ברצוננו להודות לאנדראה Portbury לקריאה ביקורתית של כתב היד, מעבדת השירות של מיקרוסקופ UNC לקבלת סיוע בזמן לשגות ההדמיה, ו-NIH (מענק # R01HL061656) לתמיכה במימון.

1. הכן את חרוזים נוגדנים מצומדות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום אחד לפני לנתיחה, לשלב את הנוגדן של בחירה עם Dynabeads המתאים (כגון חולדת Dynabeads IgG לנוגדנים גדלו בחולדה, 4 x 10 8 חרוזים / מ&quot;ל) להוראות היצרן. לנוגדן אנטי CD31 חולדת BD (0.5 מיקרוגרם / μl, המשמש לבודד תאי אנדותל), 3 נוגדן μl מתווסף לכל 25 חרוזים μl, לריכוז סופי של 1.5 מיקרוגרם נוגדן אנטי-CD31 ו1 x 10 7 / חרוזים 25 חיץ μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה חרוזים ונוגדני לילה בשעה 4 ° C. </li></ol> 2. הכנת פלייט קולגן <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים מבודדים יוצרים צינוריות במהירות רבות יותר כאשר גדלו על ג&#39;ל קולגן בניגוד לסתם צלחת קולגן מצופה. לכן, ג&#39;ל קולגן נעשים בלילה שלפני הניתוח, כפי שתואר ב6. על קרח במכסת מנוע בתרבית רקמה, לשלב את ריאגנטים הבאים (מספיק 19 בארות): 206.4 H סטרילי μl &lt;תת&gt; 2 O, 140.4 סוג קולגן μl אני (4.08 מ&quot;ג / מ&quot;ל), 38.4 M199 10x μl, ו1.15 μl 5 M NaOH. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה μl 20 של ג&#39;ל קולגן זה לתוך הבארות של צלחת תרבית רקמת 384 גם. מניחים את הצלחת 37 ° C תרבות רקמות חממה למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 80 DMEM μl לכל היטב דגירה במשך 15 דקות ב 37 ° C. הסר את התרבות בינונית ולחזור פעמיים נוספות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר השטיפה הסופית, להוסיף 80% 10 μl FBS / DMEM זה היטב דגירה הלילה בשעה 37 ° C. הסר את התרבות בינונית לפני הוספת התאים הבודדים. </li></ol> 3. בלו ולעכל לב <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את העכבר מתוזמן בהריון ביום העוברי הרצוי באמצעות טכניקת המתת חסד מאושרת. כל הניסויים אושרו על ידי הטיפול בבעלי החיים המוסדיים ועדת שימוש באוניברסיטת צפון קרוליינה בצ&#39;אפל היל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם העכבר במצב שכיבה, בנדיבות לרסס את צד הגחון של הנקבה עם אתנול 70% לפנינתיחה. בעזרת מלקחיים כדי להרים את עור הבטן התחתון ושריר מהאיברים הפנימיים, לחתוך לפתוח חלל הבטן התחתונה של הנקבה כדי להמחיש את האיברים הפנימיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחזיק את צוואר הרחם עם מלקחיים, לחתוך בזהירות הזנב למלקחיים ולהתחיל להרים את קרן הרחם מחלל הבטן. תוך הרמת קרן הרחם, חתך את כל רקמת חיבור שמחזיקה את הקרן במקום. כדי לסיים מוציא את קרן הרחם, חתך את הצומת של קרן הרחם עם oviduct לשחרר את קרן הרחם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את קרן הרחם בצלחת פטרי שמכילה תמיסת מלח קר 1x פוספט שנאגרו (PBS) ולשטוף במידת הצורך. גזור לפתוח קרן הרחם דרך קו האמצע לחשוף את שקי העובריים המצורפים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גזור לפתוח השק עוברי בצומת של השליה ואת העובר, כדי למנוע טעות חיתוך העובר ולאחזר עובר. הנח את העובר בצלחת פטרי שנייה עם PBS הקר. להחזיר את צלחת פטרי עם קרן הרחם לקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Decapitate העובר כדי לשפר את הגישה לקיר החזה. אם genotyping הוא צורך, לחתוך את הזנב כדי להסיר אותו ולשמור בצינור Eppendorf מונח על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם העובר על הגב שלה, לחתוך לפתוח את דופן בית החזה כדי להמחיש את הלב וריאות. כדי להימנע מחיתוך הלב, לעשות חתך אנכי בצד של כלוב הצלעות, ליד forelimb, ואחריו חתך אופקי לרוחב החלק התחתון של הצלעות, ולאחר מכן משוך בעדינות את בית החזה ואת הדרך. דרך כ יום עוברי 13.5, קיר החזה הוא שקוף, בסיוע בהדמיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רם בזהירות את הלב באמצעות מלקחיים ולחתוך את כלי בהמשך. לאחר מכן, לחתוך מעל כלי הגדול כדי לשחרר את הלב. אם כלי ריאתי לא נחתכים, הריאות ניתן להסיר עם הלב. לפיכך, להסיר רקמות זרות, כמו הריאות, במידת צורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפריד ולהשליך את כלי הפרוזדורים וגדולים מהחדרים. בעזרת מספריים, ברר את החדרים לחתיכות קטנות (כ 1 מ&quot;מ 3 &lt;/ Sup&gt;) ומקום בכ -500 collagenase μl (1 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​בPBS סטרילי). שמור דגימות על קרח עד שכל חדרי לב טחון והניח בcollagenase. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזרו על השלבים הקודמים עד שכבר נכרת מכל העוברים את החדרים, איסוף כל לב בצינור Eppendorf נפרד. אם יש לי כל העוברים באותו גנוטיפ, לב עשוי להיות נקווה בצינור Eppendorf אחת. מספר הדגימות שעובדו בכל פעם אחת עלול להיות מוגבל המבוסס על המגנט משמש לבידוד; DynaMag (123-21D) משמש כאן מחזיק מקסימום של 16 צינורות Eppendorf. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקם את החדרים הטחונים ב 37 ° C עם הנדנדה למשך 45 דקות. בכל 15 דקות, להסיר בעדינות את הדגימות ו פיפטה מעלה ומטה כדי לנתק מכאני את התאים. </li></ol> 4. בידוד תאי האנדותל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעבור את פתרון חדר-collagenase דרך 70 מיקרומטר סינון כדי להסיר גושים הנותרים של תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה התאים ב XG 400 במשך 10 דקות. להשליךsupernatant, להחליף עם כ 200 FBS 10% μl בDMEM, ופיפטה מעלה ומטה כדי לנתק את התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על השלב הקודם ועונה אחת. צנטריפוגה התאים ב XG 400 במשך 10 דקות אחרי השני 10% לשטוף FBS / DMEM. Resuspend התאים 50 FBS 10% / DMEM μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך השלב הסופי צנטריפוגה, להכין את החרוזים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את צינור Eppendorf המכיל נוגדנים וחרוזים על מגנט דקות 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם הצינור במקום על המגנט, להסיר את supernatant. הסר את הצינור מהמגנט ולהוסיף כ 100 FBS 10% / DMEM μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הצינור על מגנט דקות 1. הסר את supernatant, ולשטוף שוב עם FBS 10% / DMEM. חזור על פעולה עבור סכום כולל של 3 שוטף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר לשטוף הסופי, resuspend את חרוזי נוגדנים מצומדות בFBS 10% / DMEM (5 μl לדגימה). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכל דגימה של תאים, מוסיף 5 μl של חרוזי נוגדנים מצומדות. מניחים את השעיות חרוז הסלולריים על 4 מעלות צלזיוס עם נדנדה עבורדקות R 30. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במכסת מנוע זרימה למינרית, למקם את צינורות Eppendorf המכילים תאים וחרוזים נוגדנים מצומדות על מגנט דקות 1. הסר את supernatant, הסר את הצינורות מהמגנט, ולשטוף עם FBS כ 100 μl 10% / DMEM. חזור על פעולה עבור 5 שוטף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר השטיפה האחרונה, מניח את הצינורות על מגנט דקות 1, להסיר את supernatant, והסר את הצינורות מהמגנט. הוסף כ 100 DMEM μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הצינורות על מגנט דקות 1, להסיר את supernatant, והסר את הצינורות מהמגנט. הוסף 100-200 μl prewarmed 0.25% טריפסין-EDTA. דגירה הדגימות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הצינורות על המגנט במשך 2 דקות. להעביר את supernatant המכיל תא בזהירות לצינורות Eppendorf טריים. צנטריפוגה במשך 5 דקות ב 400 x גרם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את supernatant. Resuspend התאים בינוני 80-100 μl צמיחה וצלחת ב96 - או 384 היטב צלחת תרבות מטופלים, בהתאם לתשואה הצפויה(כ 450-600 תאים מהחדרים של E14.5-E16.5 עוברים). לתאי אנדותל, השתמש במדיום תרבות צמיחת אנדותל (מוגדר להלן). </li></ol>

<ol>
	<li>Landecker, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Culturing Life: How Cells Became Technologies. , (2007).</li><li>Kan, C. Y., Wen, V. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+dysfunction+and+cytoskeletal+changes+associated+with+repression+of+p16(INK4a)+during+immortalization.">Endothelial cell dysfunction and cytoskeletal changes associated with repression of p16(INK4a) during immortalization.</a> Oncogene. , (2012).</li><li>Dyer, L. A., Patterson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+endothelium:+an+emphasis+on+heterogeneity.">Development of the endothelium: an emphasis on heterogeneity.</a> Semin. Thromb. Hemost. 36, 227-235 (2010).</li><li>Dong, Q. G., Bernasconi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+strategy+for+isolation+of+endothelial+cells+from+murine+tissues.+Characterization+of+two+endothelial+cell+lines+from+the+murine+lung+and+subcutaneous+sponge+implants.">A general strategy for isolation of endothelial cells from murine tissues. Characterization of two endothelial cell lines from the murine lung and subcutaneous sponge implants.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 17, 1599-1604 (1997).</li><li>van Beijnum, J. R., Rousch, M., Castermans, K., vander Linden, E., Griffioen, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+endothelial+cells+from+fresh+tissues.">Isolation of endothelial cells from fresh tissues.</a> Nat. Protoc. 3, 1085-1091 (2008).</li><li>Runyan, R. B., Markwald, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invasion+of+mesenchyme+into+three-dimensional+collagen+gels:+a+regional+and+temporal+analysis+of+interaction+in+embryonic+heart+tissue.">Invasion of mesenchyme into three-dimensional collagen gels: a regional and temporal analysis of interaction in embryonic heart tissue.</a> Dev. Biol. 95, 108-114 (1983).</li><li>Arnaoutova, I., Kleinman, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+angiogenesis:+endothelial+cell+tube+formation+on+gelled+basement+membrane+extract.">In vitro angiogenesis: endothelial cell tube formation on gelled basement membrane extract.</a> Nat. Protoc. 5, 628-635 (2010).</li><li>Zeisberg, E. M., Potenta, S. E., Sugimoto, H., Zeisberg, M., Kalluri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblasts+in+kidney+fibrosis+emerge+via+endothelial-to-mesenchymal+transition.">Fibroblasts in kidney fibrosis emerge via endothelial-to-mesenchymal transition.</a> Journal of the American Society of Nephrology : JASN. 19, 2282-2287 (2008).</li><li>Chang, L., Noseda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+vascular+smooth+muscle+cells+from+local+precursors+during+embryonic+and+adult+arteriogenesis+requires+Notch+signaling.">Differentiation of vascular smooth muscle cells from local precursors during embryonic and adult arteriogenesis requires Notch signaling.</a> PNAS. 109, 5993-6998 (2012).</li><li>Fehrenbach, M. L., Cao, G., Williams, J. T., Finklestein, J. M., DeLisser, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+murine+lung+endothelial+cells.">Isolation of murine lung endothelial cells.</a> American Journal of Physiology: Lung Cellular and Molecular Physiology. 296, L1095-L1103 (2009).</li><li>Frauli, M., Ludwig, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+fibroblast+proliferation+in+a+culture+of+human+endometrial+stromal+cells+using+a+medium+containing+D-valine.">Inhibition of fibroblast proliferation in a culture of human endometrial stromal cells using a medium containing D-valine.</a> Archives of Gynecology and Obstetrics. , 241-96 (1987).</li><li>Lazzaro, V. A., Walker, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+fibroblast+proliferation+in+L-valine+reduced+selective+media.">Inhibition of fibroblast proliferation in L-valine reduced selective media.</a> Research communications in chemical pathology and pharmacology. 75, 39-48 (1992).</li><li>Arima, S., Nishiyama, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenic+morphogenesis+driven+by+dynamic+and+heterogeneous+collective+endothelial+cell+movement.">Angiogenic morphogenesis driven by dynamic and heterogeneous collective endothelial cell movement.</a> Development. 138, 4763-4776 (2011).</li></ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

עבודה עם תאים עובריים ראשוניים מאפשרת ניסויים חדשניים לטיפול בשלבים קריטיים של פיתוח במבחנה. עם זאת, הליך הבידוד הוא לא טריוויאלי. שלבים קריטיים לבידוד כל סוג של תאים כוללים הבטחה כי התאים מופרדים היטב על עיכול collagenase ולאחר מכן שהם הושעו גם במהלך השלבים לשט?...

כניסתו של שורות תאים הנציחו יש מהפכה ביולוגיה של תא בסיסית 1. שורות התאים הקיימים כיום נגזרות ממגוון רחב של איברים ולהקיף את כל סוגי התאים העיקריים. עם זאת, יש לי שורות תאים הוקמו כמה מגבלות. תהליך ההנצחה ברור שמשנה את אופן הפעולה של התאים, במיוחד ביחס לתוחלת חיים והתפשטות, אלא גם יכול להשפיע על הביטוי של חלבונים בלתי צפויים, כגון חלבוני cytoskeletal 2. בנוסף, למרות ששורות תאים רבות ושונות זמינות, יש גיוון משמעותי בקרב אפילו סוג תא בודד בתוך כל אורגניזם. תאי אנדותל בהתנהגויות מגוונות מופע מסוימות המבוססים על אם הם קו עורקים או ורידים ואיזה סוג של זרימה הוא הווה בכלי 3. ועוד יותר דחוף מבחינה התפתחותית, לעומת זאת, הוא שהרוב המכריע של שורות התאים הזמינות נגזרים מרקמות בוגרת (ראה, למשל tהוא אוסף זמין דרך ATCC). שורות תאי בוגרים אלה עשויים לא לשחזר את האופי הדינמי של המבשרים העובריים שלהם. את דפוסי ביטוי גנים spatiotemporal המשתנים במהירות שנצפו במהלך פיתוח גם מצביעים על כך שתא האנדותל מאיבר אחד בכל שלב התפתחותי נתון לא יכול להתנהג באותה הצורה כמו תא האנדותל מאותו איבר בשלב התפתחותי שונה. כחלופה לשימוש בשורות תאים הנציחו זמינות מסחרי, ניתן לבודד תאים ראשוניים מהרקמה הספציפית של עניין. בין היתרונות של טכניקה זו, ניתן לבודד תאים הראשוניים אלה מאיבר מסוים או אפילו חלק מאיבר בכל שלב התפתחותי מסוים. יתר על כן, ניתן לבודד תאים הראשוניים אלה ממגוון הרחב של בעלי חיים מהונדסים זמינים, המאפשרים במחקר במבחנה של נוקאאוט הגן ודפיקה ב, תוך הימנעות בעיות אחרות כגון יעילות transfection. באופן לא מפתיע, רביםטכניקות כבר פורסם מפרטות כיצד לבודד סוגי תאים מסוימים 4,5. באופן כללי, טכניקות אלה כרוכים באיסוף באזור של עניין, dissociating תאים, תיוג סוג התא המסוים של עניין, ומבודד את התאים הללו לניתוח נוסף. ללמוד אוכלוסייה עוברית מוקדמת של תאי האנדותל הכליליים, אנו scaled למטה 4 טכניקה שפורסמו בעבר לשימוש עם איבר קטן יותר. עם הליך מוקטן זה, אנו יכולים לבודד את תאי האנדותל הכליליים מהלב העוברי בשלבים עובריים ספציפיים. תאים אלה לאחר מכן ניתן להשתמש במבחני אנדותל מסורתיים, כגון ניתוחי הגירה. עד שורות תאים עובריים מוקדמות הפכו נפוצות יותר, עבודה עם התאים הראשוניים היא טכניקה לא יסולא בפז.

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;REAGENTS&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Timed-pregnant mice</td><td></td><td></td><td>To be dissected at the embryonic stage of interest</td></tr><tr><td>Anti-mouse CD31</td><td>BD Bioscience</td><td>553370</td><td></td></tr><tr><td>Rat IgG Dynabeads</td><td>Invitrogen</td><td>110-35</td><td></td></tr><tr><td>Collagen</td><td>BD Bioscience</td><td>354236</td><td></td></tr><tr><td>PBS (1x)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Collagenase, type I</td><td>Worthington Biochemical</td><td>LS004196</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Cellgro</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2442</td><td></td></tr><tr><td>Endothelial cell growth medium</td><td>(made in lab as described in notes)</td><td></td><td>DMEM containing 20% FBS, 5 &amp;mu;M &amp;#946;-mercapt&amp;#8211;thanol, 50 &amp;mu;g/ml ECG, and 1x penicillin/streptomycin</td></tr><tr><td>&amp;#946;-mercapt&amp;#8211;thanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>ECGS</td><td>Biomedical Technologies, Inc.</td><td>BT-203</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Gibco</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25300</td><td></td></tr><tr><td>384-well culture plate</td><td>Greiner</td><td>T-3037-6</td><td>Plate was prepared with a thin collagen gel, as described in &lt;sup&gt;6&lt;/sup&gt;; working surface area 10 mm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>Collagen type I</td><td>BD</td><td>354236</td><td>Use at a final concentration of 1.5 mg/ml</td></tr><tr><td>M199, 10x</td><td>Invitrogen</td><td>11825-015</td><td></td></tr><tr><td>Syto-16</td><td>Invitrogen</td><td>S7578</td><td>Used as directed in &lt;sup&gt;13&lt;/sup&gt; </td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;EQUIPMENT&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Stereoscopic microscope</td><td>Nikon</td><td>SMZ645</td><td></td></tr><tr><td>Cell culture incubator</td><td>Thermo</td><td>3110</td><td></td></tr><tr><td>DynaMag</td><td>Invitrogen</td><td>123-21D</td><td></td></tr><tr><td>Table-top centrifuge</td><td>Thermo</td><td>75002430</td><td></td></tr></tbody></table>

isolation of embryonic ventricular endothelial cells

תרבית תאים שיפרה באופן משמעותי את היכולת שלנו להעריך אוכלוסיות בודדות של תאים בתנאי התרבות עצום. בעוד שורות תאים הנציחו מציעות יתרונות משמעותיים לנוחות השימוש שלהם, שורות תאים אלה אינן זמינות לכל סוגי התאים הפוטנציאליים. על ידי בידוד תאים ראשוניים מאזור מסוים של עניין, במיוחד מעכבר מהונדס, ניתן לבצע מחקרים מורכבים יותר. הטכניקה הבסיסית כרוכה לנתח איבר או איברים חלקיים של עניין (למשל לב או באזור מסוים של הלב) וdissociating האיברים לתאים בודדים. תאים אלה מודגרת מכן עם חרוזים מגנטיים מצומדות לנוגדן שמזהה את סוג התא של עניין. התאים של עניין אז יכולים להיות מבודדים עם השימוש במגנט, עם דגירה קצרה טריפסין dissociating תאים מאת החרוזים. אז יכולים להיות מתורבתים תאים מבודדים אלה וניתח המועדפים. טכניקה זו תוכננה במקור עבור איבר עכבר בוגראבל ים וניתן לשנות בקלות את לשימוש עם איברים עובריים, כפי שמודגם במסמך זה. כי האינטרס שלנו הוא בכלי הדם כליליים פיתוח, אנחנו רוצים ללמוד אוכלוסייה של תאים זה בשלבים עובריים ספציפיים. לפיכך, פרוטוקול המקורי היה צריך להיות שונה כדי להיות תואם עם הגודל הקטן של החדרים העובריים והתשואה הפוטנציאלית הנמוכה של תאי האנדותל בשלבי התפתחותיים אלה. ניצול גישה מוקטנת זה, יש לנו להעריך שיפוץ מקלעת כלילית בתאי אנדותל חדריות עובריים מהונדסים.

באמצעות נוגדן ספציפי לאנדותל שמכיר CD31, תאי האנדותל בודדו מהחדרים של (E) 13.5 (איור 1 א) ו 18.5 (איורים 1 ב-1D) עוברים עובריים. כאשר גדלו על צלחת תרבות מטופל, התאים אלה יישארו מעוגלים והיינו ליצור דפוס מרוצף אם מחוברות קרובים (איור 1 א). קולגן לדלל שימש ?...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Embryonic Ventricular Endothelial Cells at JoVE.com

Isolation of Embryonic Ventricular Endothelial Cells

תרבית תאים העיקרית היא טכניקה שימושית לניתוח אוכלוסיות מסוימות של תאים, במיוחד מעוברי עכבר מהונדסים בשלבי התפתחות ספציפיים. בזאת, חדרי לב עובריים הם גזורים וניתקו, וחרוזים נוגדנים מצומדות לזהות ולהפריד את תאי האנדותל לניתוח נוסף.

בידוד של תאי האנדותל חדרית עובריים

Cell culture has greatly enhanced our ability to assess individual populations of cells under myriad culture conditions. While immortalized cell lines ...

isolation-of-embryonic-ventricular-endothelial-cells

Research

JoVE Journal

Biology

9.3K Views.  University of North Carolina at Chapel Hill. תרבית תאים העיקרית היא טכניקה שימושית לניתוח אוכלוסיות מסוימות של תאים, במיוחד מעוברי עכבר מהונדסים בשלבי התפתחות ספציפיים. בזאת, חדרי לב עובריים הם גזורים וניתקו, וחרוזים נוגדנים מצומדות לזהות ולהפריד את תאי האנדותל לניתוח נוסף.

Video: Isolation of Embryonic Ventricular Endothelial Cells

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC)

Angiogenesis is a complex multi-step process, where in response to angiogenic stimuli, new vessels are created from the existing vasculature. These steps include: degradation of the basement membrane, proliferation and migration (sprouting) of endothelial cells (EC) into the extracellular matrix, alignment of EC into cords, lumen formation, anastomosis, and formation of a new basement membrane. Many in vitro assays have been developed to study this process, but most only mimic certain stages of angiogenesis, and morphologically the vessels often do not resemble vessels in vivo. Here we demonstrate an optimized in vitro angiogenesis assay that utilizes human umbilical vein EC and fibroblasts. This model recapitulates all of the key early stages of angiogenesis, and importantly the vessels display patent intercellular lumens surrounded by polarized EC. Vessels can be easily observed by phase-contrast and time-lapse microscopy, and recovered in pure form for downstream applications.

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells HUVEC

This video protocol illustrates the isolation and culture of human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) from human umbilical cord. Once isolated these cells can be used for in vitro angiogenesis assays like the Optimized Fibrin Gel Bead Assay also demonstrated by the Hughes lab.

בידוד של האדם תאים עורק טבורי האנדותל (HUVEC)

Angiogenesis is a complex multi-step process, where in response to angiogenic stimuli, new vessels are created from the existing vasculature. These steps ...

Isolation of Murine Embryonic Hemogenic Endothelial Cells

The specification of hemogenic endothelial cells from embryonic vascular endothelium occurs during brief developmental periods within distinct tissues, and is necessary for the emergence of definitive HSPC from the murine extra embryonic yolk sac, placenta, umbilical vessels, and the embryonic aorta-gonad-mesonephros (AGM) region. The transient nature and small size of this cell population renders its reproducible isolation for careful quantification and experimental applications technically difficult. We have established a fluorescence-activated cell sorting (FACS)-based protocol for simultaneous isolation of hemogenic endothelial cells and HSPC during their peak generation times in the yolk sac and AGM. We demonstrate methods for dissection of yolk sac and AGM tissues from mouse embryos, and we present optimized tissue digestion and antibody conjugation conditions for maximal cell survival prior to identification and retrieval via FACS. Representative FACS analysis plots are shown that identify the hemogenic endothelial cell and HSPC phenotypes, and describe a methylcellulose-based assay for evaluating their blood forming potential on a clonal level.

Hematopoietic stem and progenitor cells (HSPC) derive from specialized (hemogenic) endothelial cells during development, yet little is known about the process by which some endothelial cells specify to become blood forming. We demonstrate a flow-cytometry based method allowing simultaneous isolation of hemogenic endothelial cells and HSPC from murine embryonic tissues.

בידוד של Murine העוברי Hemogenic לתאי אנדותל

The specification of hemogenic endothelial cells from embryonic vascular endothelium occurs during brief developmental periods within distinct tissues, ...

Developmental Biology

Isolation of Endothelial Progenitor Cells from Human Umbilical Cord Blood

The existence of endothelial progenitor cells (EPCs) in peripheral blood and its involvement in vasculogenesis was first reported by Ashara and colleagues1. Later, others documented the existence of similar types of EPCs originating from bone marrow2,3. More recently, Yoder and Ingram showed that EPCs derived from umbilical cord blood had a higher proliferative potential compared to ones isolated from adult peripheral blood4,5,6. Apart from being involved in postnatal vasculogenesis, EPCs have also shown promise as a cell source for creating tissue-engineered vascular and heart valve constructs7,8. Various isolation protocols exist, some of which involve the cell sorting of mononuclear cells (MNCs) derived from the sources mentioned earlier with the help of endothelial and hematopoietic markers, or culturing these MNCs with specialized endothelial growth medium, or a combination of these techniques9. Here, we present a protocol for the isolation and culture of EPCs using specialized endothelial medium supplemented with growth factors, without the use of immunosorting, followed by the characterization of the isolated cells using Western blotting and immunostaining.

The goal of this protocol is to isolate endothelial progenitor cells from umbilical cord blood. Some of the applications include using these cells as a biomarker for identifying patients with cardiovascular risk, treating ischemic diseases, and creating tissue-engineered vascular and heart valve constructs.

בידוד של אנדותל ובתאים של דם טבורי אנושי

The existence of endothelial progenitor cells (EPCs) in peripheral blood and its involvement in vasculogenesis was first reported by Ashara and ...

Isolation and Culture of Endothelial Cells from the Embryonic Forebrain

Embryonic brain endothelial cells can serve as an important tool in the study of angiogenesis and neurovascular development and interactions. The two vascular networks of the embryonic forebrain, pial and periventricular, are spatially distinctive and have different origins and growth patterns. Endothelial cells from the pial and periventricular vascular networks have unique gene expression profiles and functions. Here we present a step-by-step protocol for isolation, culture, and verification of pure populations of endothelial cells from the periventricular vascular network (PVECs) of the embryonic forebrain (telencephalon). In this approach, telencephalon devoid of pial membrane obtained from embryonic day 15 mice is minced, digested with collagenase/dispase, and dispersed mechanically into a single cell suspension. PVECs are purified from cell suspension using positive selection with anti-CD-31/PECAM-1 antibody conjugated to MicroBeads using a strong magnetic separation method. Purified cells are cultured on collagen 1&#160;coated culture dishes in endothelial cell culture medium until they become confluent and further subcultured. PVECs obtained with this protocol exhibit cobblestone and spindle shaped phenotypes, as visualized by phase-contrast light microscopy and fluorescence microscopy. Purity of PVEC cultures was established with endothelial cell markers. In our hands, this method reliably and consistently yields pure populations of PVECs. This protocol will benefit studies aimed at gaining mechanistic insights into forebrain angiogenesis, understanding PVEC interactions, and cross-talks with neuronal cell types and holds tremendous potential for therapeutic angiogenesis.

This video demonstrates an easy and reliable strategy for preparation of pure cultures of endothelial cells from the embryonic forebrain within 10-12 days and will be useful for research focused on many aspects of cerebral angiogenesis.

בידוד והתרבות של תאי האנדותל מהמוח הקדמי עוברי

Embryonic brain endothelial cells can serve as an important tool in the study of angiogenesis and neurovascular development and interactions. The two ...

Neuroscience

Isolation of Endocardial and Coronary Endothelial Cells from the Ventricular Free Wall of the Rat Heart

It has been shown that endocardial endothelial cells (EECs) and coronary endothelial cells (CECs) differ in origin, development, markers, and functions. Consequently, these two cell populations play unique roles in cardiac diseases. Current studies involving isolated endothelial cells investigate cell populations consisting of both EECs and CECs. This protocol outlines a method to independently isolate these two cell populations for cell-specific characterization. Following the collection of the left and right ventricular free wall, endothelial cells from the outer surface and inner surface are separately liberated using a digestion buffer solution. The sequential digestion of the outer surface and the inner endocardial layer retained separation of the two endothelial cell populations. The separate isolation of EECs and CECs is further verified through the identification of markers specific to each population. Based on previously published single cell RNA profiling in the mouse heart, the Npr3, Hapln1, and Cdh11 gene expression is unique to EECs; while Fabp4, Mgll, and Cd36 gene expression is unique to CECs. qPCR data revealed enriched expression of these characteristic markers in their respective samples, indicating successful EEC and CEC isolation, as well as maintenance of cell phenotype, enabling further cell-specific functional analysis.

We present a protocol for the isolation of endocardial and coronary endothelial cells from rat hearts through sequential tissue digestion in a digestion buffer, cell collection from recurrent centrifuge cycles, and cell purification using anti-rat CD31 microbeads.

בידוד של תאי כלילית ותאים כליליים מהקיר החופשי של לב החולדה

It has been shown that endocardial endothelial cells (EECs) and coronary endothelial cells (CECs) differ in origin, development, markers, and functions. ...

Isolation of Valvular Endothelial Cells

Heart valves are solely responsible for maintaining unidirectional blood flow through the cardiovascular system. These thin, fibrous tissues are subjected to significant mechanical stresses as they open and close several billion times over a lifespan. The incredible endurance of these tissues is due to the resident valvular endothelial (VEC) and interstitial cells (VIC) that constantly repair and remodel in response to local mechanical and biological signals. Only recently have we begun to understand the unique behaviors of these cells, for which in vitro experimentation has played a key role. Particularly challenging is the isolation and culture of VEC. Special care must be used from the moment the tissue is removed from the host through final plating. Here we present protocols for direct isolation, side specific isolation, culture, and verification of pure populations of VEC. We use enzymatic digestion followed by a gentle swab scraping technique to dislodge only surface cells. These cells are then collected into a tube and centrifuged into a pellet. The pellet is then resuspended and plated into culture flasks pre-coated with collagen I matrix. VEC phenotype is confirmed by contact inhibited growth and the expression of endothelial specific markers such as PECAM1 (CD31), Von Willebrand Factor (vWF), and negative expression of alpha-smooth muscle actin (&alpha;-SMA). The functional characteristics of VEC are associated with high levels of acetylated LDL. Unlike vascular endothelial cells, VEC have the unique capacity to transform into mesenchyme, which normally occurs during embryonic valve formation1. This can also occur during significantly prolonged post confluent in vitro culture, so care should be made to passage at or near confluence. After VEC isolation, pure populations of VIC can then be easily acquired.

We provide a method for isolating and culturing pure populations of heart valve endothelial cells (VEC). VEC can be isolated from either side of the cusp or leaflet and immediately following, underlying interstitial cell (VIC) isolation is straightforward.

בידוד של תאים אנדותל valvular

Heart valves are solely responsible for maintaining unidirectional blood flow through the cardiovascular system.  These thin, fibrous tissues are ...

Isolation and Culture of Avian Embryonic Valvular Progenitor Cells

Proper formation and function of embryonic heart valves is critical for developmental progression. The early embryonic heart is a U-shaped tube of endocardium surrounded by myocardium. The myocardium secretes cardiac jelly, a hyaluronan-rich gelatinous matrix, into the atrioventricular (AV) junction and outflow tract (OFT) lumen. At stage HH14 valvulogenesis begins when a subset of endocardial cells receive signals from the myocardium, undergo endocardial to mesenchymal transformation (EMT), and invade the cardiac jelly. At stage HH25 the valvular cushions are fully mesenchymalized, and it is this mesenchyme that eventually forms the valvular and septal apparatus of the heart. Understanding the mechanisms that initiate and modulate the process of EMT and cell differentiation are important because of their connection to serious congenital heart defects. In this study we present methods to isolate pre-EMT endocardial and post-EMT mesenchymal cells, which are the two different cell phenotypes of the prevalvular cushion. Pre-EMT endocardial cells can be cultured with or without the myocardium. Post-EMT AV cushion mesenchymal cells can be cultured inside mechanically constrained or stress-free collagen gels. These 3D in vitro models mimic key valvular morphogenic events and are useful for deconstructing the mechanisms of early and late stage valvulogenesis.

This article will provide a method for isolating and culturing quail or chicken HH14- valve endocardial cells and HH25 valve cushion mesenchymal cells.

בידוד והתרבות של תאים עובריים העופות אבי valvular

Proper formation and function of embryonic heart valves is critical for developmental progression. The early embryonic heart is a U-shaped tube of ...

Isolation of Murine Retinal Endothelial Cells for Next-Generation Sequencing

Recent improvements in next-generation sequencing have advanced researchers&#39; knowledge of molecular and cellular biology, with several studies revealing novel paradigms in vascular biology. Applying these methods to models of vascular development requires the optimization of cell isolation techniques from embryonic and postnatal tissues. Cell yield, viability, and purity all need to be maximal to obtain accurate and reproducible results from next-generation sequencing approaches. The neonatal mouse retinal vascularization model is used by researchers to study mechanisms of vascular development. Researchers have used this model to investigate mechanisms of angiogenesis and arterial-venous fate specification during blood vessel formation and maturation. Applying next-generation sequencing techniques to study the retinal vascular development model requires optimization of a method for the isolation of retinal endothelial cells that maximizes cell yield, viability, and purity. This protocol describes a method for murine retinal tissue isolation, digestion, and purification using fluorescence-activated cell sorting (FACS). The results indicate that the FACS-purified CD31+/CD45- endothelial cell population is highly enriched for endothelial cell gene expression and exhibits no change in viability for 60 min post-FACS. Included are representative results of next-generation sequencing approaches on endothelial cells isolated using this method, including bulk RNA sequencing and single-cell RNA sequencing, demonstrating that this method for retinal endothelial cell isolation is compatible with next-generation sequencing applications. This method of retinal endothelial cell isolation will allow for advanced sequencing techniques to reveal novel mechanisms of vascular development.

This protocol describes a method for the isolation of murine postnatal retinal endothelial cells optimized for cell yield, purity, and viability. These cells are suitable for next-generation sequencing approaches.

בידוד תאי אנדותל רשתית מורין לריצוף הדור הבא

Recent improvements in next-generation sequencing have advanced researchers&#39; knowledge of molecular and cellular biology, with several studies ...

Isolation and Culture of Pulmonary Endothelial Cells from Neonatal Mice

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) have shown to be convenient, easy to obtain and culture, and thus are the most widely studied endothelial cells. However, for research focused on processes like angiogenesis, permeability or many others, microvascular endothelial cells (ECs) are a much more physiologically relevant model to study 2. Furthermore, ECs isolated from knockout mice provide a useful tool for analysis of protein function ex vivo. Several approaches to isolate and culture microvascular ECs of different origin have been reported to date 3-7, but consistent isolation and culture of pure ECs is still a major technical problem in many laboratories. Here, we provide a step-by-step protocol on a reliable and relatively simple method of isolating and culturing mouse lung endothelial cells (MLECs). In this approach, lung tissue obtained from 6- to 8-day old pups is first cut into pieces, digested with collagenase/dispase (C/D) solution and dispersed mechanically into single-cell suspension. MLECS are purified from cell suspension using positive selection with anti-PECAM-1 antibody conjugated to Dynabeads using a Magnetic Particle Concentrator (MPC). Such purified cells are cultured on gelatin-coated tissue culture (TC) dishes until they become confluent. At that point, cells are further purified using Dynabeads coupled to anti-ICAM-2 antibody. MLECs obtained with this protocol exhibit a cobblestone phenotype, as visualized by phase-contrast light microscopy, and their endothelial phenotype has been confirmed using FACS analysis with anti-VE-cadherin 8 and anti-VEGFR2 9 antibodies and immunofluorescent staining of VE-cadherin. In our hands, this two-step isolation procedure consistently and reliably yields a pure population of MLECs, which can be further cultured. This method will enable researchers to take advantage of the growing number of knockout and transgenic mice to directly correlate in vivo studies with results of in vitro experiments performed on isolated MLECs and thus help to reveal molecular mechanisms of vascular phenotypes observed in vivo.

Here, we describe a protocol for isolation and culture of murine pulmonary endothelial cells. This method comprises mechanic and enzymatic lung tissue dissociation as well as a 2-step purification process using anti-PECAM-1 and anti-ICAM-2 antibodies conjugated to magnetic beads, which produces a pure endothelial cell population of mostly microvascular origin.

בידוד תרבות לתאי אנדותל ריאתי מעכברים ילודים

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells ...

Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and surrounded by a monolayer of valve endothelial cells (VECs). VECs play essential roles in establishing the valve structures during embryonic development, and are important for maintaining life-long valve integrity and function. In contrast to a continuous endothelium over the surface of healthy valve leaflets, VEC disruption is commonly observed in malfunctioning valves and is associated with pathological processes that promote valve disease and dysfunction. Despite the clinical relevance, focused studies determining the contribution of VECs to development and disease processes are limited. The isolation of VECs from animal models would allow for cell-specific experimentation. VECs have been isolated from large animal adult models but due to their small population size, fragileness, and lack of specific markers, no reports of VEC isolations in embryos or adult small animal models have been reported. Here we describe a novel method that allows for the direct isolation of VECs from mice at embryonic and adult stages. Utilizing the Tie2-GFP reporter model that labels all endothelial cells with Green Fluorescent Protein (GFP), we have been successful in isolating GFP-positive (and negative) cells from the semilunar and atrioventricular valve regions using fluorescence activated cell sorting (FACS). Isolated GFP-positive VECs are enriched for endothelial markers, including CD31 and von Willebrand Factor (vWF), and retain endothelial cell expression when cultured; while, GFP-negative cells exhibit molecular profiles and cell shapes consistent with VIC phenotypes. The ability to isolate embryonic and adult murine VECs allows for previously unattainable molecular and functional studies to be carried out on a specific valve cell population, which will greatly improve our understanding of valve development and disease mechanisms.

The ability to isolate heart valve endothelial cells (VECs) is critical for understanding mechanisms of valve development, maintenance, and disease. Here we describe the isolation of VECs from embryonic and adult Tie2-GFP mice using FACS that will allow for studies determining the contribution of VECs in developmental and disease processes.

בידוד של תאי Murine Valve האנדותל

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...