>11251-35</td>
<td>Extra-fine tipped forceps for performing craniotomy</td>
</tr>
<tr>
<td>Standard Pattern Forceps, straight, 2.5mmx1.35mmtip, 12cm</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>11000-12</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microtorque Control Box and Tech2000 handpiece</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ram Products, Inc.</td>
<td>TECH2000ON/OFF</td>
<td>Dental drill</td>
</tr>
<tr>
<td>Micro Drill Stainless Steel Burrs 1.4mm tip diameter</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>19008-14</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Wiretrol micropipettes, to deliver 1-5 Ul</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR International/ Drummond</td>
<td>5-000-1001 or 53480-287</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Mineral oil</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR International</td>
<td>29447-338</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Manual Micromanipulator and Tilting Base (right-handed)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>World Precision Instruments, Inc.</td>
<td>M3301-M3-R</td>
<td>Used for determining stereotaxic co-ordinates</td>
</tr>
<tr>
<td>UltraMicroPump (UMP3) (one) with SYS-Micro4 Controller</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>World Precision Instruments, Inc.</td>
<td>UMP3-1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sutures</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR International</td>
<td>95056-952</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>P-97 Flaming/Brown Micropipette Puller</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sutter Instruments</td>
<td>P-97</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tobradex</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Available from your institution&#x2019;s veterinary services</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

intracranial injection of adeno-associated viral vectors

Intrakranielle Injektion von viralen Vektoren entwickelt, um ein fluoreszierendes Protein exprimieren ist eine vielseitige Kennzeichnung Technik zur Visualisierung von bestimmten Untergruppen von Zellen in verschiedenen Hirnregionen in vivo und in Hirnschnitten. Anders als die Injektion von Fluoreszenzfarbstoffen, bietet virale Kennzeichnung der gezielten Förderung einzelner Zelltypen und ist weniger teuer und zeitaufwendig ist als Einführung transgener Mauslinien. Bei dieser Technik wird ein Adeno-assoziierte Viren (AAV) Vektor injiziert intrakraniell mit stereotaktischen Koordinaten einer Mikropipette und eine automatische Pumpe für präzise Lieferung von AAV auf den gewünschten Bereich mit minimaler Schädigung des umliegenden Gewebes. Injection-Parameter können auf einzelne Experimente durch Anpassung der Tier-Alter an der Injektionsstelle, Injektion Lage, Injektionsvolumen, die Rate der Injektion, AAV-Serotyp und der Promotor, der die Genexpression zugeschnitten werden. Je nach den gewählten Bedingungen kann viral-induzierter Transgenexpression erlauben die Visualisierung von Gruppen von Zellen, einzelne Zellen oder feinen zelluläre Prozesse, bis auf die Ebene von dendritischen Dornen. Die hier gezeigten Experiment zeigt eine Injektion von doppelsträngiger AAV, die grün fluoreszierendes Protein für die Kennzeichnung von Neuronen und Gliazellen in der Maus primären visuellen Kortex.

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Intracranial Injection of Adeno-associated Viral Vectors

Hier präsentieren wir die intrakranielle Injektion von AAV-Vektoren für die Fluoreszenzmarkierung von Neuronen und Gliazellen in der Sehrinde.

Intrakranielle Injektion von Adeno-assoziierte virale Vektoren

Intracranial injection of viral vectors engineered to express a fluorescent protein is a versatile labeling technique for visualization of specific ...

intracranial-injection-of-adeno-associated-viral-vectors

Research

JoVE Journal

Neuroscience

47.2K Aufrufe.  University of Rochester. Hier präsentieren wir die intrakranielle Injektion von AAV-Vektoren für die Fluoreszenzmarkierung von Neuronen und Gliazellen in der Sehrinde.

Serie: Intracranial Injection of Adeno-associated Viral Vectors

Targeting of Deep Brain Structures with Microinjections for Delivery of Drugs, Viral Vectors, or Cell Transplants

Microinjections into the brain parenchyma are important procedures to deliver drugs, viral vectors or cell transplants.  The brain lesion that an injecting needle produces during its trajectory is a major concern especially in the mouse brain for not only the brain is small but also sometimes multiple injections are needed.  We show here a method to produce glass capillary needles with a 50-&mu;m lumen which significantly reduces the brain damage and allows a precise targeting into the rodent brain. This method allows a delivery of small volumes (from 20 to 100 nl), reduces bleeding risks, and minimizes passive diffusion of drugs into the brain parenchyma. By using different size of capillary glass tubes, or changing the needle lumen, several types of substances and cells can be injected. Microinjections with a glass capillary tube represent a significant improvement in injection techniques and deep brain targeting with minimal collateral damage in small rodents.

In this article, we show a method to make glass capillary needles with a 50-&mu;m lumen. This technique significantly reduces the brain damage, minimizes passive diffusion of drugs and allows a precise targeting into the rodent brain.

Targeting von Deep Brain Strukturen mit Mikroinjektionen für die Lieferung von Drogen, virale Vektoren oder Zelltransplantaten

Microinjections into the brain parenchyma are important procedures to deliver drugs, viral vectors or cell transplants.  The brain lesion that an ...

Forschung

Neurowissenschaften

Intracerebroventricular Viral Injection of the Neonatal Mouse Brain for Persistent and Widespread Neuronal Transduction

With the pace of scientific advancement accelerating rapidly, new methods are needed for experimental neuroscience to quickly and easily manipulate gene expression in the mouse brain. Here we describe a technique first introduced by Passini and Wolfe for direct intracranial delivery of virally-encoded transgenes into the neonatal mouse brain. In its most basic form, the procedure requires only an ice bucket and a microliter syringe. However, the protocol can also be adapted for use with stereotaxic frames to improve consistency for researchers new to the technique. The method relies on the ability of adeno-associated virus (AAV) to move freely from the cerebral ventricles into the brain parenchyma while the ependymal lining is still immature during the first 12-24 hr after birth. Intraventricular injection of AAV at this age results in widespread transduction of neurons throughout the brain. Expression begins within days of injection and persists for the lifetime of the animal. Viral titer can be adjusted to control the density of transduced neurons, while co-expression of a fluorescent protein provides a vital label of transduced cells. With the rising availability of viral core facilities to provide both off-the-shelf, pre-packaged reagents and custom viral preparation, this approach offers a timely method for manipulating gene expression in the mouse brain that is fast, easy, and far less expensive than traditional germline engineering.

Here we demonstrate a technique for widespread neuronal transduction by intraventricular injection of adeno-associated virus into the neonatal mouse brain. This method provides a rapid and easy way to attain lifelong expression of virally-delivered transgenes.

Intracerebroventricular Viral Injektion der Neonatal Maus Gehirn für anhaltenden und verbreiteten Neuronale Transduction

With the pace of scientific advancement accelerating rapidly, new methods are needed for experimental neuroscience to quickly and easily manipulate gene ...

Limbal Approach-Subretinal Injection of Viral Vectors for Gene Therapy in Mice Retinal Pigment Epithelium

The eye is a small and enclosed organ which makes it an ideal target for gene therapy. Recently various strategies have been applied to gene therapy in retinopathies using non-viral and viral gene delivery to the retina and retinal pigment epithelium (RPE). Subretinal injection is the best approach to deliver viral vectors directly to RPE cells. Before the clinical trial of a gene therapy, it is inevitable to validate the efficacy of the therapy in animal models of various retinopathies. Thus, subretinal injection in mice becomes a fundamental technique for an ocular gene therapy. In this protocol, we provide the easy and replicable technique for subretinal injection of viral vectors to experimental mice. This technique is modified from the intravitreal injection, which is widely used technique in ophthalmology clinics. The representative results of RPE/choroid/scleral complex flat-mount will help to understand the efficacy of this technique and adjust the volume and titer of viral vectors for the extent of gene transduction.

Subretinal injection is a surgical technique for effective gene delivery to retinal pigment epithelium in the mouse eye. Here we describe an easy and replicable method for subretinal injection of viral vectors to retinal pigment epithelium in experimental mice.

Limbus-Ansatz-Subretinale Injektion von viralen Vektoren für die Gentherapie bei Mäusen Retinapigmentepithel

The eye is a small and enclosed organ which makes it an ideal target for gene therapy. Recently various strategies have been applied to gene therapy in ...

Intracerebroventricular and Intravascular Injection of Viral Particles and Fluorescent Microbeads into the Neonatal Brain

In the study on the pathogenesis of viral encephalitis, the infection method is critical. The first of the two main infectious routes to the brain is the hematogenous route, which involves infection of the endothelial cells and pericytes of the brain. The second is the intracerebroventricular (ICV) route. Once within the central nervous system (CNS), viruses may spread to the subarachnoid space, meninges, and choroid plexus via the cerebrospinal fluid. In experimental models, the earliest stages of CNS viral distribution are not well characterized, and it is unclear whether only certain cells are initially infected. Here, we have analyzed the distribution of cytomegalovirus (CMV) particles during the acute phase of infection, termed primary viremia, following ICV or intravascular (IV) injection into the neonatal mouse brain. In the ICV injection model, 5 &#181;l of murine CMV (MCMV) or fluorescent microbeads were injected into the lateral ventricle at the midpoint between the ear and eye using a 10-&#181;l syringe with a 27 G needle. In the IV injection model, a 1-ml syringe with a 35 G needle was used. A transilluminator was used to visualize the superficial temporal (facial) vein of the neonatal mouse. We infused 50 &#181;l of MCMV or fluorescent microbeads into the superficial temporal vein. Brains were harvested at different time points post-injection. MCMV genomes were detected using the in situ hybridization method. Fluorescent microbeads or green fluorescent protein expressing recombinant MCMV particles were observed by fluorescent microscopy. These techniques can be applied to many other pathogens to investigate the pathogenesis of encephalitis.

Here, we describe a simple method of intracerebroventricular and intravascular injection of viral particles or fluorescent microbeads into the neonatal mouse brain. The localization pattern of the virus and nanoparticles could be detected by microscopic evaluation or by in situ hybridization.

Intracerebroventricular und intravaskuläre Injektion von Viruspartikeln und Fluorescent Microbeads in die neonatale Gehirn

In the study on the pathogenesis of viral encephalitis, the infection method is critical. The first of the two main infectious routes to the brain is the ...

Subpial Adeno-associated Virus 9 (AAV9) Vector Delivery in Adult Mice

The successful development of a subpial adeno-associated virus 9 (AAV9) vector delivery technique in adult rats and pigs has been reported on previously. Using subpially-placed polyethylene catheters (PE-10 or PE-5) for AAV9 delivery, potent transgene expression through the spinal parenchyma (white and gray matter) in subpially-injected spinal segments has been demonstrated. Because of the wide range of transgenic mouse models of neurodegenerative diseases, there is a strong desire for the development of a potent central nervous system (CNS)-targeted vector delivery technique in adult mice. Accordingly, the present study describes the development of a spinal subpial vector delivery device and technique to permit safe and effective spinal AAV9 delivery in adult C57BL/6J mice. In spinally immobilized and anesthetized mice, the pia mater (cervical 1 and lumbar 1-2 spinal segmental level) was incised with a sharp 34 G needle using an XYZ manipulator. A second XYZ manipulator was then used to advance a blunt 36G needle into the lumbar and/or cervical subpial space. The AAV9 vector (3-5 &#181;L; 1.2 x 1013 genome copies (gc)) encoding green fluorescent protein (GFP) was then injected subpially. After injections, neurological function (motor and sensory) was assessed periodically, and animals were perfusion-fixed 14 days after AAV9 delivery with 4% paraformaldehyde. Analysis of horizontal or transverse spinal cord sections showed transgene expression throughout the entire spinal cord, in both gray and white matter. In addition, intense retrogradely-mediated GFP expression was seen in the descending motor axons and neurons in the motor cortex, nucleus ruber, and formatio reticularis. No neurological dysfunction was noted in any animals. These data show that the subpial vector delivery technique can successfully be used in adult mice, without causing procedure-related spinal cord injury, and is associated with highly potent transgene expression throughout the spinal neuraxis.

Subpial Adeno-associated Virus 9 AAV9 Vector Delivery in Adult Mice

The goal of the present study was to develop and validate the potency and safety of spinal adeno-associated virus 9 (AAV9)-mediated gene delivery by using a novel subpial gene delivery technique in adult mice.

Subpial Adeno-assoziiertes Virus 9 (AAV9) Vektorlieferung in erwachsenen Mäusen

The successful development of a subpial adeno-associated virus 9 (AAV9) vector delivery technique in adult rats and pigs has been reported on previously. ...

Methods and Tips for Intravenous Administration of Adeno-associated Virus to Rats and Evaluation of Central Nervous System Transduction

Adeno-associated virus (AAV) vectors are a key reagent in the neurosciences for clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR), optogenetics, cre-lox targeting, etc. The purpose of this manuscript is to aid the investigator attempting expansive central nervous system (CNS) gene transfer in the rat via tail vein injection of AAV. Wide-scale expression is relevant for conditions with widespread pathology, and a rat model is significant due to its greater size and physiologic similarities to humans compared to mice. In this example application, a wide-scale neuronal transduction is used to mimic a neurodegenerative disease that affects the entire spinal cord, amyotrophic lateral sclerosis (ALS). The efficient wide-scale CNS transduction can also be used to deliver therapeutic protein factors in pre-clinical studies. After a post-injection expression interval of several weeks, the effects of the transduction are evaluated. For a green fluorescent protein (GFP) control vector, the amount of GFP in the cerebellum is estimated quickly and reliably by a basic imaging program. For motor disease phenotypes that are induced by the ALS related protein transactive response DNA-binding protein of 43 kDa (TDP-43), the deficits are scored by escape reflex and rotarod. Beyond disease modeling and gene therapy, there are diverse potential applications for the wide-scale gene targeting described here. The expanded use of this method will aid in expediting hypothesis testing in the neurosciences and neurogenetics.

Methods for a wide-scale central nervous system gene delivery in the rat are covered. In this example, the purpose is to mimic a disease that affects the entire spinal cord. The widespread transduction can be used to deliver a therapeutic protein to the CNS from a one-time, peripheral administration.

Methoden und Tipps für die intravenöse Gabe von Adeno-assoziierten Virus an Ratten und Bewertung des zentralen Nervensystems Transduktion

Adeno-associated virus (AAV) vectors are a key reagent in the neurosciences for clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR), ...

Adeno-associated Virus-mediated Transgene Expression in Genetically Defined Neurons of the Spinal Cord

Selective manipulation of spinal neuronal subpopulations has mainly been achieved by two different methods: 1) Intersectional genetics, whereby double or triple transgenic mice are generated in order to achieve selective expression of a reporter or effector gene (e.g., from the Rosa26 locus) in the desired spinal population. 2) Intraspinal injection of Cre-dependent recombinant adeno-associated virus (rAAV); here Cre-dependent AAV vectors coding for the reporter or effector gene of choice are injected into the spinal cord of mice expressing Cre recombinase in the desired neuronal subpopulation. This protocol describes how to generate Cre-dependent rAAV vectors and how to transduce neurons in the dorsal horn of the lumbar spinal cord segments L3-L5 with rAAVs. As the lumbar spinal segments L3-L5 are innervated by those peripheral sensory neurons that transmit sensory information from the hindlimbs, spontaneous behavior and responses to sensory tests applied to the hindlimb ipsilateral to the injection side can be analyzed in order to interrogate the function of the manipulated neurons in sensory processing. We provide examples of how this technique can be used to analyze genetically defined subsets of spinal neurons. The main advantages of virus-mediated transgene expression in Cre transgenic mice compared to classical reporter mouse-induced transgene expression are the following: 1) Different Cre-dependent rAAVs encoding various reporter or effector proteins can be injected into a single Cre transgenic line, thus overcoming the need to create several multiple transgenic mouse lines. 2) Intraspinal injection limits manipulation of Cre-expressing cells to the injection site and to the time after injection. The main disadvantages are: 1) Reporter gene expression from rAAVs is more variable. 2) Surgery is required to transduce the spinal neurons of interest. Which of the two methods is more appropriate depends on the neuron population and research question to be addressed.

Intraspinal injection of recombinase dependent recombinant adeno-associated virus (rAAV) can be used to manipulate any genetically labelled cell type in the spinal cord. Here we describe how to transduce neurons in the dorsal horn of the lumbar spinal cord. This technique enables functional interrogation of the manipulated neuron subtype.

Adeno-assoziierten Virus-vermittelten Transgene Ausdruck in genetisch definierten Nervenzellen des Rückenmarks

Selective manipulation of spinal neuronal subpopulations has mainly been achieved by two different methods: 1) Intersectional genetics, whereby double or ...

Direct Intrathecal Injection of Recombinant Adeno-associated Viruses in Adult Mice

Intrathecal (IT) injection of adeno-associated virus (AAV) has drawn considerable interest in CNS gene therapy by virtue of its safety, noninvasiveness, and excellent transduction efficacy in the CNS.&#160;Previous studies have demonstrated the therapeutic potency of AAV-delivered gene therapy in neurodegenerative disorders by IT administration. However, high rates of unpredictable failure due to the technical limitation of IT administration in small animals have been reported. Here, we established a scoring system to indicate the success extent of lumbar puncture in small animals by adding 1% lidocaine hydrochloride into the injection solution. We further show that the extent of transient weakness following injection can predict the transduction efficiency of AAV. Thus, this IT injection method can be used to optimize therapeutic trials in mouse models of CNS diseases that afflict wide regions of the CNS.

Here we present a direct intrathecal injection technique using 1% lidocaine hydrochloride in a viral solution to ensure efficient adeno-associated virus delivery to small animals and establish a scoring system to predict transduction efficiency in the central nervous system according to the degree of transient weakness induced by lidocaine.

Direkte intrathekale Injektion von Recombinant Adeno-assoziierten Viren bei Erwachsenen Mäusen

Intrathecal (IT) injection of adeno-associated virus (AAV) has drawn considerable interest in CNS gene therapy by virtue of its safety, noninvasiveness, ...

Production, Purification, and Quality Control for Adeno-associated Virus-based Vectors

Gene delivery tools based on adeno-associated viruses (AAVs) are a popular choice for the delivery of transgenes to the central nervous system (CNS), including gene therapy applications. AAV vectors are non-replicating, able to infect both dividing and non-dividing cells&#160;and provide long-term transgene expression. Importantly, some serotypes, such as the newly described PHP.B, can cross the blood-brain-barrier (BBB) in animal models, following systemic delivery. AAV vectors can be efficiently produced in the laboratory. However, robust and reproducible protocols are required to obtain AAV vectors with sufficient purity levels and titer values high enough for in vivo applications. This protocol describes an efficient and reproducible strategy for AAV vector production, based on an iodixanol gradient purification strategy. The iodixanol purification method is suitable for obtaining batches of high-titer AAV vectors of high purity, when compared to other purification methods. Furthermore, the protocol is generally faster than other methods currently described. In addition, a quantitative polymerase chain reaction (qPCR)-based strategy is described for a fast and accurate determination of the vector titer, as well as a silver staining method to determine the purity of the vector batch. Finally, representative results of gene delivery to the CNS, following systemic administration of AAV-PHP.B, are presented. Such results should be possible in all labs using the protocols described in this article.

Here, we describe an efficient and reproducible strategy to produce, titer, and quality-control batches of adeno-associated virus vectors. It allows the user to obtain a vector preparation with high-titer&#160;(&#8805;1 x 1013 vector genomes/mL) and a high purity, ready for in vitro or in vivo use.

Produktion, Reinigung und Qualitätskontrolle für Adeno-assoziierten Virus-basierte Vektoren

Gene delivery tools based on adeno-associated viruses (AAVs) are a popular choice for the delivery of transgenes to the central nervous system (CNS), ...

Convection Enhanced Delivery of Optogenetic Adeno-associated Viral Vector to the Cortex of Rhesus Macaque Under Guidance of Online MRI Images

In non-human primate (NHP) optogenetics, infecting large cortical areas with viral vectors is often a difficult and time-consuming task. Here, we demonstrate the use of magnetic resonance (MR)-guided convection enhanced delivery (CED) of optogenetic viral vectors into primary somatosensory (S1) and motor (M1) cortices of macaques to obtain efficient, widespread cortical expression of light-sensitive ion channels. Adeno-associated viral (AAV) vectors encoding the red-shifted opsin C1V1 fused to yellow fluorescent protein (EYFP) were injected into the cortex of rhesus macaques under MR-guided CED. Three months post-infusion, epifluorescent imaging confirmed large regions of optogenetic expression (&#62;130 mm2) in M1 and S1 in two macaques. Furthermore, we were able to record reliable light-evoked electrophysiology responses from the expressing areas using micro-electrocorticographic arrays. Later histological analysis and immunostaining against the reporter revealed widespread and dense optogenetic expression in M1 and S1 corresponding to the distribution indicated by epifluorescent imaging. This technique enables us to obtain expression across large areas of the cortex within a shorter period of time with minimal damage compared to the traditional techniques and can be an optimal approach for optogenetic viral delivery in large animals such as NHPs. This approach demonstrates great potential for network-level manipulation of neural circuits with cell-type specificity in animal models evolutionarily close to humans.&#160;

Here, we demonstrate magnetic resonance (MR)-guided convection enhanced delivery (CED) of viral vectors into the cortex as an efficient and simplified approach for achieving optogenetic expression across large cortical areas in the macaque brain.

Konvektion Verbesserte Lieferung von optogenetischen Adeno-assoziierten Viral vektor an den Cortex von Rhesus Macaque unter Anleitung von Online-MRT-Bildern