המקורי GFP-Pem1 היה מתנה ד&quot;ר Li Lei. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מ-NIH ו הרפואי אליסון קרן אל VG ו AS

בפרוטוקול זה אנו מתארים את שיטת ניתוח לתיקון DSB-DNA משולב עם הכתב chromosomally בונה 1,2 שבו DSBs הם המושרה in vivo על ידי ביטוי חולף endonuclease חיתוך נדיר I-SCEI 3. Assay משולב מספק את היתרונות של ניתוח לתיקון DSB בהקשר כרומוזומליות. עם זאת, פרוטוקול זה מחייב תא passaging ממושך, אשר עשוי להיות בעייתי כאשר עובדים עם תאים ראשוניים. גישה חלופית היא assay extrachromosomal שבו בונה כתב מתעכלים במבחנה עם I-SCEI או endonucleases HindIII ואז transfected לתוך התאים כמו DNA ליניארי. פרוטוקול assay exctrachromosomal 4 דומה assay המשולב המתואר להלן בשינויים הבאים. עבור assay extrachromosomal להשמיט את האינטגרציה של בונה כתב ובמקום שיתוף transfect התאים עם 0.5 מיקרוגרם של הכתב NHEJ פלסמיד לינארית במבחנה עם I-SCEI או HindIII ו 0.1 מיקרוגרם של pDsRed2-N1 כמו שליטה transfection. עבור assay משאבי אנוש שיתוף transfect 2 HR מיקרוגרם כתב פלסמיד לינארית עם I-SCEI או HindIII ו 0.1 מיקרוגרם pDsRed2-N1. נתח את התאים על ידי FACS שלושה ימים לאחר transfection. Assay extrachromosomal מאפשר ניתוח של תיקון DSB ב מבודד העיקרי, הימנעות תא נרחב passaging, והקלה על ניתוח של שורות תאים מרובים. 1. כתב בונה עבור NHEJ ו HR קלטת כתב NHEJ 5 מכיל את הגן GFP עם מהונדסים 3 kb אינטרון מן הגן Pem1 (GFP-Pem1). אינטרון Pem1 מכיל אקסון adenoviral מוקף רצפי הכרה endonucleases HindIII ואני-SCEI (איור 1 א) לזירוז של DSBs. I-SCEI האתרים בכיוון הפוך. I-SCEI יש רצף הכרה nonpalindromic, ומכאן שני אתרים הפוכה ליצור קצוות דנ&quot;א תואם (איור 1 ג&#39;). ה-DNA לא תואם מסתיים הטובה ביותר לחקות את DSBs טבעי. קלטת שלם NHEJ היא GFP שלילי כמו אקסון adenoviral משבש את ORF GFP. עם הגיוס של DSBs על ידי I-SCEI, אקסון adenoviral יוסר NHEJ משחזר פונקציה של הגן GFP (איור 2). תכונה ייחודית של הכתב הזה NHEJ היא כי ניתן לזהות מגוון רחב של אירועים NHEJ מאז אינטרון יכול לסבול השמטות והוספות. קלטת הכתב HR 1 (איור 1b) מבוססת גם על ה-GFP-Pem1. בשנת הקלטת HR, אקסון הראשון של ה-GFP-Pem1 מכיל מחיקה 22 נ&quot;ב בשילוב עם הכניסה של שלושה אתרי הגבלה, I-SceI/HindIII/I-SceI. המחיקה מבטיחה כי ה-GFP לא ניתן מחדש על ידי אירוע NHEJ. שתי I-SCEI האתרים בכיוון ההפוך, כך אני-SCEI העיכול עלים מסתיימת עולה בקנה אחד (איור 1 ג&#39;). העותק הראשון של ה-GFP-Pem1 מלווה אקסון אינטרון first promoter-less/ATG-less ו-GFP-Pem1. לבנות שלם GFP הוא שלילי. עם הגיוס של DSB ידי עיכול I-SCEI הגן GFP פונקציונלי הוא מחדש על ידי המרה גן intramolecular או מולקולאריים בין שני עותקים של מוטציה אקסון ה-GFP-Pem1 הראשון. מאז העותק השני של הגן GFP חסר קודון ATG הראשון, אקסון השני, מעבר מעל או גדיל יחיד חישול לא תשחזר את פעילות ה-GFP. עיצוב זה מאפשר זיהוי הבלעדית של המרה גן, המהווה את מסלול HR השולט בתאי יונקים (איור 3). 2. שילוב של כתב המבנים לתוך גנום <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך הכנה באיכות גבוהה של NHEJ או כתב HR פלסמיד. לקבלת התוצאות הטובות ביותר להשתמש Qiagen ערכת אנדו חינם. מדידת ריכוז טוהר פלסמיד ועל ידי ספיגת ב 260/280 ננומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Linearize 10 מיקרוגרם של הכתב הפלסמיד על ידי לעכל עם U 50 של NheI ב μl 50 (הנפח הכולל של התגובה) במשך 6 שעות ב 37 ° C חממה (לא להשתמש לחסום יבש, כדי למנוע אידוי). לטהר DNA מפתרון העיכול עם Qiagen QiaexII קיט, ה-DNA לתוך elute μl 20 של 10 mM טריס-HCl pH 8.0. מדד ה-DNA ריכוז טוהר על ידי ספיגת ב 260/280 ננומטר. בדרך כלל, תאבד 20-30% של ה-DNA במהלך הטיהור. אשר את התשואה העיכול על ידי הפעלת aliquot קטן (2 μl) על ג&#39;ל, יחד עם כתב מעוכלים לבנות. לבנות מטוהרים כתב לינארית ניתן לאחסן בטמפרטורה של 20 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקראת transfection, להביא את התאים למצב הטוב הולך וגדל. אם החל בקבוקון קפוא, לפצל את התאים פעמיים לפני transfection. אם החל צלחת של תאים ומחוברות, לפצל אותם פעם אחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדל את התאים מפגש 70-80% (בדרך כלל יומיים, אם מצופה צלחת 5x10 cells/100 5 מ&quot;מ, עבור fibroblasts אדם נורמלי). זה קריטי עבור יעילות transfection הטובה ביותר להביא את התאים לתוך הגידול לוגריתמי. תרבות ומתרחב מכיל תאים בשלב M (כפי שניתן לראות תאים מעוגלים המצורפת פני השטח). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Transfect התאים באמצעות המלצות Amaxa יצרן Nucleofector של הבאים. עבור fibroblasts להשתמש בפתרון NHDF ו U20 התוכנית. עבור transfection, הקציר תאים משני 100 צלחות מ&quot;מ (~ 2x10 6 תאים). זה קריטי לא מעל trypsinize התאים. עצור trypsinization בהקדם 80% של תאים מנותקת מן הצלחת. Resuspend התאים פתרון NHDF. תאים רגישים פתרון NHDF, אפוא, לצמצם את זמן הדגירה ומערבבים בעדינות את התאים. Transfect התאים עם 0.5 מיקרוגרם של לבנות כתב לינארית. אלה התנאים transfection, הפועל עם תוצאה fibroblasts נורמלי האדם שילוב של עותק אחד של כתב לבנות עבור רוב integrants. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את התאים עם בונה כתב משולב chromosomally ידי הוספת 1 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​geneticin (G418) 24 שעות לאחר transfection. המשך מבחר ימים 7-10. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את עמידים מושבות G418 (ניתן לבחור מושבות בודדות או בבריכה שיבוטים עמיד). הרחב את התרבות כחמש צלחות 100 מ&quot;מ. הקפאת שלוש צלחות לשימוש עתידי ולהרחיב הנותרים שתי צלחות למספר התא הרצוי (בדרך כלל ten 100 צלחות מ&quot;מ מספיקים חמישה transfections). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר התאים מגיעים מפגש 70-80% (יומיים לאחר ציפוי 5x10 5 תאים לכל צלחת 100 מ&quot;מ עבור פיברובלסטיים), התאים מוכנים transfected עם I-SCEI להביע פלסמיד. </li></ol> 3. אינדוקציה של DSB ידי הביטוי חלוף של Endonuclease I-SCEI <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Transfect ~ 2x10 6 תאים (שתי צלחות) של התרבות בטור לוגריתמי גדל בתערובת של 5 מיקרוגרם I-SCEI להביע פלסמיד ו 0.1 מיקרוגרם pDsRed2-N1 (Clontech) כביקורת transfection יעילות באמצעות Amaxa Nucleofector (להשתמש בפתרון NHDF ו U20 תוכנית fibroblasts ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במקביל להכין שלושה שולטת כיול עבור FACS ידי trasfecting ~ 2x10 6 תאים (i) 5 מיקרוגרם EGFP-לבטא פלסמיד (ii) 5 מיקרוגרם pDsRed2-N1; (ג) 5 מיקרוגרם של פקד פלסמיד שאינו להביע חלבון פלואורסצנטי (אנחנו באמצעות קידוד פלסמיד HPRT minigene). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדל את התאים במשך ארבעה ימים על מנת לספק מספיק זמן ביטוי של GFP וחלבונים DsRed. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> (אופציונאלי) שלושה ימים לאחר transfection לאמת את היעילות של transfection והביטוי של ה-GFP וחלבונים DsRed על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוכה עם מסננים לגילוי של ה-GFP ו DsRed. </li></ol> 4. ניתוח של ה-GFP תאים + + ו DsRed על ידי זרימת cytometry <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ארבעה ימים לאחר הקציר transfection I-SCEI תאים transfected והתאים שליטה. Resuspend התאים μL 500 של PBS ולהעביר התאים צינורות FACS. בשלב זה הוא קריטי כדי לקצור את כל התאים יש תאים של הצורה העגולה. כדי להשיג זאת, מומלץ להשתמש trypsinization זמן ארוך יותר או חזקה יותר טריפסין. ודא כי 99% של תאים מנותקים הצלחת ויש להם צורה עגולה על ידי התבוננות בתאים תחת מיקרוסקופ. שמור את התאים על הקרח מוגן מפני אור (דלי קרח לכסות בנייר כסף). ניתן לאחסן את התאים על קרח למשך כמה שעות. לקבלת התוצאות הטובות ביותר לנתח את התאים מיד לאחר הקציר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כיול FACS עם GFP, DsRed, ואת שולטת שלילית. התאם את מתח פיצוי צבע על מנת לכלול את כל התאים פלורסנט בניתוח (איור 4). זכור כי עוצמת ניאון של דגימות הניסוי יהיה נמוך מזה של הביקורת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוח I-SCEI transfected תאים על ידי FACS. אנו סופרים לפחות 20,000 תאים עבור כל טיפול. כדי למנוע הפרעה אפשרית בין ה-GFP ו DsRed הקרינה מומלץ לשמור על אחוז או DsRed GFP + + תאים מתחת 25%. אם אחוז + DsRed או GFP בתאים + גבוה להפחית את כמות pDsRed2-N1 או I-SCEI פלסמיד. בניסויים שלנו אנחנו רק צריכים להתאים את כמות pDsRed2-N1 פלסמיד, אך לא של I-SCEI פלסמיד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחוז התאים ה-GFP + מתאים היעילות של תיקון DSB-DNA ואת אחוז של תאים + DsRed מציין את היעילות של transfection. חשב את היעילות היחסית של תיקון DSB-DNA כיחס בין התאים לתאי ה-GFP + + DsRed. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צמתים סוף תוקן עשוי להיות רצף כדי לבדוק את הדיוק של תיקון. בונה כתב מכילים ממוצא E.coli של שכפול והתנגדות גנים kanamycin (איור 1). זה מאפשר הצלת בונה על ידי לעכל הדנ&quot;א הגנומי עם EcoRI האנזים, recircularization ו והפיכתו המוסמכת תאים E.coli. פלסמידים הצילה מנותחים מכן על ידי עיכול הגבלה וסדר. </li></ol> 5. נציג תוצאות אופיינית FACS תוצאות transfections מלאה של NHEJ וניסויים HR מוצגים איורים 4 ו -5. עוצמת פלורסנט ומספר תאים פלורסנט יהיה נמוך בתאים I-SCEI transfected המכיל integratעורך NHEJ ובונה HR (איור 5) בהשוואה לקבוצת הביקורת (איור 4) בגלל ההבדל במספר עותק של ה-GFP ובונה DsRed בתאים אלה. כל תא מכיל את הניסוי רק עותק אחד של לבנות את הכתב משולב, אירועים תיקון מוצלח וכך יהיה לשקם את הגן GFP בשבריר של התאים. Transfection עם 0.1 מיקרוגרם pDsRed2-N1 ב fibroblasts האנושי מספק כ 1 עותק פלסמיד לכל תא. היעילות של NHEJ ו HR מחושב כיחס של ה-GFP + / DsRed + תאים. NHEJ הוא תהליך יעיל יותר HR בתאים אנושיים 2. ב fibroblasts האדם את היעילות NHEJ היא בדרך כלל 0.6-1.3, ויעילות HR הוא 0.05-0.3. מאז DSB יעילות נמדדת כמו GFP יחס + / DsRed + תאים וריאציות תערובת של I-SCEI DsRed2 ו-N1 פלסמידים עשויים להשפיע על התוצאה. איכות פלסמיד עשוי גם להשפיע על תוצאות על ידי שינוי יעילות transfection. לכן, כדי לקבל מדידה עקבית, חשוב להשתמש לערבב אותו בתוך פלסמיד בניסוי אחד. יתר על כן, יעילות תיקון DSB מושפע סוג התא, מחזור שלב התא, ומיקום כרומוזומליות של המבנים המשולבים. <img src="/files/ftp_upload/2002/2002fig1.jpg" alt="איור 1" /> באיור 1. כתב בונה לניתוח תיקון DSB-DNA על ידי NHEJ (א) ו - HR (B). (ג) ה-DNA לא תואם מסתיים שנוצר על ידי עיכול של שני I-SCEI אתרים הפוכה SD, אחוי התורם; SA, אחוי acceptor; ריבועים מוצלות, אתרי polyadenylation; ניאו / כנא, יחיד ORF נשלט על ידי שני יזמים:. SV40 התנגדות neomycin מתייעצים יונקים תאים, ו β-lactamase התנגדות kanamicyn מתייעצים החיידק, אורי, א קולי מוצא PUC של שכפול. <img src="/files/ftp_upload/2002/2002fig2.jpg" alt="איור 2" /> איור 2. כתב לבנות לניתוח NHEJ בחודש זה לבנות את הגן GFP אינו פעיל,. אולם על אינדוקציה של NHEJ DSB ומצליח לבנות הופך GFP +. המוצג להלן הוא מוצר לתיקון כתב את זה על ידי NHEJ. <img src="/files/ftp_upload/2002/2002fig3.jpg" alt="איור 3" /> איור 3. כתב לבנות לניתוח משאבי אנוש על ידי המרה גן. עם גיוס של DSBs על ידי I-SCEI, משאבי אנוש על ידי הגן המרה (GC) reconstitutes הגן GFP פעיל. המוצג להלן המוצרים תיקון כתב את זה על ידי המסלולים העיקריים לתקן דנ&quot;א: GC, מעבר מעל (X-over), גדיל בודד חישול (SSA), ו NHEJ. ה-X על מוצר לתקן מוצג עבור רקומבינציה intramolecular, רקומבינציה exramolecular ייתן את אותו מוצר, אך בכרומוזום אחד. גנים לבטא חלבון ה-GFP פעיל (GFP +) מסומנים על ידי הצבע הירוק. <img src="/files/ftp_upload/2002/2002fig4.jpg" alt="איור 4" /> איור 4. כיול הפרמטרים לניתוח FACS. (א) Fibroblasts transfected pHPRT עם הפלסמיד, לשמש מלאה שלילי למעט תאים אוטומטי ניאון. (ב) Fibroblasts transfected עם pEGFP פלסמיד, המשמש לקביעת gating עבור ה-GFP בתאים + (שטח ירוק). (ג) Fibroblasts transfected עם pDsRed2-N1 פלסמיד, המשמש לקביעת gating עבור תאים + DsRed (אזור אדום). <img src="/files/ftp_upload/2002/2002fig5.jpg" alt="איור 5" /> איור 5. תוצאות אופייניות של ניתוח NHEJ (א) ו - HR (B) ב fibroblasts אדם נורמלי עם בונה כתב משולב chromosomally.

<ol>
	<li>Mao, Z., Seluanov, A., Jiang, Y., Gorbunova, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRF2+is+required+for+repair+of+nontelomeric+DNA+double-strand+breaks+by+homologous+recombination.">TRF2 is required for repair of nontelomeric DNA double-strand breaks by homologous recombination.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 13068-13073 (2007).</li><li>Mao, Z., Bozzella, M., Seluanov, A., Gorbunova, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+nonhomologous+end+joining+and+homologous+recombination+in+human+cells.">Comparison of nonhomologous end joining and homologous recombination in human cells.</a> DNA Repair (Amst). 7, 1765-1771 (2008).</li><li>Rouet, P., Smih, F., Jasin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+a+site-specific+endonuclease+stimulates+homologous+recombination+in+mammalian+cells.">Expression of a site-specific endonuclease stimulates homologous recombination in mammalian cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 91, 6064-6068 (1994).</li><li>Mao, Z., Jiang, Y., Xiang, L., Seluanov, A., Gorbunova, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+repair+by+homologous+recombination,+but+not+by+nonhomologous+end+joining,+is+elevated+in+breast+cancer+cells.">DNA repair by homologous recombination, but not by nonhomologous end joining, is elevated in breast cancer cells.</a> Neoplasia. 11, 683-691 (2009).</li><li>Seluanov, A., Mittelman, D., Pereira-Smith, O. M., Wilson, J. H., Gorbunova, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+end+joining+becomes+less+efficient+and+more+error-prone+during+cellular+senescence.">DNA end joining becomes less efficient and more error-prone during cellular senescence.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 7624-7629 (2004).</li><li>Mao, Z., Bozzella, M., Seluanov, A., Gorbunova, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+repair+by+nonhomologous+end+joining+and+homologous+recombination+during+cell+cycle+in+human+cells.">DNA repair by nonhomologous end joining and homologous recombination during cell cycle in human cells.</a> Cell Cycle. 7, 2902-296 (2008).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

NHEJ פלורסנט מבחני HR כתב לספק דרך כמותית למדוד בנפרד עבור כל מסלול תיקון DSB in vivo. מבחני רגישים מאוד, כמו FACS יכולים לזהות באופן אמין 10 + התאים GFP ב 20,000 תאים. מבחני עשוי להיות מותאם למדידת אירועים לתקן &quot;בזמן אמת&quot; על ידי איתור את המראה של ה-GFP בתאים + בתוך דקות או שעות ל...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>EndoFree Plasmid Maxi kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Qiagen</td>
<td>12362</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Qiaex II Gel Extraction Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Qiagen</td>
<td>20021</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Amaxa Nucleofector</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Lonza</td>
<td>AAD-1001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Geneticin (G418)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>11811-031</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>pDsRed2-N1</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Clontech</td>
<td>632406</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Round bottom tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Falcon</td>
<td>352058</td>
<td>FACS tubes</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

analysis of dna double-strand break (dsb) repair in mammalian cells

גדיל הדנ&quot;א הכפול הפסקות הם נגעים DNA המסוכן ביותר שעלול להוביל לאובדן מסיבי של מידע גנטי ומוות התא. תאים לתקן DSBs באמצעות שני מסלולים עיקריים: nonhomologous סוף להצטרף (NHEJ) ו הומולוגיים רקומבינציה (HR). הפרעות של NHEJ ו HR הקשורים לעתים קרובות עם הזדקנות מוקדמת ו tumorigenesis, ולכן חשוב לנו דרך כמותית למדוד כל מסלול תיקון DSB. המעבדה שלנו פיתחה בונה כתב ניאון המאפשרים מדידה כמותית של רגיש NHEJ משאבי אנוש. בונה מבוססים על גן ה-GFP מהונדסים המכיל אתרים הכרה endonuclease I-SCEI נדיר חיתוך לזירוז של DSBs. בונה החל GFP הם שליליים כמו הגן GFP הוא מובטל ידי אקסון נוספת, או על ידי מוטציות. תיקון מוצלח של שוברת את I-SCEI הנגרמת על ידי NHEJ או HR משחזר את גן ה-GFP תפקודית. מספר התאים GFP חיובי נספר על ידי cytometry זרימה מספקת למדוד כמותית של NHEJ או יעילות משאבי אנוש.

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of DNA Double-strand Break DSB Repair in Mammalian Cells at JoVE.com

Analysis of DNA Double-strand Break DSB Repair in Mammalian Cells

מאמר זה מתאר GFP מבוססי פלואורסצנציה<em&gt; In vivo</em&gt; מבחני כי בנפרד לכמת הומולוגיים רקומבינציה ו nonhomologous סוף להצטרף בתאי יונקים.

ניתוח תיקון DNA פעמיים גדיל Break (DSB) בתאי יונקים

DNA double-strand breaks are the most dangerous DNA lesions that may lead to massive loss of genetic information and cell death.  Cells repair DSBs using ...

analysis-of-dna-double-strand-break-dsb-repair-in-mammalian-cells

Research

JoVE Journal

Biology

Analysis of DNA Double-strand Break (DSB) Repair in Mammalian Cells

31.5K Views.  University of Rochester. מאמר זה מתאר GFP מבוססי פלואורסצנציה In vivo מבחני כי בנפרד לכמת הומולוגיים רקומבינציה ו nonhomologous סוף להצטרף בתאי יונקים.

Video: Analysis of DNA Double-strand Break DSB Repair in Mammalian Cells

DNA Transfection of Mammalian Skeletal Muscles using In Vivo Electroporation

A growing interest in cell biology is to express transgenically modified forms of essential proteins (e.g. fluorescently tagged constructs and/or mutant variants) in order to investigate their endogenous distribution and functional relevance. An interesting approach that has been implemented to fulfill this objective in fully differentiated cells is the in vivo transfection of plasmids by various methods into specific tissues such as liver1, skeletal muscle2,3, and even the brain4. We present here a detailed description of the steps that must be followed in order to efficiently transfect genetic material into fibers of the flexor digitorum brevis (FDB) and interosseus (IO) muscles of adult mice using an in vivo electroporation approach. The experimental parameters have been optimized so as to maximize the number of muscle fibers transfected while minimizing tissue damages that may impair the quality and quantity of the proteins expressed in individual fibers. We have verified that the implementation of the methodology described in this paper results in a high yield of soluble proteins, i.e. EGFP and ECFP3, calpain, FKBP12, &beta;2a-DHPR, etc. ; structural proteins, i.e. minidystrophin and &alpha;-actinin; and membrane proteins, i.e. &alpha;1s-DHPR, RyR1, cardiac Na/Ca2+ exchanger , NaV1.4 Na channel, SERCA1, etc., when applied to FDB, IO and other muscles of mice and rats. The efficient expression of some of these proteins has been verified with biochemical3 and functional evidence5. However, by far the most common confirmatory approach used by us are standard fluorescent microscopy and 2-photon laser scanning microscopy (TPLSM), which permit to identify not only the overall expression, but also the detailed intracellular localization, of fluorescently tagged protein constructs. The method could be equally used to transfect plasmids encoding for the expression of proteins of physiological relevance (as shown here), or for interference RNA (siRNA) aiming to suppress the expression of normally expressed proteins (not tested by us yet). It should be noted that the transfection of FDB and IO muscle fibers is particularly relevant for the investigation of mammalian muscle physiology since fibers enzymatically dissociated from these muscles are currently one of the most suitable models to investigate basic mechanisms of excitability and excitation-contraction coupling under current or voltage clamp conditions2,6-8.

DNA Transfection of Mammalian Skeletal Muscles using In Vivo Electroporation

We describe detailed procedures for the efficient transfection of plasmid DNA into the fibers of foot muscles of live mice using electroporation and the subsequent visualization of protein expression using fluorescence microscopy.

ה-DNA transfection של שרירי השלד היונקים באמצעות In vivo Electroporation

 A growing interest in cell biology is to express transgenically modified forms of essential proteins (e.g. fluorescently tagged constructs and/or mutant ...

Pulse-chase Analysis of N-linked Sugar Chains from Glycoproteins in Mammalian Cells

Attachment of the Glc3Man9GlcNAc2 precursor oligosaccharide to nascent polypeptides in the ER is a common modification for secretory proteins. Although this modification was implicated in several biological processes, additional aspects of its function are emerging, with recent evidence of its role in the production of signals for glycoprotein quality control and trafficking. Thus, phenomena related to N-linked glycans and their processing are being intensively investigated. Methods that have been recently developed for proteomic analysis have greatly improved the characterization of glycoprotein N-linked glycans. Nevertheless, they do not provide insight into the dynamics of the sugar chain processing involved. For this, labeling and pulse-chase analysis protocols are used that are usually complex and give very low yields. We describe here a simple method for the isolation and analysis of metabolically labeled N-linked oligosaccharides. The protocol is based on labeling of cells with [2-3H] mannose, denaturing lysis and enzymatic release of the oligosaccharides from either a specifically immunoprecipitated protein of interest or from the general glycoprotein pool by sequential treatments with endo H and N-glycosidase F, followed by molecular filtration (Amicon). In this method the isolated oligosaccharides serve as an input for HPLC analysis, which allows discrimination between various glycan structures according to the number of monosaccharide units comprising them, with a resolution of a single monosaccharide. Using this method we were able to study high mannose N-linked oligosaccharide profiles of total cell glycoproteins after pulse-chase in normal conditions and under proteasome inhibition. These profiles were compared to those obtained from an immunoprecipitated ER-associated degradation (ERAD) substrate. Our results suggest that most NIH 3T3 cellular glycoproteins are relatively stable and that most of their oligosaccharides are trimmed to Man9-8GlcNAc2. In contrast, unstable ERAD substrates are trimmed to Man6-5GlcNAc2 and glycoproteins bearing these species accumulate upon inhibition of proteasomal degradation.

We describe a method for analysis of the alteration of N-linked glycans through the early life of glycoproteins after their biosynthesis in mammalian cells. This is achieved by pulse-chase analysis of metabolically labeled glycans, enzymatic release from glycoproteins and examination by HPLC.

Pulse-מרדף ניתוח של N-linked שרשראות סוכר מ גליקופרוטאינים בתאי יונקים

Attachment of the Glc3Man9GlcNAc2 precursor oligosaccharide to nascent polypeptides in the ER is a common modification for secretory proteins. Although ...

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying potassium (referred to as GIRK) channels, which are important for regulating the excitability of neurons. There are four different mammalian GIRK channel subunits (GIRK1-GIRK4) - we focus on GIRK2 because it forms a homotetramer. Stimulation of different types of G protein-coupled receptors (GPCRs), such as the muscarinic receptor (M2R), leads to activation of GIRK channels. Alcohol also directly activates GIRK channels. We will show how to mutate one amino acid by specifically changing one or more nucleotides in the cDNA for the GIRK channel. This mutated cDNA sequence will be amplified in bacteria, purified, and the presence of the point mutation will be confirmed by DNA sequencing. The cDNAs for the mutated and wild-type GIRK channels will be transfected into human embryonic kidney HEK293T cells cultured in vitro. Lastly, whole-cell patch-clamp electrophysiology will be used to study the macroscopic potassium currents through the ectopically expressed wild-type or mutated GIRK channels. In this experiment, we will examine the effect of a L257W mutation in GIRK2 channels on M2R-dependent and alcohol-dependent activation.

We will demonstrate how to study the effect of a single point mutation on the function of an ion channel.

Mutagenesis וניתוח פונקציונלי של תעלות יונים הביעו Heterologously בתאי יונקים

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

Schwann cells are one of the commonly used cells in repair strategies following spinal cord injuries. Schwann cells are capable of supporting axonal regeneration and sprouting by secreting growth factors 1,2 and providing growth promoting adhesion molecules 3 and extracellular matrix molecules 4. In addition they myelinate the demyelinated axons at the site of injury 5.
However following transplantation, Schwann cells do not migrate from the site of implant and do not intermingle with the host astrocytes 6,7. This results in formation of a sharp boundary between the Schwann cells and astrocytes, creating an obstacle for growing axons trying to exit the graft back into the host tissue proximally and distally. Astrocytes in contact with Schwann cells also undergo hypertrophy and up-regulate the inhibitory molecules 8-13.
In vitro assays have been used to model Schwann cell-astrocyte interactions and have been important in understanding the mechanism underlying the cellular behaviour.
These in vitro assays include boundary assay, where a co-culture is made using two different cells with each cell type occupying different territories with only a small gap separating the two cell fronts. As the cells divide and migrate, the two cellular fronts get closer to each other and finally collide. This allows the behaviour of the two cellular populations to be analyzed at the boundary. Another variation of the same technique is to mix the two cellular populations in culture and over time the two cell types segregate with Schwann cells clumped together as islands in between astrocytes together creating multiple Schwann-astrocyte boundaries.
The second assay used in studying the interaction of two cell types is the migration assay where cellular movement can be tracked on the surface of the other cell type monolayer 14,15. This assay is commonly known as inverted coverslip assay. Schwann cells are cultured on small glass fragments and they are inverted face down onto the surface of astrocyte monolayers and migration is assessed from the edge of coverslip.
Both assays have been instrumental in studying the underlying mechanisms involved in the cellular exclusion and boundary formation. Some of the molecules identified using these techniques include N-Cadherins 15, Chondroitin Sulphate proteoglycans(CSPGs) 16,17, FGF/Heparin 18, Eph/Ephrins19.
This article intends to describe boundary assay and migration assay in stepwise fashion and elucidate the possible technical problems that might occur.

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

This article intends to describe in stepwise fashion the commonly used in vitro assays used in studying Schwann cell-asrtocyte interactions.

ניתוח של שוואן-astrocyte אינטראקציות שימוש במבחנה מבחני

Schwann cells are one of the commonly used cells in repair strategies following spinal cord injuries. Schwann cells are capable of supporting axonal ...

Analysis of mRNA Nuclear Export Kinetics in Mammalian Cells by Microinjection

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although the nuclear export of mRNA has been studied extensively in Xenopus oocytes1 and genetically tractable organisms such as yeast2 and the Drosophila derived S2 cell line3, few studies had been conducted in mammalian cells. Furthermore the kinetics of mRNA export in mammalian somatic cells could only be inferred indirectly4,5. In order to measure the nuclear export kinetics of mRNA in mammalian tissue culture cells, we have developed an assay that employs the power of microinjection coupled with fluorescent in situ hybridization (FISH). These assays have been used to demonstrate that in mammalian cells, the majority of mRNAs are exported in a splicing dependent manner6,7, or in manner that requires specific RNA sequences such as the signal sequence coding region (SSCR) 6. In this assay, cells are microinjected with either in vitro synthesized mRNA or plasmid DNA containing the gene of interest. The microinjected cells are incubated for various time points then fixed and the sub-cellular localization of RNA is assessed using FISH. In contrast to transfection, where transcription occurs several hours after the addition of nucleic acids, microinjection of DNA or mRNA allows for rapid expression and allows for the generation of precise kinetic data.

Here we describe an assay that employs the power of microinjection coupled with fluorescent in situ hybridization in order to accurately measure the nuclear export kinetics of mRNA in mammalian somatic cells.

אנליזה של קינטיקה mRNA גרעיני ייצוא בתאי יונקים ידי Microinjection

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although ...

Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of cell proliferation underlies the pathology of diseases like cancer. As such there is great need to be able to investigate cell proliferation and quantitate the proportion of cells in each phase of the cell cycle. It is also of vital importance to indistinguishably identify cells that are replicating their DNA within a larger population. Since a cell&prime;s decision to proliferate is made in the G1 phase immediately before initiating DNA synthesis and progressing through the rest of the cell cycle, detection of DNA synthesis at this stage allows for an unambiguous determination of the status of growth regulation in cell culture experiments.
DNA content in cells can be readily quantitated by flow cytometry of cells stained with propidium iodide, a fluorescent DNA intercalating dye. Similarly, active DNA synthesis can be quantitated by culturing cells in the presence of radioactive thymidine, harvesting the cells, and measuring the incorporation of radioactivity into an acid insoluble fraction. We have considerable expertise with cell cycle analysis and recommend a different approach. We Investigate cell proliferation using bromodeoxyuridine/fluorodeoxyuridine (abbreviated simply as BrdU) staining that detects the incorporation of these thymine analogs into recently synthesized DNA. Labeling and staining cells with BrdU, combined with total DNA staining by propidium iodide and analysis by flow cytometry1 offers the most accurate measure of cells in the various stages of the cell cycle. It is our preferred method because it combines the detection of active DNA synthesis, through antibody based staining of BrdU, with total DNA content from propidium iodide. This allows for the clear separation of cells in G1 from early S phase, or late S phase from G2/M. Furthermore, this approach can be utilized to investigate the effects of many different cell stimuli and pharmacologic agents on the regulation of progression through these different cell cycle phases.
In this report we describe methods for labeling and staining cultured cells, as well as their analysis by flow cytometry. We also include experimental examples of how this method can be used to measure the effects of growth inhibiting signals from cytokines such as TGF-&beta;1, and proliferative inhibitors such as the cyclin dependent kinase inhibitor, p27KIP1. We also include an alternate protocol that allows for the analysis of cell cycle position in a sub-population of cells within a larger culture5. In this case, we demonstrate how to detect a cell cycle arrest in cells transfected with the retinoblastoma gene even when greatly outnumbered by untransfected cells in the same culture. These examples illustrate the many ways that DNA staining and flow cytometry can be utilized and adapted to investigate fundamental questions of mammalian cell cycle control.

Determining the cell cycle position of a population of cells, or understanding how signals affect proliferation, can be readily measured by flow cytometry using this protocol. We report a simple experimental approach to staining cells and quantifying their position in the cell cycle.

ניתוח של עמדת מחזור התא בתאי יונקים

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during development. Misregulation of this process has been implicated as a key event in fibrosis and the progression of carcinomas to a metastatic state. Understanding the processes that underlie EMT is imperative for the early diagnosis and clinical control of these disease states. Reliable induction of EMT in vitro is a useful tool for drug discovery as well as to identify common gene expression signatures for diagnostic purposes. Here we demonstrate a straightforward method for the induction of EMT in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells pre- and post-EMT induction by immunocytochemistry are also included. Additionally, we demonstrate the effectiveness of this method through antibody-based array analysis and migration/invasion assays.

A straightforward method is described for the induction of epithelial to mesenchymal transition (EMT) in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells in EMT states by immunocytochemistry are included.

אינדוקציה וניתוח של אפיתל לmesenchymal מעבר

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the development of diverse techniques to visualize individual RNA transcripts in single living cells. One promising technique that has recently been described utilizes an oligonucleotide-based optical probe, ratiometric bimolecular beacon (RBMB), to detect RNA transcripts that were engineered to contain at least four tandem repeats of the RBMB target sequence in the 3&#8217;-untranslated region. RBMBs are specifically designed to emit a bright fluorescent signal upon hybridization to complementary RNA, but otherwise remain quenched. The use of a synthetic probe in this approach allows photostable, red-shifted, and highly emissive organic dyes to be used for imaging. Binding of multiple RBMBs to the engineered RNA transcripts results in discrete fluorescence spots when viewed under a wide-field fluorescent microscope. Consequently, the movement of individual RNA transcripts can be readily visualized in real-time by taking a time series of fluorescent images. Here we describe the preparation and purification of RBMBs, delivery into cells by microporation and live-cell imaging of single RNA transcripts.

Ratiometric bimolecular beacons (RBMBs) can be used to image single engineered RNA transcripts in living cells. Here, we describe the preparation and purification of RBMBs, delivery of RBMBs into cells by microporation and fluorescent imaging of single RNA transcripts in real-time.

הדמיה בזמן אמת של יחיד תכנון הנדסי RNA תמלילים בתאים חיים באמצעות משואות bimolecular רציומטרי

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

Examination of Proteins Bound to Nascent DNA in Mammalian Cells Using  BrdU-ChIP-Slot-Western Technique

Histone deacetylases 1 and 2 (HDAC1,2) localize to the sites of DNA replication. In the previous study, using a selective inhibitor and a genetic knockdown system, we showed novel functions for HDAC1,2 in replication fork progression and nascent chromatin maintenance in mammalian cells. Additionally, we used a BrdU-ChIP-Slot-Western technique that combines chromatin immunoprecipitation (ChIP) of bromo-deoxyuridine (BrdU)-labeled DNA with slot blot and Western analyses to quantitatively measure proteins or histone modification associated with nascent DNA.
Actively dividing cells were treated with HDAC1,2 selective inhibitor or transfected with siRNAs against Hdac1 and Hdac2 and then newly synthesized DNA was labeled with the thymidine analog bromodeoxyuridine (BrdU). The BrdU labeling was done at a time point when there was no significant cell cycle arrest or apoptosis due to the loss of HDAC1,2 functions. Following labeling of cells with BrdU, chromatin immunoprecipitation (ChIP) of histone acetylation marks or the chromatin-remodeler was performed with specific antibodies. BrdU-labeled input DNA and the immunoprecipitated (or ChIPed) DNA was then spotted onto a membrane using the slot blot technique and immobilized using UV. The amount of nascent DNA in each slot was then quantitatively assessed using Western analysis with an anti-BrdU antibody. The effect of loss of HDAC1,2 functions on the levels of newly synthesized DNA-associated histone acetylation marks and chromatin remodeler was then determined by normalizing the BrdU-ChIP signal obtained from the treated samples to the control samples.

In this protocol, we describe a novel BrdU-ChIP-Slot-Western technique to examine proteins and histone modifications associated with newly synthesized or nascent DNA.

בדיקה של החלבונים Bound לינוקא DNA בתאי יונקים באמצעות טכניקת BrdU-שבב חריץ-מערבי

Histone deacetylases 1 and 2 (HDAC1,2) localize to the sites of DNA replication. In the previous study, using a selective inhibitor and a genetic ...

Analysis of Cell Suspensions Isolated from Solid Tissues by Spectral Flow Cytometry

Flow cytometry has been used for the past 40 years to define and analyze the phenotype of lymphoid and other hematopoietic cells. Initially restricted to the analysis of a few fluorochromes, currently there are dozens of different fluorescent dyes, and up to 14-18 different dyes can be combined at a time. However, several limitations still impair the analytical capabilities. Because of the multiplicity of fluorescent probes, data analysis has become increasingly complex due to the need of large, multi-parametric compensation matrices. Moreover, mutant mouse models carrying fluorescent proteins to detect and trace specific cell types in different tissues have become available, so the analysis (by flow cytometry) of auto-fluorescent cell suspensions obtained from solid organs is required. Spectral flow cytometry, which distinguishes the shapes of emission spectra along a wide range of continuous wavelengths, addresses some of these problems. The data is analyzed with an algorithm that replaces compensation matrices and treats auto-fluorescence as an independent parameter. Thus, spectral flow cytometry should be capable of discriminating fluorochromes with similar emission peaks and can provide a multi-parametric analysis without compensation requirements.
This protocol describes the spectral flow cytometry analysis, allowing for a 21-parameter (19 fluorescent probes) characterization and the management of an auto-fluorescent signal, providing high resolution in minor population detection. The results presented here show that spectral flow cytometry presents advantages in the analysis of cell populations from tissues difficult to characterize in conventional flow cytometry, such as the heart and the intestine. Spectral flow cytometry thus demonstrates the multi-parametric analytical capacity of high-performing conventional flow cytometry without the requirement for compensation and enables auto-fluorescence management.

This article describes spectral cytometry, a new approach in flow cytometry that uses the shapes of emission spectra to distinguish fluorochromes. An algorithm replaces compensations and can treat auto-fluorescence as an independent parameter. This new approach allows for the proper analysis of cells isolated from solid organs.

ניתוח של המתלים תא מבודד מרקמות Solid ידי זרימת cytometry ספקטרלי

Flow cytometry has been used for the past 40 years to define and analyze the phenotype of lymphoid and other hematopoietic cells. Initially restricted to ...