מחקר זה נתמך על ידי פרס קריירה NSF, הקרן Hartwell, ואת איגוד הלב האמריקני (# 0830384N).

1. הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החיטוי במכשיר מכוסה מגש את הפריטים הבאים: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משוננת מלקחיים רקמה - לטיפול ברקמת העלון </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רקמות מספריים (8 ס&quot;מ) - לקבלת זמירה רקמות העלון cusps </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספוגיות כותנה - בשביל לבודד את שכבת האנדותל מתוך העלון או סף </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע פתרון collagenase סטרילית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 4.0 גרם של אבקת DMEM ל 250 מ&quot;ל מים MΩ 18. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים 1.11 גרם של סודיום ביקרבונט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף (600 U / mL) 180,000 יחידות של collagenase. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1% (3mL) פניצילין / סטרפטומיצין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את ה-pH של התמיסה עד 7.2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תביא את הפתרון עד 270 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר את הפתרון על ידי עובר דרך מסנן 0.2 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10% (30 מ&quot;ל) של נסיוב סטרילי שור העובר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך את תא סטרילי בינוני אנדותל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 6.7 גרם של אבקת DMEM ל 400 מ&quot;ל מים MΩ 18. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים 1.85 גרם של סודיום ביקרבונט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף (50 U / mL) 25,000 יחידות של הפרין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1% (5 מ&quot;ל) פניצילין / סטרפטומיצין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את ה-pH של התמיסה עד 7.2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תביא את הפתרון עד 450 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר את הפתרון על ידי עובר דרך מסנן 0.2 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10% (50 מ&quot;ל) של נסיוב סטרילי שור העובר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך את תא סטרילי בינוני ביניים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 13.37 גרם של אבקת DMEM ל 800 מ&quot;ל מים MΩ 18. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 3.7 גרם סודיום ביקרבונט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1% (10 מ&quot;ל) פניצילין / סטרפטומיצין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את ה-pH של התמיסה עד 7.2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תביא את הפתרון עד 900 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר את הפתרון על ידי עובר דרך מסנן 0.2 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10% (100 מ&quot;ל) של בסרום שור סטרילית. </li></ol></li></ol> 2. בידוד של עלונים שסתום הלב <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שורש והבלו אבי העורקים מיד בסביבה נקייה מחיידקים מהלב לאחר הקרבה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביסודיות לשטוף את שורש האאורטה דם עם DPBS סטרילי קר. זה הכרחי להסיר את כל מרכיבי הדם מוקדם ככל האפשר להגביל את מותו VEC וזיהום חיידקי. אנטיביוטיקה antimycotics לא מומלץ בשלב זה, שכן הם מזיקים אל VEC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בודד עלונים שסתום (3 לכל שסתום) ישירות מן השורש ומכניסים צינורית סטרילית 15 מ&quot;ל חרוטי מלא 12 DPBS קר מ&quot;ל. לנער מספר פעמים כדי להסיר שאריות ולמלא עם DPBS טריים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחבורה בחזרה למעבדה על הקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בהגיעם במעבדה, במקום מכולה עם הרקמה מתחת למכסה המנוע סטרילית. </li></ol> 3. בידוד של שכבת האנדותל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלאו צלחת 35mm סטרילי עם 3mL של פתרון collagenase קר לכל שסתום (3 כרוזים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את כל שלושת עלונים מהצינור 15 מ&quot;ל לתוך צלחת מלאה הפתרון collagenase. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה הרקמה למשך 5-10 דקות ב 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות להסיר את שכבת האנדותל ידי סיבוב משטח סטרילי יבש על פני השטח של העלון. את כיוון הסיבוב ואת כמות להחיל גזירה היא קריטית עבור טוהר המדגם שלך. הסיבוב של ספוגית צריך להיות בכיוון ההפוך לתנועה קווית של היד שלך ליצור גזירה מבוקר. גזירה זה מה מרימה את לתאי אנדותל של הרקמה. כמות הכוח המופעל צריך להיות מספיק כדי להרגיש את ההתנגדות של הרקמה, אבל לא לחדור את הקרום במרתף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדי פעם, להספיג את ספוגית בתוך הפתרון collagenase כדי לסלק תאים הסיבים קצה. לאחר בניקוי תושלם, את המרקם של שכבת האנדותל צריך להרגיש קצת חלק יותר מאשר לפני כן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אסוף את ההשעיה תא / collagenase והעברת צינור חדש 15 מ&quot;ל סטרילי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה צינורות ב 1000 סל&quot;ד במשך 5 דקות עד גלולה כל התאים מבודדים לשאוב supernatant. אם לבודד תאים ביניים וכן, לבצע את הפרוטוקול בעוד תאים אלה נמצאים centrifuged. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 3 מ&quot;ל של מדיום חזירי האנדותל אל צינורות 15 מ&quot;ל, צנטריפוגה בפעם השנייה, התקשורת לשאוב. זה צנטריפוגה second עוזר לסנן חלק מהחומר לא רצויות כגון סיבים קצה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Re-להשעות לתאי אנדותל centrifuged ב 5 מ&quot;ל של מדיום חזירי האנדותל צלחת התאים בבקבוק T-25 מראש מצופה קולגן (שימוש 1 בקבוק לכל צינור צנטריפוגות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בואו התאים לגדול לפחות 2-3 ימים לפני שינוי בינוני האנדותל. זה עוזר לתאים להתאושש מאז לחלק את תהליך הבידוד היא קשה למדי התשואה התא עלול להיות נמוך. זה קריטי לתאי המעבר ליד מפגש מאז עיכוב הקשר יכול להוביל שינוי התא. </li></ol> 4. הכנת תבשיל 60 מ&quot;מ התרבות בידוד ספציפיות סייד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קו 60 מ&quot;מ זכוכית פטרי מנות עם רדיד אלומיניום (2 כוס מנות לכל leafle<html> t). רדיד אלומיניום מסייע להסיר את פרפין, כך צלחת פטרי מזכוכית ניתן לעשות שימוש חוזר עבור isolations אחרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המקום חרוזים פרפין בתוך המנות, כמחצית מלא, כיסוי מעוקר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר מעוקר הוא מלא פרפין הוא נמס, להעביר את הרכב המנה על משטח שטוח מגניב. כמו פרפין מתקררת, להקשיח אותו רצון ליצור שכבה כי יתמוך דקירות מחט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 30 דקות, צלחת מעוקרים יכולים לשמש חדר בידוד כדי לשתק את הרקמה העלון. </li></ol> 5. בידוד של שכבת האנדותל לוואי ספציפיות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את כרוזים מן הצינורות 15ml ומניחים על צלחת מוכן תרבות 60mm לבידוד ספציפי בצד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לתפעל את העלון כך שהצד ventricularis היא עם הפנים כלפי מטה על פני השטח פרפין עוזב את הצד fibrosa חשוף. הצמד את הקצוות של העלון כדי לחשוף את שכבת האנדותל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים כמה טיפות של collagenase קר על פני השטח (הפונה כלפי מעלה) כל האנדותל דגירה הרקמה למשך 5-10 דקות ב 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כמו בעבר, בעדינות להסיר את שכבת האנדותל ידי סיבוב משטח סטרילי יבש על פני השטח של העלון. את כיוון הסיבוב ואת כמות להחיל גזירה היא קריטית עבור טוהר המדגם שלך. הסיבוב של ספוגית צריך להיות בכיוון ההפוך לתנועה קווית של היד שלך ליצור גזירה מבוקר. גזירה זה מה מרימה את לתאי אנדותל של הרקמה ולא שום דבר אחר. כמות הכוח המופעל צריך להיות מספיק כדי להרגיש את ההתנגדות של הרקמה, אבל לא לחדור בתוך הרקמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדי פעם, להספיג את ספוגית בתוך הפתרון collagenase כדי לסלק תאים הסיבים קצה. לאחר בניקוי תושלם, את המרקם של שכבת האנדותל צריך להרגיש קצת חלק יותר מאשר לפני כן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אסוף את ההשעיה תא / collagenase והעברת צינור חדש 15 מ&quot;ל סטרילי. ציין סגוליות צד על התווית (כרוזים מן שסתום אותו ניתן ונקווה יחד). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את העלונים לצלחת תרבות חדשה כך שהצד ventricularis נחשפת עכשיו וחזור על שלבים (5.3-5.6). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר השעיית כל תא / collagenase נאסף, צנטריפוגה צינורות ב 1000 סל&quot;ד עבור 5minutes כדי גלולה כל התאים מבודדים לשאוב supernatant. אם לבודד תאים ביניים וכן, לבצע את הפרוטוקול בעוד תאים אלה נמצאים centrifuged. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 3 מ&quot;ל של מדיום חזירי האנדותל אל הצינורות, צנטריפוגה בפעם השנייה, ואת לשאוב התקשורת. זה צנטריפוגה second עוזר לסנן חלק מהחומר לא רצויות כגון סיבים קצה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Re-להשעות לתאי אנדותל centrifuged ב 5 מ&quot;ל של מדיום חזירי האנדותל צלחת התאים בבקבוק T-25 מראש מצופה קולאז&#39; (1 להשתמש בבקבוק לכל צינור צנטריפוגות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בואו התאים לגדול לפחות 2-3 ימים לפני שינוי בינוני האנדותל. זה עוזר לתאים להתאושש מאז לחלק את תהליך הבידוד הוא קשה למדי. אם אתה מבחין התשואה יהיה נמוך מאוד, שקול להעביר את בקבוקון קטן או צלחת יפה מאז תאים תאים הידבקות מקדם צמיחה התא. זכור המעבר ליד מפגש מאז עיכוב הקשר יכול להוביל שינוי התא. </li></ol> 6. בידוד של תאים ביניים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלאו צנטריפוגה סטרילי 15 מ&quot;ל עם שפופרת 10 מ&quot;ל של תמיסת collagenase לכל שסתום (3 כרוזים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שטיפת כרוזים בתאי האנדותל, מיד למקם אותם בצינור 15 מ&quot;ל מתאים עם פתרון collagenase. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה של כ -12 עד 18 שעות (להתסיס בעדינות אם רוצים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים בעדינות את הרקמה מושפל עם טפטפת סרולוגיות עד ההשעיה תא / collagenase הופך הומוגני. Homogenization זה עוזר לשבור את הרקמות ולשחרר את התאים ביניים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה רקמת מתעכל במשך 5 דקות ב 1000 סל&quot;ד ו לשאוב supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 5 מ&quot;ל בינוני ביניים חזירי את צינורות 15 מ&quot;ל, צנטריפוגה בפעם השנייה, ואת לשאוב supernate. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Re-להשעות לתאי אנדותל centrifuged ב 5 מ&quot;ל של מדיום חזירי ביניים צלחת התאים T-75 צפחת (1 להשתמש בבקבוק לכל צינור צנטריפוגות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בואו התאים לגדול לפחות 1-2 ימים לפני שינוי המדיום הסלולרי ביניים. יהיו פסולת רקמות הרבה יותר מאשר עם לתאי אנדותל, אך זה צפוי. התאים צריכים גם לגדול מהר יותר מאשר מפגש בתאי האנדותל בגלל התשואה התא הטבע שלהם. </li></ol> 7. נציג תמונות <img src="/files/ftp_upload/2158/2158fig1.jpg" alt="איור 1" /> באיור 1. מורפולוגיה של תאים מבודדים בבידוד בבית 2-3 ימים הדואר. (א) VEC מפגינים מורפולוגיה אנדותל טיפוסי הטופס אשכולות כדי לקדם צמיחה. (ב) ויק מורפולוגיה דומה myofibroblasts אשר בדרך כלל ציר בצורת להתפשט באופן שווה על פני הבקבוק. class = &quot;jove_content&quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/2158/2158fig2.jpg" alt="איור 2" /> איור 2. מורפולוגיה של תאים מבודדים בבית confluency. (א) VEC מפגינים מורפולוגיה אופיינית האנדותל אשר בדרך כלל המרוצף וקשר צמיחה עכבות. (ב) ויק מורפולוגיה דומה myofibroblasts אשר בדרך כלל בצורת כישור ולא לפנות צמיחה עכבות. <img src="/files/ftp_upload/2158/2158fig3.jpg" alt="איור 3" /> איור 3. המאפיינים פונקציה של תאים מבודדים 6. (א) VEC קשורים עם רמות גבוהות של LDL ספיגת acetylated (אדום). (ב) ויק קשורים עם רמות נמוכות של LDL ספיגת acetylated. <img src="/files/ftp_upload/2158/2158fig4.jpg" alt="איור 4" /> איור 4. סמנים נייד של תאים מבודדים 6. (א) פנוטיפ VEC הוא תרם מכתים חיובית פון Willebrand Factor (ירוק), כחול (גרעינים). (ב) פנוטיפ ויק הוא תרם מכתים שלילי גורם Willebrand פון. <img src="/files/ftp_upload/2158/2158fig5.jpg" alt="איור 5" /> איור 5. סמנים נייד של תאים בודדים. (א) פנוטיפ VEC הוא תרם מכתים שלילי אלפא SMA (ירוק), כחול (גרעינים). (ב) פנוטיפ ויק הוא תרם מכתים חיובית SMA אלפא. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> דיסוציאציה Agent </td><td> דיסוציאציה טכניקה </td><td> תא אוסף </td><td> Cell כמות </td><td> תא טוהר </td><td> זיהום </td></tr><tr><td> EDTA (3mm) ללא CaCl 2 </td><td> 5, 20, 60 דקות. לפני CaCl 2 בנוסף </td><td> 20, 60, 120 דקות. לפני איסוף </td><td> - </td><td> + / - </td><td> + + + </td></tr><tr><td> EDTA (6 מ&quot;מ) ללא CaCl 2 </td><td> 5, 20, 60 דקות. לפני CaCl 2 בנוסף </td><td> 20, 60, 120 דקות. לפני איסוף </td><td> + / - </td><td> + </td><td> + + + </td></tr><tr><td> טריפסין-EDTA (0.5 g / L) </td><td> 5, 10, 15 דקות. לפני שחרור משרות </td><td> בינוני נאסף מיד </td><td> + </td><td> + </td><td> + + </td></tr><tr><td> Collagenase II (300 U / mL) </td><td> 5, 10, 15 דקות. לפני שחרור משרות </td><td> בינוני נאסף מיד </td><td> - + + + </td><td> - + +, + </td><td> + </td></tr><tr><td> Collagenase II (600 U / mL) </td><td> 5, 10, 15 דקות. לפני שחרור משרות </td><td> בינוני נאסף מיד </td><td> + + +, + + + </td><td> + +, + +, - </td><td> - </td></tr></tbody></table> טבלה 1. תוצאות ראשוניות של פרוטוקולים valvular בידוד תא האנדותל.

<ol>
	<li>Thompson, R. P., Fitzharris, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphogenesis+of+the+truncus+arteriosus+of+the+chick+embryo+heart:+the+formation+and+migration+of+mesenchymal+tissue.">Morphogenesis of the truncus arteriosus of the chick embryo heart: the formation and migration of mesenchymal tissue.</a> Am J Anat. 154, 545-556 (1979).</li><li>Johnson, C. M., Fass, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Porcine+cardiac+valvular+endothelial+cells+in+culture:+A+relative+deficiency+of+fibronectin+synthesis+in+vitro.">Porcine cardiac valvular endothelial cells in culture: A relative deficiency of fibronectin synthesis in vitro.</a> Lab Invest. 49 (5), 589-598 (1983).</li><li>Manduteanu, I., Popov, D., Radu, A., Simionescu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calf+cardiac+valvular+endothelial+cells+in+culture:+production+of+glycosaminoglycans,+prostacyclin+and+fibronectin.">Calf cardiac valvular endothelial cells in culture: production of glycosaminoglycans, prostacyclin and fibronectin.</a> J Mol Cell Cardiol. 20 (2), 103-118 (1988).</li><li>Cheunyg, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+for+isolating+and+purifying+porcine+aortic+valve+endothelial+cells.">Techniques for isolating and purifying porcine aortic valve endothelial cells.</a> JHVD. 17 (6), 674-681 (2008).</li><li>Paranya, G., Vineberg, S., Dvorin, E., Kaushal, S., Roth, S. J., Rabkin, E., Schoen, F. J., Bischoff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aortic+valve+endothelial+cells+undergo+transforming+growth+factor-beta-mediated+and+non-transforming+growth+factor-beta-mediated+transdifferentiation+in+vitro.">Aortic valve endothelial cells undergo transforming growth factor-beta-mediated and non-transforming growth factor-beta-mediated transdifferentiation in vitro.</a> Am J Pathol. 159 (4), 1335-1343 (2001).</li><li>Butcher, J. T., Penrod, A., Garcia, A. J. M., Nerem, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unique+morphology+and+focal+adhesion+development+of+valvular+endothelial+cells+in+static+and+fluid+flow+environments.">Unique morphology and focal adhesion development of valvular endothelial cells in static and fluid flow environments.</a> Arterioscler Thromb Vasc Bio. 24 (1), 1429-1434 (2004).</li><li>Simmons, C. A., Grant, G. R., Manduchi, E., Davies, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+heterogeneity+of+endothelial+phenotypes+correlates+with+side-specific+vulnerability+to+calcification+in+normal+porcine+aortic+valves.">Spatial heterogeneity of endothelial phenotypes correlates with side-specific vulnerability to calcification in normal porcine aortic valves.</a> Circ Res. 96, 792-799 (2005).</li><li>Butcher, J. T., Tressel, S., Johnson, T., Turner, D., Sorescu, G., Jo, H., Nerem, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+Profiles+of+Valvular+and+Vascular+Endothelial+Cells+Reveal+Phenotypic+Differences:+Influence+of+Shear+Stress.">Transcriptional Profiles of Valvular and Vascular Endothelial Cells Reveal Phenotypic Differences: Influence of Shear Stress.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 26, 69-69 (2006).</li><li>Parachuri, S., Yang, J. H., Aikawa, E., Melero-Martin, J. M., Khan, Z. A., Loukogeorgakis, S., Schoen, F. J., Bischoff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Pulmonary+Valve+Progenitor+Cells+Exhibit+Endothelial/Mesenchymal+Plasticity+in+Response+to+Vascular+Endothelial+Growth+Factor-A+and+Transforming+Growth+Factor-&#946;2.">Human Pulmonary Valve Progenitor Cells Exhibit Endothelial/Mesenchymal Plasticity in Response to Vascular Endothelial Growth Factor-A and Transforming Growth Factor-&#946;2.</a> Circ Res. 99 (8), 861-869 (2006).</li><li>Shi, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+circulating+bone+marrow-derived+endothelial+cells.">Evidence for circulating bone marrow-derived endothelial cells.</a> Blood. 92, 362-367 (1998).</li><li>Rehman, J., Li, J., Orschell, C. M., March, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+blood+endothelial+progenitor+cells+are+derived+from+monocyte/macrophages+and+secrete+angiogenic+growth+factors.">Peripheral blood endothelial progenitor cells are derived from monocyte/macrophages and secrete angiogenic growth factors.</a> Circulation. 107, 1164-1169 (2003).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

הבנה של הביולוגיה valvular נפגעה על ידי קשיים טכניים בידוד אוכלוסיות culturing טהור של בתאי האנדותל valvular. טכניקות בידוד אופייניים לערב עיכול אנזימטי של מטריקס הבסיס הבסיסי או כימי דיסוציאציה של אג&quot;ח דבק אנדותל 2,3. ניסויים ראשוניים בידוד איכותית הוערכו על ידי סוכנים ?...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Dulbecco&#x2019;s Modified Eagle Medium</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Mediatech</td>
<td>50-103-PB</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fetal Bovine Serum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>26140</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Penicillin Streptomycin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>15140-122</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>0.25% Trypsin-EDTA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>25200</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Heparin Sodium Salt</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>H4784-1G</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Collagenase Type 2</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Worthington Biochemical</td>
<td>LS004176</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DPBS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>21300-058</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Rat Tail Collagen</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Biosciences</td>
<td>354236</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Critical Swabs</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>89031-270</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium Bicarbonate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>55761</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>T25 Flasks</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Biosciences</td>
<td>353018</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>T75 Flasks</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Biosciences</td>
<td>353136</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>24 Well Plate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Falcon</td>
<td>353047</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>60x15 mm Dishes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>25384-092</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>60x15 Glass Dishes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>89000-310</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Paraffin Embedding Wax</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Electron Microscopy Sciences</td>
<td>19304-01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Precision Glide Needles</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Biosciences </td>
<td>305165</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>500 mL Nalgene Filters</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>73520-985</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1L Nalgene Filters</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>73520-986</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tissue Forceps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>11023-15</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>FSC Tweezers #5</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>11295-00</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

isolation of valvular endothelial cells

שסתומי הלב הוא האחראי הבלעדי לשמירה על זרימת דם חד כיווני דרך מערכת הלב וכלי הדם. דקים אלה, סיבי רקמות חשופים מדגיש מכני משמעותי כפי שהם לפתוח ולסגור כמה מיליארדי פעמים על תוחלת חיים. סיבולת מדהימה של רקמות אלה נובע valvular התושב האנדותל (VEC) ותאי ביניים (ויק), כי כל הזמן לתקן לשפץ בתגובה לאותות מכני ביולוגי המקומית. רק לאחרונה התחלנו להבין את התנהגות ייחודית של תאים אלה, אשר בניסויים במבחנה יש תפקיד מפתח. מאתגר במיוחד הוא בידוד תרבות VEC. טיפול מיוחד יש להשתמש מרגע רקמה יוסר המארח באמצעות ציפוי הסופי. כאן אנו מציגים פרוטוקולים בידוד ישיר, בידוד צד מסוים, תרבות, ואימות של אוכלוסיות טהורות של VEC. אנו משתמשים עיכול אנזימטי ואחריו טכניקה גירוד עדין ספוגית כדי לסלק משטח תאים בלבד. תאים אלו נאספים אז לתוך צינור ו centrifuged לתוך גלולה. גלולה היא resuspended אז מצופה לתוך צלוחיות תרבות טרום מצופה מטריצה ​​אני קולגן. פנוטיפ VEC הוא אושר על ידי מגע עכבות הצמיחה ביטוי של סמנים ספציפיים כגון PECAM1 האנדותל (CD31), פון Willebrand Factor (vWF), ואת הביטוי השלילי של אקטין אלפא שריר חלק (α-SMA). המאפיינים של פונקציונלי VEC קשורים עם רמות גבוהות של LDL acetylated. בניגוד לתאי אנדותל כלי הדם, VEC יש יכולת ייחודית להפוך mesenchyme, אשר בדרך כלל מתרחשת במהלך היווצרות שסתום עובריים 1. זה יכול להתרחש גם במהלך ומחוברות משמעותית לפרסם ממושך בתרבות חוץ גופית, ולכן הטיפול צריך להיעשות כדי המעבר ליד או מפגש. לאחר בידוד VEC, אוכלוסיות טהור של ויק אז יכול להיות נרכש בקלות.

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Valvular Endothelial Cells at JoVE.com

Isolation of Valvular Endothelial Cells

אנו מספקים שיטה בידוד אוכלוסיות culturing טהור של שסתום הלב תאים אנדותל (VEC). VEC יכול להיות מבודד צדי סף או העלעל ומיד הבאה, תא ביניים הבסיסית (ויק) בידוד היא פשוטה.

בידוד של תאים אנדותל valvular

Heart valves are solely responsible for maintaining unidirectional blood flow through the cardiovascular system.  These thin, fibrous tissues are ...

Research

JoVE Journal

Biology

20.2K Views.  Cornell University. אנו מספקים שיטה בידוד אוכלוסיות culturing טהור של שסתום הלב תאים אנדותל (VEC). VEC יכול להיות מבודד צדי סף או העלעל ומיד הבאה, תא ביניים הבסיסית (ויק) בידוד היא פשוטה.

Video: Isolation of Valvular Endothelial Cells

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC)

Angiogenesis is a complex multi-step process, where in response to angiogenic stimuli, new vessels are created from the existing vasculature. These steps include: degradation of the basement membrane, proliferation and migration (sprouting) of endothelial cells (EC) into the extracellular matrix, alignment of EC into cords, lumen formation, anastomosis, and formation of a new basement membrane. Many in vitro assays have been developed to study this process, but most only mimic certain stages of angiogenesis, and morphologically the vessels often do not resemble vessels in vivo. Here we demonstrate an optimized in vitro angiogenesis assay that utilizes human umbilical vein EC and fibroblasts. This model recapitulates all of the key early stages of angiogenesis, and importantly the vessels display patent intercellular lumens surrounded by polarized EC. Vessels can be easily observed by phase-contrast and time-lapse microscopy, and recovered in pure form for downstream applications.

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells HUVEC

This video protocol illustrates the isolation and culture of human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) from human umbilical cord. Once isolated these cells can be used for in vitro angiogenesis assays like the Optimized Fibrin Gel Bead Assay also demonstrated by the Hughes lab.

בידוד של האדם תאים עורק טבורי האנדותל (HUVEC)

Angiogenesis is a complex multi-step process, where in response to angiogenic stimuli, new vessels are created from the existing vasculature. These steps ...

Isolation and Large Scale Expansion of Adult Human Endothelial Colony Forming Progenitor Cells

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult human peripheral blood within a mean of 12 days. After large scale expansion &gt;1x108 ECFCs can be obtained for further tests. Advantageously by using pHPL the contact of human cells with bovine serum antigens can be excluded. By flow cytometry and immunohistochemistry the isolated cells can be characterized as ECFC and their in vitro functionality to form vascular like structures can be tested in a matrigel assay. Further these cells can be subcutaneously injected in a mouse model to form functional, perfused vessels in vivo. After long term expansion and cryopreservation proliferation, function and genomic stability appear to be preserved. 3,4
This animal-protein free isolation and expansion method is easily applicable to generate a large quantity of ECFCs.

Endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) are a promising tool to study vascular homeostasis and repair.1,2 This paper introduces a novel animal-serum free method for isolation and expansion of ECFC from heparinised adult human peripheral blood with pooled human platelet lysate (pHPL) diminishing the risk of anti-bovine immunisation.

בידוד הרחבת בקנה מידה גדול של תאים אנושיים למבוגרים האנדותל המושבה יצירת אב

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult ...

Isolation and Culture of Avian Embryonic Valvular Progenitor Cells

Proper formation and function of embryonic heart valves is critical for developmental progression. The early embryonic heart is a U-shaped tube of endocardium surrounded by myocardium. The myocardium secretes cardiac jelly, a hyaluronan-rich gelatinous matrix, into the atrioventricular (AV) junction and outflow tract (OFT) lumen. At stage HH14 valvulogenesis begins when a subset of endocardial cells receive signals from the myocardium, undergo endocardial to mesenchymal transformation (EMT), and invade the cardiac jelly. At stage HH25 the valvular cushions are fully mesenchymalized, and it is this mesenchyme that eventually forms the valvular and septal apparatus of the heart. Understanding the mechanisms that initiate and modulate the process of EMT and cell differentiation are important because of their connection to serious congenital heart defects. In this study we present methods to isolate pre-EMT endocardial and post-EMT mesenchymal cells, which are the two different cell phenotypes of the prevalvular cushion. Pre-EMT endocardial cells can be cultured with or without the myocardium. Post-EMT AV cushion mesenchymal cells can be cultured inside mechanically constrained or stress-free collagen gels. These 3D in vitro models mimic key valvular morphogenic events and are useful for deconstructing the mechanisms of early and late stage valvulogenesis.

This article will provide a method for isolating and culturing quail or chicken HH14- valve endocardial cells and HH25 valve cushion mesenchymal cells.

בידוד והתרבות של תאים עובריים העופות אבי valvular

Proper formation and function of embryonic heart valves is critical for developmental progression. The early embryonic heart is a U-shaped tube of ...

Isolation and Culture of Pulmonary Endothelial Cells from Neonatal Mice

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) have shown to be convenient, easy to obtain and culture, and thus are the most widely studied endothelial cells. However, for research focused on processes like angiogenesis, permeability or many others, microvascular endothelial cells (ECs) are a much more physiologically relevant model to study 2. Furthermore, ECs isolated from knockout mice provide a useful tool for analysis of protein function ex vivo. Several approaches to isolate and culture microvascular ECs of different origin have been reported to date 3-7, but consistent isolation and culture of pure ECs is still a major technical problem in many laboratories. Here, we provide a step-by-step protocol on a reliable and relatively simple method of isolating and culturing mouse lung endothelial cells (MLECs). In this approach, lung tissue obtained from 6- to 8-day old pups is first cut into pieces, digested with collagenase/dispase (C/D) solution and dispersed mechanically into single-cell suspension. MLECS are purified from cell suspension using positive selection with anti-PECAM-1 antibody conjugated to Dynabeads using a Magnetic Particle Concentrator (MPC). Such purified cells are cultured on gelatin-coated tissue culture (TC) dishes until they become confluent. At that point, cells are further purified using Dynabeads coupled to anti-ICAM-2 antibody. MLECs obtained with this protocol exhibit a cobblestone phenotype, as visualized by phase-contrast light microscopy, and their endothelial phenotype has been confirmed using FACS analysis with anti-VE-cadherin 8 and anti-VEGFR2 9 antibodies and immunofluorescent staining of VE-cadherin. In our hands, this two-step isolation procedure consistently and reliably yields a pure population of MLECs, which can be further cultured. This method will enable researchers to take advantage of the growing number of knockout and transgenic mice to directly correlate in vivo studies with results of in vitro experiments performed on isolated MLECs and thus help to reveal molecular mechanisms of vascular phenotypes observed in vivo.

Here, we describe a protocol for isolation and culture of murine pulmonary endothelial cells. This method comprises mechanic and enzymatic lung tissue dissociation as well as a 2-step purification process using anti-PECAM-1 and anti-ICAM-2 antibodies conjugated to magnetic beads, which produces a pure endothelial cell population of mostly microvascular origin.

בידוד תרבות לתאי אנדותל ריאתי מעכברים ילודים

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells ...

Isolation of Embryonic Ventricular Endothelial Cells

Cell culture has greatly enhanced our ability to assess individual populations of cells under myriad culture conditions. While immortalized cell lines offer significant advantages for their ease of use, these cell lines are unavailable for all potential cell types. By isolating primary cells from a specific region of interest, particularly from a transgenic mouse, more nuanced studies can be performed. The basic technique involves dissecting the organ or partial organ of interest (e.g. the heart or a specific region of the heart) and dissociating the organ to single cells. These cells are then incubated with magnetic beads conjugated to an antibody that recognizes the cell type of interest. The cells of interest can then be isolated with the use of a magnet, with a short trypsin incubation dissociating the cells from the beads. These isolated cells can then be cultured and analyzed as desired. This technique was originally designed for adult mouse organs but can be easily scaled down for use with embryonic organs, as demonstrated herein. Because our interest is in the developing coronary vasculature, we wanted to study this population of cells during specific embryonic stages. Thus, the original protocol had to be modified to be compatible with the small size of the embryonic ventricles and the low potential yield of endothelial cells at these developmental stages. Utilizing this scaled-down approach, we have assessed coronary plexus remodeling in transgenic embryonic ventricular endothelial cells.

Primary cell culture is a useful technique for analyzing specific populations of cells, particularly from transgenic mouse embryos at specific developmental stages. Herein, embryonic ventricles are dissected and dissociated, and antibody-conjugated beads recognize and separate out the endothelial cells for further analysis.

בידוד של תאי האנדותל חדרית עובריים

Cell culture has greatly enhanced our ability to assess individual populations of cells under myriad culture conditions. While immortalized cell lines ...

Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and surrounded by a monolayer of valve endothelial cells (VECs). VECs play essential roles in establishing the valve structures during embryonic development, and are important for maintaining life-long valve integrity and function. In contrast to a continuous endothelium over the surface of healthy valve leaflets, VEC disruption is commonly observed in malfunctioning valves and is associated with pathological processes that promote valve disease and dysfunction. Despite the clinical relevance, focused studies determining the contribution of VECs to development and disease processes are limited. The isolation of VECs from animal models would allow for cell-specific experimentation. VECs have been isolated from large animal adult models but due to their small population size, fragileness, and lack of specific markers, no reports of VEC isolations in embryos or adult small animal models have been reported. Here we describe a novel method that allows for the direct isolation of VECs from mice at embryonic and adult stages. Utilizing the Tie2-GFP reporter model that labels all endothelial cells with Green Fluorescent Protein (GFP), we have been successful in isolating GFP-positive (and negative) cells from the semilunar and atrioventricular valve regions using fluorescence activated cell sorting (FACS). Isolated GFP-positive VECs are enriched for endothelial markers, including CD31 and von Willebrand Factor (vWF), and retain endothelial cell expression when cultured; while, GFP-negative cells exhibit molecular profiles and cell shapes consistent with VIC phenotypes. The ability to isolate embryonic and adult murine VECs allows for previously unattainable molecular and functional studies to be carried out on a specific valve cell population, which will greatly improve our understanding of valve development and disease mechanisms.

The ability to isolate heart valve endothelial cells (VECs) is critical for understanding mechanisms of valve development, maintenance, and disease. Here we describe the isolation of VECs from embryonic and adult Tie2-GFP mice using FACS that will allow for studies determining the contribution of VECs in developmental and disease processes.

בידוד של תאי Murine Valve האנדותל

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an important model for cardiovascular disease research. This study demonstrates a simple method to isolate and culture endothelial cells from the mouse aorta without any special equipment. To isolate endothelial cells, the thoracic aorta is quickly removed from the mouse body, and the attached adipose tissue and connective tissue are removed from the aorta. The aorta is cut into 1 mm rings. Each aortic ring is opened and seeded onto a growth factor reduced matrix with the endothelium facing down. The segments are cultured in endothelial cell growth medium for about 4 days. The endothelial sprouting starts as early as day 2. The segments are then removed and the cells are cultured continually until they reach confluence. The endothelial cells are harvested using neutral proteinase and cultured in endothelial cell growth medium for another two passages before being used for experiments. Immunofluorescence staining indicated that after the second passage the majority of cells were double positive for Dil-ac-LDL uptake, Lectin binding, and CD31 staining, the typical characteristics of endothelial cells. It is suggested that cells at the second to third passages are suitable for in vitro and in vivo experiments to study the endothelial biology. Our protocol provides an effective means of identifying specific cellular and molecular mechanisms in endothelial cell physiopathology.

The vascular endothelial cells play a significant role in many important cardiovascular disorders. This article describes a simple method to isolate and expand endothelial cells from the mouse aorta without using any special equipment. Our protocol provides an effective means of identifying mechanisms in endothelial cell physiopathology.

בידוד והתרבות ראשית של לתאי אנדותל עכבר אב העורקים

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Isolation of Mouse Coronary Endothelial Cells

Endothelial cells line the inner wall of blood vessels and play an important role in the regulation of vascular tone, vascular permeability, and new vascular formation. Endothelial cell dysfunction is implicated in the development and progression of many cardiovascular diseases including ischemic heart disease. To examine the function and characterization of coronary endothelial cells, cell isolation is the first step and it requires high purity and quantity to conduct subsequent experiments. This protocol describes an efficient method to isolate adult mouse coronary endothelial cells. The mouse heart is dissected and minced into small pieces. After the digestion of the heart using dispase and collagenase II, cells are washed&#160;and incubated with magnetic beads which are conjugated with anti-CD31 antibody. The beads with endothelial cells are washed several times and are ready to use in various applications, including imaging and molecular biological experiments. Efficient isolation yields approximately 104 cells per one heart with over 90% purity.

This protocol is prepared to share our method of isolating mouse coronary endothelial cells for the purpose of imaging or to conduct molecular biological experiments.

בידוד של תאי האנדותל העכבר כלילי

Endothelial cells line the inner wall of blood vessels and play an important role in the regulation of vascular tone, vascular permeability, and new ...

Isolation and Culture of Primary Aortic Endothelial Cells from Miniature Pigs

Xenotransplantation is a promising way to resolve the shortage of human organs for patients with end-stage organ failure, and the pig is considered as a suitable organ source. Immune rejection and coagulation are two major hurdles for the success of xenotransplantation. Vascular endothelial cell (EC) injury and dysfunction are important for the development of the inflammation and coagulation responses in xenotransplantation. Thus, isolation of porcine aortic endothelial cells (pAECs) is necessary for investigating the immune rejection and coagulation responses. Here, we have developed a simple enzymatic approach for the isolation, characterization, and expansion of highly purified pAECs from miniature pigs. First, the miniature pig was anaesthetized with ketamine, and a length of aorta was excised. Second, the endothelial surface of aorta was exposed to 0.005% collagenase IV digestive solution for 15 min. Third, the endothelial surface of the aorta was scraped in only one direction with a cell scraper (&#60;10 times), and was not compressed during the process of scraping. Finally, the isolated pAECs of Day 3, and after passage 1 and passage 2, were identified by flow cytometry with an anti-CD31 antibody. The percentages of CD31-positive cells were 97.4% &#177; 1.2%, 94.4% &#177; 1.1%, and 92.4% &#177; 1.7% (mean &#177; SD), respectively. The concentration of Collagenase IV, the digestive time, the direction, and frequency and intensity of scraping are critical for decreasing fibroblast contamination and obtaining high-purity and a large number of ECs. In conclusion, our enzymatic method is a highly-effctive method for isolating ECs from the miniature pig aorta, and the cells can be expanded in vitro to investigate the immune and coagulation responses in xenotransplantation.

An effective enzymatic method for isolation of primary porcine aortic endothelial cells (pAECs) from miniature pigs is described. The isolated primary pAECs can be used to investigate the immune and coagulation response in xenotransplantation.

בידוד ותרבות של בתאי אבי העורקים הראשוניים מחזירים זעירים

Xenotransplantation is a promising way to resolve the shortage of human organs for patients with end-stage organ failure, and the pig is considered as a ...

Isolation and Characterization of Mouse Primary Liver Sinusoidal Endothelial Cells

Liver sinusoidal endothelial cells (LSECs) are specialized endothelial cells located at the interface between the circulation and the liver parenchyma. LSECs have a distinct morphology characterized by the presence of fenestrae and the absence of basement membrane. LSECs play essential roles in many pathological disorders in the liver, including metabolic dysregulation, inflammation, fibrosis, angiogenesis, and carcinogenesis. However, little has been published about the isolation and characterization of the LSECs. Here, this protocol discusses the isolation of LSEC from both healthy and nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD) mice. The protocol is based on collagenase perfusion of the mouse liver and magnetic beads positive selection of nonparenchymal cells to purify LSECs. This study characterizes LSECs using specific markers by flow cytometry and identifies the characteristic phenotypic features by scanning electron microscopy. LSECs isolated following this protocol can be used for functional studies, including adhesion and permeability assays, as well as downstream studies for a particular pathway of interest. In addition, these LSECs can be pooled or used individually, allowing multi-omics data generation including RNA-seq bulk or single cell, proteomic or phospho-proteomics, and Assay for Transposase-Accessible Chromatin using sequencing (ATAC-seq), among others. This protocol will be useful for investigators studying LSECs&#39; communication with other liver cells in health and disease and allow an in-depth understanding of the role of LSECs in the pathogenic mechanisms of acute and chronic liver injury.

Here we outline and demonstrate a protocol for primary mouse liver sinusoidal endothelial cell (LSEC) isolation. The protocol is based on liver collagenase perfusion, nonparenchymal cell purification by low-speed centrifugation, and CD146 magnetic bead selection. We also phenotype and characterize these isolated LSECs using flow cytometry and scanning electron microscopy.

בידוד ואפיון של תאי אנדותל סינוסואידליים ראשוניים בכבד של עכבר

Liver sinusoidal endothelial cells (LSECs) are specialized endothelial cells located at the interface between the circulation and the liver parenchyma. ...