저자는 DNP - Cellobioside 기판을 제공하는 스티브 위더스 및 홍콩 - 밍 첸 감사하고 싶습니다.

이 프로토콜을 시작하기 전에, 당신은 384 잘 플레이트 형식으로 저장하여 metagenomic 라이브러리가 필요합니다. 우리의 연구에서는, 우리는 파지 T1 방지 TransforMax EPI300 - T1 R E.와 함께 pCC1 복사 제어 fosmid 벡터를 사용 도서관 호스트 및 -80 ° C 11 시에 우리 접시 저장된 대장균 세포. 1. Metagenomic 도서관 플레이트의 복제 <ol><li> 37 라이브러리를 포함하는 서리를 없애다 플레이트는 ° C 약 20 분 동안, 또는 때까지 우물을 해동합니다. </li><li> 15 분 동안 로봇을 소독하기 위해 qPix2에 자외선 살균 기능을 사용합니다. </li><li> 500mL 시약 병에 100ug/mL에서 12.5ug/mL와 arabinose의 최종 농도에서 chloramphenicol와 LB의 국물을 준비합니다. 각각의 플레이트는 약 20mL를 사용, 플러스 죽은 볼륨 수 있도록 추가 50mL을 다할 것입니다. </li><li> 미디어 병은 멸균 튜브를 통해 매니폴드에 부착된와 당 제조 업체의 지침으로 qFill3를 설정합니다. 미디어의 적절한 금액을 위해 프로그램, 각 우물에 45uL 볼륨을 채우기 위해 그것을 설정합니다. </li><li> 미디어 다기관 각 핀에서 오는 볼 때까지 로봇의 퍼지 기능을 사용하여 튜브와 매니폴드의 공기를 정화. </li><li> qFill3를 사용하여 LB 미디어와 함께 접시에 원하는 번호를 입력합니다. 각 플레이트 채워 약 20 초 정도 걸립니다. </li><li> qPix2 로봇의 해당 영역으로 도서관 접시와 신선한 접시를로드합니다. 후면 욕조에서 2% Micro90, 중앙 목욕탕에 증류수를 autoclaved, 전면 욕조에서 80 % 에탄올, 적절한 시약으로 청소 목욕탕을 입력합니다. </li><li> qPix2의 &quot;복제&quot;프로그램을 사용합니다. 소프트웨어, 소스 접시와 목적지 플레이트의 적절한 머리 숫자와 유형을 선택합니다. 또한 각 욕탕에 일반적으로 복제, 6주기 사이의 청소 머리를 설정하는 것만으로 충분합니다. 기계의 용량은 한 번에 10 접시이며, 그것은 384 핀 헤드 (또는 96 핀 머리로 약 50 분)와 함께 그들 모두를 복제하기 위해 약 15 분 정도 소요됩니다. 참고 : &quot;대상을 흔들어&quot; &quot;소스를 저어&quot;또는 수있는 옵션이 있습니다. 그것은 문제가 이전에 우리의 로봇을 이용하여 발생한 이러한 옵션을 사용하지 않는 것이 좋습니다. </li><li> 접시가 복제되면, 습도 상자에 24 시간 동안 37 ° C에서 접시를 성장. 우리가 arabinose를 추가로 fosmid 높은 사본 번호를 유도하기 때문에, 클론이 아닌 유발 클론보다 느리게 성장하는 경향이있다. -80 ° C.에 라이브러리 접시를 반환 참고 : 습도 상자에서 부화 미디어의 증발이 모든 우물을위한 균일한 환경을 유지, 접시의 가장자리에있는 우물에서 발생하지 않습니다 보장합니다. </li><li> 첫째 물 (~ 50mL) 후 80 % 에탄올 (~ 50mL)로 정화하여 qFill3 로봇을 청소하십시오. 구성 요소를 분해하고, 알루미늄 호일에 싸서 병, 뚜껑, 그리고 튜브를 청소하고 압력솥. </li></ol> 2. E.의 성장을 측정 콜리 클론 <ol><li> 37 ° C 배양기에서 접시를 제거합니다. 제거하고 최대 25 접시의 최대, RapidStak와 함께 제공되는 잡지 로딩 플랫폼에 뚜껑, 장소 플레이트를 별도로 설정할 수 있습니다. 참고 : 스택의 맨 아래에있는 접시를 읽을 수있는 첫 번째 것입니다. 소프트웨어가이 기록하지 않는 한, 접시의 순서를 추적해야합니다. </li><li> 신속한 Stak 한 잡지를 제거 그것이 비어 있도록하고, 읽을 수 접시의 스택에 밀어. 핸들에 의해 그것을 잡아, 접시는 모두 잡지에로드해야합니다. RapidStak에 잡지를로드합니다. 참고 : 잡지는 접시의 A1 우물 가야하는 코너 나타내는 모서리에있는 작은 나사를하고 있습니다. 이 잡지는 한 방향 RapidStak에 마운트됩니다. </li><li> 기계에 연결된 컴퓨터에있는 SkanIt의 RE 프로그램을 엽니다. &quot;새 세션&quot;을 선택하고 적절하게 그것을 이름을 지정합니다. 플레이트 형식으로 &quot;코닝 플랫 바텀 384 잘 플레이트&quot;를 선택합니다. </li><li> &quot;플레이트 레이아웃&quot;영역에서 &quot;마법사&quot;버튼을 선택하고, 접시에 384 지문을 추가로 선택합니다. </li><li> &quot;프로토콜&quot;영역에서 &quot;음 루프&quot;옵션을 선택하고, 384 우물에 대한 입력합니다. &quot;글쎄 루프&quot;아이콘이 화면의 왼쪽에있는 흐름 - 트리에 나타납니다. 아이콘을 선택하고 &quot;광도계의 측정&quot;를 추가합니다. 600nm에서 읽을 수를 설정합니다. </li><li> 고유한 이름으로 프로토콜을 저장하고 SkanIt RE 프로그램을 닫습니다. </li><li> 컴퓨터에서 PolaraRS 프로그램을 엽니다. </li><li> 메인 페이지에 RapidStak 장치에 연결된 악기를 목록 테이블이있을 것입니다. VarioSkan이 테이블의 왼쪽에 있어야합니다. VarioSkan 제목 아래 두 개의 링크가있을 것입니다, &quot;RunSession&quot;및 &quot;부화&quot;. &quot;RunSession&quot;옵션을 클릭합니다. </li><li> 새 창에서, 분석 창, 중간에 순서로 나타납니다. &quot;RunSession&quot;항목을 (이것은 유일한 항목 존재한다)를 선택합니다. 화면의 우측 드롭 다운 메뉴에서나타납니다. 이 메뉴에서 실행 저장된 SkanIt의 RE의 이름을 찾으십시오. 참고 :이 메뉴에는 합리적인 순서는 없어 보입니다. 그것은 알파벳 아니라, 또는 날짜에 의해 추가, 또는 컴퓨터의 프로토콜이 저장된 위치를 관련. 이것은 고통이다 자신을 찾는하기 전에 모든 프로토콜을 통해 보여야. </li><li> 일단 오른쪽 상단 모서리에있는 당신의 프로토콜을 선택 &quot;이 분석을 실행&quot;을 클릭하십시오. </li><li> 상자의 소스로 사용할 수있는 잡지를 나타내는 당신을 묻는 팝업 것이며, 어떤 잡지가 비어 있습니다. 화면의 하단 상자는 전면 잡지에 해당합니다. [옵션 : 그것이 걸릴 것이다 시간의 금액에 대한 견적을 결정하기 위해 로드된 접시의 숫자를 입력 해주기를 부탁합니다. 이 예측은 일반적으로 기울어져 있습니다.] </li><li> RapidStak과 VarioSkan 모두 켜져 있는지 확인하고, &quot;OK&quot;를 누릅니다. </li><li> RapidStak 자동으로 접시의 지속적인 측정을 위해 수 있도록 플레이트 판독기에 번호판을로드합니다. 25 접시를 읽으려면 대략 50 분 걸립니다. 참고 :이 기계의 적절한 정렬을 보장하기 위해 VarioSkan에 첫 번째 판 로딩을 관찰하는 것이 좋습니다. RapidStak이 플레이트 리더를 제대로로드되지 않는 경우 PolaraRS 윈도우의 오른쪽 상단 모서리에있는 &quot;일시 중지이 분석&quot;버튼을 사용합니다. </li><li> VarioSkan 모든 접시를 읽는 완료되면 전체 잡지를 제거하고 잡지 로딩 플랫폼에 놓으십시오. 플랫폼의 바깥쪽 사각형을 올려, 그리고 잡지 중간에 더미 서 번호판을 떠나, 밀어해야합니다. 해당 접시에 뚜껑을 교체하십시오. </li></ol> 3. 각 플레이트에 분석 믹스 추가 <ol><li> 산도 5.5에서 50mM 칼륨 아세테이트 버퍼에 용해 혼합의 premade 10X 주식 (10 % 트리톤 X - 100, 100mM RIS, 10mM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산))를 사용하여 분석 믹스를 준비합니다. 기판이 완전히 해소되어 있는지 확인하고, DMSO에 75mg/mL DNP - cellobioside 기판 최대의 재고를 준비합니다. 검정 믹스에 0.1mg/mL의 최종 농도 DNP - cellobioside 주식 솔루션을 추가합니다. 각 판은 솔루션의 약 20mL를 사용하여, 플러스 죽은 볼륨 수 있도록 추가 50mL을 다할 것입니다. 참고 : DNP - Cellobioside은 용해도가 증가하므로 DMSO에 용해, 물에 쉽게 용해되지 않습니다. 최종 분석 솔루션에서 DMSO의 존재는 눈에 띄는 효과가 없습니다. </li><li> 미디어 병은 멸균 튜브를 통해 매니폴드에 부착된와 당 제조 업체의 지침으로 qFill3를 설정합니다. 미디어의 적절한 금액을 위해 프로그램, 각 우물에 45uL 볼륨을 채우기 위해 그것을 설정합니다. </li><li> 미디어 다기관 각 핀에서 오는 볼 때까지 로봇의 퍼지 기능을 사용하여 튜브와 매니폴드의 공기를 정화. </li><li> qFill3를 사용하여 각 플레이트에 분석 믹스를 추가합니다. 각 플레이트 채워 약 20 초 정도 걸립니다. </li><li> 검정 혼합이 추가되면 37 번호판을 품어 ° C를 습도 상자에 12-16시간하십시오. 참고 : 분석 믹스 한 접시 이상의 - 부화가 추가하면 내부 우물을 보지보다 높은 흡광도 수치를 항복, 접시의 바깥쪽 우물의 증발을 일으킬 것입니다. 이것은 습도 챔버에서 번호판을 잠복기로 상쇄 수 있습니다. </li></ol> 4. Assayed 클론 읽기 흡광도 <ol><li> 37 ° C 배양기에서 접시를 제거합니다. 제거하고 최대 25 접시의 최대, RapidStak와 함께 제공되는 잡지 로딩 플랫폼에 뚜껑, 장소 플레이트를 별도로 설정할 수 있습니다. 참고 : 스택의 맨 아래에있는 접시를 읽을 수있는 첫 번째 것입니다. 소프트웨어가이 기록하지 않는 한, 접시의 순서를 추적해야합니다. </li><li> 신속한 Stak 한 잡지를 제거 그것이 비어 있도록하고, 읽을 수 접시의 스택에 밀어. 핸들에 의해 그것을 잡아, 접시는 모두 잡지에로드해야합니다. RapidStak에 잡지를로드합니다. 참고 : 잡지는 접시의 A1 우물 가야하는 코너 나타내는 모서리에있는 작은 나사를하고 있습니다. 이 잡지는 한 방향 RapidStak에 마운트됩니다. </li><li> 기계에 연결된 컴퓨터에있는 SkanIt의 RE 프로그램을 엽니다. &quot;새 세션&quot;을 선택하고 적절하게 그것을 이름을 지정합니다. 플레이트 형식으로 &quot;코닝 플랫 바텀 384 잘 플레이트&quot;를 선택합니다. </li><li> &quot;플레이트 레이아웃&quot;영역에서 &quot;마법사&quot;버튼을 선택하고, 접시에 384 지문을 추가로 선택합니다. </li><li> &quot;프로토콜&quot;영역에서 &quot;음 루프&quot;옵션을 선택하고, 384 우물에 대한 입력합니다. &quot;글쎄 루프&quot;아이콘이 화면의 왼쪽에있는 흐름 - 트리에 나타납니다. 아이콘을 선택하고 &quot;광도계의 측정&quot;를 추가합니다. 400nm에서 읽을 수를 설정합니다. </li><li> 고유한 이름으로 프로토콜을 저장하고 SkanIt RE 프로그램을 닫습니다. </li><li> 컴퓨터에서 PolaraRS 프로그램을 엽니다. </li><li> 메인 페이지에 RapidStak 장치에 연결된 악기를 목록 테이블이있을 것입니다. VarioSkan이 테이블의 왼쪽에 있어야합니다. VarioSkan 제목 아래 두 개의 링크가있을 것입니다, &quot;RunSession&quot;와 &quot;IncubatE &quot;. 클릭하여&quot;RunSession &quot;옵션을. </li><li> 새 창에서, 분석 창, 중간에 순서로 나타납니다. &quot;RunSession&quot;항목을 (이것은 유일한 항목 존재한다)를 선택합니다. 화면의 오른쪽에있는 드롭 다운 메뉴가 나타납니다. 이 메뉴에서 실행 저장된 SkanIt의 RE의 이름을 찾으십시오. </li><li> 일단 오른쪽 상단 모서리에있는 당신의 프로토콜을 선택 &quot;이 분석을 실행&quot;을 클릭하십시오. </li><li> 상자의 소스로 사용할 수있는 잡지를 나타내는 당신을 묻는 팝업 것이며, 어떤 잡지가 비어 있습니다. 화면의 하단 상자는 전면 잡지에 해당합니다. [옵션 : 그것이 걸릴 것이다 시간의 금액에 대한 견적을 결정하기 위해 로드된 접시의 숫자를 입력 해주기를 부탁합니다. 이 예측은 일반적으로 기울어져 있습니다.] </li><li> RapidStak과 VarioSkan 모두 켜져 있는지 확인하고, &quot;OK&quot;를 누르십시오 </li><li> RapidStak 자동으로 접시의 지속적인 측정을 위해 수 있도록 플레이트 판독기에 번호판을로드합니다. 참고 :이 기계의 적절한 정렬을 보장하기 위해 VarioSkan에 첫 번째 판 로딩을 관찰하는 것이 좋습니다. RapidStak이 플레이트 리더를 제대로로드되지 않는 경우 PolaraRS 윈도우의 오른쪽 상단 모서리에있는 &quot;일시 중지이 분석&quot;버튼을 사용합니다. </li><li> VarioSkan 모든 접시를 읽는 완료되면 전체 잡지를 제거하고 잡지 로딩 플랫폼에 놓으십시오. 플랫폼의 바깥쪽 사각형을 올려, 그리고 잡지 중간에 더미 서 번호판을 떠나, 밀어해야합니다. 접시는 실험실 절차에 따라 폐기하실 수 있습니다. </li><li> 흡광도 수치를 열고 SkanIt의 RE 소프트웨어를 수출하고 &quot;기존 파일을 엽니다&quot;를 선택합니다. </li><li> 귀하의 세션을 저장한 디렉토리를 선택, 목록을 확장하고 제목 제목 아래 접시의 숫자에 따라 &quot;컨테이너 N&quot;를 &quot;컨테이너 1&quot;표시 옵션가 될 &quot;+&quot;아이콘을 누르십시오. 분석을 가장 먼저 접시를 선택합니다. </li><li> 페이지 상단의 메뉴 표시줄에서 &quot;데이터 처리&gt; 보고서 / 내보내기&quot;를 선택 </li><li> 수출 원하는 옵션을 선택합니다. 참고 : 나는 일반적으로 &quot;플레이트 레이아웃&quot;을 선택하고 수출에 대해 &quot;광도계의 &#39;데이터입니다. </li><li> &#39;리포트보기&#39;그리고 &#39;파일&gt; 저장&#39;을 클릭합니다. 원하는 디렉토리를 선택합니다. 출력 형식은 Microsoft Excel 스프레드 시트입니다 </li></ol> 5. 대표 결과 긍정적인 복제를 포함하는 하나의 384 잘 접시에서 흡광도 수치의 예제는 그림 2에 표시됩니다. 긍정적인 클론 cellulase 활동을 표현되지 않은 이상 흡광도에 표시된 증가 보여줍니다. 분석 시간의 차이, 접시에 잘 위치, 또는 DNP의 농도는 (해제 해산 DNP을 필터링하여 도입있을 수 있습니다) 절대 흡광도 수치에 영향을 줄 수 있습니다. 같은 플레이트 평균 또는 평균 이상 열 흡광도의 차이로 상대 흡광도 수치가, cellulase 긍정적인 클론을 식별하는보다 강력한 방법입니다. 도서관 접시에서 긍정적인 클론의 확인에 따라, 그것은 차 검사에 대한 새 접시에 모두 긍정적인 클론을 복제하는 것이 좋습니다. 이것은 잘 위치 또는 판 변형으로 인한 효과를 제거하고 긍정적인 클론 사이에 더 직접적인 비교를위한 수 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/2461/2461fig1.jpg" alt="그림 1" /> 그림 1. metagenomic 도서관에 대한 높은 처리량 분석의 플로우 차트는 E.으로 복제 대장균과 -80에 저장된 ° C. <img src="/files/ftp_upload/2461/2461fig2.jpg" alt="그림 2" /> 그림 2. 흡광도 수치가 긍정적인 복제를 포함 한 384 잘 접시에서. Cellulase 긍정적인 클론은 부정적인 클론 이상 크게 증가 흡광도에서 확인할 수 있습니다.

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관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

대형 삽입 게놈의 DNA의 metagenomic 라이브러리에서 cellulolytic 활동의 신속한 검출을위한 높은 처리량 화면 E.으로 표현 대장균이 프로토콜에 설명되어 있습니다. 이 방법은 일반적으로 문학에 사용되는 CMC / 콩고 레드 분석을 통해 개선이다. 이 솔루션을 기반으로하고, 정량 분석​​을 위해 허용하는 플레이트 판독기에서 흡광도 수치로 최종 출력으로 384 잘 접시에 한 냄비 화학 검사 ?...

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>qPix2</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Genetix</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>With 384-pin gridding head</td>
</tr>
<tr>
<td>qFill3</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Genetix</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>With 384-well manifold</td>
</tr>
<tr>
<td>Varioskan</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo-Fisher</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>RapidStak</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo-Fisher</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Connected to Varioskan</td>
</tr>
<tr>
<td>Micro90 Detergent</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cole-Parmer</td>
<td>18100-00</td>
<td>Diluted to 2% in water</td>
</tr>
<tr>
<td>Ethanol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Major Lab Supplier</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Diluted to 80% in water</td>
</tr>
<tr>
<td>Chloramphenicol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>C0378</td>
<td>12.5mg/mL in ethanol</td>
</tr>
<tr>
<td>LB broth, Miller</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>BP1426-2</td>
<td>25g/L, autoclaved</td>
</tr>
<tr>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>384-well flat bottom plates</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Corning</td>
<td>3680</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L-(+)-Arabinose</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>A3256</td>
<td>100mg/mL in water</td>
</tr>
<tr>
<td>Potassium Acetate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>P171</td>
<td>50mM in water, autoclaved, adjusted to pH 5.5 with HCl</td>
</tr>
<tr>
<td>Triton X-100</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>BP151</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Trizma hydrochloride</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>T3253</td>
<td>In TE buffer solution, 100mM</td>
</tr>
<tr>
<td>EDTA disodium salt</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>E5134</td>
<td>In TE buffer solution, 10mM</td>
</tr>
<tr>
<td>2,4-dinitrophenyl cellobioside</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Provided by Dr. Steve Withers, UBC</td>
</tr>
<tr>
<td>Dimethyl Sulfoxide</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>D8418</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

a high throughput screen for biomining cellulase activity from metagenomic libraries

셀룰로스, 지구상의 유기 탄소의 가장 풍부한 원천은, 생물 연료 생산 1 증가 중심으로 광범위한 산업 애플 리케이션을했다. 셀룰로스를 수정하거나 저하에 화학 방법은 일반적으로 강한 지방산과 높은 온도를 필요로합니다. 따라서, 효소 방법은 bioconversion 과정에서 두드러진되고 있습니다. 박테리아와 곰팡이 격리에서 Active cellulases의 식별은 다소 효과가있다지만, 자연 미생물의 대부분은 실험 재배에 저항. 또한 metagenomic, 심사 방식으로 알려진 환경 게놈은 소설 bioconversion 효소에 대한 검색 재배 격차를 브리징 큰 약속을했습니다. 토양 2, 버팔로 제일위 3 콩고 레드 염료 (테더와 우드 5 방법에 따라) 물들일 흰개미 뒷다리 - 직감 4 사용 carboxymethylcellulose (CMC) 한천 플레이트와 같은 다양한으로 Metagenomic 심사 방식이 성공적으로 환경에서 소설 cellulases를 발견했습니다. 그러나, CMC 메서드가 처리량 제한됩니다, 양적되지 않고 잡음 비율 6 낮은 신호를 승객 명단. 다른 방법은 7,8를보고 있지만 각 사용 대형 삽입 게놈 라이브러리의 높은 처리량 검사 바람직하지는 한천 플레이트 기반의 분석.했습니다 여기서 우리는 솔루션을 기반 chromogenic dinitrophenol (DNP) cellobioside 기판 9를 사용 cellulase 활동에 대한 화면을 제시한다. 우리 도서관은 복사 번호 유도 열을 통해 분석 감도를 높이기 위해 fosmid pCC1 복사 제어에 복제되었습니다. 방법은 흡광도 측정으로 제공되는 최종 판독과 함께 384 잘 microplates에 한 냄비 화학을 사용합니다. 이 저장되어 첨부 스태킹 시스템으로 액체 처리기 및 플레이트 판독기를 사용하여 하루에 100X 384 잘 접시 최대의 처리량과 양적 민감하고 자동으로 진행됩니다.

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A High Throughput Screen for Biomining Cellulase Activity from Metagenomic Libraries

이 프로토콜은 대장균의 표현 metagenomic 도서관에서 cellulolytic 활동에 높은 처리량 화면을 설명합니다. 화면이 솔루션을 기반으로하고 고도의 자​​동화, 그리고 흡광도 측정으로 최종 판독과 384 잘 microplates에 한 냄비 화학을 사용합니다.

Metagenomic 도서관에서 Cellulase 활동 Biomining에 대해 높은 처리량 화면

Cellulose, the most abundant source of organic carbon on the planet, has wide-ranging industrial applications with increasing emphasis on biofuel ...

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Research

JoVE Journal

Biology

15.0K 조회수.  University of British Columbia - UBC. 이 프로토콜은 대장균의 표현 metagenomic 도서관에서 cellulolytic 활동에 높은 처리량 화면을 설명합니다. 화면이 솔루션을 기반으로하고 고도의 자​​동화, 그리고 흡광도 측정으로 최종 판독과 384 잘 microplates에 한 냄비 화학을 사용합니다.

비디오: A High Throughput Screen for Biomining Cellulase Activity from Metagenomic Libraries

Large-Scale Screens of Metagenomic Libraries

Metagenomic libraries archive large fragments of contiguous genomic sequences from microorganisms without requiring prior cultivation. Generating a streamlined procedure for creating and screening metagenomic libraries is therefore useful for efficient high-throughput investigations into the genetic and metabolic properties of uncultured microbial assemblages. Here, key protocols are presented on video, which we propose is the most useful format for accurately describing a long process that alternately depends on robotic instrumentation and (human) manual interventions. First, we employed robotics to spot library clones onto high-density macroarray membranes, each of which can contain duplicate colonies from twenty-four 384-well library plates. Automation is essential for this procedure not only for accuracy and speed, but also due to the miniaturization of scale required to fit the large number of library clones into highly dense spatial arrangements. Once generated, we next demonstrated how the macroarray membranes can be screened for genes of interest using modified versions of standard protocols for probe labeling, membrane hybridization, and signal detection. We complemented the visual demonstration of these procedures with detailed written descriptions of the steps involved and the materials required, all of which are available online alongside the video.

Metagenomic 도서관 대규모 화면

Metagenomic libraries archive large fragments of contiguous genomic sequences from microorganisms without requiring prior cultivation.  Generating a ...

연구

생물학

High-throughput Yeast Plasmid Overexpression Screen

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a powerful model system for defining fundamental mechanisms of many important cellular processes, including those with direct relevance to human disease. Because of its short generation time and well-characterized genome, a major experimental advantage of the yeast model system is the ability to perform genetic screens to identify genes and pathways that are involved in a given process. Over the last thirty years such genetic screens have been used to elucidate the cell cycle, secretory pathway, and many more highly conserved aspects of eukaryotic cell biology 1-5. In the last few years, several genomewide libraries of yeast strains and plasmids have been generated 6-10. These collections now allow for the systematic interrogation of gene function using gain- and loss-of-function approaches 11-16. Here we provide a detailed protocol for the use of a high-throughput yeast transformation protocol with a liquid handling robot to perform a plasmid overexpression screen, using an arrayed library of 5,500 yeast plasmids. We have been using these screens to identify genetic modifiers of toxicity associated with the accumulation of aggregation-prone human neurodegenerative disease proteins. The methods presented here are readily adaptable to the study of other cellular phenotypes of interest.

Here we describe a plasmid overexpression screen in Saccharomyces cerevisiae, using an arrayed plasmid library and a high-throughput yeast transformation protocol with a liquid handling robot.

높은 처리량 효모 플라스미드 Overexpression 화면

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a powerful model system for defining fundamental mechanisms of many important cellular processes, ...

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted into fuel alcohols1. The potential for enzymatic hydrolysis of cellulosic biomass to provide renewable energy has intensified efforts to engineer cellulases for economical fuel production2. Of particular interest are fungal cellulases3-8, which are already being used industrially for foods and textiles processing.
Identifying active variants among a library of mutant cellulases is critical to the engineering process; active mutants can be further tested for improved properties and/or subjected to additional mutagenesis. Efficient engineering of fungal cellulases has been hampered by a lack of genetic tools for native organisms and by difficulties in expressing the enzymes in heterologous hosts. Recently, Morikawa and coworkers developed a method for expressing in E. coli the catalytic domains of endoglucanases from H. jecorina3,9, an important industrial fungus with the capacity to secrete cellulases in large quantities. Functional E. coli expression has also been reported for cellulases from other fungi, including Macrophomina phaseolina10 and Phanerochaete chrysosporium11-12. 
We present a method for high throughput screening of fungal endoglucanase activity in E. coli. (Fig 1) This method uses the common microbial dye Congo Red (CR) to visualize enzymatic degradation of carboxymethyl cellulose (CMC) by cells growing on solid medium. The activity assay requires inexpensive reagents, minimal manipulation, and gives unambiguous results as zones of degradation (&#x201C;halos&#x201D;) at the colony site. Although a quantitative measure of enzymatic activity cannot be determined by this method, we have found that halo size correlates with total enzymatic activity in the cell. Further characterization of individual positive clones will determine , relative protein fitness. 
Traditional bacterial whole cell CMC/CR activity assays13 involve pouring agar containing CMC onto colonies, which is subject to cross-contamination, or incubating cultures in CMC agar wells, which is less amenable to large-scale experimentation. Here we report an improved protocol that modifies existing wash methods14 for cellulase activity: cells grown on CMC agar plates are removed prior to CR staining. Our protocol significantly reduces cross-contamination and is highly scalable, allowing the rapid screening of thousands of clones. In addition to H. jecorina enzymes, we have expressed and screened endoglucanase variants from the Thermoascus aurantiacus and Penicillium decumbens (shown in Figure 2), suggesting that this protocol is applicable to enzymes from a range of organisms.

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

We describe a low cost, high throughput method to screen for fungal endoglucanase activity in E. coli. The method relies on a simple visual readout of substrate degradation, does not require enzyme purification, and is highly scalable. This allows for the rapid screening of large libraries of enzyme variants.

에서 곰팡이 Endoglucanase 활동의 높은 처리량 검사 대장균</em

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted ...

High-throughput Saccharification Assay for Lignocellulosic Materials

Polysaccharides that make up plant lignocellulosic biomass can be broken down to produce a range of sugars that subsequently can be 
used in establishing a biorefinery. These raw materials would constitute a new industrial platform, which is both sustainable and carbon neutral, to replace 
the current dependency on fossil fuel. The recalcitrance to deconstruction observed in lignocellulosic materials is produced by several intrinsic properties 
of plant cell walls. Crystalline cellulose is embedded in matrix polysaccharides such as xylans and arabinoxylans, and the whole structure is encased by the 
phenolic polymer lignin, that is also difficult to digest 1. In order to improve the digestibility of plant materials we need to discover the main bottlenecks 
for the saccharification of cell walls and also screen mutant and breeding populations to evaluate the variability in saccharification 2. These tasks require 
a high throughput approach and here we present an analytical platform that can perform saccharification analysis in a 96-well plate format. This platform has 
been developed to allow the screening of lignocellulose digestibility of large populations from varied plant species. We have scaled down the reaction volumes 
for gentle pretreatment, partial enzymatic hydrolysis and sugar determination, to allow large numbers to be assessed rapidly in an automated system.
This automated platform works with milligram amounts of biomass, performing ball milling under controlled conditions to reduce the plant 
materials to a standardised particle size in a reproducible manner. Once the samples are ground, the automated formatting robot dispenses specified and recorded 
amounts of material into the corresponding wells of 96 deep well plate (Figure 1). Normally, we dispense the same material into 4 wells to have 4 replicates for 
analysis. Once the plates are filled with the plant material in the desired layout, they are manually moved to a liquid handling station (Figure 2). In this 
station the samples are subjected to a mild pretreatment with either dilute acid or alkaline and incubated at temperatures of up to 90&deg;C. The pretreatment solution 
is subsequently removed and the samples are rinsed with buffer to return them to a suitable pH for hydrolysis. The samples are then incubated with an enzyme
mixture for a variable length of time at 50&deg;C. An aliquot is taken from the hydrolyzate and the reducing sugars are automatically determined by the MBTH 
colorimetric method.

A simple, rapid method for determining the saccharification potential of large numbers of plant biomass samples is described. The automated platform for this analysis involves the preparation of the plant biomass for analysis in 96 well plates and the subsequent performance of pretreatment, hydrolysis and quantification of the sugars released.

리그노셀룰로오스성 자료에 대한 높은 처리량 당화 분석

Polysaccharides that make up plant lignocellulosic biomass can be broken down to produce a range of sugars that subsequently can be 
used in establishing ...

Single Read and Paired End mRNA-Seq Illumina Libraries from 10 Nanograms Total RNA

Whole transcriptome sequencing by mRNA-Seq is now used extensively to perform global gene expression, mutation, allele-specific expression and other genome-wide analyses. mRNA-Seq even opens the gate for gene expression analysis of non-sequenced genomes. mRNA-Seq offers high sensitivity, a large dynamic range and allows measurement of transcript copy numbers in a sample. Illumina&#x2019;s genome analyzer performs sequencing of a large number (&gt; 107) of relatively short sequence reads (&lt; 150 bp).The &quot;paired end&quot; approach, wherein a single long read is sequenced at both its ends, allows for tracking alternate splice junctions, insertions and deletions, and is useful for de novo transcriptome assembly.
One of the major challenges faced by researchers is a limited amount of starting material. For example, in experiments where cells are harvested by laser micro-dissection, available starting total RNA may measure in nanograms. Preparation of mRNA-Seq libraries from such samples have been described1, 2 but involves significant PCR amplification that may introduce bias. Other RNA-Seq library construction procedures with minimal PCR amplification have been published3, 4 but require microgram amounts of starting total RNA.
Here we describe a protocol for the Illumina Genome Analyzer II platform for mRNA-Seq sequencing for library preparation that avoids significant PCR amplification and requires only 10 nanograms of total RNA. While this protocol has been described previously and validated for single-end sequencing5, where it was shown to produce directional libraries without introducing significant amplification bias, here we validate it further for use as a paired end protocol. We selectively amplify polyadenylated messenger RNAs from starting total RNA using the T7 based Eberwine linear amplification method, coined &quot;T7LA&quot; (T7 linear amplification). The amplified poly-A mRNAs are fragmented, reverse transcribed and adapter ligated to produce the final sequencing library. For both single read and paired end runs, sequences are mapped to the human transcriptome6 and normalized so that data from multiple runs can be compared. We report the gene expression measurement in units of transcripts per million (TPM), which is a superior measure to RPKM when comparing samples7.

Here we describe a method for preparation of both single read and paired end Illumina mRNA-Seq sequencing libraries for gene expression analysis based on T7 linear RNA amplification. This protocol requires only 10 nanograms of starting total RNA and generates highly consistent libraries representing whole transcripts.

10 나노 그램 총 RNA의 단일 읽기와 결합하여 최종 mRNA - Seq의 Illumina 도서관

Whole transcriptome sequencing by mRNA-Seq is now used extensively to perform global gene expression, mutation, allele-specific expression and other ...

High Throughput Microinjections of Sea Urchin Zygotes

Microinjection into cells and embryos is a common technique that is used to study a wide range of biological processes. In this method a small amount of treatment solution is loaded into a microinjection needle that is used to physically inject individual immobilized cells or embryos. Despite the need for initial training to perform this procedure for high-throughput delivery, microinjection offers maximum efficiency and reproducible delivery of a wide variety of treatment solutions (including complex mixtures of samples) into cells, eggs or embryos. Applications to microinjections include delivery of DNA constructs, mRNAs, recombinant proteins, gain of function, and loss of function reagents. Fluorescent or colorimetric dye is added to the injected solution to enable instant visualization of efficient delivery as well as a tool for reliable normalization of the amount of the delivered solution. The described method enables microinjection of 100-400 sea urchin zygotes within 10-15 min.

Microinjection is a common technique used to deliver DNA constructs, mRNAs, morpholino antisense oligonucleotides or other treatments into eggs, embryos, and cells of various species.

성게 접합자의 높은 처리량 Microinjections

Microinjection into cells and embryos is a common technique that is used to study a wide range of biological processes. In this method a small amount of ...

A Manual Small Molecule Screen Approaching High-throughput Using Zebrafish Embryos

Zebrafish have become a widely used model organism to investigate the mechanisms that underlie developmental biology and to study human disease pathology due to their considerable degree of genetic conservation with humans. Chemical genetics entails testing the effect that small molecules have on a biological process and is becoming a popular translational research method to identify therapeutic compounds. Zebrafish are specifically appealing to use for chemical genetics because of their ability to produce large clutches of transparent embryos, which are externally fertilized. Furthermore, zebrafish embryos can be easily drug treated by the simple addition of a compound to the embryo media. Using whole-mount in situ hybridization (WISH), mRNA expression can be clearly visualized within zebrafish embryos. Together, using chemical genetics and WISH, the zebrafish becomes a potent whole organism context in which to determine the cellular and physiological effects of small molecules. Innovative advances have been made in technologies that utilize machine-based screening procedures, however for many labs such options are not accessible or remain cost-prohibitive. The protocol described here explains how to execute a manual high-throughput chemical genetic screen that requires basic resources and can be accomplished by a single individual or small team in an efficient period of time. Thus, this protocol provides a feasible strategy that can be implemented by research groups to perform chemical genetics in zebrafish, which can be useful for gaining fundamental insights into developmental processes, disease mechanisms, and to identify novel compounds and signaling pathways that have medically relevant applications.

The zebrafish is an excellent experimental organism to study vertebrate developmental processes and model human disease. Here, we describe a protocol on how to perform a manual high-throughput chemical screen in zebrafish embryos with a whole-mount in situ hybridization (WISH) read-out.

Zebrafish의 배아를 사용하여 높은 처리량 접근 수동 작은 분자 화면

Zebrafish have become a widely used model organism to investigate the mechanisms that underlie developmental biology and to study human disease pathology ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays focus on transcriptional regulation, being essentially aimed at the identification of promoter-targeting molecules. As a result, post-transcriptional mechanisms are largely uncovered by gene expression targeted drug development. Here we describe a cell-based assay aimed at investigating the role of the 3&#39; untranslated region (3&#8217; UTR) in the modulation of the fate of its mRNA, and at identifying compounds able to modify it. The assay is based on the use of a luciferase reporter construct containing the 3&#8217; UTR of a gene of interest stably integrated into a disease-relevant cell line. The protocol is divided into two parts, with the initial focus on the primary screening aimed at the identification of molecules affecting luciferase activity after 24 hr of treatment. The second part of the protocol describes the counter-screening necessary to discriminate compounds modulating luciferase activity specifically through the 3&#8217; UTR. In addition to the detailed protocol and representative results, we provide important considerations about the assay development and the validation of the hit(s) on the endogenous target. The described cell-based reporter gene assay will allow scientists to identify molecules modulating protein levels via post-transcriptional mechanisms dependent on a 3&#8217; UTR.

Here we describe a cell-based reporter gene assay as a valuable tool to screen chemical libraries for compounds modulating post-transcriptional control mechanisms exerted through 3&#8217; UTR.

후 전사적으로 규제 유전자의 화학 변조기에 대한 높은 처리량 검사

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

qPCRTag Analysis - A High Throughput, Real Time PCR Assay for Sc2.0 Genotyping

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic chromosome, synIII1, and one synthetic chromosome arm, synIXR2, have been constructed and their in vivo function validated in the absence of the corresponding wild type chromosomes. An important design feature of Sc2.0 chromosomes is the introduction of PCRTags, which are short, re-coded sequences within open reading frames (ORFs) that enable differentiation of synthetic chromosomes from their wild type counterparts. PCRTag primers anneal selectively to either synthetic or wild type chromosomes and the presence/absence of each type of DNA can be tested using a simple PCR assay. The standard readout of the PCRTag assay is to assess presence/absence of amplicons by agarose gel electrophoresis. However, with an average PCRTag amplicon density of one per 1.5 kb and a genome size of ~12 Mb, the completed Sc2.0 genome will encode roughly 8,000 PCRTags. To improve throughput, we have developed a real time PCR-based detection assay for PCRTag genotyping that we call qPCRTag analysis. The workflow specifies 500 nl reactions in a 1,536 multiwell plate, allowing us to test up to 768 PCRTags with both synthetic and wild type primer pairs in a single experiment.

Designer chromosomes of the Synthetic Yeast Genome project, Sc2.0, can be distinguished from their native counterparts using a PCR-based genotyping assay called PCRTagging, which has a presence/absence endpoint. Here we describe a high-throughput real time PCR detection method for PCRTag genotyping.

qPCRTag 분석 - 높은 처리량, Sc2.0 유전형에 대한 실시간 PCR 분석

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic ...

A Protocol for Functional Assessment of Whole-Protein Saturation Mutagenesis Libraries Utilizing High-Throughput Sequencing

Site-directed mutagenesis has long been used as a method to interrogate protein structure, function and evolution. Recent advances in massively-parallel sequencing technology have opened up the possibility of assessing the functional or fitness effects of large numbers of mutations simultaneously. Here, we present a protocol for experimentally determining the effects of all possible single amino acid mutations in a protein of interest utilizing high-throughput sequencing technology, using the 263 amino acid antibiotic resistance enzyme TEM-1 &#946;-lactamase as an example. In this approach, a whole-protein saturation mutagenesis library is constructed by site-directed mutagenic PCR, randomizing each position individually to all possible amino acids. The library is then transformed into bacteria, and selected for the ability to confer resistance to &#946;-lactam antibiotics. The fitness effect of each mutation is then determined by deep sequencing of the library before and after selection. Importantly, this protocol introduces methods which maximize sequencing read depth and permit the simultaneous selection of the entire mutation library, by mixing adjacent positions into groups of length accommodated by high-throughput sequencing read length and utilizing orthogonal primers to barcode each group. Representative results using this protocol are provided by assessing the fitness effects of all single amino acid mutations in TEM-1 at a clinically relevant dosage of ampicillin. The method should be easily extendable to other proteins for which a high-throughput selection assay is in place.

We present a protocol for the functional assessment of comprehensive single-site saturation mutagenesis libraries of proteins utilizing high-throughput sequencing. Importantly, this approach uses orthogonal primer pairs to multiplex library construction and sequencing. Representative results using TEM-1 &#946;-lactamase selected at a clinically relevant dosage of ampicillin are provided.

높은 처리량 시퀀싱을 활용하여 전체 - 단백질 포화 돌연변이 유발 도서관의 기능 평가를위한 프로토콜

Site-directed mutagenesis has long been used as a method to interrogate protein structure, function and evolution. Recent advances in massively-parallel ...