Este trabalho só foi possível por concessões do NIH (EY012977), um Prémio Carreira na de Ciências Biomédicas da Burroughs Wellcome Fund, a Fundação Whitehall, e da Fundação Sloan (AKM).

1. Manuseio e Armazenamento de vírus <ol><li> Uma protecção adequada e técnicas de manejo devem ser escolhidos com base no nível de biossegurança do vírus para ser usado. Estas práticas podem ser encontrados em Biossegurança em Microbiologia e Biomédica ª edição Laboratories 5, disponível no site do CDC ( <a href="http://www.cdc.gov/od/OHS/biosfty/bmbl5/bmbl5toc.htm">http://www.cdc.gov/od/OHS/biosfty/bmbl5/bmbl5toc.htm</a> ). O uso de vetores AAV é aprovado para o Nível de Biossegurança 1 (NB-1). Para o experimento mostrado aqui, um jaleco e luvas vai ser usado durante o manuseamento do vírus, de acordo com os procedimentos para a manipulação de NBS-1 agentes. </li><li> Para preservar a atividade do vírus é melhor dividi-lo em pequenas alíquotas para evitar o congelamento e descongelamento repetidos. </li><li> Prepare um Gabinete de Biossegurança (BSC) Classe II de alíquotas de vírus por limpar o BSC de quaisquer objetos desnecessários e esterilizar a superfície com EtOH 70%. Coloque um copo contendo solução de água sanitária a 10% no capô para a recolha de resíduos contaminados AAV. Também colocado no BSC são estéreis tubos de 0,5 ml e um recipiente de gelo seco. </li><li> Descongelar estoque viral no gelo fora do BSC. </li><li> Vortex vírus e abrir o tubo dentro do BSC. </li><li> Pipetar volume da alíquota desejada (por exemplo, 5 mL) em um tubo de 0,5 ml, fechar o tubo e colocá-lo no gelo seco para flash-freeze o vírus. </li><li> Quando todos os vírus foi aliquotado, alienar o tubo de vírus e ponteiras no contentor de resíduos contendo lixívia a 10%. </li><li> Remova o recipiente de resíduos da capa e adicionar água sanitária a 10% adicionais, em seguida, despeje a lixívia na pia. Descarte de resíduos plásticos em um recipiente biohazard conforme instruído pelo oficial de seu instituto de biossegurança. </li><li> Limpar qualquer equipamento ou superfícies que entraram em contato com o vírus com água sanitária a 10%. Descarte as luvas. </li><li> Alíquotas armazenar em freezer -80 C °. </li></ol> 2. Cirurgia <ol><li> Cobrir a área cirúrgica com papel absorvente laboratório banco. Instrumentos cirúrgicos devem ser esterilizados e cirurgia feita sob condições assépticas, de acordo com a biossegurança de sua instituição e as diretrizes de uso animal. </li><li> Escolha uma área adjacente à área cirúrgica, que será dedicado a carregar o micropipetas com o vírus, e cobri-lo com papel absorvente laboratório banco. Transferir uma parte alíquota do vírus em um recipiente de gelo nesta área e permitir que o vírus para descongelar em gelo como a cirurgia está sendo realizada. </li><li> Configuração de um recipiente de resíduos de lixívia a 10% na área dedicada vírus manuseio para a eliminação de pontas de pipeta, etc, que entram em contato com o vírus. </li><li> Puxe uma micropipeta de vidro Wiretrol a um diâmetro da ponta de aproximadamente 20 microns. Coloque uma pequena gota de óleo mineral na extremidade sem corte da micropipeta e inserir o êmbolo de arame fornecido com o micropipetas. </li><li> Assegurar a micropipeta no grampo do braço micropump. </li><li> Injetar um rato por via subcutânea com buprenorfina na dose de 0,5 mg / kg. Anestesiar o rato com Avertin via intraperitoneal com uma dose de 200 mg / kg e remover o cabelo do topo da cabeça com uma tesoura cirúrgica, certificando-se de deixar margens grande o suficiente para impedir que o cabelo de entrar na incisão. </li><li> Anexar uma manta de aquecimento à base de um stereotax para manter uma temperatura corporal de 37 ° C durante toda a cirurgia e segura o mouse na stereotax. </li><li> Banhar a cabeça com três esfrega alternadas de etanol e betadine para esterilizar a área. </li><li> Coloque uma gota de TOBRADEX pomada em cada olho para manter os olhos úmidos durante a cirurgia. </li><li> Faça uma incisão abaixo da linha média da cabeça e puxe a pele de volta para expor o crânio. </li><li> Remova cuidadosamente a fáscia do crânio usando uma pinça de ponta fina. </li><li> Localizar a área a ser injetado usando coordenadas estereotáxica e marcar o crânio com uma caneta cirúrgica. </li><li> Usando uma broca de dentista com um 1,4 milímetros rebarba, uma área fina do crânio de aproximadamente dois milímetros de diâmetro, até as rachaduras do crânio, dividindo a área diluído em vários segmentos. </li><li> Todo esse procedimento, manter o crânio úmido com aplicações de soro fisiológico estéril. </li><li> Realizar uma craniotomia delicadamente removendo os segmentos crânio diluído com extra-fina com ponta fórceps. </li></ol> 3. Preparação de injeção <ol><li> Com um KimWipe colocado sobre a tampa, abra o tubo de vírus e de pipeta 1.5uL (para uma injeção 1uL) do vírus em um pequeno pedaço de parafilme. </li><li> Coloque a ponta da micropipeta para o estoque viral e retirar manualmente o êmbolo. Se a dificuldade é experimentada desenho estoque viral para a micropipeta, a ponta pode ser ligeiramente aumentada ser uma perfuração KimWipe com a micropipeta para quebrar uma pequena parte do vidro. </li><li> Braço inferior micropump em êmbolo até uma pequena quantidade de vírus é dissipada a partir da ponta da micropipeta. Remover esta pequena gota com um cotonete e aplicador de descarte em erascontainer e. </li><li> Aplique uma gota de óleo mineral para a ponta da micropipeta para evitar o entupimento como a micropipeta é abaixado no cérebro. </li></ol> 4. Injeção de vírus <ol><li> Usando o X e Y estereotáxica coordenadas, a posição da micropipeta sobre a área a ser injetada. Neste experimento, os estereotáxica coordenadas utilizadas para localizar córtex visual primário é posterior ao bregma 2,7 milímetro e 2,5 mm lateral à linha média. Muito lentamente o micropipeta (a uma taxa aproximada de 1mm/1minute) para a posição Z adequada. </li><li> Digite os parâmetros de injeção desejada na caixa de controlador de SYS MICRO4 micropump e iniciar a injeção. Para esta experiência, 1 microlitro mais de 10 minutos será usado como uma taxa de injeção. </li><li> Quando a injeção é terminar, deixe a pipeta para descansar por 1-2 minutos para evitar o efluxo do vírus durante a remoção. Após este período, muito lentamente remover a micropipeta do cérebro (mesma taxa acima). </li><li> Sutura no couro cabeludo e selá-lo com cola de tecido. Injetar o animal por via subcutânea com buprenorfina na dose de 0,1 mg / kg a cada 8-12 horas nas próximas 72 horas, ou enquanto o animal está exibindo sinais de dor. Permitir que o animal se recuperar sob uma lâmpada de calor até que esteja deambulando e pronto para ser devolvido à sua gaiola. Experimentos com imagens pode ser iniciada após o tempo de incubação desejado (dias a semanas após a injeção viral). </li></ol> 5. Limpeza <ol><li> Lavar a micropipeta com lixívia a 10% e descartá-lo em um recipiente adequado. </li><li> Dispor de recipiente de resíduos da mesma maneira como Seção 1. </li><li> Descarte o papel bancada do laboratório em bin de risco biológico e limpar todas as superfícies e instrumentos que possam ter estado em contacto com o vírus com água sanitária a 10%. </li><li> Vírus não utilizados podem ser congelados novamente, tendo em mente que repetidos de congelamento / descongelamento causar degradação do vírus. </li></ol> 6. Resultados representante <img src="/files/ftp_upload/2140/2140fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Transduzidas neurônio após a injeção de double-stranded adeno-associated virus sorotipo 1 (dsAAV S1) carregando proteína verde fluorescente (GFP) sob controle do promotor CMV. O corpo da célula, bem como dendritos proximais e distais são claramente visíveis nas seções fixas fotografada usando um microscópio de epifluorescência. Barra de escala = 100 mm. <img src="/files/ftp_upload/2140/2140fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Labeling típico de uma injeção do vírus intracraniana em córtex visual primário usando S1 dsAAV mostrando a extensão da disseminação viral, assim como neurônios rotuladas, glia e processos. Barra de escala = 250 mM. <img src="/files/ftp_upload/2140/2140fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Rotulagem de células no hipocampo usando S1 dsAAV. Barra de escala = 250 mM. Estes números são adaptados de Lowery et al. 2009 1

<ol>
	<li>Kaplitt, M. G., Leone, P., Samulski, R. J., Xiao, X., Pfaff, D. W., O'Malley, K. L., During, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+gene+expression+and+phenotypic+correction+using+adeno-associated+virus+vectors+in+the+mammalian+brain.">Long-term gene expression and phenotypic correction using adeno-associated virus vectors in the mammalian brain.</a> Nat Genet. 8, 148-154 (1994).</li><li>Harding, T. C., Dickinson, P. J., Roberts, B. N., Yendluri, S., Gonzalez-Edick, M., Lecouteur, R. A., Jooss, K. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+gene+transfer+efficiency+in+the+murine+striatum+and+an+orthotopic+glioblastoma+tumor+model,+using+AAV-7-+and+AAV-8-pseudotyped+vectors.">Enhanced gene transfer efficiency in the murine striatum and an orthotopic glioblastoma tumor model, using AAV-7- and AAV-8-pseudotyped vectors.</a> Hum Gene Ther. 17, 807-820 (2006).</li><li>Lo, W. D., Qu, G., Sferra, T. J., Clark, R., Chen, R., Johnson, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus-mediated+gene+transfer+to+the+brain:+duration+and+modulation+of+expression.">Adeno-associated virus-mediated gene transfer to the brain: duration and modulation of expression.</a> Hum Gene Ther. 10, 201-213 (1999).</li><li>Lowery, R. L., Zhang, Y., Kelly, E. A., Lamantia, C. E., Harvey, B. K., Majewska, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+long-term+labeling+of+cells+in+the+developing+and+adult+rodent+visual+cortex+using+double-stranded+adeno-associated+viral+vectors.">Rapid long-term labeling of cells in the developing and adult rodent visual cortex using double-stranded adeno-associated viral vectors.</a> Dev Neurobiol. 69, 674-688 (2009).</li></ol>

Os protocolos experimentais animais e foram aprovados pela Universidade de Rochester University Comissão de Recursos Animais (UCAR), em conformidade com o PHS Política de Assistência Humanitária e Uso de Animais de Laboratório.

Virally mediada entrega do gene tem um grande potencial para o estudo de processos neurológicos e tratamento de distúrbios cerebrais 1,2,3. A grande versatilidade desta técnica também pode ser explorada para fluorescente rótulo células para geração de imagens tanto in vitro como in vivo 4. Aqui demonstramos um procedimento detalhado para a transdução de neurônios e células gliais no córtex visual do rato usando um double-stranded do vírus adeno-associação expressan...

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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Stoelting Mouse and Neonatal Rat Adaptor</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Stoelting</td>
<td>51625</td>
<td>Regular stereotax for securing animals for surgery may be substituted</td>
</tr>
<tr>
<td>Extra Fine Bonn Scissors, 8.5cm, straight tip, cutting edge 13mm</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>14084-08</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Eye Dressing Forceps, 10cm, tip width 0.5mm, curved</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>11152-10</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dumont #5/45 Forceps- Dumoxel Standard Tip, 11cm, angled</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>11251-35</td>
<td>Extra-fine tipped forceps for performing craniotomy</td>
</tr>
<tr>
<td>Standard Pattern Forceps, straight, 2.5mmx1.35mmtip, 12cm</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>11000-12</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microtorque Control Box and Tech2000 handpiece</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ram Products, Inc.</td>
<td>TECH2000ON/OFF</td>
<td>Dental drill</td>
</tr>
<tr>
<td>Micro Drill Stainless Steel Burrs 1.4mm tip diameter</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>19008-14</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Wiretrol micropipettes, to deliver 1-5 Ul</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR International/ Drummond</td>
<td>5-000-1001 or 53480-287</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Mineral oil</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR International</td>
<td>29447-338</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Manual Micromanipulator and Tilting Base (right-handed)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>World Precision Instruments, Inc.</td>
<td>M3301-M3-R</td>
<td>Used for determining stereotaxic co-ordinates</td>
</tr>
<tr>
<td>UltraMicroPump (UMP3) (one) with SYS-Micro4 Controller</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>World Precision Instruments, Inc.</td>
<td>UMP3-1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sutures</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR International</td>
<td>95056-952</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>P-97 Flaming/Brown Micropipette Puller</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sutter Instruments</td>
<td>P-97</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tobradex</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Available from your institution&#x2019;s veterinary services</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

intracranial injection of adeno-associated viral vectors

Injeção intracraniana de vetores virais projetadas para expressar uma proteína fluorescente é uma técnica de rotulagem versátil para visualização de subgrupos específicos de células em diferentes regiões do cérebro in vivo e em secções do cérebro. Ao contrário da injeção de corantes fluorescentes, rotulagem viral oferece segmentação de tipos de células individuais e é menos caro e demorado do que estabelecer linhas de ratinhos transgénicos. Nesta técnica, um vetor adeno-associado (AAV) viral é injetado intracraniana usando coordenadas estereotáxica, uma micropipeta e uma bomba automatizada para entrega preciso de AAV para a área desejada com o mínimo dano ao tecido circundante. Parâmetros de injeção pode ser adaptado para experimentos individuais, ajustando a idade do animal em injeção, injeção de localização, volume de injeção, a taxa de injeção, sorotipo AAV eo promotor dirigindo a expressão do gene. Dependendo das condições de escolhido, virally induzida a expressão do transgene pode permitir a visualização de grupos de células, as células individuais ou multa processos celulares, até o nível das espinhas dendríticas. O experimento mostrado aqui representa uma injeção de double-stranded AAV expressando a proteína fluorescente verde para a rotulagem de neurônios e células gliais no córtex visual primário do mouse.

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Intracranial Injection of Adeno-associated Viral Vectors

Aqui apresentamos a injeção intracraniana de vetores de AAV para a rotulagem fluorescentes de neurônios e células gliais no córtex visual.

Injeção intracraniana da adeno-associado vetores virais

Intracranial injection of viral vectors engineered to express a fluorescent protein is a versatile labeling technique for visualization of specific ...

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Research

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Neuroscience

47.0K visualizações.  University of Rochester. Aqui apresentamos a injeção intracraniana de vetores de AAV para a rotulagem fluorescentes de neurônios e células gliais no córtex visual.