LRC-V. desejos de dedicar este artigo à memória do Dr. Adriel D. Johnson, um professor maravilhoso, cuja prioridade número um era sempre a educação dos estudantes. Nós sentimos sua falta, Adriel. Somos gratos a Jacqueline Moreno por sua ajuda na realização das experiências descritas neste estudo. Este estudo foi suportado por uma concessão fornecida para CY da National Science Foundation, MCB-0615390, e por fundos start-up desde a LRC-V. da Universidade do Alabama, em Huntsville.

1. Preparação de células Extrato grátis. <ol><li> Dois gramas de uma coli Escherichia seca bacteriana pellet obtido a partir de meados log-culturas fase são lavados, por duas vezes, com meio litro de tampão contendo 10 mM A Tris-acetato, pH 8,0, 14 mM de acetato de magnésio, 60 mM acetato de potássio e 50 mg / phenylmethanesulphonylfluoride mL (PMSF) por centrifugação a 5000 X g por 5 min a 4 ° C. Após a lavagem, o pellet bacteriano é ressuspenso em 40 mL de tampão A. </li><li> As células bacterianas são interrompidos usando uma imprensa francesa, a aplicação de pressão 6000 psi. Esta pressão corresponde a 600 unidades com um pistão de uma polegada. A suspensão interrompido é coletado em um tubo de vidro limpo (50 mL). </li><li> A suspensão interrompido é tratada com 1 mM ditiotreitol (DTT) e é centrifugado a 30.000 xg por 30 min. O procedimento é repetido centrifugação, utilizando o sobrenadante resultante. O sobrenadante final é dispensado (1 mL) em microtubos. Finalmente, as alíquotas são congeladas usando uma mistura de gelo etanol seco ou nitrogênio líquido, e são armazenadas a -60 ° C ou -80 ° C. </li></ol> 2. Preparação de Extratos celular grátis empobrecido de RF2. <ol><li> 4,5 mL de proteína A Sepharose 4B contas de chorume são misturados com 5 mL de um anti-soro anti-RF2 usando uma roda girando em temperatura ambiente, durante uma hora. A mistura é centrifugada a 2500 xg para separar as contas do anti-soro. Após descartar o sobrenadante, estes grânulos contendo os anticorpos anti-RF2 (anti-RF2 esferas) são posteriormente lavadas por ressuspensão em 1 mL de tampão B contendo 35 mM Tris-acetato pH 7,8, 10 mM de acetato de magnésio, 30 mM acetato de amónio, 60 glutamato de potássio mM e 5 mg / mL de leupeptin inibidor de protease. As esferas anti-RF2 são então separados do buffer B por centrifugação utilizando as mesmas condições acima indicadas. O procedimento de lavagem é repetida duas vezes. </li><li> Um mL do extrato livre de células é misturado com 150 mL de anti-RF2 contas usando uma roda giratória, a 4 ° C, por duas horas. A mistura é centrifugada a 10.000 xg para separar o extrato livre de células dos grânulos. O sobrenadante é removido e tratado novamente com outro mL 150 de anti-RF2 contas. Este procedimento é repetido mais uma vez com a solução de extrato livre de células resultantes. A solução extrato final livre de células é dispensado (100 mL) em microtubos. As alíquotas são congeladas usando uma mistura de gelo etanol seco ou nitrogênio líquido, e são armazenadas a -60 ° C ou -80 ° C. </li></ol> 3. Elaboração de um modelo de DNA. <ol><li> Prepare a 1 mL de reacção da PCR através da mistura de 600 femtomoles do modelo plasmídeo contendo a seqüência a ser traduzido (Fig. 1), com 0,4 nanomoles de cada um dos oligodeoxynucleotides indicado na Fig. 1, 0,2 micromoles de cada dNTP e 50 U de Taq- DNA polimerase no buffer fornecido pela Stratagene Co. Executar a reação de amplificação nas condições a seguir: 94 ° C por 2 min, (94 ° C por 30 s, 55 ° C por 30 s, 72 ° C por 1 min; por 30 ciclos) e 72 ° C por 12 min. </li><li> Purificar o PCR-produtos por precipitar o DNA pela adição de volume de 1 / 10 de 3 M acetato de sódio, pH 5,2 e 2 volumes de etanol gelado. Repita o procedimento de precipitação mais uma vez. Ressuspender o DNA em 100 mL de dietil-pyrocarbonate (DEPC) de água tratada. Normalmente, este procedimento produz 100 mg de um produto DNA 600 pb. </li><li> Verificar a integridade dos produtos de PCR por eletroforese em gel de agarose. </li></ol> 4. Preparação de Biotina mRNA rotuladas. <ol><li> Prepare uma mL 100 in vitro a reação de transcrição na água tratada DEPC através da mistura de 5 mg do fragmento de DNA PCR gerados com 0,5 micromoles de ATP, CTP, GTP, 0,3 micromoles de UTP, 50 nanomoles de biotina-16-UTP, e 10 mL de T7 mix enzima no buffer fornecido pela Promega Co. Incubar a mistura de reação a 37 ° C por 3 horas. Para quantificar a quantidade de mRNA obtidos, o modelo de DNA deve ser eliminada pela adição de RNase DNase. Incubar a reação a 37 ° C por 10 min. </li><li> Purificar os produtos mRNA por precipitar o RNA, adicionando volume 1 / 10 de acetato de sódio 3 M, pH 5,2 e 2 volumes de etanol frio. Repita o procedimento de precipitação mais uma vez. Ressuspender o mRNA em 100 mL de água tratada DEPC. Normalmente, este procedimento produz entre 02/01 mg de biotina a 600 nt rotulados produto mRNA. </li><li> Verificar a integridade dos produtos mRNA biotina marcada por eletroforese em gel de agarose. </li></ol> 5. Isolamento de Ribossomos Traduzindo Contendo um peptidil-tRNA. <ol><li> Prepare 500 mL de uma mistura de reação in vitro de tradução em água tratada DEPC pela mistura de 10-15 mg de biotina marcado mRNA com 75 nanomoles de cada um dos dezenove aminoácidos-todos, exceto o aminoácido que será substituído por um ácido amino radioativo , 50 μCi de um ácido amino radioativo (37MBq) e 20-5<html> 0 mL de RF2 depleção extrato livre de células, em uma mistura de reação contendo tampão 40 mM Tris-acetato, pH 8,0, 10 mM de acetato de magnésio, 175 mM de acetato de potássio, acetato de amônio 10 mM, 2 mM DTT, 2 mM ATP, 0,5 GTP mM, 30 mM fosfoenolpiruvato (PEP), 0,3 piruvato quinase U / mL (PK), 3,5% de polietileno glicol 8000, um espermidina mM, 20 mcg / mL de ácido folínico, e 250 mcg / mL tRNA de E. coli. Incubar a mistura de reação a 37 ° C por 10 minutos. A ordem de adição dos componentes de reação é muito importante. O extrato livre de células deve ser misturado primeiro com a solução tampão contendo os aminoácidos e da mistura final incubadas por 5 min à temperatura ambiente para permitir a ativação do ribossomos. Mais tarde, a biotina marcada com mRNAs são adicionados. Para as análises estruturais utilizando procedimentos de modificação química, a adição de um ácido amino radioativo não é necessária. </li><li> Adicione à mistura de reação de tradução - 3 mL de contas paramagnética estreptavidina (SMB) suspenso em tampão C contendo 35 mM Tris-acetato, pH 8,0, 10 mM de acetato de magnésio, 175 mM de acetato de potássio, 10 mM acetato de amônio e 1 mM DTT. Incubar a nova suspensão em temperatura ambiente por 10 min. </li><li> Separar o SMB a partir da mistura pela aplicação de um campo magnético (MF), utilizando se de separação magnética. </li><li> Ressuspender o SMB em tampão C e separar as contas novamente usando o MF. Repita este procedimento de lavagem duas vezes. Volte a suspender as contas em 500 mL de tampão C, loja da suspensão sobre o gelo e realizar o próximo procedimento imediatamente. </li></ol> 6. Análise dos ribossomos isolados Contendo o peptidil-tRNA. Para peptidil-tRNA <ol><li> Misturar 10 mL do SMB (suspenso em tampão C) com 10 mL de um tampão de carregamento contendo 50 mM Tris-HCl, pH 6,8, 2,5% (v / v) de glicerol, sulfato de sódio 4% dodecil, 2 mM DTT e 0,2 mg / mL de azul de bromofenol. Resolver os componentes ligados às esferas executando as amostras em 10% géis de poliacrilamida Tris-tricine. </li><li> Secar o gel usando um secador de vácuo gel. </li><li> Verificar a integridade e purificação do peptidil-tRNA pela exposição do gel seco a um filme de raios-X. </li></ol> Para RNA ribossomal <ol start="4"><li> Adicionar 190 mL de solução de 2 mM etilenodiaminotetracetato (EDTA) preparado com água tratada DEPC-, e 200 mL de fenol equilibrado com a água, a 10 mL de uma suspensão de esferas. Misture a suspensão, por vórtex vigoroso e separar a fase inorgânica da fase orgânica por centrifugação a 10.000 xg por 3 min à temperatura ambiente. Coletar a camada de água superior em um microtubo novo. </li><li> Precipitar o RNA a partir da camada de água, adicionando volume 1 / 10 de acetato de sódio 3 M, pH 5.2, 1 mL de 20 mg / mL de solução de glicogênio, e 2 volumes de etanol gelado. Ressuspender o RNA em 10 mL de água tratada DEPC-. </li><li> Verificar a integridade dos RNAs ribossomais por eletroforese em gel de agarose. Normalmente, 50 mL de suspensão contas rendimentos 1μg de RNA ribossômico. </li></ol> 7. Resultados representativos: A Figura 2 apresenta os resultados de uma série de análises a avaliação da qualidade e funcionalidade dos ribossomos traduzindo isolado usando o procedimento descrito. A observação de uma banda única resolvidos em géis de poliacrilamida indica a presença de polipeptídeos ligados ao mRNAs biotina marcado ligado ao SMB (Figura 2A). A purificação de RNAs ribossomais usando este procedimento estabelece a presença de ribossomos ligados a estes mRNAs biotina-rotulados, também (Figura 2B). Além de puromicina, um antibiótico que induz a atividade de peptidil-transferase do ribossomo, resulta na clivagem da nascente peptidil-tRNAs 1. Isto é observado como uma mudança no padrão de migração do polipeptídeo isolado em gel de poliacrilamida (Fig. 2C). Juntos, esses dados indicam que a biotina marcada com mRNAs anexado ao SMB contêm ribossomos funcionais com peptidil-tRNAs. O isolamento dos ribossomos traduzindo contendo específicas peptidil-tRNAs permite o estudo dos efeitos da peptidil-tRNAs, antibióticos e outras moléculas, em função do ribossomo (Figura 3A), e sobre a estrutura do ribossomo (Figura 3B). Nos exemplos aqui apresentados sparsomycin o antibiótico eo aminoácido triptofano (Trp) inibir a clivagem hidrolítica do nascente tnaC-tRNA peptidil-tRNA induzida por RF2 nos ribossomos isolados (Figura 3A). A interação de sparsomycin ou Trp com o ribossoma também induz mudanças estruturais em alguns nucleotídeos que constituem o rRNA 23S do ribossomo traduz (Fig 3B). Em resumo, o material biológico obtido utilizando o procedimento descrito aqui são úteis na obtenção de entendimento adicional dos contatos estruturais envolvidos na inibição da função do ribossomo em cima de sua interação com vários fatores molecular. ove_content &quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/2498/2498fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Procedimento usado para produzir e purificar ribossomos traduzindo contendo peptidil-tRNAs. DNA fragmentos ca. 650 bp de comprimento, contendo o gene tnaC e sua região adjacente, mostrado na figura, são usados ​​como modelos na preparação de mRNAs que contém biotina, [(bio) UMP] mRNA. Estes fragmentos de DNA são produzidos por PCR usando os procedimentos oligodeoxynucleotides indicado na parte superior da figura. Letras sublinhadas marcar a localização do promotor T7 codificada na cartilha de nucleotídeos. Letras em negrito indicam a seqüência Equipamento para engraxar os Dalgarno que é usado na tradução das seqüências de mRNA tnaC. O promotor T7 no fragmento de DNA é reconhecido por T7 RNA polimerase, que é usado para transcrever (seta) a seqüência tnaC ea jusante não-codificantes seqüência. Transcrição termina quando a RNA polimerase chega ao fim 3&#39;-do fragmento de DNA, depois de as seqüências rpoBC terminator (rpoBC &quot;t&quot;). A estrutura do haste-laço do terminator rpoBC protege o mRNA da 3&#39;-5 apresentam atividade &quot;exoribonuclease nos extratos livres de células utilizadas na tradução em reações in vitro. O isolado [(bio) UMP] mRNAs são usados ​​para gerar parado, ribossomos traduzindo, usando tradução em ensaios in vitro. A seqüência tnaC no [(bio) UMP] mRNA é traduzida por um ribossomo que barracas, quando o último aminoácido é incorporada, devido à ausência do Fator de Liberação (RF2) a partir da mistura de reação. O ribossomo-[(bio) UMP] complexos mRNA são isolados a partir da mistura de reação total com estreptavidina-magnético-beads (SMB) que se ligam a biotina marcada com nucleotídeos incorporados no mRNA. O SMBs ligado ao ribossomo-[(bio) UMP] complexos mRNA são extraídos da mistura de reação total usando um campo magnético (MF). <img src="/files/ftp_upload/2498/2498fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Análises estruturais e funcionais dos complexos isolados. A) Nas reações de tradução in vitro foram realizados com [(bio) UMP] mRNAs em que o códon de iniciação do gene tnaC foi substituído por um códon de parada. Os produtos finais foram isolados usando pérolas de estreptavidina, como é indicado na Figura 1. Produtos de reacção e moléculas isoladas foram então analisadas por eletroforese em gel de poliacrilamida. O tnaC-tRNA e bandas tnaC peptídeo são marcados. B) Total RNA foi isolado a partir dos complexos parado utilizando procedimentos de extração fenol. Cada RNA isolado foi resolvido por eletroforese em gel de agarose. RNAs ribossomais (rRNAs) são indicados. C) complexos isolados contendo tnaC-tRNAs foram incubadas com (+) ou sem (-) 0,02 mM puromicina (Puro) em temperatura ambiente por 10 min. O peptídeo tnaC foram marcados durante a tradução usando [35S]-metionina (A) ou [3H]-prolina (B). <img src="/files/ftp_upload/2498/2498fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Análises estrutural e funcional dos ribossomos contendo tnaC-tRNA que estão vinculados ao sparsomycin antibiótico, ou do aminoácido triptofano. A) complexos isolados contendo tnaC-tRNAs foram incubadas com (+) ou sem (-) sparsomycin (Spar) ou triptofano (Trp) em temperatura ambiente por 5 min. Mais tarde, as misturas foram misturados com RF2 e incubados a 37 ° C por 20 min. B) Análise das mudanças de metilação no 23S rRNA induzida por moléculas de adesão dentro do ribossomo. Complexos isolados foram pré-incubadas com (+) ou sem (-) 2 mM Trp ou Spar por 5 min a 37 ° C. Então, um agente de alquilação, sulfato de dimetilo, e foi adicionado a misturas incubadas em temperatura ambiente por um adicional de 20 min. RNA total foi extraído e ensaios de extensão de primer foram realizadas com [32P]-rotulados oligodeoxynucleotide complementares para os nucleotídeos do rRNA 23S, que são espaçados 100 nucleotídeos a jusante do nucleotídeo modificado. Os produtos finais dos ensaios de extensão foram resolvidos por eletroforese em gel de poliacrilamida. Os nucleotídeos 23S rRNA afetada pela presença de Trp ou Spar são indicados.

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	<li>Cruz-Vera, L. R., Gong, M., Yanofsky, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+produced+by+bound+tryptophan+in+the+ribosome+peptidyl+transferase+center+in+response+to+tnaC,+a+nascent+leader+peptide.">Changes produced by bound tryptophan in the ribosome peptidyl transferase center in response to tnaC, a nascent leader peptide.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 103, 3598-3603 (2006).</li><li>Garza-Ramos, G., Xiong, L., Zhong, P., Mankin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+site+of+macrolide+antibiotics+on+the+ribosome:+new+resistance+mutation+identifies+a+specific+interaction+of+ketolides+with+rRNA.">Binding site of macrolide antibiotics on the ribosome: new resistance mutation identifies a specific interaction of ketolides with rRNA.</a> J. 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Não há conflitos de interesse declarados.

Este procedimento de isolamento descritas neste relatório é altamente reprodutível. Infelizmente, a presença de curto peptidil-tRNAs produzido a partir de seqüências de mesmo traduzido não pode ser convenientemente evitada; tais peptidil-tRNAs podem corresponder a 15-20% do material total isolada (Figura 2C). Estes contaminantes podem aumentar em concentração quando maiores concentrações de mRNA biotina-rotulados foram usadas ou quando os extratos de células livres usados ​​são antigos ou que tenham sido re-utilizado várias vezes. Portanto, é muito importante para controlar a qualidade e concentração dos componentes da tradução em reações in vitro. Alternativamente, alta eficiência comercial reconstituído livre de células extratos estão disponíveis, que podem ser utilizados para os mesmos fins (sistema PURE) 18. Usando este método, biotina-16-UMP é incorporado aleatoriamente ao longo do comprimento do mRNA alvo. Há uma possibilidade de que alguns ORFs contendo uridina tratos podem ter incorporado este nucleotídeo modificado em suas seqüências, afetando a sua tradução. Variável concentrações relativas de biotin-16-UTP/UTP têm de ser testados durante a síntese do mRNA, a fim de obter a tradução mais eficiente. Métodos alternativos de rotulagem biotina pode ser usado, visando o 5&#39;-final, final mais estável do mRNAs. (I) A biotina pode ser ligado à extremidade 5&#39;-do mRNA usando 3&#39;-NH2ATP (3&#39;-amino, trifosfato de 3&#39;-desoxiadenosina) e T4 RNA ligase 19. (Ii) 5&#39;-end biotina marcada com oligonucleotídeo pode ser ligado à extremidade 5&#39;-do mRNA usando RNA ligase T4 bem 20. (Iii) 3&#39;-end biotina-rotulados oligodeoxynucleotides que correspondem à seqüência complementar no final 5&#39;-do mRNA também poderia ser usado para isolar os complexos de tradução. Estes oligodeoxynucleotides biotina marcada poderia ser anexado ao SMB antes de isolamento. Mais tarde, o SMB ligado à biotina-rotulados oligodeoxynucleotides poderia ser misturado com a mistura de reação de tradução para permitir a interação com suas seqüências de mRNA complementar. Após o isolamento, a região RNA-DNA híbrido - e na região hibridação entre o oligodeoxynucleotide biotina marcado ea seqüência de mRNA - poderiam ser degradadas com RNAse H, separando os complexos parado dos grânulos estreptavidina. Este método alternativo pode permitir que os complexos a ser empregada, no futuro, análises estruturais usando métodos de resolução mais alta.

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		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
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<td>Tris base</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>252859</td>
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<tr>
<td>Magnesium acetate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fluka</td>
<td>63049</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Potassium glutamate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>G1501</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ammonium acetate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fluka</td>
<td>09688</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PMSF</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P7626</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Protein A sepharose 4B slurry beads</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P9424</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Leupeptin inhibitor</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>L9783</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Taq-DNA polymerase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Stratagene</td>
<td>201223</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>T7 Maxiprep kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Promega</td>
<td>P1300</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>SMB</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Promega</td>
<td>Z5482</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Biotin-16-UTP</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche</td>
<td>1388908</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>ATP</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>A7699</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>GTP</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>G8877</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PEP</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P7002</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PK</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P7768</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Polyethylenglycol 8000</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fluka</td>
<td>81268</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Folinic acid</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fluka</td>
<td>47612</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Spermidine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fluka</td>
<td>85558</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>tRNA from E. coli</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>R1753</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DEPC</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>D5758</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tricine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>T5816</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L-amino acids</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>LAA21</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DTT</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fluka</td>
<td>43815</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>magnetic separation stands</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Promega</td>
<td>Z5342</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

isolation of translating ribosomes containing peptidyl-trnas for functional and structural analyses

Recentemente, estudos estruturais e bioquímicos têm detalhada muitos dos eventos moleculares que ocorrem no ribossomo durante a inibição da síntese proteica por antibióticos e, durante a síntese de polipeptídeos nascentes. Alguns destes antibióticos, e regulamentar polipeptídeos nascentes principalmente na forma de peptidil-tRNAs, inibem ou formação da ligação peptídica ou término de tradução 1-7. Estes eventos inibitória pode parar o movimento do ribossomo, um fenômeno denominado &quot;prisão de translação&quot;. Prisão tradução induzida por qualquer um antibiótico ou um polipeptídeo nascente foi mostrado para regular a expressão de genes envolvidos em diversas funções celulares, como crescimento celular, a resistência aos antibióticos, a translocação de proteínas e metabolismo celular 8-13. Conhecimento de como antibióticos e regulamentares polipeptídeos nascentes alterar a função do ribossomo é essencial se quisermos compreender o papel completo do ribossoma na tradução, em cada organismo. Aqui, descrevemos uma metodologia simples que podem ser usados ​​para purificar, exclusivamente, para análise, os ribossomos traduzindo um mRNA específico e contendo um determinado peptidil-tRNA 14. Este procedimento é baseado no isolamento seletivo de ribossomos traduzindo vinculado a um mRNA biotina-rotulados. Estes complexos de translação são separados dos ribossomos outros na mesma mistura, usando pérolas paramagnética estreptavidina (SMB) e um campo magnético (MF). MRNAs biotina-rotulados são sintetizados por ensaios de run-off de transcrição usando como modelos de fragmentos de PCR gerado DNA que contêm promotores T7 transcricional. T7 RNA polimerase incorpora biotina-16-UMP de biotina-UTP; nas nossas condições aproximadamente dez biotina-16-UMP moléculas são incorporadas em um mRNA nt 600 com um teor UMP 25%. Estes biotina-rotulados mRNAs são então isolados, e utilizado em ensaios in vitro realizados com tradução fator de liberação de 2 (RF2) estão esgotados livre de células extratos obtidos a partir de cepas de Escherichia coli contendo o tipo selvagem ou mutante ribossomos. Ribossomos traduzindo a biotina marcada com seqüências de mRNA estão paralisadas na região códon de parada, devido à ausência da proteína RF2, que normalmente realiza encerramento de tradução. Ribossomos parado contendo o recém-sintetizado peptidil-tRNA são isolados e removidos a partir de reações de tradução usando SMB e um MF. Estas contas só ligar biotina contendo mensagens. Os isolados, complexos de translação, pode ser usado para analisar as características estruturais e funcionais do tipo selvagem ou mutante componentes ribossomal, ou peptidil-tRNA seqüências, bem como determinar a interação ribossomo com antibióticos ou outros fatores moleculares 1,14-16. Para examinar a função desses complexos isolados ribossomo, peptidil-transferase ensaios podem ser realizados na presença do antibiótico puromicina 1. Para estudar as mudanças estruturais em complexos de translação, procedimentos bem estabelecidos podem ser utilizados, tais como i) crosslinking a 14 aminoácidos específicos e / ou ii) ensaios alquilação proteção 1,14,17.

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Isolation of Translating Ribosomes Containing Peptidyl-tRNAs for Functional and Structural Analyses

Um grande impedimento para análises bioquímicas dos ribossomos contendo nascente peptidil-tRNAs foi a presença de ribossomos outros nas mesmas amostras, os ribossomos não estão envolvidos na tradução da seqüência de mRNA específico que está sendo analisado. Nós desenvolvemos uma metodologia simples para purificar, exclusivamente, os ribossomos que contém a nascente peptidil-tRNA de interesse.

Isolamento de Ribossomos Traduzindo Contendo peptidil-tRNAs para análises funcionais e estruturais

Recently, structural and biochemical studies have detailed many of the molecular events that occur in the ribosome during inhibition of protein synthesis ...

isolation-translating-ribosomes-containing-peptidyl-trnas-for

Research

JoVE Journal

Biology

19.7K visualizações.  University of Alabama Huntsville. Um grande impedimento para análises bioquímicas dos ribossomos contendo nascente peptidil-tRNAs foi a presença de ribossomos outros nas mesmas amostras, os ribossomos não estão envolvidos na tradução da seqüência de mRNA específico que está sendo analisado. Nós desenvolvemos uma metodologia simples para purificar, exclusivamente, os ribossomos que contém a nascente peptidil-tRNA de interesse.

Vídeo: Isolation of Translating Ribosomes Containing Peptidyl-tRNAs for Functional and Structural Analyses

Crystallizing Membrane Proteins for Structure Determination using Lipidic Mesophases

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the lipidic cubic phase or in meso method. The method has been shown to be quite versatile in that it has been used to solve X-ray crystallographic structures of prokaryotic and eukaryotic proteins, proteins that are monomeric, homo- and hetero-multimeric, chromophore-containing and chromophore-free, and alpha-helical and beta-barrel proteins. Recent successes using in meso crystallization are the human engineered beta2-adrenergic and adenosine A2a G protein-coupled receptors. Protocols are presented for reconstituting the membrane protein into the monoolein-based mesophase, and for setting up crystallizations in the manual mode. Additional steps in the overall process, such as crystal harvesting, are to be addressed in future video articles. The time required to prepare the protein-loaded mesophase and to set up a crystallization plate manually is about one hour.

Herein is described the procedure implemented in the Caffrey Membrane Structural and Functional Biology Group to set up manually crystallization trials of membrane proteins in lipidic mesophases.

Cristalizando Proteínas de Membrana para determinação da estrutura usando mesofases lipídico

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the ...

Biologia

Evisceration of Mouse Vitreous and Retina for Proteomic Analyses

While the mouse retina has emerged as an important genetic model for inherited retinal disease, the mouse vitreous remains to be explored. The vitreous is a highly aqueous extracellular matrix overlying the retina where intraocular as well as extraocular proteins accumulate during disease.1-3 Abnormal interactions between vitreous and retina underlie several diseases such as retinal detachment, proliferative diabetic retinopathy, uveitis, and proliferative vitreoretinopathy.1,4 The relative mouse vitreous volume is significantly smaller than the human vitreous (Figure 1), since the mouse lens occupies nearly 75% of its eye.5 This has made biochemical studies of mouse vitreous challenging. In this video article, we present a technique to dissect and isolate the mouse vitreous from the retina, which will allow use of transgenic mouse models to more clearly define the role of this extracellular matrix in the development of vitreoretinal diseases.

The dissection technique illustrates evisceration of the vitreous, retina, and lens from the mouse eye, separation by centrifugation, and characterization with protein assays.

Evisceração de Vítreo Mouse e Retina de Análises Proteômica

While the mouse retina has emerged as an important genetic model for inherited retinal disease, the mouse vitreous remains to be explored. The vitreous is ...

Isolation and Characterization of RNA-Containing Exosomes

The field of exosome research is rapidly expanding, with a dramatic increase in publications in recent years. These small vesicles (30-100 nm) of endocytic origin were first proposed to function as a way for reticulocytes to eradicate the transferrin receptor while maturing into erythrocytes1, and were later named exosomes. Exosomes are formed by inward budding of late endosomes, producing multivesicular bodies (MVBs), and are released into the environment by fusion of the MVBs with the plasma membrane2. Since the first discovery of exosomes, a wide range of cells have been shown to release these vesicles. Exosomes have also been detected in several biological fluids, including plasma, nasal lavage fluid, saliva and breast milk3-6. Furthermore, it has been demonstrated that the content and function of exosomes depends on the originating cell and the conditions under which they are produced. A variety of functions have been demonstrated for exosomes, such as induction of tolerance against allergen7,8, eradication of established tumors in mice9, inhibition and activation of natural killer cells10-12, promotion of differentiation into T regulatory cells13, stimulation of T cell proliferation14 and induction of T cell apoptosis15. Year 2007 we demonstrated that exosomes released from mast cells contain messenger RNA (mRNA) and microRNA (miRNA), and that the RNA can be shuttled from one cell to another via exosomes. In the recipient cells, the mRNA shuttled by exosomes was shown to be translated into protein, suggesting a regulatory function of the transferred RNA16. Further, we have also shown that exosomes derived from cells grown under oxidative stress can induce tolerance against further stress in recipient cells and thus suggest a biological function of the exosomal shuttle RNA17. Cell culture media and biological fluids contain a mixture of vesicles and shed fragments. A high quality isolation method for exosomes, followed by characterization and identification of the exosomes and their content, is therefore crucial to distinguish exosomes from other vesicles and particles. Here, we present a method for the isolation of exosomes from both cell culture medium and body fluids. This isolation method is based on repeated centrifugation and filtration steps, followed by a final ultracentrifugation step in which the exosomes are pelleted. Important methods to identify the exosomes and characterize the exosomal morphology and protein content are highlighted, including electron microscopy, flow cytometry and Western blot. The purification of the total exosomal RNA is based on spin column chromatography and the exosomal RNA yield and size distribution is analyzed using a Bioanalyzer.

This paper demonstrates methods for the isolation, purification and detection of exosomes, as well as techniques for analysis of their molecular content. These methods are adaptable for exosome isolation from both cell culture media and biological fluids, and can beyond analysis of molecular content also be useful in functional studies.

Isolamento e Caracterização de RNA-Contendo exossomos

The field of exosome research is rapidly expanding, with a dramatic increase in publications in recent years. These small vesicles (30-100 nm) of ...

Chromatographic Purification of Highly Active Yeast Ribosomes

Eukaryotic ribosomes are much more labile as compared to their eubacterial and archael counterparts, thus posing a significant challenge to researchers. Particularly troublesome is the fact that lysis of cells releases a large number of proteases and nucleases which can degrade ribosomes. Thus, it is important to separate ribosomes from these enzymes as quickly as possible. Unfortunately, conventional differential ultracentrifugation methods leaves ribosomes exposed to these enzymes for unacceptably long periods of time, impacting their structural integrity and functionality. To address this problem, we utilize a chromatographic method using a cysteine charged Sulfolink resin. This simple and rapid application significantly reduces co-purifying proteolytic and nucleolytic activities, producing high yields of intact, highly biochemically active yeast ribosomes. We suggest that this method should also be applicable to mammalian ribosomes. The simplicity of the method, and the enhanced purity and activity of chromatographically purified ribosome represents a significant technical advancement for the study of eukaryotic ribosomes.

Contamination of preparations of eukaryotic ribosomes purified by traditional methods by co-purifying nucleases and proteases negatively impacts on downstream biochemical and structural analyses. A rapid and simple chromatographic purification method is used to solve this problem using yeast ribosomes as a model system.

Purificação cromatográfica de Ribossomos Yeast Highly Active

Eukaryotic ribosomes are much more labile as compared to their eubacterial and archael counterparts, thus posing a significant challenge to researchers.  ...

Use of a Robot for High-throughput Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through macromolecular X-ray crystallography (MX). An essential ingredient of MX is a steady supply of ideally diffraction-quality crystals. The in meso or lipidic cubic phase (LCP) method for crystallizing membrane proteins is one of several methods available for crystallizing membrane proteins. It makes use of a bicontinuous mesophase in which to grow crystals. As a method, it has had some spectacular successes of late and has attracted much attention with many research groups now interested in using it. One of the challenges associated with the method is that the hosting mesophase is extremely viscous and sticky, reminiscent of a thick toothpaste. Thus, dispensing it manually in a reproducible manner in small volumes into crystallization wells requires skill, patience and a steady hand. A protocol for doing just that was developed in the Membrane Structural &amp; Functional Biology (MS&amp;FB) Group1-3. JoVE video articles describing the method are available1,4. 
The manual approach for setting up in meso trials has distinct advantages with specialty applications, such as crystal optimization and derivatization. It does however suffer from being a low throughput method. Here, we demonstrate a protocol for performing in meso crystallization trials robotically. A robot offers the advantages of speed, accuracy, precision, miniaturization and being able to work continuously for extended periods under what could be regarded as hostile conditions such as in the dark, in a reducing atmosphere or at low or high temperatures. An in meso robot, when used properly, can greatly improve the productivity of membrane protein structure and function research by facilitating crystallization which is one of the slow steps in the overall structure determination pipeline. 
In this video article, we demonstrate the use of three commercially available robots that can dispense the viscous and sticky mesophase integral to in meso crystallogenesis. The first robot was developed in the MS&amp;FB Group5,6. The other two have recently become available and are included here for completeness.	
An overview of the protocol covered in this article is presented in Figure 1. All manipulations were performed at room temperature (~20 &deg;C) under ambient conditions.

Herein is described a robotic approach to high-throughput crystallization of membrane proteins in lipidic mesophases for use in structure determination using macromolecular X-ray crystallography. Three robots capable of handling the viscous and sticky protein-laden mesophase integral to the method are introduced.

A utilização de um robô para alta capacidade de cristalização de proteínas de membrana em mesofases lipídicas

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through ...

Harvesting and Cryo-cooling Crystals of Membrane Proteins Grown in Lipidic Mesophases for Structure Determination by Macromolecular Crystallography

An important route to understanding how proteins function at a mechanistic level is to have the structure of the target protein available, ideally at atomic resolution. Presently, there is only one way to capture such information as applied to integral membrane proteins (Figure 1), and the complexes they form, and that method is macromolecular X-ray crystallography (MX). To do MX diffraction quality crystals are needed which, in the case of membrane proteins, do not form readily. A method for crystallizing membrane proteins that involves the use of lipidic mesophases, specifically the cubic and sponge phases1-5, has gained considerable attention of late due to the successes it has had in the G protein-coupled receptor field6-21 (<a href="http://www.mpdb.tcd.ie" target="_blank">www.mpdb.tcd.ie</a>). However, the method, henceforth referred to as the in meso or lipidic cubic phase method, comes with its own technical challenges. These arise, in part, due to the generally viscous and sticky nature of the lipidic mesophase in which the crystals, which are often micro-crystals, grow. Manipulating crystals becomes difficult as a result and particularly so during harvesting22,23. Problems arise too at the step that precedes harvesting which requires that the glass sandwich plates in which the crystals grow (Figure 2)24,25 are opened to expose the mesophase bolus, and the crystals therein, for harvesting, cryo-cooling and eventual X-ray diffraction data collection.
The cubic and sponge mesophase variants (Figure 3) from which crystals must be harvested have profoundly different rheologies4,26. The cubic phase is viscous and sticky akin to a thick toothpaste. By contrast, the sponge phase is more fluid with a distinct tendency to flow. Accordingly, different approaches for opening crystallization wells containing crystals growing in the cubic and the sponge phase are called for as indeed different methods are required for harvesting crystals from the two mesophase types. Protocols for doing just that have been refined and implemented in the Membrane Structural and Functional Biology (MS&amp;FB) Group, and are described in detail in this JoVE article (Figure 4). Examples are given of situations where crystals are successfully harvested and cryo-cooled. We also provide examples of cases where problems arise that lead to the irretrievable loss of crystals and describe how these problems can be avoided. In this article the Viewer is provided with step-by-step instructions for opening glass sandwich crystallization wells, for harvesting and for cryo-cooling crystals of membrane proteins growing in cubic and in sponge phases.

Herein is described procedures implemented in the Caffrey Membrane Structural and Functional Biology Group to harvest and cryo-cool membrane protein crystals grown in lipidic cubic and sponge phases for use in structure determination using macromolecular X-ray crystallography.

Colheita e Cryo-resfriamento cristais de proteínas de membrana crescida no mesofases lipídicas para a determinação da estrutura de Cristalografia Macromolecular

An important route to understanding how proteins function at a mechanistic level is to have the structure of the target protein available, ideally at ...

Isolation, Culture, and Functional Characterization of Adult Mouse Cardiomyoctyes

The use of primary cardiomyocytes (CMs) in culture has provided a powerful complement to murine models of heart disease in advancing our understanding of heart disease. In particular, the ability to study ion homeostasis, ion channel function, cellular excitability and excitation-contraction coupling and their alterations in diseased conditions and by disease-causing mutations have led to significant insights into cardiac diseases. Furthermore, the lack of an adequate immortalized cell line to mimic adult CMs, and the limitations of neonatal CMs (which lack many of the structural and functional biomechanics characteristic of adult CMs) in culture have hampered our understanding of the complex interplay between signaling pathways, ion channels and contractile properties in the adult heart strengthening the importance of studying adult isolated cardiomyocytes. Here, we present methods for the isolation, culture, manipulation of gene expression by adenoviral-expressed proteins, and subsequent functional analysis of cardiomyocytes from the adult mouse. The use of these techniques will help to develop mechanistic insight into signaling pathways that regulate cellular excitability, Ca2+ dynamics and contractility and provide a much more physiologically relevant characterization of cardiovascular disease.

Here we describe the isolation of adult mouse cardiomyoctyes using a Langendorff perfusion system. The resulting cells are Ca2+-tolerant, electrically quiescent and can be cultured and transfected with adeno- or lentiviruses to manipulate gene expression. Their functionality can also be analyzed using the MMSYS system and patch clamp techniques.

Isolamento, cultura e caracterização funcional de rato adulto Cardiomyoctyes

The use of primary cardiomyocytes (CMs) in culture has provided a powerful complement to murine models of heart disease in advancing our understanding of ...

Reconstitution of a Kv Channel into Lipid Membranes for Structural and Functional Studies

To study the lipid-protein interaction in a reductionistic fashion, it is necessary to incorporate the membrane proteins into membranes of well-defined lipid composition. We are studying the lipid-dependent gating effects in a prototype voltage-gated potassium (Kv) channel, and have worked out detailed procedures to reconstitute the channels into different membrane systems. Our reconstitution procedures take consideration of both detergent-induced fusion of vesicles and the fusion of protein/detergent micelles with the lipid/detergent mixed micelles as well as the importance of reaching an equilibrium distribution of lipids among the protein/detergent/lipid and the detergent/lipid mixed micelles. Our data suggested that the insertion of the channels in the lipid vesicles is relatively random in orientations, and the reconstitution efficiency is so high that no detectable protein aggregates were seen in fractionation experiments. We have utilized the reconstituted channels to determine the conformational states of the channels in different lipids, record electrical activities of a small number of channels incorporated in planar lipid bilayers, screen for conformation-specific ligands from a phage-displayed peptide library, and support the growth of 2D crystals of the channels in membranes. The reconstitution procedures described here may be adapted for studying other membrane proteins in lipid bilayers, especially for the investigation of the lipid effects on the eukaryotic voltage-gated ion channels.

Procedures for complete reconstitution of a prototype voltage-gated potassium channel into lipid membranes are described. The reconstituted channels are suitable for biochemical assays, electrical recordings, ligand screening and electron crystallographic studies. These methods may have general applications to the structural and functional studies of other membrane proteins.

Reconstituição de um canal de Kv para membranas lipídicas de Estudos estruturais e funcionais

To study the lipid-protein interaction in a reductionistic fashion, it is necessary to incorporate the membrane proteins into membranes of well-defined ...

Isolation and Functional Analysis of Mitochondria from Cultured Cells and Mouse Tissue

Comparison between two or more distinct groups, such as healthy vs. disease, is necessary to determine cellular status. Mitochondria are at the nexus of cell heath due to their role in both cell metabolism and energy production as well as control of apoptosis. Therefore, direct evaluation of isolated mitochondria and mitochondrial perturbation offers the ability to determine if organelle-specific (dys)function is occurring. The methods described in this protocol include isolation of intact, functional mitochondria from HEK cultured cells and mouse liver and spinal cord, but can be easily adapted for use with other cultured cells or animal tissues. Mitochondrial function assessed by TMRE and the use of common mitochondrial uncouplers and inhibitors in conjunction with a fluorescent plate reader allow this protocol not only to be versatile and accessible to most research laboratories, but also offers high throughput.

Comparison of mitochondrial membrane potential between samples yields valuable information about cellular status. Detailed steps for isolating mitochondria and assessing response to inhibitors and uncouplers using fluorescence are described. The method and utility of this protocol are illustrated by use of a cell culture and animal model of cellular stress.

Isolamento e Análise Funcional de mitocôndrias de células cultivadas e mouse Tissue

Comparison between two or more distinct groups, such as healthy vs. disease, is necessary to determine cellular status. Mitochondria are at the nexus of ...

Methods for the Isolation, Culture, and Functional Characterization of Sinoatrial Node Myocytes from Adult Mice

Sinoatrial node myocytes (SAMs) act as the natural pacemakers of the heart, initiating each heart beat by generating spontaneous action potentials (APs). These pacemaker APs reflect the coordinated activity of numerous membrane currents and intracellular calcium cycling. However the precise mechanisms that drive spontaneous pacemaker activity in SAMs remain elusive. Acutely isolated SAMs are an essential preparation for experiments to dissect the molecular basis of cardiac pacemaking. However, the indistinct anatomy, complex microdissection, and finicky enzymatic digestion conditions have prevented widespread use of acutely isolated SAMs. In addition, methods were not available until recently to permit longer-term culture of SAMs for protein expression studies. Here we provide a step-by-step protocol and video demonstration for the isolation of SAMs from adult mice. A method is also demonstrated for maintaining adult mouse SAMs in vitro and for expression of exogenous proteins via adenoviral infection. Acutely isolated and cultured SAMs prepared via these methods are suitable for a variety of electrophysiological and imaging studies.

Methods are demonstrated for the isolation of sinoatrial node myocytes (SAMs) from adult mice for patch clamp electrophysiology or imaging studies. Isolated cells can be used directly or can be maintained in culture to permit expression of proteins of interest, such as genetically encoded reporters.

Métodos para o isolamento, Cultura e caracterização funcional de SINOATRIAL Nó miócitos de ratos adultos

Sinoatrial node myocytes (SAMs) act as the natural pacemakers of the heart, initiating each heart beat by generating spontaneous action potentials (APs). ...