Name: analysis of dna double-strand break (dsb) repair in mammalian cells
Uploaded: 2010-09-08T17:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 10 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of DNA Double-strand Break DSB Repair in Mammalian Cells at JoVE.com

המקורי GFP-Pem1 היה מתנה ד&quot;ר Li Lei. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מ-NIH ו הרפואי אליסון קרן אל VG ו AS

בפרוטוקול זה אנו מתארים את שיטת ניתוח לתיקון DSB-DNA משולב עם הכתב chromosomally בונה 1,2 שבו DSBs הם המושרה in vivo על ידי ביטוי חולף endonuclease חיתוך נדיר I-SCEI 3. Assay משולב מספק את היתרונות של ניתוח לתיקון DSB בהקשר כרומוזומליות. עם זאת, פרוטוקול זה מחייב תא passaging ממושך, אשר עשוי להיות בעייתי כאשר עובדים עם תאים ראשוניים. גישה חלופית היא assay extrachromosomal שבו בונה כתב מתעכלים במבחנה עם I-SCEI או endonucleases HindIII ואז transfected לתוך התאים כמו DNA ליניארי. פרוטוקול assay exctrachromosomal 4 דומה assay המשולב המתואר להלן בשינויים הבאים. עבור assay extrachromosomal להשמיט את האינטגרציה של בונה כתב ובמקום שיתוף transfect התאים עם 0.5 מיקרוגרם של הכתב NHEJ פלסמיד לינארית במבחנה עם I-SCEI או HindIII ו 0.1 מיקרוגרם של pDsRed2-N1 כמו שליטה transfection. עבור assay משאבי אנוש שיתוף transfect 2 HR מיקרוגרם כתב פלסמיד לינארית עם I-SCEI או HindIII ו 0.1 מיקרוגרם pDsRed2-N1. נתח את התאים על ידי FACS שלושה ימים לאחר transfection. Assay extrachromosomal מאפשר ניתוח של תיקון DSB ב מבודד העיקרי, הימנעות תא נרחב passaging, והקלה על ניתוח של שורות תאים מרובים. 1. כתב בונה עבור NHEJ ו HR קלטת כתב NHEJ 5 מכיל את הגן GFP עם מהונדסים 3 kb אינטרון מן הגן Pem1 (GFP-Pem1). אינטרון Pem1 מכיל אקסון adenoviral מוקף רצפי הכרה endonucleases HindIII ואני-SCEI (איור 1 א) לזירוז של DSBs. I-SCEI האתרים בכיוון הפוך. I-SCEI יש רצף הכרה nonpalindromic, ומכאן שני אתרים הפוכה ליצור קצוות דנ&quot;א תואם (איור 1 ג&#39;). ה-DNA לא תואם מסתיים הטובה ביותר לחקות את DSBs טבעי. קלטת שלם NHEJ היא GFP שלילי כמו אקסון adenoviral משבש את ORF GFP. עם הגיוס של DSBs על ידי I-SCEI, אקסון adenoviral יוסר NHEJ משחזר פונקציה של הגן GFP (איור 2). תכונה ייחודית של הכתב הזה NHEJ היא כי ניתן לזהות מגוון רחב של אירועים NHEJ מאז אינטרון יכול לסבול השמטות והוספות. קלטת הכתב HR 1 (איור 1b) מבוססת גם על ה-GFP-Pem1. בשנת הקלטת HR, אקסון הראשון של ה-GFP-Pem1 מכיל מחיקה 22 נ&quot;ב בשילוב עם הכניסה של שלושה אתרי הגבלה, I-SceI/HindIII/I-SceI. המחיקה מבטיחה כי ה-GFP לא ניתן מחדש על ידי אירוע NHEJ. שתי I-SCEI האתרים בכיוון ההפוך, כך אני-SCEI העיכול עלים מסתיימת עולה בקנה אחד (איור 1 ג&#39;). העותק הראשון של ה-GFP-Pem1 מלווה אקסון אינטרון first promoter-less/ATG-less ו-GFP-Pem1. לבנות שלם GFP הוא שלילי. עם הגיוס של DSB ידי עיכול I-SCEI הגן GFP פונקציונלי הוא מחדש על ידי המרה גן intramolecular או מולקולאריים בין שני עותקים של מוטציה אקסון ה-GFP-Pem1 הראשון. מאז העותק השני של הגן GFP חסר קודון ATG הראשון, אקסון השני, מעבר מעל או גדיל יחיד חישול לא תשחזר את פעילות ה-GFP. עיצוב זה מאפשר זיהוי הבלעדית של המרה גן, המהווה את מסלול HR השולט בתאי יונקים (איור 3). 2. שילוב של כתב המבנים לתוך גנום <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך הכנה באיכות גבוהה של NHEJ או כתב HR פלסמיד. לקבלת התוצאות הטובות ביותר להשתמש Qiagen ערכת אנדו חינם. מדידת ריכוז טוהר פלסמיד ועל ידי ספיגת ב 260/280 ננומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Linearize 10 מיקרוגרם של הכתב הפלסמיד על ידי לעכל עם U 50 של NheI ב μl 50 (הנפח הכולל של התגובה) במשך 6 שעות ב 37 ° C חממה (לא להשתמש לחסום יבש, כדי למנוע אידוי). לטהר DNA מפתרון העיכול עם Qiagen QiaexII קיט, ה-DNA לתוך elute μl 20 של 10 mM טריס-HCl pH 8.0. מדד ה-DNA ריכוז טוהר על ידי ספיגת ב 260/280 ננומטר. בדרך כלל, תאבד 20-30% של ה-DNA במהלך הטיהור. אשר את התשואה העיכול על ידי הפעלת aliquot קטן (2 μl) על ג&#39;ל, יחד עם כתב מעוכלים לבנות. לבנות מטוהרים כתב לינארית ניתן לאחסן בטמפרטורה של 20 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקראת transfection, להביא את התאים למצב הטוב הולך וגדל. אם החל בקבוקון קפוא, לפצל את התאים פעמיים לפני transfection. אם החל צלחת של תאים ומחוברות, לפצל אותם פעם אחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדל את התאים מפגש 70-80% (בדרך כלל יומיים, אם מצופה צלחת 5x10 cells/100 5 מ&quot;מ, עבור fibroblasts אדם נורמלי). זה קריטי עבור יעילות transfection הטובה ביותר להביא את התאים לתוך הגידול לוגריתמי. תרבות ומתרחב מכיל תאים בשלב M (כפי שניתן לראות תאים מעוגלים המצורפת פני השטח). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Transfect התאים באמצעות המלצות Amaxa יצרן Nucleofector של הבאים. עבור fibroblasts להשתמש בפתרון NHDF ו U20 התוכנית. עבור transfection, הקציר תאים משני 100 צלחות מ&quot;מ (~ 2x10 6 תאים). זה קריטי לא מעל trypsinize התאים. עצור trypsinization בהקדם 80% של תאים מנותקת מן הצלחת. Resuspend התאים פתרון NHDF. תאים רגישים פתרון NHDF, אפוא, לצמצם את זמן הדגירה ומערבבים בעדינות את התאים. Transfect התאים עם 0.5 מיקרוגרם של לבנות כתב לינארית. אלה התנאים transfection, הפועל עם תוצאה fibroblasts נורמלי האדם שילוב של עותק אחד של כתב לבנות עבור רוב integrants. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את התאים עם בונה כתב משולב chromosomally ידי הוספת 1 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​geneticin (G418) 24 שעות לאחר transfection. המשך מבחר ימים 7-10. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את עמידים מושבות G418 (ניתן לבחור מושבות בודדות או בבריכה שיבוטים עמיד). הרחב את התרבות כחמש צלחות 100 מ&quot;מ. הקפאת שלוש צלחות לשימוש עתידי ולהרחיב הנותרים שתי צלחות למספר התא הרצוי (בדרך כלל ten 100 צלחות מ&quot;מ מספיקים חמישה transfections). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר התאים מגיעים מפגש 70-80% (יומיים לאחר ציפוי 5x10 5 תאים לכל צלחת 100 מ&quot;מ עבור פיברובלסטיים), התאים מוכנים transfected עם I-SCEI להביע פלסמיד. </li></ol> 3. אינדוקציה של DSB ידי הביטוי חלוף של Endonuclease I-SCEI <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Transfect ~ 2x10 6 תאים (שתי צלחות) של התרבות בטור לוגריתמי גדל בתערובת של 5 מיקרוגרם I-SCEI להביע פלסמיד ו 0.1 מיקרוגרם pDsRed2-N1 (Clontech) כביקורת transfection יעילות באמצעות Amaxa Nucleofector (להשתמש בפתרון NHDF ו U20 תוכנית fibroblasts ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במקביל להכין שלושה שולטת כיול עבור FACS ידי trasfecting ~ 2x10 6 תאים (i) 5 מיקרוגרם EGFP-לבטא פלסמיד (ii) 5 מיקרוגרם pDsRed2-N1; (ג) 5 מיקרוגרם של פקד פלסמיד שאינו להביע חלבון פלואורסצנטי (אנחנו באמצעות קידוד פלסמיד HPRT minigene). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדל את התאים במשך ארבעה ימים על מנת לספק מספיק זמן ביטוי של GFP וחלבונים DsRed. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> (אופציונאלי) שלושה ימים לאחר transfection לאמת את היעילות של transfection והביטוי של ה-GFP וחלבונים DsRed על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוכה עם מסננים לגילוי של ה-GFP ו DsRed. </li></ol> 4. ניתוח של ה-GFP תאים + + ו DsRed על ידי זרימת cytometry <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ארבעה ימים לאחר הקציר transfection I-SCEI תאים transfected והתאים שליטה. Resuspend התאים μL 500 של PBS ולהעביר התאים צינורות FACS. בשלב זה הוא קריטי כדי לקצור את כל התאים יש תאים של הצורה העגולה. כדי להשיג זאת, מומלץ להשתמש trypsinization זמן ארוך יותר או חזקה יותר טריפסין. ודא כי 99% של תאים מנותקים הצלחת ויש להם צורה עגולה על ידי התבוננות בתאים תחת מיקרוסקופ. שמור את התאים על הקרח מוגן מפני אור (דלי קרח לכסות בנייר כסף). ניתן לאחסן את התאים על קרח למשך כמה שעות. לקבלת התוצאות הטובות ביותר לנתח את התאים מיד לאחר הקציר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כיול FACS עם GFP, DsRed, ואת שולטת שלילית. התאם את מתח פיצוי צבע על מנת לכלול את כל התאים פלורסנט בניתוח (איור 4). זכור כי עוצמת ניאון של דגימות הניסוי יהיה נמוך מזה של הביקורת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוח I-SCEI transfected תאים על ידי FACS. אנו סופרים לפחות 20,000 תאים עבור כל טיפול. כדי למנוע הפרעה אפשרית בין ה-GFP ו DsRed הקרינה מומלץ לשמור על אחוז או DsRed GFP + + תאים מתחת 25%. אם אחוז + DsRed או GFP בתאים + גבוה להפחית את כמות pDsRed2-N1 או I-SCEI פלסמיד. בניסויים שלנו אנחנו רק צריכים להתאים את כמות pDsRed2-N1 פלסמיד, אך לא של I-SCEI פלסמיד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחוז התאים ה-GFP + מתאים היעילות של תיקון DSB-DNA ואת אחוז של תאים + DsRed מציין את היעילות של transfection. חשב את היעילות היחסית של תיקון DSB-DNA כיחס בין התאים לתאי ה-GFP + + DsRed. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צמתים סוף תוקן עשוי להיות רצף כדי לבדוק את הדיוק של תיקון. בונה כתב מכילים ממוצא E.coli של שכפול והתנגדות גנים kanamycin (איור 1). זה מאפשר הצלת בונה על ידי לעכל הדנ&quot;א הגנומי עם EcoRI האנזים, recircularization ו והפיכתו המוסמכת תאים E.coli. פלסמידים הצילה מנותחים מכן על ידי עיכול הגבלה וסדר. </li></ol> 5. נציג תוצאות אופיינית FACS תוצאות transfections מלאה של NHEJ וניסויים HR מוצגים איורים 4 ו -5. עוצמת פלורסנט ומספר תאים פלורסנט יהיה נמוך בתאים I-SCEI transfected המכיל integratעורך NHEJ ובונה HR (איור 5) בהשוואה לקבוצת הביקורת (איור 4) בגלל ההבדל במספר עותק של ה-GFP ובונה DsRed בתאים אלה. כל תא מכיל את הניסוי רק עותק אחד של לבנות את הכתב משולב, אירועים תיקון מוצלח וכך יהיה לשקם את הגן GFP בשבריר של התאים. Transfection עם 0.1 מיקרוגרם pDsRed2-N1 ב fibroblasts האנושי מספק כ 1 עותק פלסמיד לכל תא. היעילות של NHEJ ו HR מחושב כיחס של ה-GFP + / DsRed + תאים. NHEJ הוא תהליך יעיל יותר HR בתאים אנושיים 2. ב fibroblasts האדם את היעילות NHEJ היא בדרך כלל 0.6-1.3, ויעילות HR הוא 0.05-0.3. מאז DSB יעילות נמדדת כמו GFP יחס + / DsRed + תאים וריאציות תערובת של I-SCEI DsRed2 ו-N1 פלסמידים עשויים להשפיע על התוצאה. איכות פלסמיד עשוי גם להשפיע על תוצאות על ידי שינוי יעילות transfection. לכן, כדי לקבל מדידה עקבית, חשוב להשתמש לערבב אותו בתוך פלסמיד בניסוי אחד. יתר על כן, יעילות תיקון DSB מושפע סוג התא, מחזור שלב התא, ומיקום כרומוזומליות של המבנים המשולבים. <img src="/files/ftp_upload/2002/2002fig1.jpg" alt="איור 1" /> באיור 1. כתב בונה לניתוח תיקון DSB-DNA על ידי NHEJ (א) ו - HR (B). (ג) ה-DNA לא תואם מסתיים שנוצר על ידי עיכול של שני I-SCEI אתרים הפוכה SD, אחוי התורם; SA, אחוי acceptor; ריבועים מוצלות, אתרי polyadenylation; ניאו / כנא, יחיד ORF נשלט על ידי שני יזמים:. SV40 התנגדות neomycin מתייעצים יונקים תאים, ו β-lactamase התנגדות kanamicyn מתייעצים החיידק, אורי, א קולי מוצא PUC של שכפול. <img src="/files/ftp_upload/2002/2002fig2.jpg" alt="איור 2" /> איור 2. כתב לבנות לניתוח NHEJ בחודש זה לבנות את הגן GFP אינו פעיל,. אולם על אינדוקציה של NHEJ DSB ומצליח לבנות הופך GFP +. המוצג להלן הוא מוצר לתיקון כתב את זה על ידי NHEJ. <img src="/files/ftp_upload/2002/2002fig3.jpg" alt="איור 3" /> איור 3. כתב לבנות לניתוח משאבי אנוש על ידי המרה גן. עם גיוס של DSBs על ידי I-SCEI, משאבי אנוש על ידי הגן המרה (GC) reconstitutes הגן GFP פעיל. המוצג להלן המוצרים תיקון כתב את זה על ידי המסלולים העיקריים לתקן דנ&quot;א: GC, מעבר מעל (X-over), גדיל בודד חישול (SSA), ו NHEJ. ה-X על מוצר לתקן מוצג עבור רקומבינציה intramolecular, רקומבינציה exramolecular ייתן את אותו מוצר, אך בכרומוזום אחד. גנים לבטא חלבון ה-GFP פעיל (GFP +) מסומנים על ידי הצבע הירוק. <img src="/files/ftp_upload/2002/2002fig4.jpg" alt="איור 4" /> איור 4. כיול הפרמטרים לניתוח FACS. (א) Fibroblasts transfected pHPRT עם הפלסמיד, לשמש מלאה שלילי למעט תאים אוטומטי ניאון. (ב) Fibroblasts transfected עם pEGFP פלסמיד, המשמש לקביעת gating עבור ה-GFP בתאים + (שטח ירוק). (ג) Fibroblasts transfected עם pDsRed2-N1 פלסמיד, המשמש לקביעת gating עבור תאים + DsRed (אזור אדום). <img src="/files/ftp_upload/2002/2002fig5.jpg" alt="איור 5" /> איור 5. תוצאות אופייניות של ניתוח NHEJ (א) ו - HR (B) ב fibroblasts אדם נורמלי עם בונה כתב משולב chromosomally.

<ol>
	<li>Mao, Z., Seluanov, A., Jiang, Y., Gorbunova, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRF2+is+required+for+repair+of+nontelomeric+DNA+double-strand+breaks+by+homologous+recombination.">TRF2 is required for repair of nontelomeric DNA double-strand breaks by homologous recombination.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 13068-13073 (2007).</li><li>Mao, Z., Bozzella, M., Seluanov, A., Gorbunova, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+nonhomologous+end+joining+and+homologous+recombination+in+human+cells.">Comparison of nonhomologous end joining and homologous recombination in human cells.</a> DNA Repair (Amst). 7, 1765-1771 (2008).</li><li>Rouet, P., Smih, F., Jasin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+a+site-specific+endonuclease+stimulates+homologous+recombination+in+mammalian+cells.">Expression of a site-specific endonuclease stimulates homologous recombination in mammalian cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 91, 6064-6068 (1994).</li><li>Mao, Z., Jiang, Y., Xiang, L., Seluanov, A., Gorbunova, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+repair+by+homologous+recombination,+but+not+by+nonhomologous+end+joining,+is+elevated+in+breast+cancer+cells.">DNA repair by homologous recombination, but not by nonhomologous end joining, is elevated in breast cancer cells.</a> Neoplasia. 11, 683-691 (2009).</li><li>Seluanov, A., Mittelman, D., Pereira-Smith, O. M., Wilson, J. H., Gorbunova, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+end+joining+becomes+less+efficient+and+more+error-prone+during+cellular+senescence.">DNA end joining becomes less efficient and more error-prone during cellular senescence.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 7624-7629 (2004).</li><li>Mao, Z., Bozzella, M., Seluanov, A., Gorbunova, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+repair+by+nonhomologous+end+joining+and+homologous+recombination+during+cell+cycle+in+human+cells.">DNA repair by nonhomologous end joining and homologous recombination during cell cycle in human cells.</a> Cell Cycle. 7, 2902-296 (2008).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

NHEJ פלורסנט מבחני HR כתב לספק דרך כמותית למדוד בנפרד עבור כל מסלול תיקון DSB in vivo. מבחני רגישים מאוד, כמו FACS יכולים לזהות באופן אמין 10 + התאים GFP ב 20,000 תאים. מבחני עשוי להיות מותאם למדידת אירועים לתקן &quot;בזמן אמת&quot; על ידי איתור את המראה של ה-GFP בתאים + בתוך דקות או שעות ל...

<table><tbody><tr><td>EndoFree Plasmid Maxi kit</td><td>Qiagen</td><td>12362</td><td></td></tr><tr><td>Qiaex II Gel Extraction Kit</td><td>Qiagen</td><td>20021</td><td></td></tr><tr><td>Amaxa Nucleofector</td><td>Lonza Inc.</td><td>AAD-1001</td><td></td></tr><tr><td>Geneticin (G418)</td><td>Invitrogen</td><td>11811-031</td><td></td></tr><tr><td>pDsRed2-N1</td><td>Clontech Laboratories</td><td>632406</td><td></td></tr><tr><td>Round bottom tubes</td><td>BD Biosciences</td><td>352058</td><td>FACS tubes</td></tr></tbody></table>

analysis of dna double-strand break (dsb) repair in mammalian cells

גדיל הדנ&quot;א הכפול הפסקות הם נגעים DNA המסוכן ביותר שעלול להוביל לאובדן מסיבי של מידע גנטי ומוות התא. תאים לתקן DSBs באמצעות שני מסלולים עיקריים: nonhomologous סוף להצטרף (NHEJ) ו הומולוגיים רקומבינציה (HR). הפרעות של NHEJ ו HR הקשורים לעתים קרובות עם הזדקנות מוקדמת ו tumorigenesis, ולכן חשוב לנו דרך כמותית למדוד כל מסלול תיקון DSB. המעבדה שלנו פיתחה בונה כתב ניאון המאפשרים מדידה כמותית של רגיש NHEJ משאבי אנוש. בונה מבוססים על גן ה-GFP מהונדסים המכיל אתרים הכרה endonuclease I-SCEI נדיר חיתוך לזירוז של DSBs. בונה החל GFP הם שליליים כמו הגן GFP הוא מובטל ידי אקסון נוספת, או על ידי מוטציות. תיקון מוצלח של שוברת את I-SCEI הנגרמת על ידי NHEJ או HR משחזר את גן ה-GFP תפקודית. מספר התאים GFP חיובי נספר על ידי cytometry זרימה מספקת למדוד כמותית של NHEJ או יעילות משאבי אנוש.

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of DNA Double-strand Break DSB Repair in Mammalian Cells at JoVE.com

Analysis of DNA Double-strand Break DSB Repair in Mammalian Cells

מאמר זה מתאר GFP מבוססי פלואורסצנציה<em&gt; In vivo</em&gt; מבחני כי בנפרד לכמת הומולוגיים רקומבינציה ו nonhomologous סוף להצטרף בתאי יונקים.

ניתוח תיקון DNA פעמיים גדיל Break (DSB) בתאי יונקים

DNA double-strand breaks are the most dangerous DNA lesions that may lead to massive loss of genetic information and cell death.  Cells repair DSBs using ...

analysis-of-dna-double-strand-break-dsb-repair-in-mammalian-cells

Research

JoVE Journal

Biology

Analysis of DNA Double-strand Break (DSB) Repair in Mammalian Cells

31.6K Views.  University of Rochester. מאמר זה מתאר GFP מבוססי פלואורסצנציה In vivo מבחני כי בנפרד לכמת הומולוגיים רקומבינציה ו nonhomologous סוף להצטרף בתאי יונקים.

Video: Analysis of DNA Double-strand Break DSB Repair in Mammalian Cells

Application of Laser Micro-irradiation for Examination of Single and Double Strand Break Repair in Mammalian Cells

Highly coordinated DNA repair pathways exist to detect, excise and replace damaged DNA bases, and coordinate repair of DNA strand breaks. While molecular biology techniques have clarified structure, enzymatic functions, and kinetics of repair proteins, there is still a need to understand how repair is coordinated within the nucleus. Laser micro-irradiation offers a powerful tool for inducing DNA damage and monitoring the recruitment of repair proteins. Induction of DNA damage by laser micro-irradiation can occur with a range of wavelengths, and users can reliably induce single strand breaks, base lesions and double strand breaks with a range of doses. Here, laser micro-irradiation is used to examine repair of single and double strand breaks induced by two common confocal laser wavelengths, 355 nm and 405 nm. Further, proper characterization of the applied laser dose for inducing specific damage mixtures is described, so users can reproducibly perform laser micro-irradiation data acquisition and analysis.

Confocal fluorescence microscopy and laser micro-irradiation offer tools for inducing DNA damage and monitoring the response of DNA repair proteins in selected sub-nuclear areas. This technique has significantly advanced our knowledge of damage detection, signaling, and recruitment. This manuscript demonstrates these technologies to examine single and double strand break repair.

היישום של לייזר מיקרו-הקרנה בחינת יחיד ותיקון כפול Strand Break בתאים בתרבית

Highly coordinated DNA repair pathways exist to detect, excise and replace damaged DNA bases, and coordinate repair of DNA strand breaks. While molecular ...

Cancer Research

Immunofluorescence Microscopy of &#947;H2AX and 53BP1 for Analyzing the Formation and Repair of DNA Double-strand Breaks

DNA double-strand breaks (DSB) are serious DNA lesions. Analysis of the formation and repair of DSB is relevant in a broad spectrum of research areas including genome integrity, genotoxicity, radiation biology, aging, cancer, and drug development. In response to DSB, the histone H2AX is phosphorylated at Serine 139 in a region of several megabase pairs forming discrete nuclear foci detectable by immunofluorescence microscopy. In addition, 53BP1 (p53 binding protein 1) is another important DSB-responsive protein promoting repair of DSB by nonhomologous end-joining while preventing homologous recombination. According to the specific functions of &#947;H2AX and 53BP1, the combined analysis of &#947;H2AX and 53BP1 by immunofluorescence microscopy may be a reasonable approach for a detailed analysis of DSB. This manuscript provides a step-by-step protocol supplemented with methodical notes for performing the technique. Specifically, the influence of the cell cycle on &#947;H2AX foci patterns is demonstrated in normal fibroblasts of the cell line NHDF. Further, the value of the &#947;H2AX foci as a biomarker is depicted in x-ray irradiated lymphocytes of a healthy individual. Finally, genetic instability is investigated in CD34+ cells of a patient with acute myeloid leukemia by immunofluorescence microscopy of &#947;H2AX and 53BP1.

This manuscript provides a protocol for the analysis of DNA double-strand breaks by immunofluorescence microscopy of &#947;H2AX and 53BP1.

מיקרוסקופ immunofluorescence של γH2AX ו 53BP1 לניתוח את היווצרות והתיקון של מעברי כפול-גדיל ה-DNA

DNA double-strand breaks (DSB) are serious DNA lesions. Analysis of the formation and repair of DSB is relevant in a broad spectrum of research areas ...

Characterizing DNA Repair Processes at Transient and Long-lasting Double-strand DNA Breaks by Immunofluorescence Microscopy

The repair of double-stranded breaks (DSBs) in DNA is a highly coordinated process, necessitating the formation and resolution of multi-protein repair complexes. This process is regulated by a myriad of proteins that promote the association and disassociation of proteins to these lesions. Thanks in large part to the ability to perform functional screens of a vast library of proteins, there is a greater appreciation of the genes necessary for the double-strand DNA break repair. Often knockout or chemical inhibitor screens identify proteins involved in repair processes by using increased toxicity as a marker for a protein that is required for DSB repair. Although useful for identifying novel cellular proteins involved in maintaining genome fidelity, functional analysis requires the determination of whether the protein of interest promotes localization, formation, or resolution of repair complexes. 
The accumulation of repair proteins can be readily detected as distinct nuclear foci by immunofluorescence microscopy. Thus, association and disassociation of these proteins at sites of DNA damage can be accessed by observing these nuclear foci at representative intervals after the induction of double-strand DNA breaks. This approach can also identify mis-localized repair factor proteins, if repair defects do not simultaneously occur with incomplete delays in repair. In this scenario, long-lasting double-strand DNA breaks can be engineered by expressing a rare cutting endonuclease (e.g., I-SceI) in cells where the recognition site for the said enzyme has been integrated into the cellular genome. The resulting lesion is particularly hard to resolve as faithful repair will reintroduce the enzyme's recognition site, prompting another round of cleavage. As a result, differences in the kinetics of repair are eliminated. If repair complexes are not formed, localization has been impeded. This protocol describes the methodology necessary to identify changes in repair kinetics as well as repair protein localization.

Repair of double-strand DNA breaks is a dynamic process, requiring not only formation of repair complexes at the breaks, but also their resolution after the lesion is addressed. Here, we use immunofluorescence microscopy for transient and long-lasting double-stranded breaks as a tool to dissect this genome maintenance mechanism.

אפיון תהליכי תיקון DNA-ארעי ומעברי DNA ארוך כפול-strand על ידי מיקרוסקופ Immunofluorescence

The repair of double-stranded breaks (DSBs) in DNA is a highly coordinated process, necessitating the formation and resolution of multi-protein repair ...

Using Next Generation Sequencing to Identify Mutations Associated with Repair of a CAS9-induced Double Strand Break Near the CD4 Promoter

Double strand breaks (DSBs) in DNA are the most cytotoxic type of DNA damage. Because a myriad of insults can result in these lesions (e.g., replication stress, ionizing radiation, unrepaired UV damage), DSBs occur in most cells each day. In addition to cell death, unrepaired DSBs reduce genome integrity and the resulting mutations can drive tumorigenesis. These risks and the prevalence of DSBs motivate investigations into the mechanisms by which cells repair these lesions. Next generation sequencing can be paired with the induction of DSBs by ionizing radiation to provide a powerful tool to precisely define the mutations associated with DSB repair defects. However, this approach requires computationally challenging and cost prohibitive whole genome sequencing to detect the repair of the randomly occurring DSBs associated with ionizing radiation. Rare cutting endonucleases, such as I-Sce1, provide the ability to generate a single DSB, but their recognition sites must be inserted into the genome of interest. As a result, the site of repair is inherently artificial. Recent advances allow guide RNA (sgRNA) to direct a Cas9 endonuclease to any genome locus of interest. This could be applied to the study of DSB repair making next generation sequencing more cost effective by allowing it to be focused on the DNA flanking the Cas9-induced DSB. The goal of the manuscript is to demonstrate the feasibility of this approach by presenting a protocol that can define mutations that stem from the repair of a DSB upstream of the CD4 gene. The protocol can be adapted to determine changes in the mutagenic potential of DSB associated with exogenous factors, such as repair inhibitors, viral protein expression, mutations, and environmental exposures with relatively limited computation requirements. Once an organism's genome has been sequenced, this method can be theoretically employed at any genomic locus and in any cell culture model of that organism that can be transfected. Similar adaptations of the approach could allow comparisons of repair fidelity between different loci in the same genetic background.

Presented here is sgRNA/CAS9 endonuclease and next-generation sequencing protocol that can be used to identify the mutations associated with double strand break repair near the CD4 promoter.

שימוש בריצוף הדור הבא כדי לזהות מוטציות הקשורות לתיקון של שבר גדיל כפול המושרה על ידי CAS9 ליד מקדם CD4

Double strand breaks (DSBs) in DNA are the most cytotoxic type of DNA damage. Because a myriad of insults can result in these lesions (e.g., replication ...

Genetics

Visualization of miniSOG Tagged DNA Repair Proteins in Combination with Electron Spectroscopic Imaging (ESI)

The limits to optical resolution and the challenge of identifying specific protein populations in transmission electron microscopy have been obstacles in cell biology. Many phenomena cannot be explained by in vitro analysis in simplified systems and need additional structural information in situ, particularly in the range between 1 nm and 0.1 &#181;m, in order to be fully understood. Here, electron spectroscopic imaging, a transmission electron microscopy technique that allows simultaneous mapping of the distribution of proteins and nucleic acids, and an expression tag, miniSOG, are combined to study the structure and organization of DNA double-strand break repair foci.

Visualization of miniSOG Tagged DNA Repair Proteins in Combination with Electron Spectroscopic Imaging ESI

Electron spectroscopic imaging can image and distinguish nucleic acid from protein at nanometer resolution. It can be combined with the miniSOG system, which is able to specifically label tagged proteins in transmission electron microscopy samples. We illustrate the use of these technologies using double-strand break repair foci as an example.

הדמיה של חלבונים תיקון ה- DNA miniSOG תייג בשילוב עם אלקטרונים Spectroscopic הדמיה (ESI)

The limits to optical resolution and the challenge of identifying specific protein populations in transmission electron microscopy have been obstacles in ...

Visualization of DNA Repair Proteins Interaction by Immunofluorescence

Mammalian cells are constantly exposed to chemicals, radiations, and naturally occurring metabolic by-products, which create specific types of DNA insults. Genotoxic agents can damage the DNA backbone, break it, or modify the chemical nature of individual bases. Following DNA insult, DNA damage response (DDR) pathways are activated and proteins involved in the repair are recruited. A plethora of factors are involved in sensing the type of damage and activating the appropriate repair response. Failure to correctly activate and recruit DDR factors can lead to genomic instability, which underlies many human pathologies including cancer. Studies of DDR proteins can provide insights into genotoxic drug response and cellular mechanisms of drug resistance.
There are two major ways of visualizing&#160;proteins in vivo: direct observation, by tagging the protein of interest with a fluorescent protein and following it by live imaging, or indirect immunofluorescence on fixed samples. While visualization of fluorescently tagged proteins allows precise monitoring over time, direct tagging in N- or C-terminus can interfere with the protein localization or function. Observation of proteins in their unmodified, endogenous version is preferred. When DNA repair proteins are recruited to the DNA insult, their concentration increases locally and they form groups, or &#8220;foci&#8221;, that can be visualized by indirect immunofluorescence using specific antibodies.
Although detection of protein foci does not provide a definitive proof of direct interaction, co-localization of proteins in cells indicates that they regroup to the site of damage and can inform of the sequence of events required for complex formation. Careful analysis of foci spatial overlap in cells expressing wild type or mutant versions of a protein can provide precious clues on functional domains important for DNA repair function. Last, co-localization of proteins indicates possible direct interactions that can be verified by co-immunoprecipitation in cells, or direct pulldown using purified proteins.

Following DNA damage, human cells activate essential repair pathways to restore the integrity of their genome. Here, we describe the method of indirect immunofluorescence as a means to detect DNA repair proteins, analyze their spatial and temporal recruitment, and help interrogate protein-protein interaction at the sites of DNA damage.

הדמיה של אינטראקציה חלבוני תיקון DNA על ידי אימונופלואורסץ

Mammalian cells are constantly exposed to chemicals, radiations, and naturally occurring metabolic by-products, which create specific types of DNA ...

Visualization of Replisome Encounters with an Antigen Tagged Blocking Lesion

Considerable insight is present into the cellular response to double strand breaks (DSBs), induced by nucleases, radiation, and other DNA breakers. In part, this reflects the availability of methods for the identification of break sites, and characterization of factors recruited to DSBs at those sequences. However, DSBs also appear as intermediates during the processing of DNA adducts formed by compounds that do not directly cause breaks, and do not react at specific sequence sites. Consequently, for most of these agents, technologies that permit the analysis of binding interactions with response factors and repair proteins are unknown. For example, DNA interstrand crosslinks (ICLs) can provoke breaks following replication fork encounters. Although formed by drugs widely used as cancer chemotherapeutics, there has been no methodology for monitoring their interactions with replication proteins.
Here, we describe our strategy for following the cellular response to fork collisions with these challenging adducts. We linked a steroid antigen to psoralen, which forms photoactivation dependent ICLs in nuclei of living cells. The ICLs were visualized by immunofluorescence against the antigen tag. The tag can also be a partner in the Proximity Ligation Assay (PLA) which reports the close association of two antigens. The PLA was exploited to distinguish proteins that were closely associated with the tagged ICLs from those that were not. It was possible to define replisome proteins that were retained after encounters with ICLs and identify others that were lost. This approach is applicable to any structure or DNA adduct that can be detected immunologically.

While replication fork collisions with DNA adducts can induce double strand breaks, less is known about the interaction between replisomes and blocking lesions. We have employed the proximity ligation assay to visualize these encounters and to characterize the consequences for replisome composition.

הדמיה של מפגשים רפליזומיים עם נגע חוסם מתויג אנטיגן

Considerable insight is present into the cellular response to double strand breaks (DSBs), induced by nucleases, radiation, and other DNA breakers. In ...

Assessment of Global DNA Double-Strand End Resection using BrdU-DNA Labeling coupled with Cell Cycle Discrimination Imaging

The study of the DNA damage response (DDR) is a complex and essential field, which has only become more important due to the use of DDR-targeting drugs for cancer treatment. These targets are poly(ADP-ribose) polymerases (PARPs), which initiate various forms of DNA repair. Inhibiting these enzymes using PARP inhibitors (PARPi) achieves synthetic lethality by conferring a therapeutic vulnerability in homologous recombination (HR)-deficient cells due to mutations in breast cancer type 1 (BRCA1), BRCA2, or partner and localizer of BRCA2 (PALB2). 
Cells treated with PARPi accumulate DNA double-strand breaks (DSBs). These breaks are processed by the DNA end resection machinery, leading to the formation of single-stranded (ss) DNA and subsequent DNA repair. In a BRCA1-deficient context, reinvigorating DNA resection through mutations in DNA resection inhibitors, such as 53BP1 and DYNLL1, causes PARPi resistance. Therefore, being able to monitor DNA resection in cellulo is critical for a clearer understanding of the DNA repair pathways and the development of new strategies to overcome PARPi resistance. Immunofluorescence (IF)-based techniques allow for monitoring of global DNA resection after DNA damage. This strategy requires long-pulse genomic DNA labeling with 5-bromo-2&#8242;-deoxyuridine (BrdU). Following DNA damage and DNA end resection, the resulting single-stranded DNA is specifically detected by an anti-BrdU antibody under native conditions. Moreover, DNA resection can also be studied using cell cycle markers to differentiate between various phases of the cell cycle. Cells in the S/G2 phase allow the study of end resection within HR, whereas G1 cells can be used to study non-homologous end joining (NHEJ). A detailed protocol for this IF method coupled to cell cycle discrimination is described in this paper.

In the present protocol, we demonstrate how to visualize DNA double-strand end resection during S/G2 phase of the cell cycle using an immunofluorescence-based method.

הערכה של כריתת קצה כפולת גדילים של DNA גלובלי באמצעות תיוג BrdU-DNA בשילוב עם הדמיית אפליה במחזור התא

The study of the DNA damage response (DDR) is a complex and essential field, which has only become more important due to the use of DDR-targeting drugs ...

זיהוי מוקדי DNA חד-גדילי בשלב G1 באמצעות צביעה אימונופלואורסצנטית RPA2

Visualizing Single-Stranded DNA Foci in the G1 Phase of the Cell Cycle

DNA has dedicated cellular repair pathways capable of coping with lesions that could arise from both endogenous and/or exogenous sources. DNA repair necessitates collaboration between numerous proteins, responsible for covering a broad range of tasks from recognizing and signaling the presence of a DNA lesion to physically repairing it. During this process, tracks of single-stranded DNA (ssDNA) are often created, which are eventually filled by DNA polymerases. The nature of these ssDNA tracks (in terms of both length and number), along with the polymerase recruited to fill these gaps, are repair pathway-specific. The visualization of these ssDNA tracks can help us understand the complicated dynamics of DNA repair mechanisms.
This protocol provides a detailed method for the preparation of G1 synchronized cells to measure ssDNA foci formation upon genotoxic stress. Using an easy-to-utilize immunofluorescence approach, we visualize ssDNA by staining for RPA2, a component of the heterotrimeric replication protein A complex (RPA). RPA2 binds to and stabilizes ssDNA intermediates that arise upon genotoxic stress or replication to control DNA repair and DNA damage checkpoint activation. 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) staining is used to visualize DNA replication to exclude any S phase cells. This protocol provides an alternative approach to the conventional, non-denaturing 5-bromo-2'-deoxyuridine (BrdU)-based assays and is better suited for the detection of ssDNA foci outside the S phase.

מחבר זרקור: הדמיה של DNA חד-גדילי במהלך תיקון DNA לתובנות טיפוליות 

The following protocol presents the detection of single-stranded DNA foci in the G1 phase of the cell cycle utilizing cell cycle synchronization followed by RPA2 immunofluorescent staining.

הדמיה של מוקדי DNA חד-גדיליים בשלב G1 של מחזור התא

DNA has dedicated cellular repair pathways capable of coping with lesions that could arise from both endogenous and/or exogenous sources. DNA repair ...

ניתוח תיקון DNA פעמיים גדיל Break (DSB) בתאי יונקים

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

היישום של לייזר מיקרו-הקרנה בחינת יחיד ותיקון כפול Strand Break בתאים בתרבית

מיקרוסקופ immunofluorescence של γH2AX ו 53BP1 לניתוח את היווצרות והתיקון של מעברי כפול-גדיל ה-DNA

אפיון תהליכי תיקון DNA-ארעי ומעברי DNA ארוך כפול-strand על ידי מיקרוסקופ Immunofluorescence

שימוש בריצוף הדור הבא כדי לזהות מוטציות הקשורות לתיקון של שבר גדיל כפול המושרה על ידי CAS9 ליד מקדם CD4

הדמיה של חלבונים תיקון ה- DNA miniSOG תייג בשילוב עם אלקטרונים Spectroscopic הדמיה (ESI)

הדמיה של אינטראקציה חלבוני תיקון DNA על ידי אימונופלואורסץ

הדמיה של מפגשים רפליזומיים עם נגע חוסם מתויג אנטיגן

הערכה של כריתת קצה כפולת גדילים של DNA גלובלי באמצעות תיוג BrdU-DNA בשילוב עם הדמיית אפליה במחזור התא

הדמיה של מוקדי DNA חד-גדיליים בשלב G1 של מחזור התא

הדמיה של מוקדי DNA חד-גדיליים בשלב G1 של מחזור התא