ברצוננו להודות לאנדראה Portbury לקריאה ביקורתית של כתב היד, מעבדת השירות של מיקרוסקופ UNC לקבלת סיוע בזמן לשגות ההדמיה, ו-NIH (מענק # R01HL061656) לתמיכה במימון.

1. הכן את חרוזים נוגדנים מצומדות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום אחד לפני לנתיחה, לשלב את הנוגדן של בחירה עם Dynabeads המתאים (כגון חולדת Dynabeads IgG לנוגדנים גדלו בחולדה, 4 x 10 8 חרוזים / מ&quot;ל) להוראות היצרן. לנוגדן אנטי CD31 חולדת BD (0.5 מיקרוגרם / μl, המשמש לבודד תאי אנדותל), 3 נוגדן μl מתווסף לכל 25 חרוזים μl, לריכוז סופי של 1.5 מיקרוגרם נוגדן אנטי-CD31 ו1 x 10 7 / חרוזים 25 חיץ μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה חרוזים ונוגדני לילה בשעה 4 ° C. </li></ol> 2. הכנת פלייט קולגן <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים מבודדים יוצרים צינוריות במהירות רבות יותר כאשר גדלו על ג&#39;ל קולגן בניגוד לסתם צלחת קולגן מצופה. לכן, ג&#39;ל קולגן נעשים בלילה שלפני הניתוח, כפי שתואר ב6. על קרח במכסת מנוע בתרבית רקמה, לשלב את ריאגנטים הבאים (מספיק 19 בארות): 206.4 H סטרילי μl &lt;תת&gt; 2 O, 140.4 סוג קולגן μl אני (4.08 מ&quot;ג / מ&quot;ל), 38.4 M199 10x μl, ו1.15 μl 5 M NaOH. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה μl 20 של ג&#39;ל קולגן זה לתוך הבארות של צלחת תרבית רקמת 384 גם. מניחים את הצלחת 37 ° C תרבות רקמות חממה למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 80 DMEM μl לכל היטב דגירה במשך 15 דקות ב 37 ° C. הסר את התרבות בינונית ולחזור פעמיים נוספות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר השטיפה הסופית, להוסיף 80% 10 μl FBS / DMEM זה היטב דגירה הלילה בשעה 37 ° C. הסר את התרבות בינונית לפני הוספת התאים הבודדים. </li></ol> 3. בלו ולעכל לב <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את העכבר מתוזמן בהריון ביום העוברי הרצוי באמצעות טכניקת המתת חסד מאושרת. כל הניסויים אושרו על ידי הטיפול בבעלי החיים המוסדיים ועדת שימוש באוניברסיטת צפון קרוליינה בצ&#39;אפל היל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם העכבר במצב שכיבה, בנדיבות לרסס את צד הגחון של הנקבה עם אתנול 70% לפנינתיחה. בעזרת מלקחיים כדי להרים את עור הבטן התחתון ושריר מהאיברים הפנימיים, לחתוך לפתוח חלל הבטן התחתונה של הנקבה כדי להמחיש את האיברים הפנימיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחזיק את צוואר הרחם עם מלקחיים, לחתוך בזהירות הזנב למלקחיים ולהתחיל להרים את קרן הרחם מחלל הבטן. תוך הרמת קרן הרחם, חתך את כל רקמת חיבור שמחזיקה את הקרן במקום. כדי לסיים מוציא את קרן הרחם, חתך את הצומת של קרן הרחם עם oviduct לשחרר את קרן הרחם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את קרן הרחם בצלחת פטרי שמכילה תמיסת מלח קר 1x פוספט שנאגרו (PBS) ולשטוף במידת הצורך. גזור לפתוח קרן הרחם דרך קו האמצע לחשוף את שקי העובריים המצורפים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גזור לפתוח השק עוברי בצומת של השליה ואת העובר, כדי למנוע טעות חיתוך העובר ולאחזר עובר. הנח את העובר בצלחת פטרי שנייה עם PBS הקר. להחזיר את צלחת פטרי עם קרן הרחם לקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Decapitate העובר כדי לשפר את הגישה לקיר החזה. אם genotyping הוא צורך, לחתוך את הזנב כדי להסיר אותו ולשמור בצינור Eppendorf מונח על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם העובר על הגב שלה, לחתוך לפתוח את דופן בית החזה כדי להמחיש את הלב וריאות. כדי להימנע מחיתוך הלב, לעשות חתך אנכי בצד של כלוב הצלעות, ליד forelimb, ואחריו חתך אופקי לרוחב החלק התחתון של הצלעות, ולאחר מכן משוך בעדינות את בית החזה ואת הדרך. דרך כ יום עוברי 13.5, קיר החזה הוא שקוף, בסיוע בהדמיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רם בזהירות את הלב באמצעות מלקחיים ולחתוך את כלי בהמשך. לאחר מכן, לחתוך מעל כלי הגדול כדי לשחרר את הלב. אם כלי ריאתי לא נחתכים, הריאות ניתן להסיר עם הלב. לפיכך, להסיר רקמות זרות, כמו הריאות, במידת צורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפריד ולהשליך את כלי הפרוזדורים וגדולים מהחדרים. בעזרת מספריים, ברר את החדרים לחתיכות קטנות (כ 1 מ&quot;מ 3 &lt;/ Sup&gt;) ומקום בכ -500 collagenase μl (1 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​בPBS סטרילי). שמור דגימות על קרח עד שכל חדרי לב טחון והניח בcollagenase. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזרו על השלבים הקודמים עד שכבר נכרת מכל העוברים את החדרים, איסוף כל לב בצינור Eppendorf נפרד. אם יש לי כל העוברים באותו גנוטיפ, לב עשוי להיות נקווה בצינור Eppendorf אחת. מספר הדגימות שעובדו בכל פעם אחת עלול להיות מוגבל המבוסס על המגנט משמש לבידוד; DynaMag (123-21D) משמש כאן מחזיק מקסימום של 16 צינורות Eppendorf. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקם את החדרים הטחונים ב 37 ° C עם הנדנדה למשך 45 דקות. בכל 15 דקות, להסיר בעדינות את הדגימות ו פיפטה מעלה ומטה כדי לנתק מכאני את התאים. </li></ol> 4. בידוד תאי האנדותל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעבור את פתרון חדר-collagenase דרך 70 מיקרומטר סינון כדי להסיר גושים הנותרים של תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה התאים ב XG 400 במשך 10 דקות. להשליךsupernatant, להחליף עם כ 200 FBS 10% μl בDMEM, ופיפטה מעלה ומטה כדי לנתק את התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על השלב הקודם ועונה אחת. צנטריפוגה התאים ב XG 400 במשך 10 דקות אחרי השני 10% לשטוף FBS / DMEM. Resuspend התאים 50 FBS 10% / DMEM μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך השלב הסופי צנטריפוגה, להכין את החרוזים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את צינור Eppendorf המכיל נוגדנים וחרוזים על מגנט דקות 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם הצינור במקום על המגנט, להסיר את supernatant. הסר את הצינור מהמגנט ולהוסיף כ 100 FBS 10% / DMEM μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הצינור על מגנט דקות 1. הסר את supernatant, ולשטוף שוב עם FBS 10% / DMEM. חזור על פעולה עבור סכום כולל של 3 שוטף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר לשטוף הסופי, resuspend את חרוזי נוגדנים מצומדות בFBS 10% / DMEM (5 μl לדגימה). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכל דגימה של תאים, מוסיף 5 μl של חרוזי נוגדנים מצומדות. מניחים את השעיות חרוז הסלולריים על 4 מעלות צלזיוס עם נדנדה עבורדקות R 30. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במכסת מנוע זרימה למינרית, למקם את צינורות Eppendorf המכילים תאים וחרוזים נוגדנים מצומדות על מגנט דקות 1. הסר את supernatant, הסר את הצינורות מהמגנט, ולשטוף עם FBS כ 100 μl 10% / DMEM. חזור על פעולה עבור 5 שוטף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר השטיפה האחרונה, מניח את הצינורות על מגנט דקות 1, להסיר את supernatant, והסר את הצינורות מהמגנט. הוסף כ 100 DMEM μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הצינורות על מגנט דקות 1, להסיר את supernatant, והסר את הצינורות מהמגנט. הוסף 100-200 μl prewarmed 0.25% טריפסין-EDTA. דגירה הדגימות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הצינורות על המגנט במשך 2 דקות. להעביר את supernatant המכיל תא בזהירות לצינורות Eppendorf טריים. צנטריפוגה במשך 5 דקות ב 400 x גרם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את supernatant. Resuspend התאים בינוני 80-100 μl צמיחה וצלחת ב96 - או 384 היטב צלחת תרבות מטופלים, בהתאם לתשואה הצפויה(כ 450-600 תאים מהחדרים של E14.5-E16.5 עוברים). לתאי אנדותל, השתמש במדיום תרבות צמיחת אנדותל (מוגדר להלן). </li></ol>

<ol>
	<li>Landecker, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Culturing Life: How Cells Became Technologies. , (2007).</li><li>Kan, C. Y., Wen, V. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+dysfunction+and+cytoskeletal+changes+associated+with+repression+of+p16(INK4a)+during+immortalization.">Endothelial cell dysfunction and cytoskeletal changes associated with repression of p16(INK4a) during immortalization.</a> Oncogene. , (2012).</li><li>Dyer, L. A., Patterson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+endothelium:+an+emphasis+on+heterogeneity.">Development of the endothelium: an emphasis on heterogeneity.</a> Semin. Thromb. Hemost. 36, 227-235 (2010).</li><li>Dong, Q. G., Bernasconi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+strategy+for+isolation+of+endothelial+cells+from+murine+tissues.+Characterization+of+two+endothelial+cell+lines+from+the+murine+lung+and+subcutaneous+sponge+implants.">A general strategy for isolation of endothelial cells from murine tissues. Characterization of two endothelial cell lines from the murine lung and subcutaneous sponge implants.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 17, 1599-1604 (1997).</li><li>van Beijnum, J. R., Rousch, M., Castermans, K., vander Linden, E., Griffioen, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+endothelial+cells+from+fresh+tissues.">Isolation of endothelial cells from fresh tissues.</a> Nat. Protoc. 3, 1085-1091 (2008).</li><li>Runyan, R. B., Markwald, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invasion+of+mesenchyme+into+three-dimensional+collagen+gels:+a+regional+and+temporal+analysis+of+interaction+in+embryonic+heart+tissue.">Invasion of mesenchyme into three-dimensional collagen gels: a regional and temporal analysis of interaction in embryonic heart tissue.</a> Dev. Biol. 95, 108-114 (1983).</li><li>Arnaoutova, I., Kleinman, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+angiogenesis:+endothelial+cell+tube+formation+on+gelled+basement+membrane+extract.">In vitro angiogenesis: endothelial cell tube formation on gelled basement membrane extract.</a> Nat. Protoc. 5, 628-635 (2010).</li><li>Zeisberg, E. M., Potenta, S. E., Sugimoto, H., Zeisberg, M., Kalluri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblasts+in+kidney+fibrosis+emerge+via+endothelial-to-mesenchymal+transition.">Fibroblasts in kidney fibrosis emerge via endothelial-to-mesenchymal transition.</a> Journal of the American Society of Nephrology : JASN. 19, 2282-2287 (2008).</li><li>Chang, L., Noseda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+vascular+smooth+muscle+cells+from+local+precursors+during+embryonic+and+adult+arteriogenesis+requires+Notch+signaling.">Differentiation of vascular smooth muscle cells from local precursors during embryonic and adult arteriogenesis requires Notch signaling.</a> PNAS. 109, 5993-6998 (2012).</li><li>Fehrenbach, M. L., Cao, G., Williams, J. T., Finklestein, J. M., DeLisser, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+murine+lung+endothelial+cells.">Isolation of murine lung endothelial cells.</a> American Journal of Physiology: Lung Cellular and Molecular Physiology. 296, L1095-L1103 (2009).</li><li>Frauli, M., Ludwig, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+fibroblast+proliferation+in+a+culture+of+human+endometrial+stromal+cells+using+a+medium+containing+D-valine.">Inhibition of fibroblast proliferation in a culture of human endometrial stromal cells using a medium containing D-valine.</a> Archives of Gynecology and Obstetrics. , 241-96 (1987).</li><li>Lazzaro, V. A., Walker, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+fibroblast+proliferation+in+L-valine+reduced+selective+media.">Inhibition of fibroblast proliferation in L-valine reduced selective media.</a> Research communications in chemical pathology and pharmacology. 75, 39-48 (1992).</li><li>Arima, S., Nishiyama, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenic+morphogenesis+driven+by+dynamic+and+heterogeneous+collective+endothelial+cell+movement.">Angiogenic morphogenesis driven by dynamic and heterogeneous collective endothelial cell movement.</a> Development. 138, 4763-4776 (2011).</li></ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

עבודה עם תאים עובריים ראשוניים מאפשרת ניסויים חדשניים לטיפול בשלבים קריטיים של פיתוח במבחנה. עם זאת, הליך הבידוד הוא לא טריוויאלי. שלבים קריטיים לבידוד כל סוג של תאים כוללים הבטחה כי התאים מופרדים היטב על עיכול collagenase ולאחר מכן שהם הושעו גם במהלך השלבים לשטוף. נתיחה מכאנית על ידי pipetting מאוד עוזרת להפריד את התאים במהלך שלב collagenase, וצעד הסינון מסיר גושים של תאים. צעדים אלה ישפרו את הטוהר האוכלוסייה ואת התשואה. ציפוי הצפיפות היא גם דאגה משמעותית כאשר מבודדים את התאים מאיבר קטן. בגלל צינור היווצרות אנדותל תלוי בצפיפות תאי 7, אנחנו הסתמכנו על צלחות תרבית רקמת 384 גם להגדיל את צפיפות הציפוי שלנו. אפילו עם שיקול זה, יש לנו היה צריך לשנות כמה ניתוחים כדי להכיל את צפיפות תא נמוכה יותר (דייר ופטרסון, בפרוגרס). לכן, אם מספר התא הוא דאגה, תרבות בגודל קטנה יותר גם עשויה להפחית את הבעיה. מגבלה נוספת של בידוד תאים ראשוניים היא את הספציפיות של הנוגדן. אפילו זיהה חלבון האנדותל ספציפי כגון CD31 לעתים בא לידי ביטוי על ידי fibroblasts 8. אם מספר התא נקטף מאפשר FAC מיון במקום, ולאחר מכן את תאי האנדותל וfibroblasts יכולים להיות מופרדים על ידי עוצמת הקרינה. עם זאת, ניתוח מיון FAC האחרון של תאי האנדותל עובריים נדרש ארבעה עוברי E10.5 שלמים כדי לייצר תאי אנדותל מספיק למיצוי mRNA, טוען כי טכניקה זו, אם כי עוצמה, לא יכולה להיות מתאימה לקטנים יותר איברים 9. לכן, אם מיון FAC הוא לא ריאלי, יכולות להיות מועסקות בטכניקות אחרות לשיפור טוהר אוכלוסייה. תהליך בחירה בשני שלבים, שבו התאים שנבחרו באופן חיובי על ידי נוגדן אחד ולאחר מכן שלילי selected על ידי אי ספיקה להיקשר לנוגדנים שני, היא גישה חלופית אחת. סמן פיברובלסטים הספציפי FSP-1 יהיה מועמד אחד 10 בפרט. לחלופין, ניתן להזמין מדיום התרבות בלי L-לין, וניתן להוסיף D-valine במקום; fibroblasts אינם מסוגל לנצל D-valine ולכן אינו שורד 11,12. למרות המגבלות וחששות הללו, לומדים אוכלוסיות תאים עובריים ראשוניות מאפשר ניתוח מפורט במבחנה של תהליכים התפתחותיים. טכניקה זו יכולה להיות מיושמת על כל איבר או אזור של העובר ומאפשרת לסוג תא להשוואה על פני שלבים עובריים שונים. עם קנה המידה המתאימה, ניתן להשיג גם אוכלוסיות קטנות מאוד של תאים ראשוניים ונותחו. ניתוחים אלה יספקו תובנה משמעותית לכמה תת קבוצות מסוימות של תאים להתנהג ולהשתנות עם הזמן.

כניסתו של שורות תאים הנציחו יש מהפכה ביולוגיה של תא בסיסית 1. שורות התאים הקיימים כיום נגזרות ממגוון רחב של איברים ולהקיף את כל סוגי התאים העיקריים. עם זאת, יש לי שורות תאים הוקמו כמה מגבלות. תהליך ההנצחה ברור שמשנה את אופן הפעולה של התאים, במיוחד ביחס לתוחלת חיים והתפשטות, אלא גם יכול להשפיע על הביטוי של חלבונים בלתי צפויים, כגון חלבוני cytoskeletal 2. בנוסף, למרות ששורות תאים רבות ושונות זמינות, יש גיוון משמעותי בקרב אפילו סוג תא בודד בתוך כל אורגניזם. תאי אנדותל בהתנהגויות מגוונות מופע מסוימות המבוססים על אם הם קו עורקים או ורידים ואיזה סוג של זרימה הוא הווה בכלי 3. ועוד יותר דחוף מבחינה התפתחותית, לעומת זאת, הוא שהרוב המכריע של שורות התאים הזמינות נגזרים מרקמות בוגרת (ראה, למשל tהוא אוסף זמין דרך ATCC). שורות תאי בוגרים אלה עשויים לא לשחזר את האופי הדינמי של המבשרים העובריים שלהם. את דפוסי ביטוי גנים spatiotemporal המשתנים במהירות שנצפו במהלך פיתוח גם מצביעים על כך שתא האנדותל מאיבר אחד בכל שלב התפתחותי נתון לא יכול להתנהג באותה הצורה כמו תא האנדותל מאותו איבר בשלב התפתחותי שונה. כחלופה לשימוש בשורות תאים הנציחו זמינות מסחרי, ניתן לבודד תאים ראשוניים מהרקמה הספציפית של עניין. בין היתרונות של טכניקה זו, ניתן לבודד תאים הראשוניים אלה מאיבר מסוים או אפילו חלק מאיבר בכל שלב התפתחותי מסוים. יתר על כן, ניתן לבודד תאים הראשוניים אלה ממגוון הרחב של בעלי חיים מהונדסים זמינים, המאפשרים במחקר במבחנה של נוקאאוט הגן ודפיקה ב, תוך הימנעות בעיות אחרות כגון יעילות transfection. באופן לא מפתיע, רביםטכניקות כבר פורסם מפרטות כיצד לבודד סוגי תאים מסוימים 4,5. באופן כללי, טכניקות אלה כרוכים באיסוף באזור של עניין, dissociating תאים, תיוג סוג התא המסוים של עניין, ומבודד את התאים הללו לניתוח נוסף. ללמוד אוכלוסייה עוברית מוקדמת של תאי האנדותל הכליליים, אנו scaled למטה 4 טכניקה שפורסמו בעבר לשימוש עם איבר קטן יותר. עם הליך מוקטן זה, אנו יכולים לבודד את תאי האנדותל הכליליים מהלב העוברי בשלבים עובריים ספציפיים. תאים אלה לאחר מכן ניתן להשתמש במבחני אנדותל מסורתיים, כגון ניתוחי הגירה. עד שורות תאים עובריים מוקדמות הפכו נפוצות יותר, עבודה עם התאים הראשוניים היא טכניקה לא יסולא בפז.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>REAGENTS</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Timed-pregnant mice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To be dissected at the embryonic stage of interest</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Anti-mouse CD31</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>553370</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Rat IgG Dynabeads</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>110-35</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Collagen</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>354236</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>PBS (1x)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Collagenase, type I</td>
			<td>Worthington Biochemical</td>
			<td>LS004196</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Cellgro </td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich </td>
			<td>F2442 </td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Endothelial cell growth medium</td>
			<td>(made in lab as described in notes)</td>
			<td></td>
			<td>DMEM containing 20% FBS, 5 &mu;M &beta;-mercaptoethanol, 50 &mu;g/ml ECG, and 1x penicillin/streptomycin</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>&beta;-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6250</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>ECGS</td>
			<td>Biomedical Technologies, Inc.</td>
			<td>BT-203</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>384-well culture plate</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>T-3037-6</td>
			<td>Plate was prepared with a thin collagen gel, as described in 6; working surface area 10 mm2</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Collagen type I</td>
			<td>BD</td>
			<td>354236</td>
			<td>Use at a final concentration of 1.5 mg/ml</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>M199, 10x</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11825-015</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Syto-16</td>
			<td>Invitrogen </td>
			<td>S7578 </td>
			<td>Used as directed in 13 </td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>EQUIPMENT</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Stereoscopic microscope</td>
			<td>Nikon </td>
			<td>SMZ645</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Cell culture incubator</td>
			<td>Thermo </td>
			<td>3110 </td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DynaMag</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>123-21D</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Table-top centrifuge</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>75002430</td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

isolation of embryonic ventricular endothelial cells

תרבית תאים שיפרה באופן משמעותי את היכולת שלנו להעריך אוכלוסיות בודדות של תאים בתנאי התרבות עצום. בעוד שורות תאים הנציחו מציעות יתרונות משמעותיים לנוחות השימוש שלהם, שורות תאים אלה אינן זמינות לכל סוגי התאים הפוטנציאליים. על ידי בידוד תאים ראשוניים מאזור מסוים של עניין, במיוחד מעכבר מהונדס, ניתן לבצע מחקרים מורכבים יותר. הטכניקה הבסיסית כרוכה לנתח איבר או איברים חלקיים של עניין (למשל לב או באזור מסוים של הלב) וdissociating האיברים לתאים בודדים. תאים אלה מודגרת מכן עם חרוזים מגנטיים מצומדות לנוגדן שמזהה את סוג התא של עניין. התאים של עניין אז יכולים להיות מבודדים עם השימוש במגנט, עם דגירה קצרה טריפסין dissociating תאים מאת החרוזים. אז יכולים להיות מתורבתים תאים מבודדים אלה וניתח המועדפים. טכניקה זו תוכננה במקור עבור איבר עכבר בוגראבל ים וניתן לשנות בקלות את לשימוש עם איברים עובריים, כפי שמודגם במסמך זה. כי האינטרס שלנו הוא בכלי הדם כליליים פיתוח, אנחנו רוצים ללמוד אוכלוסייה של תאים זה בשלבים עובריים ספציפיים. לפיכך, פרוטוקול המקורי היה צריך להיות שונה כדי להיות תואם עם הגודל הקטן של החדרים העובריים והתשואה הפוטנציאלית הנמוכה של תאי האנדותל בשלבי התפתחותיים אלה. ניצול גישה מוקטנת זה, יש לנו להעריך שיפוץ מקלעת כלילית בתאי אנדותל חדריות עובריים מהונדסים.

באמצעות נוגדן ספציפי לאנדותל שמכיר CD31, תאי האנדותל בודדו מהחדרים של (E) 13.5 (איור 1 א) ו 18.5 (איורים 1 ב-1D) עוברים עובריים. כאשר גדלו על צלחת תרבות מטופל, התאים אלה יישארו מעוגלים והיינו ליצור דפוס מרוצף אם מחוברות קרובים (איור 1 א). קולגן לדלל שימש גם למעייל הבארות, ואילו תאי אנדותל ידבק אליו (איור 1), הם יוצרים פחות מאשר כאשר שרשרות מצופים בג&#39;ל קולגן (1C 1D ואיורים). תאי האנדותל גדלו הבמכילים גם ג&#39;ל קולגן (1C 1D ואיורים) תאי תאי אינטראקציות טופס וליצור שרשרות שמתחילות להתרחב כאשר גדלו על קולגן, ותהליך זה מתרחש מהר יותר כאשר גדל על ג&#39;ל קולגן לעומת קולגן המצופה צלחת. שרשרות אנדותל אלה תווית חיובית עם הסמן האנדותל ISO-לקטינים ( <strong&gt; 1D איור). התאים המבודדים לשרוד עד שבוע 1 בתרבות, אבל הוכיחו עמיד לtrypsinization (גם לאחר שעה 1 ב 37 ° C), ולכן הם מתאימים ביותר לניסויים סופניים. תאי אנדותל שבודדו מחדרי הלב E18.5 תווית חיובי עם PECAM (איור 2 א) וFlk1 (איור 2). יתר על כן, חיים יכולים להיות מתויגים תאי אנדותל מבודדים באמצעות הצבע האנדותל ספציפי ניאון Syto-16. איור 2D מציג תאי אנדותל שבודדו מהחדרים של עובר E14.5 ומסומן עם Syto-16. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/50463/50463fig1.jpg" /> איור 1. תאי אנדותל שבודדו מחדרי לב עכבר עובריים ליצור שרשרות כאשר גדלו על ג&#39;ל קולגן. (א) תמונת 10x Brightfield של תאי האנדותל חיות מבודדים חדרית מE13.5 לב גרםrown על צלחת תרבות מטופל; גם לאחר 48 שעות, תאים נשארים מעוגלים (ב &#39;) תמונת 10x Brightfield של תאי האנדותל קבועים מבודדים חדרית מלב E18.5 גדלה על צלחת קולגן מצופה;. לאחר 24 שעות, כמה תאים החלו מתארך (חץ), אבל רובם נשארים מעוגל (ראש חץ). (C, D) תמונות Confocal של תאי האנדותל קבועים מבודדים חדרית מלב E18.5 גדל על ג&#39;ל קולגן, המוצג בbrightfield (ג) ושכותרתו עם ISO -לקטינים (אדום). חצים מצביעים על חלק מהתאים לקטינים-החיוביים. סולם ברים בCD = 50 מיקרומטר. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/50463/50463fig2.jpg" /> איור 2. תאי אנדותל שבודדו מחדרי לב עכבר עובריים תווית חיובית לסמני אנדותל. (AC) תמונות confocal (40X) של תאי האנדותל קבועים מבודדים חדרית מלב E18.5 גדל עלמנה קולגן מצופה. תאים אלה תווית חיובית לPECAM () וFLK-1 (ב); הביקורת השלילית (ג) לא מראה שום הקרינה. בAC, הגרעינים מסומנים עם DAPI (כחול). (ד &#39;) כיסוי פלורסנט (10x) של תאי האנדותל חיות מבודדים חדרית מלב E14.5 גדל על ג&#39;ל קולגן. התאים הודגרו עם הסמן האנדותל החי Syto-16 (ירוק), והגירה נצפתה באמצעות מיקרוסקופ זמן לשגות.

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Embryonic Ventricular Endothelial Cells at JoVE.com

Isolation of Embryonic Ventricular Endothelial Cells

תרבית תאים העיקרית היא טכניקה שימושית לניתוח אוכלוסיות מסוימות של תאים, במיוחד מעוברי עכבר מהונדסים בשלבי התפתחות ספציפיים. בזאת, חדרי לב עובריים הם גזורים וניתקו, וחרוזים נוגדנים מצומדות לזהות ולהפריד את תאי האנדותל לניתוח נוסף.

בידוד של תאי האנדותל חדרית עובריים

Cell culture has greatly enhanced our ability to assess individual populations of cells under myriad culture conditions. While immortalized cell lines ...

isolation-of-embryonic-ventricular-endothelial-cells

Google

Research

JoVE Journal

Biology

9.3K Views.  University of North Carolina at Chapel Hill. תרבית תאים העיקרית היא טכניקה שימושית לניתוח אוכלוסיות מסוימות של תאים, במיוחד מעוברי עכבר מהונדסים בשלבי התפתחות ספציפיים. בזאת, חדרי לב עובריים הם גזורים וניתקו, וחרוזים נוגדנים מצומדות לזהות ולהפריד את תאי האנדותל לניתוח נוסף.

Video: Isolation of Embryonic Ventricular Endothelial Cells

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC)

Angiogenesis is a complex multi-step process, where in response to angiogenic stimuli, new vessels are created from the existing vasculature. These steps include: degradation of the basement membrane, proliferation and migration (sprouting) of endothelial cells (EC) into the extracellular matrix, alignment of EC into cords, lumen formation, anastomosis, and formation of a new basement membrane. Many in vitro assays have been developed to study this process, but most only mimic certain stages of angiogenesis, and morphologically the vessels often do not resemble vessels in vivo. Here we demonstrate an optimized in vitro angiogenesis assay that utilizes human umbilical vein EC and fibroblasts. This model recapitulates all of the key early stages of angiogenesis, and importantly the vessels display patent intercellular lumens surrounded by polarized EC. Vessels can be easily observed by phase-contrast and time-lapse microscopy, and recovered in pure form for downstream applications.

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells HUVEC

This video protocol illustrates the isolation and culture of human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) from human umbilical cord. Once isolated these cells can be used for in vitro angiogenesis assays like the Optimized Fibrin Gel Bead Assay also demonstrated by the Hughes lab.

בידוד של האדם תאים עורק טבורי האנדותל (HUVEC)

Angiogenesis is a complex multi-step process, where in response to angiogenic stimuli, new vessels are created from the existing vasculature. These steps ...

Embryonic Stem Cell-Derived Endothelial Cells for Treatment of Hindlimb Ischemia

Peripheral arterial disease (PAD) results from narrowing of the peripheral arteries that supply oxygenated blood and nutrients to the legs and feet, This pathology causes symptoms such as intermittent claudication (pain with walking), painful ischemic ulcerations, or even limb-threatening gangrene. It is generally believed that the vascular endothelium, a monolayer of endothelial cells that invests the luminal surface of all blood and lymphatic vessels, plays a dominant role in vascular homeostasis and vascular regeneration. As a result, stem cell-based regeneration of the endothelium may be a promising approach for treating PAD.In this video, we demonstrate the transplantation of embryonic stem cell (ESC)-derived endothelial cells for treatment of unilateral hindimb ischemia as a model of PAD, followed by non-invasive tracking of cell homing and survival by bioluminescence imaging. The specific materials and procedures for cell delivery and imaging will be described. This protocol follows another publication in describing the induction of hindlimb ischemia by Niiyama et al.1

The surgical procedure for delivery of embryonic stem cell-derived endothelial cells to the ischemic hindlimb is demonstrated, with non-invasive tracking by bioluminescence imaging.

עובריים, נגזר גזע לתאי אנדותל לטיפול איסכמיה Hindlimb

Peripheral arterial disease (PAD) results from narrowing of the peripheral arteries that supply oxygenated blood and nutrients to the legs and feet, This ...

Isolation and Derivation of Mouse Embryonic Germinal Cells

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental stages is a perfect model to address our hypothesis about cancer and infertility. This protocol shows how to isolate primordial germinal cells from developing gonads in 10.5-11.5 days post coitum (dpc) mouse embryos.  Developing gonadal ridges from mouse embryos (C57BL6J) were dissociated by mechanical disruption with collagenase, then plated in a mouse embryo fibroblast feeder layer (MEF-CF1) that was previously mitotically inactivated with mitomycin C in the presence of knockout media and supplemented with Leukemia Inhibitor Factor (LIF), basic Fibroblast Growth Factor (bFGF), and Stem Cell Factor (SCF).  Using these optimized methods for PCG identification, isolation, and establishment of culture conditions permits long term cultures of EG cells for more than 40 days.  The embryonic germinal cell lines showed embryonic phenotype and expression of common used markers of the pluripotent state.  Isolation and derivation of germinal cells in culture provide a tool to understand their development in vitro and offer the opportunity to monitor cumulative damage at genetic and epigenetic levels after exposure to oxidative stress.

The ability of embryonic germinal cells to differentiate into primordial germinal cells during early development stages is a perfect model to address our hypothesis about cancer and infertility. This protocol shows how to isolate primordial germinal cells from developing gonads in 10.5-11.5 days post coitum mouse embryos.

בידוד גזירת תאים עובריים בעכבר ז&#39;רמינל

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental ...

Isolation of Valvular Endothelial Cells

Heart valves are solely responsible for maintaining unidirectional blood flow through the cardiovascular system. These thin, fibrous tissues are subjected to significant mechanical stresses as they open and close several billion times over a lifespan. The incredible endurance of these tissues is due to the resident valvular endothelial (VEC) and interstitial cells (VIC) that constantly repair and remodel in response to local mechanical and biological signals. Only recently have we begun to understand the unique behaviors of these cells, for which in vitro experimentation has played a key role. Particularly challenging is the isolation and culture of VEC. Special care must be used from the moment the tissue is removed from the host through final plating. Here we present protocols for direct isolation, side specific isolation, culture, and verification of pure populations of VEC. We use enzymatic digestion followed by a gentle swab scraping technique to dislodge only surface cells. These cells are then collected into a tube and centrifuged into a pellet. The pellet is then resuspended and plated into culture flasks pre-coated with collagen I matrix. VEC phenotype is confirmed by contact inhibited growth and the expression of endothelial specific markers such as PECAM1 (CD31), Von Willebrand Factor (vWF), and negative expression of alpha-smooth muscle actin (&alpha;-SMA). The functional characteristics of VEC are associated with high levels of acetylated LDL. Unlike vascular endothelial cells, VEC have the unique capacity to transform into mesenchyme, which normally occurs during embryonic valve formation1. This can also occur during significantly prolonged post confluent in vitro culture, so care should be made to passage at or near confluence. After VEC isolation, pure populations of VIC can then be easily acquired.

We provide a method for isolating and culturing pure populations of heart valve endothelial cells (VEC). VEC can be isolated from either side of the cusp or leaflet and immediately following, underlying interstitial cell (VIC) isolation is straightforward.

בידוד של תאים אנדותל valvular

Heart valves are solely responsible for maintaining unidirectional blood flow through the cardiovascular system.  These thin, fibrous tissues are ...

Isolation and Culture of Avian Embryonic Valvular Progenitor Cells

Proper formation and function of embryonic heart valves is critical for developmental progression. The early embryonic heart is a U-shaped tube of endocardium surrounded by myocardium. The myocardium secretes cardiac jelly, a hyaluronan-rich gelatinous matrix, into the atrioventricular (AV) junction and outflow tract (OFT) lumen. At stage HH14 valvulogenesis begins when a subset of endocardial cells receive signals from the myocardium, undergo endocardial to mesenchymal transformation (EMT), and invade the cardiac jelly. At stage HH25 the valvular cushions are fully mesenchymalized, and it is this mesenchyme that eventually forms the valvular and septal apparatus of the heart. Understanding the mechanisms that initiate and modulate the process of EMT and cell differentiation are important because of their connection to serious congenital heart defects. In this study we present methods to isolate pre-EMT endocardial and post-EMT mesenchymal cells, which are the two different cell phenotypes of the prevalvular cushion. Pre-EMT endocardial cells can be cultured with or without the myocardium. Post-EMT AV cushion mesenchymal cells can be cultured inside mechanically constrained or stress-free collagen gels. These 3D in vitro models mimic key valvular morphogenic events and are useful for deconstructing the mechanisms of early and late stage valvulogenesis.

This article will provide a method for isolating and culturing quail or chicken HH14- valve endocardial cells and HH25 valve cushion mesenchymal cells.

בידוד והתרבות של תאים עובריים העופות אבי valvular

Proper formation and function of embryonic heart valves is critical for developmental progression. The early embryonic heart is a U-shaped tube of ...

Isolation and Culture of Pulmonary Endothelial Cells from Neonatal Mice

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) have shown to be convenient, easy to obtain and culture, and thus are the most widely studied endothelial cells. However, for research focused on processes like angiogenesis, permeability or many others, microvascular endothelial cells (ECs) are a much more physiologically relevant model to study 2. Furthermore, ECs isolated from knockout mice provide a useful tool for analysis of protein function ex vivo. Several approaches to isolate and culture microvascular ECs of different origin have been reported to date 3-7, but consistent isolation and culture of pure ECs is still a major technical problem in many laboratories. Here, we provide a step-by-step protocol on a reliable and relatively simple method of isolating and culturing mouse lung endothelial cells (MLECs). In this approach, lung tissue obtained from 6- to 8-day old pups is first cut into pieces, digested with collagenase/dispase (C/D) solution and dispersed mechanically into single-cell suspension. MLECS are purified from cell suspension using positive selection with anti-PECAM-1 antibody conjugated to Dynabeads using a Magnetic Particle Concentrator (MPC). Such purified cells are cultured on gelatin-coated tissue culture (TC) dishes until they become confluent. At that point, cells are further purified using Dynabeads coupled to anti-ICAM-2 antibody. MLECs obtained with this protocol exhibit a cobblestone phenotype, as visualized by phase-contrast light microscopy, and their endothelial phenotype has been confirmed using FACS analysis with anti-VE-cadherin 8 and anti-VEGFR2 9 antibodies and immunofluorescent staining of VE-cadherin. In our hands, this two-step isolation procedure consistently and reliably yields a pure population of MLECs, which can be further cultured. This method will enable researchers to take advantage of the growing number of knockout and transgenic mice to directly correlate in vivo studies with results of in vitro experiments performed on isolated MLECs and thus help to reveal molecular mechanisms of vascular phenotypes observed in vivo.

Here, we describe a protocol for isolation and culture of murine pulmonary endothelial cells. This method comprises mechanic and enzymatic lung tissue dissociation as well as a 2-step purification process using anti-PECAM-1 and anti-ICAM-2 antibodies conjugated to magnetic beads, which produces a pure endothelial cell population of mostly microvascular origin.

בידוד תרבות לתאי אנדותל ריאתי מעכברים ילודים

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells ...

Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and surrounded by a monolayer of valve endothelial cells (VECs). VECs play essential roles in establishing the valve structures during embryonic development, and are important for maintaining life-long valve integrity and function. In contrast to a continuous endothelium over the surface of healthy valve leaflets, VEC disruption is commonly observed in malfunctioning valves and is associated with pathological processes that promote valve disease and dysfunction. Despite the clinical relevance, focused studies determining the contribution of VECs to development and disease processes are limited. The isolation of VECs from animal models would allow for cell-specific experimentation. VECs have been isolated from large animal adult models but due to their small population size, fragileness, and lack of specific markers, no reports of VEC isolations in embryos or adult small animal models have been reported. Here we describe a novel method that allows for the direct isolation of VECs from mice at embryonic and adult stages. Utilizing the Tie2-GFP reporter model that labels all endothelial cells with Green Fluorescent Protein (GFP), we have been successful in isolating GFP-positive (and negative) cells from the semilunar and atrioventricular valve regions using fluorescence activated cell sorting (FACS). Isolated GFP-positive VECs are enriched for endothelial markers, including CD31 and von Willebrand Factor (vWF), and retain endothelial cell expression when cultured; while, GFP-negative cells exhibit molecular profiles and cell shapes consistent with VIC phenotypes. The ability to isolate embryonic and adult murine VECs allows for previously unattainable molecular and functional studies to be carried out on a specific valve cell population, which will greatly improve our understanding of valve development and disease mechanisms.

The ability to isolate heart valve endothelial cells (VECs) is critical for understanding mechanisms of valve development, maintenance, and disease. Here we describe the isolation of VECs from embryonic and adult Tie2-GFP mice using FACS that will allow for studies determining the contribution of VECs in developmental and disease processes.

בידוד של תאי Murine Valve האנדותל

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an important model for cardiovascular disease research. This study demonstrates a simple method to isolate and culture endothelial cells from the mouse aorta without any special equipment. To isolate endothelial cells, the thoracic aorta is quickly removed from the mouse body, and the attached adipose tissue and connective tissue are removed from the aorta. The aorta is cut into 1 mm rings. Each aortic ring is opened and seeded onto a growth factor reduced matrix with the endothelium facing down. The segments are cultured in endothelial cell growth medium for about 4 days. The endothelial sprouting starts as early as day 2. The segments are then removed and the cells are cultured continually until they reach confluence. The endothelial cells are harvested using neutral proteinase and cultured in endothelial cell growth medium for another two passages before being used for experiments. Immunofluorescence staining indicated that after the second passage the majority of cells were double positive for Dil-ac-LDL uptake, Lectin binding, and CD31 staining, the typical characteristics of endothelial cells. It is suggested that cells at the second to third passages are suitable for in vitro and in vivo experiments to study the endothelial biology. Our protocol provides an effective means of identifying specific cellular and molecular mechanisms in endothelial cell physiopathology.

The vascular endothelial cells play a significant role in many important cardiovascular disorders. This article describes a simple method to isolate and expand endothelial cells from the mouse aorta without using any special equipment. Our protocol provides an effective means of identifying mechanisms in endothelial cell physiopathology.

בידוד והתרבות ראשית של לתאי אנדותל עכבר אב העורקים

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Isolation of Mouse Coronary Endothelial Cells

Endothelial cells line the inner wall of blood vessels and play an important role in the regulation of vascular tone, vascular permeability, and new vascular formation. Endothelial cell dysfunction is implicated in the development and progression of many cardiovascular diseases including ischemic heart disease. To examine the function and characterization of coronary endothelial cells, cell isolation is the first step and it requires high purity and quantity to conduct subsequent experiments. This protocol describes an efficient method to isolate adult mouse coronary endothelial cells. The mouse heart is dissected and minced into small pieces. After the digestion of the heart using dispase and collagenase II, cells are washed&#160;and incubated with magnetic beads which are conjugated with anti-CD31 antibody. The beads with endothelial cells are washed several times and are ready to use in various applications, including imaging and molecular biological experiments. Efficient isolation yields approximately 104 cells per one heart with over 90% purity.

This protocol is prepared to share our method of isolating mouse coronary endothelial cells for the purpose of imaging or to conduct molecular biological experiments.

בידוד של תאי האנדותל העכבר כלילי

Endothelial cells line the inner wall of blood vessels and play an important role in the regulation of vascular tone, vascular permeability, and new ...

Isolation of High Quality Murine Atrial and Ventricular Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and L-Type Calcium Current

Mouse models play a crucial role in arrhythmia research and allow studying key mechanisms of arrhythmogenesis including altered ion channel function and calcium handling. For this purpose, atrial or ventricular cardiomyocytes of high quality are necessary to perform patch-clamp measurements or to explore calcium handling abnormalities. However, the limited yield of high-quality cardiomyocytes obtained by current isolation protocols does not allow both measurements in the same mouse. This article describes a method to isolate high-quality murine atrial and ventricular myocytes via retrograde enzyme-based Langendorff perfusion, for subsequent simultaneous measurements of calcium transients and L-type calcium current from one animal. Mouse hearts are obtained, and the aorta is rapidly cannulated to remove blood. Hearts are then initially perfused with a calcium-free solution (37 &#176;C) to dissociate the tissue at the level of intercalated discs and afterwards with an enzyme solution containing little calcium to disrupt extracellular matrix (37 &#176;C). The digested heart is subsequently dissected into atria and ventricles. Tissue samples are chopped into small pieces and dissolved by carefully pipetting up and down. The enzymatic digestion is stopped, and cells are stepwise reintroduced to physiologic calcium concentrations. After loading with a fluorescent Ca2+-indicator, isolated cardiomyocytes are prepared for simultaneous measurement of calcium currents and transients. Additionally, isolation pitfalls are discussed and patch-clamp protocols and representative traces of L-type calcium currents with simultaneous calcium transient measurements in atrial and ventricular murine myocytes isolated as described above are provided.

Isolation of High Quality Murine Atrial and Ventricular Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and L-Type Calcium Current

Mouse models allow studying key mechanisms of arrhythmogenesis. For this purpose, high quality cardiomyocytes are necessary to perform patch-clamp measurements. Here, a method to isolate murine atrial and ventricular myocytes via retrograde enzyme-based Langendorff perfusion, which allows simultaneous measurements of calcium-transients and L-type calcium current, is described.

בידוד מיוציטים פרוזדוריים וחדריים באיכות גבוהה למדידות בו זמנית של Ca2+ Transients וזרם סידן מסוג L

Mouse models play a crucial role in arrhythmia research and allow studying key mechanisms of arrhythmogenesis including altered ion channel function and ...