אנו מודים סוזן Gerbi, היידי סמית, דיוויד למברט לאספקת חומר למבחן ב-vivo צנטריפוגה על Sciara coprophila ו Ilyanassa obsoleta, בהתאמה. אנו מודים לחברי במעבדה Welte הערות על הטכניקה ואת כתב היד. פיתוח ועידון של assay ב-vivo צנטריפוגה נתמך על ידי מענק NIGMS GM64687 אל לוע. התמונות באיור. איור 1 ו. 5E, F פורסמו 2 והם נדפס כאן באישור.

<ol>
	<li>Wieschaus, E., N&#252;sslein-Volhard, C., Roberts, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Looking+at+embryos.">Looking at embryos.</a> Drosophila: A Practical Approach. , 179-214 (1998).</li><li>Cermelli, S., Guo, Y., Gross, S. P., Welte, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lipid+droplet+proteome+reveals+that+droplets+are+a+protein+storage+depot.">The lipid droplet proteome reveals that droplets are a protein storage depot.</a> Curr Biol. 16, 1783-1795 (2006).</li><li>Kiehart, D. P., Crawford, J. M., Montague, R. A., Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+microinjection+of+Drosophila+embryos.">Quantitative microinjection of Drosophila embryos.</a> Drosophila Protocols. , 345-359 (2000).</li><li>LaJeunesse, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three+new+Drosophila+markers+of+intracellular+membranes.">Three new Drosophila markers of intracellular membranes.</a> Biotechniques. 36 (784-788), 790-790 (2004).</li><li>Schuh, M., Lehner, C. F., Heidmann, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incorporation+of+Drosophila+CID/CENP-A+and+CENP-C+into+centromeres+during+early+embryonic+anaphase.">Incorporation of Drosophila CID/CENP-A and CENP-C into centromeres during early embryonic anaphase.</a> Curr Biol. 17, 237-243 (2007).</li><li>Clarkson, M., Saint, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+His2AvDGFP+fusion+gene+complements+a+lethal+His2AvD+mutant+allele+and+provides+an+in+vivo+marker+for+Drosophila+chromosome+behavior.">A His2AvDGFP fusion gene complements a lethal His2AvD mutant allele and provides an in vivo marker for Drosophila chromosome behavior.</a> DNA Cell Biol. 18, 457-462 (1999).</li><li>Welte, M. A., Gross, S. P., Postner, M., Block, S. M., Wieschaus, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+regulation+of+vesicle+transport+in+Drosophila+embryos:+forces+and+kinetics.">Developmental regulation of vesicle transport in Drosophila embryos: forces and kinetics.</a> Cell. 92, 547-557 (1998).</li><li>Tran, S. L., Welte, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=unpublished+observations.">unpublished observations.</a> , .</li><li>Rothwell, W. F., Sullivan, W., Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+analysis+of+Drosophila+embryos.">Fluorescent analysis of Drosophila embryos.</a> Drosophila Protocols. , 141-157 (2000).</li><li>Guo, Y., Jangi, S., Welte, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organelle-specific+Control+of+Intracellular+Transport:+Distinctly+Targeted+Isoforms+of+the+Regulator+Klar.">Organelle-specific Control of Intracellular Transport: Distinctly Targeted Isoforms of the Regulator Klar.</a> Mol Biol Cell. 16, 1406-1416 (2005).</li><li>Meyer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overlapping+Functions+of+Argonaute+Proteins+in+Patterning+and+Morphogenesis+of+Drosophila+Embryos.">Overlapping Functions of Argonaute Proteins in Patterning and Morphogenesis of Drosophila Embryos.</a> PLoS Genet. 2, 1224-1239 (2006).</li><li>Shubeita, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consequences+of+motor+copy+number+on+the+intracellular+transport+of+kinesin-1-driven+lipid+droplets.">Consequences of motor copy number on the intracellular transport of kinesin-1-driven lipid droplets.</a> Cell. 135, 1098-1107 (2008).</li><li>Welte, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+lipid-droplet+transport+by+the+Perilipin+homologue+LSD2.">Regulation of lipid-droplet transport by the Perilipin homologue LSD2.</a> Curr. Biol. 15, 1266-1275 (2005).</li><li>Phadnis, N., Welte, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unpublished+Observations.">Unpublished Observations.</a> , .</li><li>Phadnis, N., Welte, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unpublished+Observations.">Unpublished Observations.</a> , .</li><li>Morgan, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+XXII:+The+redistribution+of+the+visible+materials+of+the+egg+by+centrifuging.">Chapter XXII: The redistribution of the visible materials of the egg by centrifuging.</a> Experimental Embryology. , (1927).</li><li>Welte, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unpublished+Observations.">Unpublished Observations.</a> , .</li><li>Bownes, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abnormal+oogenesis+and+embryogenesis+resulting+from+centrifuging+Drosophila+melanogaster+females.">Abnormal oogenesis and embryogenesis resulting from centrifuging Drosophila melanogaster females.</a> J Embryol Exp Morphol. 40, 65-81 (1977).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

צעדים קריטיים ודא כי ריכוז אגר גבוה מספיק. אם זה נמוך מדי, אגר יהיה להתפורר במהלך צנטריפוגה, ואת העוברים יתפוצץ או להיות מכוונת באופן אקראי. אם ריכוז אגר הוא רק מעט נמוך מדי או אם אגר הוא רטוב (הסרת יבש מספיק או לא מספיק עודף של TSS בשלב 4.3), העוברים יצוף מתוך החורים שלהם במהלך צנטריפוגה ולהיות מכוונת כראוי. אם אגר הוא שפך דק מדי, זה יהיה גם התמוטטות או סדק במהלך צנטריפוגה. ודא כי עוברי לא מתקדמים מעבר בשלבים cellularization. אחרת, ההפרדה של אברונים לא יעבוד (איור 5c) מאז האברונים יהיה מוחרם בתוך אלפי תאים בודדים. בשנת עוברים הצעיר בשלב אחד את התא, האברונים חופשיים לנדוד מרחקים גדולים ולצבור לפי צפיפות מאפיין שלהם. כדי למנוע ניתוח עוברים כי הם זקנים מדי, הקפד (i) כולל אוסף מראש כדי לאפשר לנקבות להטיל ביצים הישן (שלב 2.4), (ii) לאסוף עוברים במשך 3 שעות או פחות (שלב 2.5), (iii) ויזואלית לבחור עוברים שלבים לפני cellularization להטבעת לתוך אגר (שלב 4.2), (ד) לשמור על הטבעה זמן קצר כדי למנוע התפתחות עד סוף cellularization (שלב 4.6), ו (v) לבטל את העוברים שלא שכבת נכונה (שלב 5.6) . לא לקמץ על הזמן צנטריפוגה. למרות שחלק עוברים יראה שכבות נחמד גם אחרי 10 דקות בלבד של צנטריפוגה, ההפרדה אינה עולה בקנה אחד מעובר לעובר. 30 דק &#39;ספינים לתת תוצאות עקביות מאוד. כמו כן, עוד פעם צנטריפוגה, ככל השכבות יציבים לאחר צנטריפוגה הסתיים. זה חשוב עבור יישומים אלה שבהם זה לוקח זמן לתהליך עוברים עוד לפני השימוש (למשל, אם הם צריכים להיות מעובד לניסויים השתלה או רכוב לניתוח confocal). שינויים אפשריים אוסף ביצה הסרת סיסית פרוטוקולים שונים רבים קיימים שלבים 2 ו -3 1, 3, 9, ו יעבוד כמו גם אלה שתוארו כאן, כל עוד נעשה שימוש בעוברים צעירים, ביצה תשואה גבוהה, את החלק היחסי של אי - עוברים מבוים ממוזער. Anterior-האחורי יישור הפרוטוקול מכוונת כל כך עוברים את הקצה האחורי קבור אגר ואת הקצה הקדמי הוא מעלה (איור 3). האוריינטציה זה טוב עקביות, כך אפשר להשתמש micropyle כציון דרך אשר בסופו הצביעה במהלך צנטריפוגה (איור 1, 5). עם זאת, בפועל, קל לבחור את הכיוון של עוברי centrifuged על ידי הופעתו שונים של טיפות השומנים שכבות חלמון על ידי מיקרוסקופ שדה בהיר. לאחר מכן ניתן יהיה הר עוברים עם צד למעלה; גמישות זה מזרז את תהליך ההרכבה. צנטריפוגה Unoriented ההיבט ביותר זמן רב מאתגר מבחינה טכנית של הפרוטוקול הוא מקבע את העוברים אגר (שלב 4). זה דורש נוגעים זה עובר פעמיים (פעם אחת כדי להכניס אותו לתוך החור פעם לשחזר אותה לאחר צנטריפוגה). כחלופה, ניתן להעביר עוברים בשלב 4.1 לתוך צינורות microcentrifuge מלא TSS. כאשר אלה הם צינורות centrifuged ב microcentrifuge (13,000 סל&quot;ד, 10-30 דקות), עוברים גם בדרך כלל גם שכבת 10-13. וריאציה זו מאפשרת לתהליך מאות העוברים באותו זמן מהר מאוד. ואולם, layering אינו עקבי כמו; שבריר של עוברי לא לפתח שכבות נפרדות למרות כוחות צנטריפוגה הרבה יותר גבוה (~ 16000 ז) מאשר ליישם בפרוטוקול לעיל. מאתגר יותר היא העובדה כי הכיוון של עוברים הוא משתנה, ניתן לראות הפרדה בזוויות שונות על ציר מרכזי העובר. השתנות זו דורשת הנסיין לברר לאחר צנטריפוגה איך עובר מסוים הוסדר בצינור צנטריפוגות. עם השימוש autofluorescence החלמון כסמן החלק הכי צפופה של העובר, זה בדרך כלל אפשרי, למרות שזה דורש תרגול הרבה יותר שיקול דעת לעשות את זה אמין. אם יש עוברים מספיק במדגם, אחד עשוי להיות מסוגל למיין את אותם מקרים שבהם עוברים במקרה מסודרים כמו באיור. 1. צנטריפוגה של עוברים במעטפת ביצה שלהם אפשר להטביע עוברים אגר עבור לשלב 4 מבלי להסיר את סיסית הראשון 2. בגישה זו, עוברים על הצלחת אוסף מכוסים שמן halocarbon במקום אקונומיקה 50% בשלב 3.2 (halocarbon הופך את שקוף סיסית). עוברים שלבים המתאימים נבחרים ומועברים צלחת אגר חדש באמצעות פינצטה; על ידי תופס רק את החוטים ביצה עם פינצטה, נזקראוי העובר הוא התחמק. עוברים המוטבעים כמו בשלב 4.4 דרך 4.8, עם חוטים ביצה קדמית מזדקרת מתוך החור אגר. הפגז ביצה יוסר על ידי טיפול אקונומיקה 50% לאחר עוברים כבר centrifuged וחפרו מתוך אגר כמו בשלב 5.4. צנטריפוגה בנוכחות הקליפה ביצה עשויה לשפר את שיעור devitellinization לאחר קיבוע (שלב 6.2), אבל הבחירה של השלבים הנכונים עבור צנטריפוגה (שלב 4.2) הוא יותר מאתגר. יישומים צנטריפוגה העובר הוא שימושי במיוחד עבור ניסויים colocalization, כלומר, לבדוק אם חלבון מסוים localizes ל אברון מרכזי מסוים. לדוגמה, החלבון קלר קיים מוקדם על טיפות השומנים עובריים, אך לוקליזציה זה מאתגר להפגין עוברים ללא פגע. בחלקו, זה בגלל שתי puncta קלר ואת טיפות השומנים נמצאים בשפע בפריפריה העובר 10, מה שהופך colocalization מזויף קשה לשלול. עם זאת, צנטריפוגה מתרכז טיפות לתוך שכבת השומנים ברורה, ולכן, colocalization עם האות קלר הופך ברור 10. ניתוח דומה הוכיחה באופן חד משמעי לוקליזציה של חלבונים אחרים טיפות השומנים 8, 13-15, כולל דוגמאות מפתיע כמו ההיסטונים מסוימים 2 ו במקרים בהם החלבון נמצא בכל מקום בגוף, אך מועשר על טיפות השומנים 8. כאשר עוברים ניתן לבחור חזותית על ידי השלב ההתפתחותי (שלב 4.2), אפשר גם לזהות גיוס מוסדר מבחינה התפתחותית של חלבונים טיפות השומנים 8, 15. בדיקת colocalization עם טיפות השומנים קל במיוחד מאז טיפות השומנים מצטברים &quot;כובע&quot; מובחנת מבחינה ויזואלית, ולכן אין סמן נוסף או כתם נדרש לזהות את השכבה. למעשה, בגלל הקלות שלה והתוצאות חזותי מרשים בפוטנציה (איור 1, איור. 5 D, E), המעבדה שלנו משתמשת בטכניקה זו באופן שגרתי עכשיו מבחן ראשון האם חלבון הוא מועמד מקומי על טיפות השומנים. באופן עקרוני, מחקרים colocalization דומה צריך לעבוד על אברונים אחרים באיור. 1, וסביר עבור אחרים (כולל טפילים תאיים) אשר הפצה עוברים centrifuged טרם תועדו. מאז צנטריפוגה מתרכז האברונים לתוך להקות חזק, זה מאפשר בידוד של חלק המועשר אברונים אלה. גישה זו כבר בשימוש להתאושש טיפות השומנים להשתלה לעוברי תורם 2. זה יכול להיות גם אפשרי ביוכימית לנתח את השבר מועשר (למשל, על ידי חיתוך שכבות את העוברים לאחר קיבוע 15). השיטה המתוארת כאן יש יישומים מעבר עוברים תסיסנית, כמו צנטריפוגה ניתן להשתמש כדי לרבד את הביצים של מינים שונים (כולל צפרדעים, נמטודות, tunicates, annelids, קיפודי ים, רכיכות, צורבים ו) 16. במעבדה שלנו, השתמשנו בפרוטוקול לעיל עוברים של Musca זבוב domestica 2 יש המועסקים צנטריפוגה unoriented בניתוח של עוברים מן יתוש פטרייה Sciara coprophila 17 ועל חילזון Ilyanassa obsoleta 17. לבסוף, שיטה זו אינה מוגבלת עוברי: צנטריפוגה יכולה להיות שימושית גם כדי לרבד תאים גדולים אחרים, כגון ביציות (למשל, תסיסנית 2, 18 ו - באג פרח חלבלוב Oncopeltus fasciatus 17). עבור הדגימה שונה, התנאים צנטריפוגה המדויק צריך להיות מותאם: לדוגמה, 10 דקות ב 3000 גרם די ביעילות לרבד בעוברים של Musca domestica 2, ואם centrifuged עוד הרבה זמן, העוברים נוטים להתפרק במהלך קיבוע ו immunostaining.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>60x15 mm Petri dishes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Becton Dickinson</td>
<td>#35-1007</td>
<td>From Falcon</td>
</tr>
<tr>
<td>Wire mesh</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Small Parts</td>
<td>CX-0150</td>
<td>stainless steel type 304; mesh size #150 x150, wire diameter: 0.0026 inches</td>
</tr>
<tr>
<td>Tungsten needles</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>10130-10</td>
<td>0.25 mm</td>
</tr>
<tr>
<td>Moria Nickel Plated Pin/Needle Holder</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>26016-12</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fly Cages</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Genesee Scientific</td>
<td>59-100 or 59-101</td>
<td>For 65 mm or 100 mm diameter Petri dishes, respectively</td>
</tr>
<tr>
<td>Halocarbon Oil 27</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>H8773</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

in-vivo centrifugation of drosophila embryos

האסטרטגיה העיקרית מטהרים לבודד סוגים שונים של אברונים תאיים היא להפריד אותם זה מזה מבוסס על הבדלים בצפיפות קליל. עם זאת, כאשר התאים הם שיבשו לפני, חלבונים צנטריפוגה ואת האברונים בסביבה לא דובר זה לעתים קרובות באופן בלתי הולם לדבוק זה בזה. כאן אנו מתארים שיטה האברונים נפרד על ידי צפיפות שלם, החיים עוברים תסיסנית. עוברי מוקדם לפני cellularization נקצרים מהכלובים האוכלוסייה, ופצצות החיצוני שלהם ביצה יוסרו על ידי טיפול עם אקונומיקה 50%. העוברים מועברים לצלחת אגר קטן ונוסף, סוף האחורי הראשונה, לתוך חורים אנכיים קטנים אגר. לוחיות המכילות עוברים המוטבע centrifuged למשך 30 דקות בכל 3000g. אגר תומכת עוברים ושומר אותם בכיוון מוגדר. לאחר מכן, עוברים הם חפרו מתוך אגר עם מחט קהה. צנטריפוגה המפרידה האברונים העיקריים לתוך שכבות נפרדות, ריבוד גלוי בקלות באמצעות מיקרוסקופ שדה בהיר. מספר סמנים ניאון זמינים לאשר ריבוד מוצלח עוברים חיים. חלבונים הקשורים אברונים מסוימים יהיה מועשר בשכבה מסוימת, הוכחת colocalization. שכבות בודדת ניתן לשחזר לניתוח השתלת ביוכימית או ביצים לתוך התורם. טכניקה זו חלה על הפרדה אברון בתאים גדולים אחרים, כולל ביצים וביציות של מינים שונים.

Watch this Scientific Journal Video about In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos at JoVE.com

In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos

אנו מתארים שיטה האברונים נפרד על ידי צפיפות המגורים<em&gt; תסיסנית</em&gt; עוברים. עוברים המוטבעים אגר ו centrifuged. טכניקה זו התשואות ההפרדה לשחזור של האברונים העיקריים לאורך הציר הקדמי, האחורי את העובר. שיטה זו מקלה על ניסויים colocalization והתשואות שברים אברון לניתוח השתלת ניסויים ביוכימיים.

In-vivo צנטריפוגה של עוברים תסיסנית

A major strategy for purifying and isolating different types of intracellular organelles is to separate them from each other based on differences in ...

in-vivo-centrifugation-of-drosophila-embryos

Research

JoVE Journal

Biology

In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos

18.3K Views.  University of Rochester. אנו מתארים שיטה האברונים נפרד על ידי צפיפות המגורים תסיסנית עוברים. עוברים המוטבעים אגר ו centrifuged. טכניקה זו התשואות ההפרדה לשחזור של האברונים העיקריים לאורך הציר הקדמי, האחורי את העובר. שיטה זו מקלה על ניסויים colocalization והתשואות שברים אברון לניתוח השתלת נ?...

Video: In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos

Preparation of Neuronal Cultures from Midgastrula Stage Drosophila Embryos

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos and their dechorionation using bleach are demonstrated. Using a glass pipet attached to a mouth suction tube, we illustrate the removal of all cells from single embryos. The method for dispersing cells from each embyro into a small (5 l) drop of medium on an uncoated glass coverslip is demonstrated. A view through the microscope at 1 hour after plating illustrates the preferred cell density. Most of the cells that survive when grown in defined medium are neuroblasts that divide one or more times in culture before extending neuritic processes by 12-24 hours. A view through the microscope illustrates the level of neurite outgrowth and branching expected in a healthy culture at 2 days in vitro. The cultures are grown in a simple bicarbonate based defined medium, in a 5% CO2 incubator at 22-24&deg;C. Neuritic processes continue to elaborate over the first week in culture and when they make contact with neurites from neighboring cells they often form functional synaptic connections. Neurons in these cultures express voltage-gated sodium, calcium, and potassium channels and are electrically excitable. This culture system is useful for studying molecular genetic and environmental factors that regulate neuronal differentiation, excitability, and synapse formation/function.

This video demonstrates the preparation of primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. Views of live cultures show cells 1 hour after plating and differentiated neurons after 2 days of growth in a bicarbonate-based defined medium. The neurons are electrically excitable and form synaptic connections.

הכנת תרבויות העצבית מ Midgastrula עוברים שלב תסיסנית

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos ...

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

Green fluorescent protein (GFP)-based timelapse live-imaging is a powerful technique for studying the genetic regulation of dynamic processes such as tissue morphogenesis, cell-cell adhesion, or cell death. Drosophila embryos expressing GFP are readily imaged using either stereoscopic or confocal microscopy. A goal of any live-imaging protocol is to minimize detrimental effects such as dehydration and hypoxia. Previous protocols for preparing Drosophila embryos for live-imaging analysis have involved placing dechorionated embryos in halocarbon oil and sandwiching them between a halocarbon gas-permeable membrane and a coverslip1-3. The introduction of compression through mounting embryos in this manner represents an undesirable complication for any biomechanical-based analysis of morphogenesis. Our method, which we call the hanging drop protocol, results in excellent viability of embryos during live imaging and does not require that embryos be compressed. Briefly, the hanging drop protocol involves the placement of embryos in a drop of halocarbon oil that is suspended from a coverslip, which is, in turn, fixed in position over a humid chamber. In addition to providing gas exchange and preventing dehydration, this arrangement takes advantage of the buoyancy of embryos in halocarbon oil to prevent them from drifting out of position during timelapse acquisition. This video describes in detail how to collect and prepare Drosophila embryos for live imaging using the hanging drop protocol. This protocol is suitable for imaging dechorionated embryos using stereomicroscopy or any upright compound fluorescence microscope.

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

A simple, inexpensive, and effective method of preparing Drosophila embryos for live-imaging analysis is presented. Our protocol provides humidity and gas exchange and does not compress the Drosophila embryo. This method is suitable for GFP-based live imaging of Drosophila embryos using a stereomicroscope or upright compound microscope.

הכנת תסיסנית עוברים Live-הדמיה באמצעות פרוטוקול Drop Hanging

Green fluorescent protein (GFP)-based timelapse live-imaging is a powerful technique for studying the genetic regulation of dynamic processes such as ...

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

Visualizing developing organ formation as well as progession and treatment of disease often heavily relies on the ability to optically interrogate molecular and functional changes in intact living organisms. Most existing optical imaging methods are inadequate for imaging at dimensions that lie between the penetration limits of modern optical microscopy (0.5-1mm) and the diffusion-imposed limits of optical macroscopy (&gt;1cm) [1]. Thus, many important model organisms, e.g. insects, animal embryos or small animal extremities, remain inaccessible for in-vivo optical imaging. 
Although there is increasing interest towards the development of nanometer-resolution optical imaging methods, there have not been many successful efforts in improving the imaging penetration depth. The ability to perform in-vivo imaging beyond microscopy limits is in fact met with the difficulties associated with photon scattering present in tissues. Recent efforts to image entire embryos for example [2,3] require special chemical treatment of the specimen, to clear them from scattering, a procedure that makes them suitable only for post-mortem imaging. These methods however evidence the need for imaging larger specimens than the ones usually allowed by two-photon or confocal microscopy, especially in developmental biology and in drug discovery.
We have developed a new optical imaging technique named Mesoscopic Fluorescence Tomography [4], which appropriate for non-invasive in-vivo imaging at dimensions of 1mm-5mm. The method exchanges resolution for penetration depth, but offers unprecedented tomographic imaging performance and it has been developed to add time as a new dimension in developmental biology observations (and possibly other areas of biological research) by imparting the ability to image the evolution of fluorescence-tagged responses over time. As such it can accelerate studies of morphological or functional dependencies on gene mutations or external stimuli, and can importantly, capture the complete picture of development or tissue function by allowing longitudinal time-lapse visualization of the same, developing organism.
The technique utilizes a modified laboratory microscope and multi-projection illumination to collect data at 360-degree projections. It applies the Fermi simplification to Fokker-Plank solution of the photon transport equation, combined with geometrical optics principles in order to build a realistic inversion scheme suitable for mesoscopic range. This allows in-vivo whole-body visualization of non-transparent three-dimensional structures in samples up to several millimeters in size.
We have demonstrated the in-vivo performance of the technique by imaging three-dimensional structures of developing Drosophila tissues in-vivo and by following the morphogenesis of the wings in the opaque Drosophila pupae in real time over six consecutive hours.

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

Mesoscopic fluorescence tomography operates beyond the penetration limits of tissue-sectioning fluorescence microscopy. The technique is based on multi-projection illumination and a photon transport description. We demonstrate in-vivo whole-body 3D visualization of the morphogenesis of GFP-expressing wing imaginal discs in Drosophila melanogaster.

Mesoscopic Fluorescence טומוגרפיה עבור In-vivo הדמיה של פיתוח תסיסנית</em

Visualizing  developing organ formation as well as progession and treatment of disease often  heavily relies on the ability to optically interrogate ...

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

The morphogenesis of the Drosophila embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell shape changes during embryonic development. One of the challenges faced in studying this structure is that the lumen of the heart tube, as well as the membrane features that are crucial to heart tube formation, are difficult to visualize in whole mount embryos, due to the small size of the heart tube and intra-lumenal space relative to the embryo. The use of transmission electron microscopy allows for higher magnification of these structures and gives the advantage of examining the embryos in cross section, which easily reveals the size and shape of the lumen. In this video, we detail the process for reliable fixation, embedding, and sectioning of late stage Drosophila embryos in order to visualize the heart tube lumen as well as important cellular structures including cell-cell junctions and the basement membrane.

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

We describe a process for fixation, embedding, sectioning, and imaging of late stage Drosophila embryos for Trasmission Electron Microscopy of the embryonic heart tube. This technique allows for the visualization of the heart tube lumen as well as the basement membrane, which lines the lumen of the heart.

הכנת עוברים אלקטרונים מיקרוסקופית של תסיסנית לב עוברי צינור

The morphogenesis of the Drosophila  embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell ...

Upright Imaging of Drosophila Embryos

Several well-known morphogenetic gradients and cellular movements occur along the dorsal/ventral axis of the Drosophila embryo. However, the current techniques used to view such processes are somewhat limited. The following protocol describes a new technique for mounting fixed and labeled Drosophila embryos for coronal viewing with confocal imaging. This method consists of embedding embryos between two layers of glycerin jelly mounting media, and imaging jelly strips positioned upright. The first step for sandwiching the embryos is to make a thin bedding of glycerin jelly on a slide. Next, embryos are carefully aligned on this surface and covered with a second layer of jelly. After the second layer is solidified, strips of jelly are cut and flipped upright for imaging. Alternatives are described for visualizing the embryos depending upon the type of microscope stand to be used. Since all cells along the dorsal-ventral axis are imaged within a single confocal Z-plane, our method allows precise measurement and comparison of fluorescent signals without photobleaching or light scattering common to 3D reconstructions of longitudinally mounted embryos.

Upright Imaging of Drosophila Embryos

Here we present a mounting protocol for stained Drosophila embryos in an upright position that allows imaging of cross-sections using Confocal microscopy.

הדמיה של זקופה תסיסנית עוברים

Several well-known morphogenetic gradients and cellular movements occur along the dorsal/ventral axis of the Drosophila embryo. However, the current ...

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

Here we describe a method for preparing and culturing primary cells dissociated from Drosophila gastrula embryos. In brief, a large amount of staged embryos from young and healthy flies are collected, sterilized, and then physically dissociated into a single cell suspension using a glass homogenizer. After being plated on culture plates or chamber slides at an appropriate density in culture medium, these cells can further differentiate into several morphologically-distinct cell types, which can be identified by their specific cell markers. Furthermore, we present conditions for treating these cells with double stranded (ds) RNAs to elicit gene knockdown. Efficient RNAi in Drosophila primary cells is accomplished by simply bathing the cells in dsRNA-containing culture medium. The ability to carry out effective RNAi perturbation, together with other molecular, biochemical, cell imaging analyses, will allow a variety of questions to be answered in Drosophila primary cells, especially those related to differentiated muscle and neuronal cells.

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

We provide a detailed protocol for preparing primary cells dissociated from Drosophila embryos. The ability to carry out the effective RNAi perturbation, together with other molecular, biochemical and cell imaging methods will allow a variety of questions to be addressed in Drosophila primary cells.

תא תרבויות ראשי מ תסיסנית Gastrula עוברים

Here we describe a method for preparing and culturing primary cells dissociated from Drosophila gastrula embryos.   In brief, a large amount of staged ...

In vivo Imaging of Intact Drosophila Larvae at Sub-cellular Resolution

Recent improvements in optical imaging, genetically encoded fluorophores and genetic tools allowing efficient establishment of desired transgenic animal lines have enabled biological processes to be studied in the context of a living, and in some instances even behaving, organism. In this protocol we will describe how to anesthetize intact Drosophila larvae, using the volatile anesthetic desflurane, to follow the development and plasticity of synaptic populations at sub-cellular resolution1-3. While other useful methods to anesthetize Drosophila melanogaster larvae have been previously described4,5,6,7,8, the protocol presented herein demonstrates significant improvements due to the following combined key features: (1) A very high degree of anesthetization; even the heart beat is arrested allowing for lateral resolution of up to 150 nm1, (2) a high survival rate of &gt; 90% per anesthetization cycle, permitting the recording of more than five time-points over a period of hours to days2 and (3) a high sensitivity enabling us in 2 instances to study the dynamics of proteins expressed at physiological levels. In detail, we were able to visualize the postsynaptic glutamate receptor subunit GluR-IIA expressed via the endogenous promoter1 in stable transgenic lines and the exon trap line FasII-GFP1. (4) In contrast to other methods4,7 the larvae can be imaged not only alive, but also intact (i.e. non-dissected) allowing observation to occur over a number of days1. The accompanying video details the function of individual parts of the in vivo imaging chamber2,3, the correct mounting of the larvae, the anesthetization procedure, how to re-identify specific positions within a larva and the safe removal of the larvae from the imaging chamber.

In vivo Imaging of Intact Drosophila Larvae at Sub-cellular Resolution

This protocol describes a reliable method for anesthetization and imaging of intact Drosophila melanogaster larvae. We have utilized the volatile anesthetic desflurane to allow for repetitive imaging at sub-cellular resolution and re-identification of structures for up to a few days1.

בתחום ההדמיה vivo של הזחלים תסיסנית אינטקט ברזולוציה משנה הסלולר

Recent improvements in optical imaging, genetically encoded fluorophores and genetic tools allowing efficient establishment of desired transgenic animal ...

RNAi Interference by dsRNA Injection into Drosophila Embryos

Genetic screening is one of the most powerful methods available for gaining insights into complex biological process 1. Over the years many improvements and tools for genetic manipulation have become available in Drosophila 2. Soon after the initial discovery by Frie and Mello 3 that double stranded RNA can be used to knockdown the activity of individual genes in Caenorhabditis elegans, RNA interference (RNAi) was shown to provide a powerful reverse genetic approach to analyze gene functions in Drosophila organ development 4, 5.
Many organs, including lung, kidney, liver, and vascular system, are composed of branched tubular networks that transport vital fluids or gases 6, 7. The analysis of Drosophila tracheal formation provides an excellent model system to study the morphogenesis of other tubular organs 8. The Berkeley Drosophila genome project has revealed hundreds of genes that are expressed in the tracheal system. To study the molecular and cellular mechanism of tube formation, the challenge is to understand the roles of these genes in tracheal development. Here, we described a detailed method of dsRNA injection into Drosophila embryo to knockdown individual gene expression. We successfully knocked down endogenous dysfusion(dys) gene expression by dsRNA injection. Dys is a bHLH-PAS protein expressed in tracheal fusion cells, and it is required for tracheal branch fusion 9, 10. dys-RNAi completely eliminated dys expression and resulted in tracheal fusion defect. This relatively simple method provides a tool to identify genes requried for tissure and organ development in Drosophila.

RNAi Interference by dsRNA Injection into Drosophila Embryos

RNA interference has been proven very effective to analyze gene function in Drosophila tracheal development. A detailed protocol used by Jiang lab to inject dsRNA into fly embryos to knockdown gene expression is illustrated. This technique has the potential for screening genes required for tissue and organ development in Drosophila.

RNAi הפרעה על ידי הזרקה לתוך dsRNA תסיסנית עוברים

Genetic screening is one of the most powerful methods available for gaining insights into complex biological process 1. Over the years many improvements ...

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging. Cell shape changes in the fly are analogous to those in higher organisms, and they drive tissue morphogenesis. So, in many cases, their study has direct implications for understanding human disease (Table 1)1-5. On the sub-cellular scale, these cell shape changes are the product of activities ranging from gene expression to signal transduction, cell polarity, cytoskeletal remodeling and membrane trafficking. Thus, the Drosophila embryo provides not only the context to evaluate cell shape changes as they relate to tissue morphogenesis, but also offers a completely physiological environment to study the sub-cellular activities that shape cells.
The protocol described here is designed to image a specific cell shape change called cellularization. Cellularization is a process of dramatic plasma membrane growth, and it ultimately converts the syncytial embryo into the cellular blastoderm. That is, at interphase of mitotic cycle 14, the plasma membrane simultaneously invaginates around each of ~6000 cortically anchored nuclei to generate a sheet of primary epithelial cells. Counter to previous suggestions, cellularization is not driven by Myosin-2 contractility6, but is instead fueled largely by exocytosis of membrane from internal stores7. Thus, cellularization is an excellent system for studying membrane trafficking during cell shape changes that require plasma membrane invagination or expansion, such as cytokinesis or transverse-tubule (T-tubule) morphogenesis in muscle.
Note that this protocol is easily applied to the imaging of other cell shape changes in the fly embryo, and only requires slight adaptations such as changing the stage of embryo collection, or using "embryo glue" to mount the embryo in a specific orientation (Table 1)8-19. In all cases, the workflow is basically the same (Figure 1). Standard methods for cloning and Drosophila transgenesis are used to prepare stable fly stocks that express a protein of interest, fused to Green Fluorescent Protein (GFP) or its variants, and these flies provide a renewable source of embryos. Alternatively, fluorescent proteins/probes are directly introduced into fly embryos via straightforward micro-injection techniques9-10. Then, depending on the developmental event and cell shape change to be imaged, embryos are collected and staged by morphology on a dissecting microscope, and finally positioned and mounted for time-lapse imaging on a confocal microscope.

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

Early development of the fruit fly, Drosophila melanogaster, is characterized by a number of cell shape changes that are well suited for imaging approaches. This article will describe basic tools and methods required for live confocal imaging of Drosophila embryos, and will focus on a cell shape change called cellularization.

צורה הדמיה תא שינוי חיים תסיסנית עוברים

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging.  Cell shape ...

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a variety of neurodegenerative diseases, understanding microtubule based motor transport and its regulation will likely ultimately lead to improved therapeutic approaches. Kinesin-1 is a eukaryotic motor protein which moves in an anterograde (plus-end) direction along microtubules (MTs), powered by ATP hydrolysis. Here we report a detailed purification protocol to isolate active full length kinesin from Drosophila embryos, thus allowing the combination of Drosophila genetics with single-molecule biophysical studies. Starting with approximately 50 laying cups, with approximately 1000 females per cup, we carried out overnight collections. This provided approximately 10 ml of packed embryos. The embryos were bleach dechorionated (yielding approximately 9 grams of embryos), and then homogenized. After disruption, the homogenate was clarified using a low speed spin followed by a high speed centrifugation. The clarified supernatant was treated with GTP and taxol to polymerize MTs. Kinesin was immobilized on polymerized MTs by adding the ATP analog, 5'-adenylyl imidodiphosphate at room temperature. After kinesin binding, microtubules were sedimented via high speed centrifugation through a sucrose cushion. The microtubule pellet was then re-suspended, and this process was repeated. Finally, ATP was added to release the kinesin from the MTs. High speed centrifugation then spun down the MTs, leaving the kinesin in the supernatant. This kinesin was subjected to a centrifugal filtration using a 100 KD cut off filter for further purification, aliquoted, snap frozen in liquid nitrogen, and stored at -80 &deg;C. SDS gel electrophoresis and western blotting was performed using the purified sample. The motor activity of purified samples before and after the final centrifugal filtration step was evaluated using an in vitro single molecule microtubule assay. The kinesin fractions before and after the centrifugal filtration showed processivity as previously reported in literature. Further experiments are underway to evaluate the interaction between kinesin and other transport related proteins.

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

This is a protocol to isolate active full length Kinesin from Drosophila embryos for single-molecule biophysical studies. We show how to collect embryos, make the embryo lysate, and then polymerize microtubules (MTs). Kinesin is purified by immobilizing it on the MTs, spinning down the Kinesin-MT complexes, and then releasing the kinesin from the MTs via ATP addition.

בידוד וטיהור של kinesin מ תסיסנית עוברים

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a ...