LRC-V. desea dedicar este trabajo a la memoria del Dr. Adriel D. Johnson, un profesor maravilloso cuya prioridad fue siempre la educación de los estudiantes. Te echamos de menos, Adriel. Estamos muy agradecidos a Jacqueline Moreno por su ayuda en la realización de los experimentos descritos en este estudio. Este estudio fue apoyado por una subvención concedida a la CIA de la Fundación Nacional de Ciencia, MCB-0615390, y por la puesta en marcha fondos proporcionados a LRC-V. de la Universidad de Alabama en Huntsville.

1. Preparación de células extracto libre. <ol><li> Dos gramos de producto seco Escherichia coli sedimento bacteriano obtenido a partir de mediados de los cultivos en fase de registro se lavan dos veces con medio litro de un buffer que contiene 10 mM Tris-acetato, pH 8,0, 14 mM de acetato de magnesio, 60 mM de acetato de potasio y 50 mg / phenylmethanesulphonylfluoride mL (PMSF) por centrifugación a 5.000 X g por 5 min a 4 ° C. Después del lavado, el sedimento bacteriano se resuspendió en 40 ml de tampón A. </li><li> Las células bacterianas se rompen con una prensa francesa, la aplicación de presión de 6,000 psi. Esta presión corresponde a 600 unidades con un pistón de una pulgada. La suspensión se interrumpe recoger en un tubo de vidrio limpio (50 ml). </li><li> La suspensión se interrumpe tratados con 1 mM ditiotreitol (DTT) y se centrifuga a 30.000 xg durante 30 min. El procedimiento de centrifugación se repite, utilizando el sobrenadante resultante. El sobrenadante final se dispensa (1 ml) en microtubos. Por último, las alícuotas se congelan con un hielo seco-etanol o el nitrógeno líquido y se almacenan a -60 ° C o -80 º C. </li></ol> 2. Preparación de los extractos libres de células de RF2 empobrecido. <ol><li> 4,5 ml de la proteína A sefarosa 4B cuentas de lodo se mezcla con 5 ml de un anti-RF2 anti-suero con una rueda giratoria a temperatura ambiente, durante una hora. La mezcla se centrifuga a 2500 xg para separar las cuentas del antisuero. Tras desechar el sobrenadante, estas cuentas que contiene los anticuerpos anti-RF2 (anti-RF2 cuentas) son lavados después de resuspensión en 1 ml de tampón B que contiene 35 mM Tris-acetato de pH 7,8, 10 mM de acetato de magnesio, 30 mM de acetato de amonio, 60 mM de glutamato de potasio y 5 mg / ml de inhibidor de la proteasa leupeptina. Las bolas anti-RF2 se separan de tampón B por centrifugación utilizando las mismas condiciones indicadas anteriormente. El procedimiento de lavado se repite dos veces. </li><li> Un ml de extracto libre de células se mezclan con 150 ml de anti-RF2 cuentas con una rueda giratoria, a 4 ° C, durante dos horas. La mezcla se centrifuga a 10.000 xg para separar el extracto libre de células de las cuentas. Se elimina el sobrenadante y se trata de nuevo con otro l 150 de anti-RF2 cuentas. Este procedimiento se repite una vez más con la solución de extracto libre de células resultantes. La final de células libres de la solución de se dispensa (100 l) en microtubos. Las alícuotas se congelan con un hielo seco-etanol o el nitrógeno líquido y se almacenan a -60 ° C o -80 º C. </li></ol> 3. Preparación de una plantilla de ADN. <ol><li> Preparar un 1 mL para la reacción PCR mediante la mezcla de 600 femtomoles de la plantilla plásmido que contiene las secuencias que se traduce (Fig. 1), con 0,4 nanomoles de cada uno de los oligodesoxinucleótidos indica en la Figura 1, 0,2 micromoles de cada dNTP y 50 U de Taq- ADN polimerasa en el buffer suministrado por Stratagene Co. realizar la reacción de amplificación en las condiciones siguientes: 94 ° C durante 2 minutos, (94 ° C durante 30 s, 55 ° C durante 30 s, 72 ° C durante 1 minuto, durante 30 ciclos) y 72 ° C durante 12 min. </li><li> Purificar el PCR-productos de la precipitación del ADN mediante la adición de volumen 1 / 10 de acetato de sodio 3 M, pH 5,2, y 2 volúmenes de etanol helado. Repita el procedimiento de precipitación, una vez más. Resuspender el ADN en 100 L de dietil-pirocarbonato (DEPC) de agua tratada. Normalmente, este procedimiento produce 100 mg de un producto de 600 pb de ADN. </li><li> Verificar la integridad de los productos de PCR por electroforesis en geles de agarosa. </li></ol> 4. Preparación de ARNm biotina etiquetados. <ol><li> Prepare una l 100 en la reacción de transcripción in vitro en el agua tratada DEPC mediante la mezcla de 5 g de los fragmentos de ADN generados por PCR con 0,5 micromoles de ATP, CTP, GTP, 0,3 micromoles de UTP, 50 nanomoles de biotina-16-UTP, y 10 l de la mezcla de la enzima T7 en el buffer suministrado por Promega Co. Incubar la mezcla de reacción a 37 ° C durante 3 horas. Para cuantificar la cantidad de ARNm obtenido, la plantilla de ADN debe ser eliminado mediante la adición de RNasa libre de DNasa. Incubar la reacción a 37 ° C durante 10 min. </li><li> Purificar los productos de ARNm por la precipitación del ARN mediante la adición de volumen 1 / 10 de acetato de sodio 3 M, pH 5,2, y 2 volúmenes de etanol frío. Repita el procedimiento de precipitación, una vez más. Resuspender el ARNm en 100 L de agua tratada con DEPC. Por lo general, este procedimiento de rendimientos entre 1.2 mg de biotina 600 nt etiquetado de productos de ARNm. </li><li> Verificar la integridad de los productos de ARNm biotina marcada por electroforesis en geles de agarosa. </li></ol> 5. El aislamiento de los ribosomas traducir contiene un peptidil-tRNA. <ol><li> Preparar 500 l de una mezcla de reacción in vitro de traducción en el agua tratada DEPC mediante la mezcla de 10-15 mg de biotina marcado ARNm con 75 nanomoles de cada uno de los amino ácidos diecinueve, todos menos el aminoácido que será reemplazado por un aminoácido radiactivo , 50 Ci de un ácido amino radiactivos (37MBq) y 20-5<html> 0 L de RF2-depleción de células extracto libre, en una mezcla de reacción tamponada que contiene 40 mM Tris-acetato, pH 8,0, 10 mM de acetato de magnesio, 175 mM de acetato de potasio, acetato de amonio 10 mM, 2 mM DTT, 2 mM ATP, 0,5 mM GTP, 30 mM fosfoenolpiruvato (PEP), 0,3 U / ml de piruvato quinasa (PK), el 3,5% de polietilenglicol 8000, 1 mM espermidina, 20 mg / ml de ácido folínico, y 250 mg / ml tRNA de E. coli. Incubar la mezcla de reacción a 37 ° C durante 10 minutos. El orden de adición de los componentes de la reacción es muy importante. El extracto libre de células debe mezclarse primero con la solución tampón que contiene los aminoácidos y la mezcla final se incubaron durante 5 min a temperatura ambiente para permitir la activación de los ribosomas. Más tarde, el marcado con biotina ARNm se agregan. Para el análisis estructural mediante procedimientos de modificación química, la adición de un aminoácido radiactivo no es necesario. </li><li> Agregar a la mezcla de reacción de traducción - 3 ml de perlas paramagnéticas de estreptavidina (SMB) en suspensión en tampón C que contiene 35 mM Tris-acetato, pH 8,0, 10 mM de acetato de magnesio, 175 mM de acetato de potasio, 10 mM de acetato de amonio y 1 mM DTT. Incubar la nueva suspensión a temperatura ambiente durante 10 min. </li><li> Separar las pymes de la mezcla mediante la aplicación de un campo magnético (CM) se encuentra con separación magnética. </li><li> Resuspender las pymes en tampón C y separar las cuentas de nuevo con el MF. Repita este procedimiento de lavado dos veces. Volver a suspender las bolas en 500 l de tampón C, conservar la suspensión en el hielo, y realizar el siguiente procedimiento inmediatamente. </li></ol> 6. El análisis de los ribosomas aislados conteniendo la peptidil-tRNA. Para peptidil-tRNA <ol><li> Se mezclan 10 l de la SMB (suspendido en tampón C) con 10 l de un tampón de carga que contiene 50 mM Tris-HCl, pH 6,8, el 2,5% (v / v) de glicerol, el 4% dodecil sulfato de sodio, 2 mM de TDT y de 0,2 mg / ml de azul de bromofenol. Resolver los componentes conectados a las cuentas mediante la ejecución de las muestras en el 10% Tris-tricina geles de poliacrilamida. </li><li> Secar el gel usando un vacío de gel de pelo. </li><li> Verificar la integridad y la purificación de la peptidil-tRNA al exponer el gel seco a una película de rayos-X. </li></ol> Para el ARN ribosomal <ol start="4"><li> Añadir 190 l de 2 mM etilendiaminotetraacetato (EDTA) preparada con agua tratada con DEPC, y 200 l de fenol equilibrado con agua a 10 l de una suspensión de bolas. Mezclar la suspensión por agitación vigorosa y separar la fase inorgánica de la fase orgánica por centrifugación a 10.000 xg durante 3 minutos a temperatura ambiente. Recoger la capa superior del agua en un microtubo nuevo. </li><li> Precipitar el ARN de la capa de agua mediante la adición de volumen 1 / 10 de acetato de sodio 3 M, pH 5,2, 1 l de 20 mg / ml de solución de glucógeno, y 2 volúmenes de etanol helado. Resuspender el RNA en 10 l de agua tratada con DEPC. </li><li> Verificar la integridad del ARN ribosomal por electroforesis en geles de agarosa. Por lo general, 50 l de la suspensión de cuentas de los rendimientos de 1 g de ARN ribosomal. </li></ol> 7. Los resultados representativos: La figura 2 presenta los resultados de una serie de análisis para evaluar la calidad y la funcionalidad de los ribosomas traducir aisladas mediante el procedimiento descrito. La observación de una única banda resolvieron en geles de poliacrilamida indica la presencia de polipéptidos unidos a los ARNm marcado con biotina unido a las pymes (Figura 2A). La purificación de ARN ribosomal usando este procedimiento establece la presencia de los ribosomas unidos a estos ARNm marcado con biotina, también (Figura 2B). Además de puromicina, un antibiótico que induce la actividad peptidil-transferasa del ribosoma, los resultados de la división de la naciente peptidil-ARNt 1. Esto se observa como un cambio en el patrón de migración del polipéptido aislado en geles de poliacrilamida (Fig. 2C). En conjunto, estos datos indican que la biotina marcado ARNm unido a las pymes contienen ribosomas funcionales con peptidil-tRNA. El aislamiento de los ribosomas traducir contiene específicos peptidil-ARNt permite el estudio de los efectos de la peptidil-ARNt, antibióticos y otras moléculas, en función de los ribosomas (Figura 3), y en la estructura del ribosoma (Figura 3B). En los ejemplos que aquí se presenta la sparsomycin antibióticos y el aminoácido triptófano (Trp) inhiben la rotura hidrolítica de la naciente tnaC-tRNA peptidil-tRNA inducida por RF2 en los ribosomas aislados (Figura 3). La interacción de sparsomycin o Trp con el ribosoma también induce cambios estructurales en algunos nucleótidos que constituyen el ARNr 23S de los ribosomas traducir (Fig. 3B). En resumen, el material biológico obtenido mediante el procedimiento descrito aquí son útiles para obtener mayor comprensión de los contactos estructurales que participan en la inhibición de la función del ribosoma en su interacción con diferentes factores moleculares. ove_content &quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/2498/2498fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Procedimiento utilizado para producir y purificar los ribosomas traducir contiene peptidil-tRNA. Fragmentos de ADN ca. 650 pb de longitud, que contiene el gen tnaC y su región adyacente, que se muestra en la figura, se utilizan como plantillas en la preparación de los ARNm que contiene biotina, [(bio) UMP] ARNm. Estos fragmentos de ADN son producidas por los procedimientos de PCR utilizando los oligodesoxinucleótidos indicado en la parte superior de la figura. Las letras subrayadas marcar la ubicación del promotor T7 codificada en el primer nucleótido. Letras en negrita indican la secuencia de Shine-Dalgarno que se utiliza en la traducción de las secuencias de ARNm tnaC. El promotor T7 en el fragmento de ADN es reconocida por la ARN polimerasa T7 que se utiliza para transcribir (flecha) la secuencia de tnaC y la posterior secuencia no codificante. La transcripción se termina cuando llega a la RNA polimerasa del extremo 3 &#39;del fragmento de ADN, después de las secuencias rpoBC terminador (rpoBC &quot;t&quot;). La estructura tallo-bucle de la terminación rpoBC protege al ARNm de la 3&#39;-5 &#39;presentan actividad exoribonuclease en los extractos libres de células utilizadas en la reacción de traducción in vitro. El aislado [(bio) UMP] ARNm se utilizan para generar estancado, los ribosomas traducir, por medio de estudios de traducción in vitro. La secuencia tnaC en el [(bio) UMP] ARNm es traducido por un ribosoma que se atasca cuando el último aminoácido se incorpora, debido a la ausencia del factor de liberación (RF2) de la mezcla de reacción. El ribosoma-[(bio) UMP] complejos de ARNm se aisló de la mezcla total de reacción utilizando estreptavidina-magnético-cuentas (SMB) que se unen a la biotina marcado nucleótidos incorporados en el ARNm. Las pymes vinculados al ribosoma-[(bio) UMP] complejos de ARNm se extraen de la mezcla total de reacción mediante un campo magnético (CM). <img src="/files/ftp_upload/2498/2498fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Análisis estructural y funcional de los complejos aislados. A) En las reacciones de traducción in vitro se realizaron con [(bio) UMP] mRNAs en que fue sustituido el codón de inicio del gen tnaC por un codón de parada. Los productos finales fueron aislados utilizando streptavidina cuentas, como se indica en la figura 1. Productos de reacción y las moléculas aisladas fueron analizados por electroforesis en geles de poliacrilamida. El tnaC-tRNA y bandas tnaC péptido están marcados. B) El ARN total fue aislado de los complejos estancado con los procedimientos de extracción con fenol. Cada ARN aislado se resolvió por electroforesis en geles de agarosa. ARN ribosomal (ARNr) se indican. C) que contiene los complejos aislados tnaC-tRNAs se incubaron con (+) o sin (-) 0,02 mM puromycin (Puro) a temperatura ambiente durante 10 min. El péptido tnaC se marcaron durante la traducción con [35S]-metionina (A) o [3H]-prolina (B). <img src="/files/ftp_upload/2498/2498fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Análisis estructural y funcional de los ribosomas que contienen tnaC-tRNA que están vinculados a la sparsomycin antibióticos, o el aminoácido triptófano. A) que contiene los complejos aislados tnaC-tRNAs se incubaron con (+) o sin (-) sparsomycin (Spar) o triptófano (Trp) a temperatura ambiente durante 5 min. Más tarde, las mezclas se mezclaron con RF2 y se incuba a 37 ° C durante 20 min. B) Análisis de los cambios de metilación en el 23S rRNA inducida por moléculas de unión en el ribosoma. Complejos aislados fueron pre-incubadas con (+) o sin (-) 2 mM Trp o Spar durante 5 min a 37 ° C. Entonces, un agente de alquilación, sulfato de dimetilo, y se añadió la mezcla se incubó a temperatura ambiente por 20 min. ARN total fue extraído y ensayos de extensión del cebador se realizaron con un [32P] marcada oligodeoxynucleotide complementaria a los nucleótidos del ARNr 23S, que están separadas 100 nucleótidos río abajo de las secuencias de nucleótidos modificados. Los productos finales de los ensayos de extensión se resolvieron mediante electroforesis en geles de poliacrilamida. El 23S rRNA nucleótidos afectados por la presencia de Trp o Spar se indican.

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Este procedimiento de aislamiento descritas en este informe es altamente reproducible. Por desgracia, la presencia de corto peptidil-ARNt producido a partir de las mismas secuencias traducido no puede ser convenientemente evitarse tales peptidil-ARNt puede corresponder a un 15-20% del total del material aislado (Fig. 2C). Estos contaminantes pueden aumentar la concentración en mayores concentraciones de ARNm marcado con biotina se han utilizado o cuando los extractos libres de células utilizadas son viejas o han sido re-usado varias veces. Por lo tanto, es muy importante para controlar la calidad y la concentración de los componentes de las reacciones de traducción in vitro. Por otra parte, una alta eficiencia comercial reconstituido extractos libres de células están disponibles que pueden ser utilizados para los mismos fines (sistema PURE) 18. Usando este método, biotina-16-UMP se incorporó al azar a lo largo del ARNm objetivo. Existe la posibilidad de que algunos ORFs contienen extensiones uridina puede haber incorporado esta modificación de nucleótidos en sus secuencias, que afectan a su traducción. Variable concentraciones relativas de biotin-16-UTP/UTP tienen que ser probados durante la síntesis del ARNm con el fin de obtener la traducción más eficiente. Métodos alternativos de etiquetado biotina se puede utilizar, dirigida al extremo 5 &#39;, el final más estable de los ARNm. (I) La biotina puede ser fijado al extremo 5 &#39;del ARNm con 3&#39;-NH2ATP (3&#39;-amino, 3&#39;-desoxiadenosina trifosfato) y T4 ligasa ARN 19. (Ii) el extremo 5 &#39;marcado con biotina oligonucleótido puede ser fijado al extremo 5&#39; del mRNA usando ARN ligasa de T4 y 20. (Iii) el extremo 3 &#39;marcado con biotina oligodesoxinucleótidos que corresponden a la secuencia complementaria al extremo 5&#39; del ARNm podría utilizarse también para aislar a los complejos de traducir. Estos oligodesoxinucleótidos biotina marcado se podría unir a las pymes antes de su aislamiento. Más tarde, el SMB unido al marcado con biotina oligodesoxinucleótidos se puede mezclar con la mezcla de reacción de traducción para permitir la interacción con sus secuencias de ARNm complementarios. Tras el aislamiento, el híbrido ARN-ADN región - y la región de hibridación entre la oligodeoxynucleotide marcado con biotina y la secuencia del ARNm - puede ser degradado con RNAsa H, la separación de los complejos se estancó a partir de las perlas de estreptavidina. Este método alternativo puede permitir que los complejos para ser empleados en futuros análisis estructural utilizando métodos de resolución más alta.

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		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Tris base</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>252859</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Magnesium acetate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fluka</td>
<td>63049</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Potassium glutamate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>G1501</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ammonium acetate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fluka</td>
<td>09688</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PMSF</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P7626</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Protein A sepharose 4B slurry beads</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P9424</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Leupeptin inhibitor</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>L9783</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Taq-DNA polymerase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Stratagene</td>
<td>201223</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>T7 Maxiprep kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Promega</td>
<td>P1300</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>SMB</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Promega</td>
<td>Z5482</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Biotin-16-UTP</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche</td>
<td>1388908</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>ATP</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>A7699</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>GTP</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>G8877</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PEP</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P7002</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PK</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P7768</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Polyethylenglycol 8000</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fluka</td>
<td>81268</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Folinic acid</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fluka</td>
<td>47612</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Spermidine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fluka</td>
<td>85558</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>tRNA from E. coli</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>R1753</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DEPC</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>D5758</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tricine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>T5816</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L-amino acids</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>LAA21</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DTT</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fluka</td>
<td>43815</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>magnetic separation stands</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Promega</td>
<td>Z5342</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

isolation of translating ribosomes containing peptidyl-trnas for functional and structural analyses

Recientemente, los estudios estructurales y bioquímicos han detallado muchos de los eventos moleculares que ocurren en el ribosoma durante la inhibición de la síntesis de proteínas por los antibióticos y en la síntesis de polipéptidos nacientes. Algunos de estos antibióticos, reguladores y polipéptidos nacientes en su mayoría en forma de peptidil-ARNt, inhibir o formación del enlace peptídico o terminación de la traducción 7.1. Estos eventos inhibitorios pueden detener el movimiento del ribosoma, un fenómeno denominado &quot;La detención de la traducción&quot;. Arresto traducción inducida por un antibiótico o un polipéptido naciente se ha demostrado que regulan la expresión de genes implicados en diversas funciones celulares como el crecimiento celular, resistencia a los antibióticos, la translocación de proteínas y el metabolismo celular 08.13. El conocimiento de cómo los antibióticos y la regulación polipéptidos nacientes alterar la función del ribosoma es esencial si queremos entender el papel completo de los ribosomas en la traducción, en todos los organismos. Aquí se describe una metodología sencilla que puede ser utilizado para purificar, exclusivamente, para su análisis, los ribosomas traducir un ARNm específico y que contienen un determinado peptidil-tRNA 14. Este procedimiento se basa en el aislamiento selectivo de los ribosomas traducir unido a un ARNm marcado con biotina. Estos complejos de traslación están separados de los ribosomas otros en la misma mezcla, usando cuentas estreptavidina paramagnético (SMB) y un campo magnético (CM). ARNm marcado con biotina son sintetizadas por los ensayos de transcripción escorrentía utilizando como fragmentos de plantillas de ADN generadas por la RCP que contienen promotores de la transcripción T7. T7 ARN polimerasa incorpora biotina-16-UMP de biotina-UTP, en nuestras condiciones aproximadamente diez biotina-16-UMP se incorporan moléculas de ARNm en un 600 nt con un 25% de contenido de la UMP. Estas marcado con biotina ARNm se aíslan, y se utiliza en ensayos de traducción in vitro realizados con factor de liberación de 2 (RF2), depleción de células libres de extractos obtenidos a partir de cepas de Escherichia coli que contiene el tipo salvaje o mutante ribosomas. Ribosomas traducir el marcado con biotina secuencias de ARNm se estancó en la región del codón de parada, debido a la ausencia de la proteína RF2, que normalmente se lleva a cabo la traducción de terminación. Estancado ribosomas que contiene la nueva síntesis de peptidil-tRNA son aislados y retirados de las reacciones de traducción mediante SMB y un MF. Estas cuentas sólo sujetarse a la biotina que contienen los mensajes. Los complejos aislados, la traducción, se puede utilizar para analizar las características estructurales y funcionales de tipo salvaje o mutante componentes ribosomal, o secuencias de peptidil-tRNA, así como la determinación de interacción ribosoma con antibióticos u otros factores moleculares 1,14-16. Para examinar la función de estos complejos ribosoma aislado, peptidil-transferasa ensayos pueden ser realizados en presencia del antibiótico puromicina 1. Para estudiar los cambios estructurales en los complejos de traslación, los procedimientos bien establecidos pueden ser utilizados, tales como i) la reticulación de 14 aminoácidos específicos y / o ii) ensayos de protección de alquilación 1,14,17.

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Isolation of Translating Ribosomes Containing Peptidyl-tRNAs for Functional and Structural Analyses

Un obstáculo importante para los análisis bioquímicos de los ribosomas que contienen naciente peptidil-ARNt ha sido la presencia de los ribosomas otros en las mismas muestras, los ribosomas no participan en la traducción de la secuencia del ARNm específico que se analiza. Hemos desarrollado una metodología sencilla para purificar, exclusivamente, los ribosomas que contiene la naciente peptidil-tRNA de interés.

El aislamiento de los ribosomas traducir contienen peptidil-ARNt para el Análisis Funcional y Estructural

Recently, structural and biochemical studies have detailed many of the molecular events that occur in the ribosome during inhibition of protein synthesis ...

isolation-translating-ribosomes-containing-peptidyl-trnas-for

Research

JoVE Journal

Biology

19.7K vistas.  University of Alabama Huntsville. Un obstáculo importante para los análisis bioquímicos de los ribosomas que contienen naciente peptidil-ARNt ha sido la presencia de los ribosomas otros en las mismas muestras, los ribosomas no participan en la traducción de la secuencia del ARNm específico que se analiza. Hemos desarrollado una metodología sencilla para purificar, exclusivamente, los ribosomas que contiene la naciente peptidil-tRNA de interés.

Video: Isolation of Translating Ribosomes Containing Peptidyl-tRNAs for Functional and Structural Analyses

Crystallizing Membrane Proteins for Structure Determination using Lipidic Mesophases

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the lipidic cubic phase or in meso method. The method has been shown to be quite versatile in that it has been used to solve X-ray crystallographic structures of prokaryotic and eukaryotic proteins, proteins that are monomeric, homo- and hetero-multimeric, chromophore-containing and chromophore-free, and alpha-helical and beta-barrel proteins. Recent successes using in meso crystallization are the human engineered beta2-adrenergic and adenosine A2a G protein-coupled receptors. Protocols are presented for reconstituting the membrane protein into the monoolein-based mesophase, and for setting up crystallizations in the manual mode. Additional steps in the overall process, such as crystal harvesting, are to be addressed in future video articles. The time required to prepare the protein-loaded mesophase and to set up a crystallization plate manually is about one hour.

Herein is described the procedure implemented in the Caffrey Membrane Structural and Functional Biology Group to set up manually crystallization trials of membrane proteins in lipidic mesophases.

Cristalización de las proteínas de membrana para la Determinación de la estructura con mesofases lipídico

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the ...

Investigación

Biología

Evisceration of Mouse Vitreous and Retina for Proteomic Analyses

While the mouse retina has emerged as an important genetic model for inherited retinal disease, the mouse vitreous remains to be explored. The vitreous is a highly aqueous extracellular matrix overlying the retina where intraocular as well as extraocular proteins accumulate during disease.1-3 Abnormal interactions between vitreous and retina underlie several diseases such as retinal detachment, proliferative diabetic retinopathy, uveitis, and proliferative vitreoretinopathy.1,4 The relative mouse vitreous volume is significantly smaller than the human vitreous (Figure 1), since the mouse lens occupies nearly 75% of its eye.5 This has made biochemical studies of mouse vitreous challenging. In this video article, we present a technique to dissect and isolate the mouse vitreous from the retina, which will allow use of transgenic mouse models to more clearly define the role of this extracellular matrix in the development of vitreoretinal diseases.

The dissection technique illustrates evisceration of the vitreous, retina, and lens from the mouse eye, separation by centrifugation, and characterization with protein assays.

Evisceración de vítreo y retina del ratón para análisis proteómico

While the mouse retina has emerged as an important genetic model for inherited retinal disease, the mouse vitreous remains to be explored. The vitreous is ...

Isolation and Characterization of RNA-Containing Exosomes

The field of exosome research is rapidly expanding, with a dramatic increase in publications in recent years. These small vesicles (30-100 nm) of endocytic origin were first proposed to function as a way for reticulocytes to eradicate the transferrin receptor while maturing into erythrocytes1, and were later named exosomes. Exosomes are formed by inward budding of late endosomes, producing multivesicular bodies (MVBs), and are released into the environment by fusion of the MVBs with the plasma membrane2. Since the first discovery of exosomes, a wide range of cells have been shown to release these vesicles. Exosomes have also been detected in several biological fluids, including plasma, nasal lavage fluid, saliva and breast milk3-6. Furthermore, it has been demonstrated that the content and function of exosomes depends on the originating cell and the conditions under which they are produced. A variety of functions have been demonstrated for exosomes, such as induction of tolerance against allergen7,8, eradication of established tumors in mice9, inhibition and activation of natural killer cells10-12, promotion of differentiation into T regulatory cells13, stimulation of T cell proliferation14 and induction of T cell apoptosis15. Year 2007 we demonstrated that exosomes released from mast cells contain messenger RNA (mRNA) and microRNA (miRNA), and that the RNA can be shuttled from one cell to another via exosomes. In the recipient cells, the mRNA shuttled by exosomes was shown to be translated into protein, suggesting a regulatory function of the transferred RNA16. Further, we have also shown that exosomes derived from cells grown under oxidative stress can induce tolerance against further stress in recipient cells and thus suggest a biological function of the exosomal shuttle RNA17. Cell culture media and biological fluids contain a mixture of vesicles and shed fragments. A high quality isolation method for exosomes, followed by characterization and identification of the exosomes and their content, is therefore crucial to distinguish exosomes from other vesicles and particles. Here, we present a method for the isolation of exosomes from both cell culture medium and body fluids. This isolation method is based on repeated centrifugation and filtration steps, followed by a final ultracentrifugation step in which the exosomes are pelleted. Important methods to identify the exosomes and characterize the exosomal morphology and protein content are highlighted, including electron microscopy, flow cytometry and Western blot. The purification of the total exosomal RNA is based on spin column chromatography and the exosomal RNA yield and size distribution is analyzed using a Bioanalyzer.

This paper demonstrates methods for the isolation, purification and detection of exosomes, as well as techniques for analysis of their molecular content. These methods are adaptable for exosome isolation from both cell culture media and biological fluids, and can beyond analysis of molecular content also be useful in functional studies.

Aislamiento y caracterización de ARN que contienen exosomas

The field of exosome research is rapidly expanding, with a dramatic increase in publications in recent years. These small vesicles (30-100 nm) of ...

Chromatographic Purification of Highly Active Yeast Ribosomes

Eukaryotic ribosomes are much more labile as compared to their eubacterial and archael counterparts, thus posing a significant challenge to researchers. Particularly troublesome is the fact that lysis of cells releases a large number of proteases and nucleases which can degrade ribosomes. Thus, it is important to separate ribosomes from these enzymes as quickly as possible. Unfortunately, conventional differential ultracentrifugation methods leaves ribosomes exposed to these enzymes for unacceptably long periods of time, impacting their structural integrity and functionality. To address this problem, we utilize a chromatographic method using a cysteine charged Sulfolink resin. This simple and rapid application significantly reduces co-purifying proteolytic and nucleolytic activities, producing high yields of intact, highly biochemically active yeast ribosomes. We suggest that this method should also be applicable to mammalian ribosomes. The simplicity of the method, and the enhanced purity and activity of chromatographically purified ribosome represents a significant technical advancement for the study of eukaryotic ribosomes.

Contamination of preparations of eukaryotic ribosomes purified by traditional methods by co-purifying nucleases and proteases negatively impacts on downstream biochemical and structural analyses. A rapid and simple chromatographic purification method is used to solve this problem using yeast ribosomes as a model system.

Purificación por cromatografía de ribosomas de levadura de gran actividad

Eukaryotic ribosomes are much more labile as compared to their eubacterial and archael counterparts, thus posing a significant challenge to researchers.  ...

Use of a Robot for High-throughput Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through macromolecular X-ray crystallography (MX). An essential ingredient of MX is a steady supply of ideally diffraction-quality crystals. The in meso or lipidic cubic phase (LCP) method for crystallizing membrane proteins is one of several methods available for crystallizing membrane proteins. It makes use of a bicontinuous mesophase in which to grow crystals. As a method, it has had some spectacular successes of late and has attracted much attention with many research groups now interested in using it. One of the challenges associated with the method is that the hosting mesophase is extremely viscous and sticky, reminiscent of a thick toothpaste. Thus, dispensing it manually in a reproducible manner in small volumes into crystallization wells requires skill, patience and a steady hand. A protocol for doing just that was developed in the Membrane Structural &amp; Functional Biology (MS&amp;FB) Group1-3. JoVE video articles describing the method are available1,4. 
The manual approach for setting up in meso trials has distinct advantages with specialty applications, such as crystal optimization and derivatization. It does however suffer from being a low throughput method. Here, we demonstrate a protocol for performing in meso crystallization trials robotically. A robot offers the advantages of speed, accuracy, precision, miniaturization and being able to work continuously for extended periods under what could be regarded as hostile conditions such as in the dark, in a reducing atmosphere or at low or high temperatures. An in meso robot, when used properly, can greatly improve the productivity of membrane protein structure and function research by facilitating crystallization which is one of the slow steps in the overall structure determination pipeline. 
In this video article, we demonstrate the use of three commercially available robots that can dispense the viscous and sticky mesophase integral to in meso crystallogenesis. The first robot was developed in the MS&amp;FB Group5,6. The other two have recently become available and are included here for completeness.	
An overview of the protocol covered in this article is presented in Figure 1. All manipulations were performed at room temperature (~20 &deg;C) under ambient conditions.

Herein is described a robotic approach to high-throughput crystallization of membrane proteins in lipidic mesophases for use in structure determination using macromolecular X-ray crystallography. Three robots capable of handling the viscous and sticky protein-laden mesophase integral to the method are introduced.

El uso de un robot para la cristalización de alto rendimiento de proteínas de membrana en mesofases lipídicas

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through ...

Harvesting and Cryo-cooling Crystals of Membrane Proteins Grown in Lipidic Mesophases for Structure Determination by Macromolecular Crystallography

An important route to understanding how proteins function at a mechanistic level is to have the structure of the target protein available, ideally at atomic resolution. Presently, there is only one way to capture such information as applied to integral membrane proteins (Figure 1), and the complexes they form, and that method is macromolecular X-ray crystallography (MX). To do MX diffraction quality crystals are needed which, in the case of membrane proteins, do not form readily. A method for crystallizing membrane proteins that involves the use of lipidic mesophases, specifically the cubic and sponge phases1-5, has gained considerable attention of late due to the successes it has had in the G protein-coupled receptor field6-21 (<a href="http://www.mpdb.tcd.ie" target="_blank">www.mpdb.tcd.ie</a>). However, the method, henceforth referred to as the in meso or lipidic cubic phase method, comes with its own technical challenges. These arise, in part, due to the generally viscous and sticky nature of the lipidic mesophase in which the crystals, which are often micro-crystals, grow. Manipulating crystals becomes difficult as a result and particularly so during harvesting22,23. Problems arise too at the step that precedes harvesting which requires that the glass sandwich plates in which the crystals grow (Figure 2)24,25 are opened to expose the mesophase bolus, and the crystals therein, for harvesting, cryo-cooling and eventual X-ray diffraction data collection.
The cubic and sponge mesophase variants (Figure 3) from which crystals must be harvested have profoundly different rheologies4,26. The cubic phase is viscous and sticky akin to a thick toothpaste. By contrast, the sponge phase is more fluid with a distinct tendency to flow. Accordingly, different approaches for opening crystallization wells containing crystals growing in the cubic and the sponge phase are called for as indeed different methods are required for harvesting crystals from the two mesophase types. Protocols for doing just that have been refined and implemented in the Membrane Structural and Functional Biology (MS&amp;FB) Group, and are described in detail in this JoVE article (Figure 4). Examples are given of situations where crystals are successfully harvested and cryo-cooled. We also provide examples of cases where problems arise that lead to the irretrievable loss of crystals and describe how these problems can be avoided. In this article the Viewer is provided with step-by-step instructions for opening glass sandwich crystallization wells, for harvesting and for cryo-cooling crystals of membrane proteins growing in cubic and in sponge phases.

Herein is described procedures implemented in the Caffrey Membrane Structural and Functional Biology Group to harvest and cryo-cool membrane protein crystals grown in lipidic cubic and sponge phases for use in structure determination using macromolecular X-ray crystallography.

Recolección y enfriamiento Cryo-cristales de proteínas de membrana cultivadas en mesofases lipídicas para la Determinación de la estructura por cristalografía macromolecular

An important route to understanding how proteins function at a mechanistic level is to have the structure of the target protein available, ideally at ...

Isolation, Culture, and Functional Characterization of Adult Mouse Cardiomyoctyes

The use of primary cardiomyocytes (CMs) in culture has provided a powerful complement to murine models of heart disease in advancing our understanding of heart disease. In particular, the ability to study ion homeostasis, ion channel function, cellular excitability and excitation-contraction coupling and their alterations in diseased conditions and by disease-causing mutations have led to significant insights into cardiac diseases. Furthermore, the lack of an adequate immortalized cell line to mimic adult CMs, and the limitations of neonatal CMs (which lack many of the structural and functional biomechanics characteristic of adult CMs) in culture have hampered our understanding of the complex interplay between signaling pathways, ion channels and contractile properties in the adult heart strengthening the importance of studying adult isolated cardiomyocytes. Here, we present methods for the isolation, culture, manipulation of gene expression by adenoviral-expressed proteins, and subsequent functional analysis of cardiomyocytes from the adult mouse. The use of these techniques will help to develop mechanistic insight into signaling pathways that regulate cellular excitability, Ca2+ dynamics and contractility and provide a much more physiologically relevant characterization of cardiovascular disease.

Here we describe the isolation of adult mouse cardiomyoctyes using a Langendorff perfusion system. The resulting cells are Ca2+-tolerant, electrically quiescent and can be cultured and transfected with adeno- or lentiviruses to manipulate gene expression. Their functionality can also be analyzed using the MMSYS system and patch clamp techniques.

Aislamiento, cultivo y caracterización funcional de ratón adulto Cardiomyoctyes

The use of primary cardiomyocytes (CMs) in culture has provided a powerful complement to murine models of heart disease in advancing our understanding of ...

Reconstitution of a Kv Channel into Lipid Membranes for Structural and Functional Studies

To study the lipid-protein interaction in a reductionistic fashion, it is necessary to incorporate the membrane proteins into membranes of well-defined lipid composition. We are studying the lipid-dependent gating effects in a prototype voltage-gated potassium (Kv) channel, and have worked out detailed procedures to reconstitute the channels into different membrane systems. Our reconstitution procedures take consideration of both detergent-induced fusion of vesicles and the fusion of protein/detergent micelles with the lipid/detergent mixed micelles as well as the importance of reaching an equilibrium distribution of lipids among the protein/detergent/lipid and the detergent/lipid mixed micelles. Our data suggested that the insertion of the channels in the lipid vesicles is relatively random in orientations, and the reconstitution efficiency is so high that no detectable protein aggregates were seen in fractionation experiments. We have utilized the reconstituted channels to determine the conformational states of the channels in different lipids, record electrical activities of a small number of channels incorporated in planar lipid bilayers, screen for conformation-specific ligands from a phage-displayed peptide library, and support the growth of 2D crystals of the channels in membranes. The reconstitution procedures described here may be adapted for studying other membrane proteins in lipid bilayers, especially for the investigation of the lipid effects on the eukaryotic voltage-gated ion channels.

Procedures for complete reconstitution of a prototype voltage-gated potassium channel into lipid membranes are described. The reconstituted channels are suitable for biochemical assays, electrical recordings, ligand screening and electron crystallographic studies. These methods may have general applications to the structural and functional studies of other membrane proteins.

La reconstitución de un canal Kv en las membranas lipídicas de Estudios estructurales y funcionales

To study the lipid-protein interaction in a reductionistic fashion, it is necessary to incorporate the membrane proteins into membranes of well-defined ...

Isolation and Functional Analysis of Mitochondria from Cultured Cells and Mouse Tissue

Comparison between two or more distinct groups, such as healthy vs. disease, is necessary to determine cellular status. Mitochondria are at the nexus of cell heath due to their role in both cell metabolism and energy production as well as control of apoptosis. Therefore, direct evaluation of isolated mitochondria and mitochondrial perturbation offers the ability to determine if organelle-specific (dys)function is occurring. The methods described in this protocol include isolation of intact, functional mitochondria from HEK cultured cells and mouse liver and spinal cord, but can be easily adapted for use with other cultured cells or animal tissues. Mitochondrial function assessed by TMRE and the use of common mitochondrial uncouplers and inhibitors in conjunction with a fluorescent plate reader allow this protocol not only to be versatile and accessible to most research laboratories, but also offers high throughput.

Comparison of mitochondrial membrane potential between samples yields valuable information about cellular status. Detailed steps for isolating mitochondria and assessing response to inhibitors and uncouplers using fluorescence are described. The method and utility of this protocol are illustrated by use of a cell culture and animal model of cellular stress.

Aislamiento y análisis funcional de las mitocondrias de las células cultivadas y ratón de Tejidos

Comparison between two or more distinct groups, such as healthy vs. disease, is necessary to determine cellular status. Mitochondria are at the nexus of ...

A Rapid, Scalable Method for the Isolation, Functional Study, and Analysis of Cell-derived Extracellular Matrix

The extracellular matrix (ECM) is recognized as a diverse, dynamic, and complex environment that is involved in multiple cell-physiological and pathological processes. However, the isolation of ECM, from tissues or cell culture, is complicated by the insoluble and cross-linked nature of the assembled ECM and by the potential contamination of ECM extracts with cell surface and intracellular proteins. Here, we describe a method for use with cultured cells that is rapid and reliably removes cells to isolate a cell-derived ECM for downstream experimentation.
Through use of this method, the isolated ECM and its components can be visualized by in situ immunofluorescence microscopy. The dynamics of specific ECM proteins can be tracked by tracing the deposition of a tagged protein using fluorescence microscopy, both before and after the removal of cells. Alternatively, the isolated ECM can be extracted for biochemical analysis, such as sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and immunoblotting. At larger scales, a full proteomics analysis of the isolated ECM by mass spectrometry can be conducted. By conducting ECM isolation under sterile conditions, sterile ECM layers can be obtained for functional or phenotypic studies with any cell of interest. The method can be applied to any adherent cell type, is relatively easy to perform, and can be linked to a wide repertoire of experimental designs.

The extracellular matrix plays a major role in defining the microenvironment of cells and in modulating cell behavior and phenotype. We describe a rapid method for the isolation of cell-derived extracellular matrix, which can be adapted to different scales for microscopic, biochemical, proteomic, or functional studies.