LRC-V. רוצה להקדיש את הנייר הזה לזכרו של ד&quot;ר לעדריאל ד ג&#39;ונסון, פרופ &#39;נפלא שאת בעדיפות ראשונה תמיד החינוך של התלמידים. אנחנו מתגעגעים אליך, לעדריאל. אנו אסירי תודה ז&#39;קלין מורנו על עזרתה בביצוע הניסויים המתוארים במחקר זה. מחקר זה נתמך על ידי מענק הניתן CY מן הקרן הלאומית למדע, MCB-0615390, ועל ידי הזנק וקרנות הניתנים LRC-V. מאוניברסיטת אלבמה בהאנטסוויל.

1. תא הכנה חלץ חינם. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שני גרם של Escherichia coli יבש חיידקי גלולה המתקבל יומן אמצע תרבויות שלב נשטפים, פעמיים, עם ליטר וחצי של חיץ מ&quot;מ המכיל 10 טריס-אצטט, pH 8.0, מגנזיום אצטט 14 מ&quot;מ, אצטט אשלגן 60 מ&quot;מ, 50 מיקרוגרם / phenylmethanesulphonylfluoride מ&quot;ל (PMSF) על ידי צנטריפוגה ב 5000 X גרם ל 5 דקות ב 4 ° C. לאחר כביסה, גלולה החיידק הוא resuspended ב 40 מ&quot;ל של חיץ א </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים חיידקיים הם שיבשו באמצעות העיתונות הצרפתית, החלת 6000 בלחץ psi. לחץ זה מתאים 600 יחידות באמצעות בוכנה אינץ&#39; אחד. המתלים שיבשו נאסף בתוך שפופרת זכוכית נקי (50 מ&quot;ל). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ההשעיה היא שיבשה שטופלו 1 mM dithiotreitol (DTT), והוא centrifuged ב XG 30,000 למשך 30 דקות. ההליך צנטריפוגה חוזרת, באמצעות supernatant שהתקבל. Supernatant הסופי הוא חילק (1 מ&quot;ל) לתוך microtubes. לבסוף, aliquots הם קפואים באמצעות קרח יבש תערובת אתנול או חנקן נוזלי, ומאוחסנים ב -60 ° C או -80 ° C. </li></ol> 2. הכנת תמציות חינם Cell מדולדלים של RF2. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 4.5 מ&quot;ל של חלבון 4B חרוזים sepharose slurry מעורבבים עם 5 מ&quot;ל של אנטי RF2 אנטי סרום באמצעות גלגל מסתובב בטמפרטורת החדר, במשך שעה אחת. התערובת היא centrifuged ב 2500 XG להפריד את החרוזים מן antiserum. לאחר השלכת supernatant, חרוזים אלה המכילים את אנטי RF2 נוגדנים (אנטי RF2 חרוזים) נשטפים בהמשך מ&quot;ל 1 של חיץ B המכיל 35 מ&quot;מ על ידי resuspension טריס-אצטט pH 7.8, מגנזיום אצטט 10 מ&quot;מ, 30 אמוניום אצטט מ&quot;מ, 60 גלוטמט אשלגן מ&quot;מ ו 5 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​של מעכבי proteinase leupeptin. אנטי RF2 חרוזים מופרדות מכן על ידי צנטריפוגה באמצעות אותם התנאים שצוינו לעיל מתוך המאגר B. ההליך כביסה חוזרים פעמיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחת מ&quot;ל של תמצית תאים חינם הוא מעורבב עם μL 150 של אנטי RF2 חרוזים באמצעות גלגל מסתובב, ב 4 ° C, למשך שעתיים. התערובת היא centrifuged ב XG 10,000 להפריד את תמצית תאים ללא החרוזים. Supernatant מוסר והתייחס שוב עם μL 150 נוסף של אנטי RF2 חרוזים. הליך זה חזר פעם נוספת עם פתרון התא ללא כתוצאה לחלץ. הפתרון הסופי תא ללא לחלץ הוא חילק (100 μL) לתוך microtubes. Aliquots קפואים באמצעות קרח יבש תערובת אתנול או חנקן נוזלי, ומאוחסנים ב -60 ° C או -80 ° C. </li></ol> 3. הכנת תבנית ה-DNA. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 1 מ&quot;ל PCR-600 תגובה על ידי femtomoles ערבוב של תבנית פלסמיד המכיל את רצפי להיות מתורגם (איור 1), עם 0.4 nanomoles של כל אחד oligodeoxynucleotides המצוין איור 1, 0.2 micromoles של dNTP כל 50-U של תקי פולימראז ה-DNA למאגר מסופק על ידי Stratagene ושות בצע את התגובה הגברה בתנאים בצע: 94 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות, (94 ° C למשך 30 שניות, 55 ° C למשך 30 שניות, 72 ° C עבור 1 דקה; עבור 30 מחזורי) ו 72 מעלות צלזיוס למשך 12 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטהר את מוצרי ה-PCR על ידי מזרז את ה-DNA על ידי הוספת נפח 1 / 10 של נתרן אצטט M 3, pH 5.2, ו - 2 כרכים של אתנול קרים כקרח. חזור על הליך משקעים פעם נוספת. Resuspend ה-DNA של 100 μL diethyl-pyrocarbonate (DEPC) טיפול במים. בדרך כלל, הליך זה מניב 100 מיקרוגרם של מוצר bp 600 דנ&quot;א. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את שלמות המוצרים PCR על ידי אלקטרופורזה על ג&#39;ל agarose. </li></ol> 4. הכנת ה-mRNA ביוטין תווית. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן μL 100 בתגובה שעתוק במבחנה במים שטופלו DEPC ידי ערבוב 5 מיקרוגרם של ה-PCR שנוצר שבר את ה-DNA עם 0.5 micromoles של ה-ATP, CTP, GTP, 0.3 micromoles של UTP, 50 nanomoles של ביוטין-16-UTP, ו - 10 μL תערובת של אנזים T7 במאגר מסופק על ידי Promega ושות דגירה את תערובת התגובה על 37 מעלות צלזיוס במשך 3 שעות. כדי לכמת את כמות ה-mRNA המתקבל, תבנית ה-DNA צריך לחסל על ידי הוספת RNase ללא DNase. דגירה התגובה על 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטהר את מוצרי ה-mRNA על ידי מזרז את הרנ&quot;א על ​​ידי הוספת נפח 1 / 10 של נתרן אצטט M 3, pH 5.2, ו - 2 כרכים של אתנול קר. חזור על הליך משקעים פעם נוספת. Resuspend ה-mRNA של 100 μL מים שטופלו DEPC. בדרך כלל, זה הליך התשואות בין 1-2 מ&quot;ג של ביוטין 600 nt שכותרתו מוצר ה-mRNA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את שלמות המוצרים שכותרתו ביוטין mRNA על ידי אלקטרופורזה על ג&#39;ל agarose. </li></ol> 5. בידוד של הריבוזומים תרגום המכיל Peptidyl-tRNA. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 500 μL של בתערובת תרגום במבחנה התגובה במים שטופלו DEPC ידי ערבוב 10-15 מיקרוגרם של ה-mRNA, ביוטין שכותרתו עם 75 nanomoles של כל אחד חומצות אמינו nineteen, למעט חומצה אמינית אשר יוחלפו על ידי חומצה אמינית רדיואקטיבי , 50 μCi של חומצה אמינית רדיואקטיבי (37MBq), ו 20-5<html> 0 μL של תמצית התא ללא RF2-מדולדל, בתערובת התגובה שנאגרו המכיל 40 מ&quot;מ טריס-אצטט, pH 8.0, מגנזיום אצטט 10 מ&quot;מ, 175 אצטט mM אשלגן, 10 אמוניום אצטט מ&quot;מ, 2 מ&quot;מ DTT, 2 mM ATP, 0.5 mM GTP, phosphoenolpyruvate 30 מ&quot;מ (PEP), 0.3 U / mL קינאז pyruvate (קי), פוליאתילן גליקול 8000 3.5%, 1 spermidine מ&quot;מ, 20 מיקרוגרם / חומצה folinic מ&quot;ל, ו -250 מיקרוגרם / מ&quot;ל tRNA מ E. coli. דגירה את תערובת התגובה על 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. סדר תוספת של מרכיבי התגובה היא מאוד חשובה. תמצית התא ללא חייב להיות מעורב הראשון עם הפתרון למאגר המכיל את חומצות האמינו ואת התערובת הסופית מודגרות במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר כדי לאפשר הפעלה של הריבוזומים. מאוחר יותר, ביוטין, כינה את mRNAs מתווספים. עבור ניתוחים מבניים באמצעות הליכי שינוי כימי, תוספת של חומצה אמינית רדיואקטיבי אינה נדרשת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים לתערובת את התרגום התגובה - 3 מ&quot;ל של חרוזים streptavidin פאראמגנטיים (SMB) תלויה חיץ C המכיל 35 מ&quot;מ טריס-אצטט, pH 8.0, מגנזיום אצטט 10 מ&quot;מ, 175 אצטט mM אשלגן, 10 mM אמוניום אצטט DTT 1 מ&quot;מ. לדגור על השעיית חדש בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפרד את SMB מתערובת על ידי הפעלת שדה מגנטי (MF) באמצעות עומד הפרדה מגנטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend ה-SMB במאגר C ו-להפריד בין החרוזים שוב באמצעות MF. חזור על נוהל זה שטיפה פעמיים. Resuspend את החרוזים μL 500 של חיץ C, לאחסן את ההשעיה על קרח, לבצע את ההליך הבא מיד. </li></ol> 6. ניתוח של הריבוזומים מבודד מכיל את Peptidyl-tRNA. עבור peptidyl-tRNA <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים 10 μL של ה-SMB (תלוי חיץ C) עם 10 μL של חיץ טעינת המכיל 50 מ&quot;מ טריס-HCl, pH 6.8, 2.5% (V / V) גליצרול, נתרן גופרתי 4% dodecyl, 2 מ&quot;מ DTT ו - 0.2 מ&quot;ג / mL bromophenol כחול. פתור את הרכיבים המחוברים חרוזים ידי הפעלת דגימות 10% טריס-tricine ג&#39;לים polyacrylamide. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יבש את הג&#39;לים באמצעות ואקום ג&#39;ל מייבש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את שלמות וטיהור של peptidyl-tRNA ידי חשיפת ג&#39;ל יבשים לצלם רנטגן. </li></ol> עבור RNA ריבוזומלי <ol start="4" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 190 μL של 2 פתרון ethylenediaminetetraacetate (EDTA) מ&quot;מ מוכן עם מים DEPC שטופלו, ו 200 μL של פנול equilibrated עם מים, כדי μL 10 ההשעיה חרוז. מערבבים את ההשעיה על ידי vortexing נמרץ להפריד את שלב אורגניים משלב אורגני על ידי צנטריפוגה ב XG 10,000 עבור 3 דקות בטמפרטורת החדר. אסוף את שכבת המים העליונה microtube חדש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשקע RNA משכבת ​​המים על ידי הוספת נפח 1 / 10 של נתרן אצטט M 3, pH 5.2, 1 μL של 20 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​של תמיסת גליקוגן, 2 כרכים של אתנול קר כקרח. Resuspend רנ&quot;א μL 10 מים DEPC שטופלו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את שלמות RNAs ריבוזומלי ידי אלקטרופורזה על ג&#39;ל agarose. בדרך כלל, 50 μL ההשעיה חרוזים התשואות 1μg של רנ&quot;א ריבוזומלי. </li></ol> 7. נציג תוצאות: תרשים 2 מציג את התוצאות של סדרת הניתוחים הערכת איכות התפקוד של הריבוזומים תרגום מבודד באמצעות ההליך המתואר. תצפית של להקה ייחודית נפתרה ג&#39;לים polyacrylamide מעיד על קיומו של פוליפפטידים מאוגדים ביוטין שכותרתו mRNAs מצורף ה-SMB (איור 2 א). טיהור RNAs ריבוזומלי באמצעות הליך זה קובע את נוכחותו של הריבוזומים קשורים אלה ביוטין שכותרתו mRNAs, כמו גם (2B איור). הוספת puromycin, אנטיביוטיקה שגורם לפעילות peptidyl-transferase של הריבוזום, התוצאות המחשוף של המתהווה peptidyl-tRNAs 1. זהו כפי שנצפה שינוי בדפוסי ההגירה של פוליפפטיד בודד ג&#39;לים polyacrylamide (איור 2C). יחד, נתונים אלה מצביעים על כך ביוטין שכותרתו mRNAs מצורף ה-SMB מכילים ריבוזומים פונקציונלי עם peptidyl-tRNAs. הבידוד של הריבוזומים תרגום המכיל ספציפי peptidyl-tRNAs היתרי חקר את ההשפעות של peptidyl-tRNAs, אנטיביוטיקה, ומולקולות אחרות, על תפקיד הריבוזום (איור 3A), וכן על מבנה הריבוזום (איור 3B). בכל הדוגמאות שהוצגו כאן sparsomycin אנטיביוטי לבין חומצת אמינו טריפטופן (TRP) לעכב את המחשוף hydrolytic של המתהווה tnaC-tRNA peptidyl-tRNA המושרה על ידי RF2 את הריבוזומים מבודד (איור 3A). האינטראקציה של sparsomycin או TRP עם הריבוזום גורם גם שינויים מבניים כמה נוקלאוטידים, המהווים את rRNA 23S של הריבוזום מתרגם (איור 3B). לסיכום, חומר ביולוגי שהושגו באמצעות ההליך המתואר כאן מועילים בהשגת הבנה נוספת של הקשרים המבניים המעורבים עיכוב של פונקציה הריבוזום על האינטראקציה שלו עם גורמים מולקולריים שונים. ove_content &quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/2498/2498fig1.jpg" alt="איור 1" /> באיור 1. נוהל המשמש לייצור ולטהר הריבוזומים תרגום המכיל peptidyl-tRNAs. שברי DNA CA. 650 נ&quot;ב אורך, המכיל את הגן tnaC ואת האזור הסמוך שלו, שמוצג באיור, משמשים כתבניות בהכנת mRNAs המכיל ביוטין, [(ביו) UMP] mRNA. שברים אלה DNA המיוצרים על ידי נהלים PCR באמצעות oligodeoxynucleotides המצוין בחלק העליון של הדמות. אותיות המסומנות בקו תחתון לסמן את המיקום של האמרגן T7 מקודד פריימר נוקלאוטיד. באותיות לציין את רצף Shine-Dalgarno המשמש התרגום של רצפי ה-mRNA tnaC. האמרגן T7 בקטע ה-DNA הוא מוכר על ידי RNA פולימראז T7 המשמש לתמלל (חץ) את רצף tnaC ואת ללא קידוד במורד רצף. תמלול הוא הופסק כאשר RNA פולימראז מגיע לסוף 3&#39;של קטע ה-DNA, לאחר רצף שליחות קטלנית rpoBC (rpoBC &quot;t&quot;). המבנה גזע לולאה של שליחות קטלנית rpoBC מגן על ה-mRNA מההווה פעילות 3&#39;-5 &quot;exoribonuclease את התא ללא תמציות בשימוש בתגובות במבחנה תרגום. מבודדים [(ביו) UMP] mRNAs משמשים ליצירת נתקע, ריבוזומים תרגום, תוך שימוש ב מבחני חוץ גופית תרגום. רצף tnaC ב [(ביו) UMP] mRNA מתורגם ע&quot;י הריבוזום אשר דוכני כאשר החומצה האמינית האחרונה משולב, בשל העדר גורם שחרור (RF2) מתערובת התגובה. הריבוזום-[(ביו) UMP] מתחמי mRNA מבודדים מתערובת התגובה הכולל שימוש streptavidin מגנטי, חרוזים (SMB) המחייבות את ביוטין שכותרתו נוקלאוטידים שולבו-mRNA. עסקים קטנים ובינוניים חייב את הריבוזום-[(ביו) UMP] מתחמי mRNA המחולצים מתערובת התגובה הכולל באמצעות שדה מגנטי (MF). <img src="/files/ftp_upload/2498/2498fig2.jpg" alt="איור 2" /> איור 2. מנתחת מבניים ותפקודיים של מתחמי מבודדים. א) תגובות במבחנה תרגום בוצעו עם [(ביו) UMP] mRNAs שבו קודון ההתחלה של הגן tnaC הוחלף קודון עצירה. המוצרים הסופיים היו מבודדים באמצעות חרוזים streptavidin, כפי שעולה באיור 1. תוצרי התגובה ומולקולות מבודד נותחו לאחר מכן על ידי אלקטרופורזה על ג&#39;ל polyacrylamide. TnaC-tRNA ו tnaC להקות פפטיד מסומנים. ב) סך RNA היה מבודד מן מתחמי נתקע באמצעות מיצוי הליכים פנול. כל RNA בודד נפתרה על ידי אלקטרופורזה ב agarose ג&#39;לים. RNAs ריבוזומלי (rRNAs) מצוינים. ג) מתחמי מבודד המכיל tnaC-tRNAs הודגרו עם (+) או בלי (-) 0.02 mM puromycin (פורו) בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. הפפטיד tnaC תויגו במהלך התרגום באמצעות [35S]-מתיונין (א) או [3H]-פרולין (B). <img src="/files/ftp_upload/2498/2498fig3.jpg" alt="איור 3" /> איור 3. מנתחת מבניים ותפקודיים של הריבוזומים המכיל tnaC-tRNA המאוגדים sparsomycin אנטיביוטי, או חומצת אמינו טריפטופן. א) מתחמי מבודד המכיל tnaC-tRNAs הודגרו עם (+) או בלי (-) sparsomycin (Spar) או טריפטופן (TRP) בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות. מאוחר יותר, תערובות היו מעורבבים עם RF2 וטופחו על 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. ב) ניתוח השינויים מתילציה ב 23S rRNA הנגרם על ידי מולקולות מחייב בתוך הריבוזום. מתחמי מבודד היו מראש מודגרות עם (+) או בלי (-) 2 מ&quot;מ או TRP Spar במשך 5 דקות ב 37 ° C. ואז, סוכן אלקילציה, דימתיל סולפט, נוספה ותערובות מודגרות בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות נוספות. סך RNA הופק והסיומת מבחני פריימר בוצעו עם [32P] שכותרתו oligodeoxynucleotide משלים את הנוקליאוטידים של rRNA 23S אשר מחולקת 100 נוקלאוטידים downstream של נוקלאוטיד שונה. המוצרים הסופיים של מבחני הרחבה נפתרו על ידי אלקטרופורזה על ג&#39;ל polyacrylamide. נוקלאוטידים 23S rRNA מושפעים על ידי נוכחות של TRP או Spar מצוינים.

<ol>
	<li>Cruz-Vera, L. R., Gong, M., Yanofsky, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+produced+by+bound+tryptophan+in+the+ribosome+peptidyl+transferase+center+in+response+to+tnaC,+a+nascent+leader+peptide.">Changes produced by bound tryptophan in the ribosome peptidyl transferase center in response to tnaC, a nascent leader peptide.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 103, 3598-3603 (2006).</li><li>Garza-Ramos, G., Xiong, L., Zhong, P., Mankin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+site+of+macrolide+antibiotics+on+the+ribosome:+new+resistance+mutation+identifies+a+specific+interaction+of+ketolides+with+rRNA.">Binding site of macrolide antibiotics on the ribosome: new resistance mutation identifies a specific interaction of ketolides with rRNA.</a> J. Bacteriol. 183, 6898-6907 (2001).</li><li>Gaynor, M., Mankin, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrolide+antibiotics:+binding+site,+mechanism+of+action,+resistance.">Macrolide antibiotics: binding site, mechanism of action, resistance.</a> Curr. Top. Med. Chem. 3, 949-961 (2003).</li><li>Polacek, N., Mankin, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ribosomal+peptidyl+transferase+center:+structure,+function,+evolution,+inhibition.">The ribosomal peptidyl transferase center: structure, function, evolution, inhibition.</a> Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 40, 285-311 (2005).</li><li>Steitz, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+insights+into+the+functions+of+the+large+ribosomal+subunit,+a+major+antibiotic+target.">Structural insights into the functions of the large ribosomal subunit, a major antibiotic target.</a> Keio J. Med. 57, 1-14 (2008).</li><li>Tenson, T., Mankin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibiotics+and+the+ribosome.">Antibiotics and the ribosome.</a> Mol. Microbiol. 59, 1664-1677 (2006).</li><li>Xiong, L., Korkhin, Y., Mankin, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+site+of+the+bridged+macrolides+in+the+Escherichia+coli+ribosome.">Binding site of the bridged macrolides in the Escherichia coli ribosome.</a> Antimicrob Agents Chemother. 49, 281-288 (2005).</li><li>Child, S. J., Miller, M. K., Geballe, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+control+by+an+upstream+open+reading+frame+in+the+HER-2/neu+transcript.">Translational control by an upstream open reading frame in the HER-2/neu transcript.</a> J. Biol. Chem. 274, 24335-24441 (1999).</li><li>Fang, P., Spevak, C. C., Wu, C., Sachs, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+nascent+polypeptide+domain+that+can+regulate+translation+elongation.">A nascent polypeptide domain that can regulate translation elongation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101, 4059-4064 (2004).</li><li>Janzen, D. M., Frolova, L., Geballe, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+translation+termination+mediated+by+an+interaction+of+eukaryotic+release+factor+1+with+a+nascent+peptidyl-tRNA.">Inhibition of translation termination mediated by an interaction of eukaryotic release factor 1 with a nascent peptidyl-tRNA.</a> Mol. Cell. Biol. 22, 8562-8570 (2002).</li><li>Nakatogawa, H., Ito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ribosomal+exit+tunnel+functions+as+a+discriminating+gate.">The ribosomal exit tunnel functions as a discriminating gate.</a> Cell. 108, 629-636 (2002).</li><li>Onouchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nascent+peptide-mediated+translation+elongation+arrest+coupled+with+mRNA+degradation+in+the+CGS1+gene+of+Arabidopsis.">Nascent peptide-mediated translation elongation arrest coupled with mRNA degradation in the CGS1 gene of Arabidopsis.</a> Genes Dev. 19, 1799-1810 (2005).</li><li>Raney, A., Law, G. L., Mize, G. J., Morris, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulated+translation+termination+at+the+upstream+open+reading+frame+in+s-adenosylmethionine+decarboxylase+mRNA.">Regulated translation termination at the upstream open reading frame in s-adenosylmethionine decarboxylase mRNA.</a> J. Biol. Chem. 277, 5988-5994 (2002).</li><li>Cruz-Vera, L. R., Rajagopal, S., Squires, C., Yanofsky, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Features+of+ribosome-peptidyl-tRNA+interactions+essential+for+tryptophan+induction+of+tna+operon+expression.">Features of ribosome-peptidyl-tRNA interactions essential for tryptophan induction of tna operon expression.</a> Mol. Cell. 19, 333-343 (2005).</li><li>Cruz-Vera, L. R., Yanofsky, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conserved+Residues+Asp16+and+Pro24+of+tnaC-tRNAPro+Participate+in+Tryptophan+Induction+of+tna+Operon+Expression.">Conserved Residues Asp16 and Pro24 of tnaC-tRNAPro Participate in Tryptophan Induction of tna Operon Expression.</a> J. Bacteriol. 190, 4791-4797 (2008).</li><li>Cruz-Vera, L. R., Yang, R., Yanofsky, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tryptophan+inhibits+Proteus+vulgaris+tnaC+leader+peptide+elongation,+activating+tna+operon+expression.">Tryptophan inhibits Proteus vulgaris tnaC leader peptide elongation, activating tna operon expression.</a> J Bacteriol. 191, 7001-7006 (2009).</li><li>Cruz-Vera, L. R., New, A., Squires, C., Yanofsky, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosomal+features+essential+for+tna+operon+induction:+tryptophan+binding+at+the+peptidyl+transferase+center.">Ribosomal features essential for tna operon induction: tryptophan binding at the peptidyl transferase center.</a> J. Bacteriol. 189, 3140-3146 (2007).</li><li>Shimizu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+translation+reconstituted+with+purified+components.">Cell-free translation reconstituted with purified components.</a> Nat. Biotechnol. 19, 751-755 (2001).</li><li>Kinoshita, Y., Nishigaki, K., Husimi, Y. F. l. u. o. r. e. s. c. e. n. c. e. -. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=isotope-+or+biotin-labeling+of+the+5+'-end+of+single-stranded+DNA/RNA+using+T4+RNA+ligase.">isotope- or biotin-labeling of the 5 '-end of single-stranded DNA/RNA using T4 RNA ligase.</a> Nucleic Acids Res. 25, 3747-3748 (1997).</li><li>Nishigaki, K., Taguchi, K., Kinoshita, Y., Aita, T., Husimi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Y-ligation:+an+efficient+method+for+ligating+single-stranded+DNAs+and+RNAs+with+T4+RNA+ligase.">Y-ligation: an efficient method for ligating single-stranded DNAs and RNAs with T4 RNA ligase.</a> Mol Divers. 4, 187-190 (1998).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

הליך זה בידוד שתוארו בדו&quot;ח זה הוא מאוד לשחזור. למרבה הצער, בנוכחות קצר peptidyl-tRNAs המופק רצפי לתרגם אותו לא ניתן להימנע בנוחות, כגון peptidyl-tRNAs מתאימות 15-20% של החומר מבודד הכולל (איור 2C). מזהמים אלה עשויות להגביר את ריכוז כאשר ריכוזים גבוהים יותר של mRNA ביוטין שכותרתו כבר בשימוש או כאשר התא ללא תמציות בהם נעשה שימוש הם ישנים או כבר שימוש חוזר מספר פעמים. לכן, חשוב מאוד לשלוט על איכות הריכוז של מרכיבי בתגובות במבחנה תרגום. לחלופין, יעילות גבוהה מסחרי מחדש תאים ללא תמציות זמינים שיכולים לשמש לאותן מטרות (מערכת PURE) 18. באמצעות שיטה זו, ביוטין-16-UMP משולב באקראי לאורכו של mRNA המטרה. קיימת אפשרות כי חלק ORFs המכיל קטעי uridine יכול להיות משולבים זה שונה נוקליאוטידים ברצפי שלהם, המשפיעים על התרגום שלהם. ריכוזים ביחס משתנה של biotin-16-UTP/UTP צריך להיבדק במהלך סינתזה של mRNA על מנת להשיג את התרגום היעילה ביותר. שיטות חלופיות של תיוג ביוטין יכול לשמש, מיקוד 5&#39;-end, סוף היציב ביותר של mRNAs. (I) ביוטין יכול להיות מצורף בסוף 5&#39;-של ה-mRNA באמצעות 3&#39;-NH2ATP (3&#39;אמינו, 3&#39;-deoxyadenosine טריפוספט) ו-RNA האנזים T4 19. (Ii) 5&#39;-end ביוטין שכותרתו oligonucleotide יכול להיות מצורף בסוף 5&#39;-של ה-mRNA באמצעות האנזים T4-RNA, כמו גם 20. (Iii) 3&#39;סוף ביוטין שכותרתו oligodeoxynucleotides אשר מתאימות רצף משלים בסוף 5&#39;-the-mRNA יכול לשמש גם כדי לבודד את מתחמי תרגום. Oligodeoxynucleotides אלה שכותרתו ביוטין יכול לצרף ה-SMB לפני הבידוד. מאוחר יותר SMB המצורפת ביוטין שכותרתו oligodeoxynucleotides יכול להיות מעורבב עם תערובת התרגום התגובה כדי לאפשר אינטראקציה עם רצפים משלימים שלהם mRNA. לאחר הבידוד, האזור היברידית RNA-DNA - והאזור והכלאה בין oligodeoxynucleotide ביוטין, שכותרתו את רצף ה-mRNA - יכול להיות מושפל באמצעות RNAse H, המפריד בין מתחמי עוכבה מן החרוזים streptavidin. זו שיטה חלופית עשויה לאפשר את מתחמי להיות מועסקים מנתח מבניים בעתיד בשיטות רזולוציה גבוהה יותר.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Tris base</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>252859</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Magnesium acetate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fluka</td>
<td>63049</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Potassium glutamate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>G1501</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ammonium acetate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fluka</td>
<td>09688</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PMSF</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P7626</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Protein A sepharose 4B slurry beads</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P9424</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Leupeptin inhibitor</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>L9783</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Taq-DNA polymerase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Stratagene</td>
<td>201223</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>T7 Maxiprep kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Promega</td>
<td>P1300</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>SMB</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Promega</td>
<td>Z5482</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Biotin-16-UTP</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche</td>
<td>1388908</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>ATP</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>A7699</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>GTP</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>G8877</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PEP</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P7002</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PK</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P7768</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Polyethylenglycol 8000</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fluka</td>
<td>81268</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Folinic acid</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fluka</td>
<td>47612</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Spermidine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fluka</td>
<td>85558</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>tRNA from E. coli</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>R1753</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DEPC</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>D5758</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tricine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>T5816</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L-amino acids</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>LAA21</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DTT</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fluka</td>
<td>43815</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>magnetic separation stands</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Promega</td>
<td>Z5342</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

isolation of translating ribosomes containing peptidyl-trnas for functional and structural analyses

לאחרונה, מחקרים מבניים ביוכימיים רבים יש מפורט של האירועים המולקולריים המתרחשים הריבוזום במהלך עיכוב של סינתזת החלבון על ידי אנטיביוטיקה במהלך הסינתזה פוליפפטיד המתהווה. חלק מאותם אנטיביוטיקה, פוליפפטידים המתהווה הרגולציה בעיקר בצורת peptidyl-tRNAs, לעכב או היווצרות הקשר פפטיד או סיום התרגום 1-7. אירועים אלה מעכבות יכול לעצור את התנועה של הריבוזום, תופעה שמכונה &quot;מעצר translational&quot;. מעצר תרגום המושרה על ידי אנטיביוטיקה או פוליפפטיד המתהווה הוכח לווסת את הביטוי של גנים המעורבים תפקודים תאיים מגוונים כגון צמיחת תאים, עמידות לאנטיביוטיקה, טרנסלוקציה חלבון מטבוליזם התא 8-13. הידע של איך אנטיביוטיקה פוליפפטידים המתהווה הרגולציה לשנות את תפקוד הריבוזום הוא חיוני אם אנחנו רוצים להבין את התפקיד המלא של הריבוזום בתרגום, כל אורגניזם. כאן אנו מתארים מתודולוגיה פשוטה, שניתן להשתמש בהם כדי לטהר, בלעדי, לצורך ניתוח, ריבוזומים אלה בתרגום mRNA ספציפי המכיל מסוים peptidyl-tRNA 14. הליך זה מבוסס על בידוד סלקטיבי של הריבוזומים בתרגום מאוגד mRNA ביוטין שכותרתו. קומפלקסים אלה translational מופרדים הריבוזומים אחרים בתערובת זאת, באמצעות חרוזים פאראמגנטיים streptavidin (SMB) ואת שדה מגנטי (MF). MRNAs ביוטין שכותרתו מסונתזים על ידי נגר מבחני שעתוק באמצעות כתבניות PCR שנוצר שברי דנ&quot;א המכילים מקדמי T7 תעתיק. T7-RNA פולימראז משלבת ביוטין-16-UMP ביוטין מ-UTP, בתנאים שלנו כעשרה ביוטין-16-UMP מולקולות משולבות mRNA nt 600 עם תוכן UMP 25%. אלה ביוטין שכותרתו mRNAs מבודדים אז, השתמשו ב מבחני חוץ גופית התרגום הופיע עם גורם לשחרור 2 (RF2)-מדולדל תא ללא תמציות המתקבל זני Escherichia coli המכיל סוג בר או ריבוזומים מוטציה. הריבוזומים לתרגם את ביוטין שכותרתו רצפי ה-mRNA תקועות על האזור קודון לעצור, בשל העדר של חלבון RF2, אשר בדרך כלל משיג סיום התרגום. הריבוזומים תקוע המכיל את מסונתז החדש peptidyl-tRNA מבודדות להסיר את התגובות תרגום באמצעות SMB ו MF. חרוזים אלה רק לקשור ביוטין המכילים מסרים. מבודד, מתחמי translational, ניתן להשתמש כדי לנתח את התכונות מבניים ותפקודיים של סוג בר או רכיבים ריבוזומלי מוטציה, או peptidyl-tRNA רצפים, כמו גם בקביעת הריבוזום אינטראקציה עם אנטיביוטיקה או גורמים מולקולריים אחרים 1,14-16. כדי לבחון את הפונקציה של אלה מתחמי הריבוזום מבודדים, peptidyl-transferase מבחני יכול להתבצע בנוכחות של אנטיביוטיקה puromycin 1. כדי לחקור שינויים מבניים מתחמי translational, נהלים מבוססת היטב יכול לשמש, כגון i) crosslinking ל 14 חומצות אמינו ספציפיות ו / או ii) הגנה אלקילציה מבחני 1,14,17.

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Translating Ribosomes Containing Peptidyl-tRNAs for Functional and Structural Analyses at JoVE.com

Isolation of Translating Ribosomes Containing Peptidyl-tRNAs for Functional and Structural Analyses

מכשול משמעותי מנתח ביוכימיים של הריבוזומים המכיל המתהווה peptidyl-tRNAs כבר נוכחות של הריבוזומים אחרים דגימות אותו, ריבוזומים לא מעורב בתרגום של רצף ה-mRNA ספציפי להיות מנותח. פיתחנו מתודולוגיה פשוטה כדי לטהר, בלעדי, את הריבוזומים המכיל את המתהווה peptidyl-tRNA של עניין.

בידוד של הריבוזומים תרגום המכילים Peptidyl-tRNAs עבור ניתוח פונקציונלי מבנית

Recently, structural and biochemical studies have detailed many of the molecular events that occur in the ribosome during inhibition of protein synthesis ...

isolation-translating-ribosomes-containing-peptidyl-trnas-for

Research

JoVE Journal

Biology

19.7K Views.  University of Alabama Huntsville. מכשול משמעותי מנתח ביוכימיים של הריבוזומים המכיל המתהווה peptidyl-tRNAs כבר נוכחות של הריבוזומים אחרים דגימות אותו, ריבוזומים לא מעורב בתרגום של רצף ה-mRNA ספציפי להיות מנותח. פיתחנו מתודולוגיה פשוטה כדי לטהר, בלעדי, את הריבוזומים המכיל את המתהווה peptidyl-tRNA של עניין.

Video: Isolation of Translating Ribosomes Containing Peptidyl-tRNAs for Functional and Structural Analyses

Crystallizing Membrane Proteins for Structure Determination using Lipidic Mesophases

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the lipidic cubic phase or in meso method. The method has been shown to be quite versatile in that it has been used to solve X-ray crystallographic structures of prokaryotic and eukaryotic proteins, proteins that are monomeric, homo- and hetero-multimeric, chromophore-containing and chromophore-free, and alpha-helical and beta-barrel proteins. Recent successes using in meso crystallization are the human engineered beta2-adrenergic and adenosine A2a G protein-coupled receptors. Protocols are presented for reconstituting the membrane protein into the monoolein-based mesophase, and for setting up crystallizations in the manual mode. Additional steps in the overall process, such as crystal harvesting, are to be addressed in future video articles. The time required to prepare the protein-loaded mesophase and to set up a crystallization plate manually is about one hour.

Herein is described the procedure implemented in the Caffrey Membrane Structural and Functional Biology Group to set up manually crystallization trials of membrane proteins in lipidic mesophases.

גיבוש חלבונים בממברנה עבור קביעת מבנה באמצעות Mesophases Lipidic

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the ...

Evisceration of Mouse Vitreous and Retina for Proteomic Analyses

While the mouse retina has emerged as an important genetic model for inherited retinal disease, the mouse vitreous remains to be explored. The vitreous is a highly aqueous extracellular matrix overlying the retina where intraocular as well as extraocular proteins accumulate during disease.1-3 Abnormal interactions between vitreous and retina underlie several diseases such as retinal detachment, proliferative diabetic retinopathy, uveitis, and proliferative vitreoretinopathy.1,4 The relative mouse vitreous volume is significantly smaller than the human vitreous (Figure 1), since the mouse lens occupies nearly 75% of its eye.5 This has made biochemical studies of mouse vitreous challenging. In this video article, we present a technique to dissect and isolate the mouse vitreous from the retina, which will allow use of transgenic mouse models to more clearly define the role of this extracellular matrix in the development of vitreoretinal diseases.

The dissection technique illustrates evisceration of the vitreous, retina, and lens from the mouse eye, separation by centrifugation, and characterization with protein assays.

הוצאת הקרביים של הזגוגיות עכבר רשתית עבור ניתוח proteomic

While the mouse retina has emerged as an important genetic model for inherited retinal disease, the mouse vitreous remains to be explored. The vitreous is ...

Isolation and Characterization of RNA-Containing Exosomes

The field of exosome research is rapidly expanding, with a dramatic increase in publications in recent years. These small vesicles (30-100 nm) of endocytic origin were first proposed to function as a way for reticulocytes to eradicate the transferrin receptor while maturing into erythrocytes1, and were later named exosomes. Exosomes are formed by inward budding of late endosomes, producing multivesicular bodies (MVBs), and are released into the environment by fusion of the MVBs with the plasma membrane2. Since the first discovery of exosomes, a wide range of cells have been shown to release these vesicles. Exosomes have also been detected in several biological fluids, including plasma, nasal lavage fluid, saliva and breast milk3-6. Furthermore, it has been demonstrated that the content and function of exosomes depends on the originating cell and the conditions under which they are produced. A variety of functions have been demonstrated for exosomes, such as induction of tolerance against allergen7,8, eradication of established tumors in mice9, inhibition and activation of natural killer cells10-12, promotion of differentiation into T regulatory cells13, stimulation of T cell proliferation14 and induction of T cell apoptosis15. Year 2007 we demonstrated that exosomes released from mast cells contain messenger RNA (mRNA) and microRNA (miRNA), and that the RNA can be shuttled from one cell to another via exosomes. In the recipient cells, the mRNA shuttled by exosomes was shown to be translated into protein, suggesting a regulatory function of the transferred RNA16. Further, we have also shown that exosomes derived from cells grown under oxidative stress can induce tolerance against further stress in recipient cells and thus suggest a biological function of the exosomal shuttle RNA17. Cell culture media and biological fluids contain a mixture of vesicles and shed fragments. A high quality isolation method for exosomes, followed by characterization and identification of the exosomes and their content, is therefore crucial to distinguish exosomes from other vesicles and particles. Here, we present a method for the isolation of exosomes from both cell culture medium and body fluids. This isolation method is based on repeated centrifugation and filtration steps, followed by a final ultracentrifugation step in which the exosomes are pelleted. Important methods to identify the exosomes and characterize the exosomal morphology and protein content are highlighted, including electron microscopy, flow cytometry and Western blot. The purification of the total exosomal RNA is based on spin column chromatography and the exosomal RNA yield and size distribution is analyzed using a Bioanalyzer.

This paper demonstrates methods for the isolation, purification and detection of exosomes, as well as techniques for analysis of their molecular content. These methods are adaptable for exosome isolation from both cell culture media and biological fluids, and can beyond analysis of molecular content also be useful in functional studies.

בידוד ואפיון של RNA המכיל Exosomes

The field of exosome research is rapidly expanding, with a dramatic increase in publications in recent years. These small vesicles (30-100 nm) of ...

Chromatographic Purification of Highly Active Yeast Ribosomes

Eukaryotic ribosomes are much more labile as compared to their eubacterial and archael counterparts, thus posing a significant challenge to researchers. Particularly troublesome is the fact that lysis of cells releases a large number of proteases and nucleases which can degrade ribosomes. Thus, it is important to separate ribosomes from these enzymes as quickly as possible. Unfortunately, conventional differential ultracentrifugation methods leaves ribosomes exposed to these enzymes for unacceptably long periods of time, impacting their structural integrity and functionality. To address this problem, we utilize a chromatographic method using a cysteine charged Sulfolink resin. This simple and rapid application significantly reduces co-purifying proteolytic and nucleolytic activities, producing high yields of intact, highly biochemically active yeast ribosomes. We suggest that this method should also be applicable to mammalian ribosomes. The simplicity of the method, and the enhanced purity and activity of chromatographically purified ribosome represents a significant technical advancement for the study of eukaryotic ribosomes.

Contamination of preparations of eukaryotic ribosomes purified by traditional methods by co-purifying nucleases and proteases negatively impacts on downstream biochemical and structural analyses. A rapid and simple chromatographic purification method is used to solve this problem using yeast ribosomes as a model system.

טיהור chromatographic של הריבוזומים שמרים מאוד פעיל

Eukaryotic ribosomes are much more labile as compared to their eubacterial and archael counterparts, thus posing a significant challenge to researchers.  ...

Use of a Robot for High-throughput Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through macromolecular X-ray crystallography (MX). An essential ingredient of MX is a steady supply of ideally diffraction-quality crystals. The in meso or lipidic cubic phase (LCP) method for crystallizing membrane proteins is one of several methods available for crystallizing membrane proteins. It makes use of a bicontinuous mesophase in which to grow crystals. As a method, it has had some spectacular successes of late and has attracted much attention with many research groups now interested in using it. One of the challenges associated with the method is that the hosting mesophase is extremely viscous and sticky, reminiscent of a thick toothpaste. Thus, dispensing it manually in a reproducible manner in small volumes into crystallization wells requires skill, patience and a steady hand. A protocol for doing just that was developed in the Membrane Structural &amp; Functional Biology (MS&amp;FB) Group1-3. JoVE video articles describing the method are available1,4. 
The manual approach for setting up in meso trials has distinct advantages with specialty applications, such as crystal optimization and derivatization. It does however suffer from being a low throughput method. Here, we demonstrate a protocol for performing in meso crystallization trials robotically. A robot offers the advantages of speed, accuracy, precision, miniaturization and being able to work continuously for extended periods under what could be regarded as hostile conditions such as in the dark, in a reducing atmosphere or at low or high temperatures. An in meso robot, when used properly, can greatly improve the productivity of membrane protein structure and function research by facilitating crystallization which is one of the slow steps in the overall structure determination pipeline. 
In this video article, we demonstrate the use of three commercially available robots that can dispense the viscous and sticky mesophase integral to in meso crystallogenesis. The first robot was developed in the MS&amp;FB Group5,6. The other two have recently become available and are included here for completeness.	
An overview of the protocol covered in this article is presented in Figure 1. All manipulations were performed at room temperature (~20 &deg;C) under ambient conditions.

Herein is described a robotic approach to high-throughput crystallization of membrane proteins in lipidic mesophases for use in structure determination using macromolecular X-ray crystallography. Three robots capable of handling the viscous and sticky protein-laden mesophase integral to the method are introduced.

שימוש ברובוט להתגבשות תפוקה גבוהה של חלבונים בממברנה בMesophases Lipidic

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through ...

Harvesting and Cryo-cooling Crystals of Membrane Proteins Grown in Lipidic Mesophases for Structure Determination by Macromolecular Crystallography

An important route to understanding how proteins function at a mechanistic level is to have the structure of the target protein available, ideally at atomic resolution. Presently, there is only one way to capture such information as applied to integral membrane proteins (Figure 1), and the complexes they form, and that method is macromolecular X-ray crystallography (MX). To do MX diffraction quality crystals are needed which, in the case of membrane proteins, do not form readily. A method for crystallizing membrane proteins that involves the use of lipidic mesophases, specifically the cubic and sponge phases1-5, has gained considerable attention of late due to the successes it has had in the G protein-coupled receptor field6-21 (<a href="http://www.mpdb.tcd.ie" target="_blank">www.mpdb.tcd.ie</a>). However, the method, henceforth referred to as the in meso or lipidic cubic phase method, comes with its own technical challenges. These arise, in part, due to the generally viscous and sticky nature of the lipidic mesophase in which the crystals, which are often micro-crystals, grow. Manipulating crystals becomes difficult as a result and particularly so during harvesting22,23. Problems arise too at the step that precedes harvesting which requires that the glass sandwich plates in which the crystals grow (Figure 2)24,25 are opened to expose the mesophase bolus, and the crystals therein, for harvesting, cryo-cooling and eventual X-ray diffraction data collection.
The cubic and sponge mesophase variants (Figure 3) from which crystals must be harvested have profoundly different rheologies4,26. The cubic phase is viscous and sticky akin to a thick toothpaste. By contrast, the sponge phase is more fluid with a distinct tendency to flow. Accordingly, different approaches for opening crystallization wells containing crystals growing in the cubic and the sponge phase are called for as indeed different methods are required for harvesting crystals from the two mesophase types. Protocols for doing just that have been refined and implemented in the Membrane Structural and Functional Biology (MS&amp;FB) Group, and are described in detail in this JoVE article (Figure 4). Examples are given of situations where crystals are successfully harvested and cryo-cooled. We also provide examples of cases where problems arise that lead to the irretrievable loss of crystals and describe how these problems can be avoided. In this article the Viewer is provided with step-by-step instructions for opening glass sandwich crystallization wells, for harvesting and for cryo-cooling crystals of membrane proteins growing in cubic and in sponge phases.

Herein is described procedures implemented in the Caffrey Membrane Structural and Functional Biology Group to harvest and cryo-cool membrane protein crystals grown in lipidic cubic and sponge phases for use in structure determination using macromolecular X-ray crystallography.

קצירה וCryo-קירור גבישים של חלבונים בממברנה גדלו בMesophases Lipidic לקביעת מבנה על ידי קריסטלוגרפיה Macromolecular

An important route to understanding how proteins function at a mechanistic level is to have the structure of the target protein available, ideally at ...

Isolation, Culture, and Functional Characterization of Adult Mouse Cardiomyoctyes

The use of primary cardiomyocytes (CMs) in culture has provided a powerful complement to murine models of heart disease in advancing our understanding of heart disease. In particular, the ability to study ion homeostasis, ion channel function, cellular excitability and excitation-contraction coupling and their alterations in diseased conditions and by disease-causing mutations have led to significant insights into cardiac diseases. Furthermore, the lack of an adequate immortalized cell line to mimic adult CMs, and the limitations of neonatal CMs (which lack many of the structural and functional biomechanics characteristic of adult CMs) in culture have hampered our understanding of the complex interplay between signaling pathways, ion channels and contractile properties in the adult heart strengthening the importance of studying adult isolated cardiomyocytes. Here, we present methods for the isolation, culture, manipulation of gene expression by adenoviral-expressed proteins, and subsequent functional analysis of cardiomyocytes from the adult mouse. The use of these techniques will help to develop mechanistic insight into signaling pathways that regulate cellular excitability, Ca2+ dynamics and contractility and provide a much more physiologically relevant characterization of cardiovascular disease.

Here we describe the isolation of adult mouse cardiomyoctyes using a Langendorff perfusion system. The resulting cells are Ca2+-tolerant, electrically quiescent and can be cultured and transfected with adeno- or lentiviruses to manipulate gene expression. Their functionality can also be analyzed using the MMSYS system and patch clamp techniques.

בידוד, תרבות ואפיון פונקציונלי של Cardiomyoctyes מאוס למבוגרים

The use of primary cardiomyocytes (CMs) in culture has provided a powerful complement to murine models of heart disease in advancing our understanding of ...

Reconstitution of a Kv Channel into Lipid Membranes for Structural and Functional Studies

To study the lipid-protein interaction in a reductionistic fashion, it is necessary to incorporate the membrane proteins into membranes of well-defined lipid composition. We are studying the lipid-dependent gating effects in a prototype voltage-gated potassium (Kv) channel, and have worked out detailed procedures to reconstitute the channels into different membrane systems. Our reconstitution procedures take consideration of both detergent-induced fusion of vesicles and the fusion of protein/detergent micelles with the lipid/detergent mixed micelles as well as the importance of reaching an equilibrium distribution of lipids among the protein/detergent/lipid and the detergent/lipid mixed micelles. Our data suggested that the insertion of the channels in the lipid vesicles is relatively random in orientations, and the reconstitution efficiency is so high that no detectable protein aggregates were seen in fractionation experiments. We have utilized the reconstituted channels to determine the conformational states of the channels in different lipids, record electrical activities of a small number of channels incorporated in planar lipid bilayers, screen for conformation-specific ligands from a phage-displayed peptide library, and support the growth of 2D crystals of the channels in membranes. The reconstitution procedures described here may be adapted for studying other membrane proteins in lipid bilayers, especially for the investigation of the lipid effects on the eukaryotic voltage-gated ion channels.

Procedures for complete reconstitution of a prototype voltage-gated potassium channel into lipid membranes are described. The reconstituted channels are suitable for biochemical assays, electrical recordings, ligand screening and electron crystallographic studies. These methods may have general applications to the structural and functional studies of other membrane proteins.

כינונה מחדש של ערוץ Kv לממברנות שומנים בדם למבני ותפקודיים ללימודים

To study the lipid-protein interaction in a reductionistic fashion, it is necessary to incorporate the membrane proteins into membranes of well-defined ...

Isolation and Functional Analysis of Mitochondria from Cultured Cells and Mouse Tissue

Comparison between two or more distinct groups, such as healthy vs. disease, is necessary to determine cellular status. Mitochondria are at the nexus of cell heath due to their role in both cell metabolism and energy production as well as control of apoptosis. Therefore, direct evaluation of isolated mitochondria and mitochondrial perturbation offers the ability to determine if organelle-specific (dys)function is occurring. The methods described in this protocol include isolation of intact, functional mitochondria from HEK cultured cells and mouse liver and spinal cord, but can be easily adapted for use with other cultured cells or animal tissues. Mitochondrial function assessed by TMRE and the use of common mitochondrial uncouplers and inhibitors in conjunction with a fluorescent plate reader allow this protocol not only to be versatile and accessible to most research laboratories, but also offers high throughput.

Comparison of mitochondrial membrane potential between samples yields valuable information about cellular status. Detailed steps for isolating mitochondria and assessing response to inhibitors and uncouplers using fluorescence are described. The method and utility of this protocol are illustrated by use of a cell culture and animal model of cellular stress.

בידוד וניתוח פונקציונלי של המיטוכונדריה מתאים בתרבית ורקמות עכבר

Comparison between two or more distinct groups, such as healthy vs. disease, is necessary to determine cellular status. Mitochondria are at the nexus of ...

A Rapid, Scalable Method for the Isolation, Functional Study, and Analysis of Cell-derived Extracellular Matrix

The extracellular matrix (ECM) is recognized as a diverse, dynamic, and complex environment that is involved in multiple cell-physiological and pathological processes. However, the isolation of ECM, from tissues or cell culture, is complicated by the insoluble and cross-linked nature of the assembled ECM and by the potential contamination of ECM extracts with cell surface and intracellular proteins. Here, we describe a method for use with cultured cells that is rapid and reliably removes cells to isolate a cell-derived ECM for downstream experimentation.
Through use of this method, the isolated ECM and its components can be visualized by in situ immunofluorescence microscopy. The dynamics of specific ECM proteins can be tracked by tracing the deposition of a tagged protein using fluorescence microscopy, both before and after the removal of cells. Alternatively, the isolated ECM can be extracted for biochemical analysis, such as sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and immunoblotting. At larger scales, a full proteomics analysis of the isolated ECM by mass spectrometry can be conducted. By conducting ECM isolation under sterile conditions, sterile ECM layers can be obtained for functional or phenotypic studies with any cell of interest. The method can be applied to any adherent cell type, is relatively easy to perform, and can be linked to a wide repertoire of experimental designs.

The extracellular matrix plays a major role in defining the microenvironment of cells and in modulating cell behavior and phenotype. We describe a rapid method for the isolation of cell-derived extracellular matrix, which can be adapted to different scales for microscopic, biochemical, proteomic, or functional studies.