המחברים מבקשים להודות לPriyanka Subrahmanyam לדיונים מועילים. המחברים לא היו מתחרים אינטרס כלכלי. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהאגודה האמריקנית לסרטן, NIH / NCI CA131487 K01, R21 CA162273, R21 CA162277, ואימונולוגיה של גידולים P30 ותכנית חיסונית לTJ ווב. התוכן הוא באחריות בלעדית של הכותבים ולא בהכרח מייצג את הדעות הרשמיות של מכון הלאומי לסרטן או המכונים הלאומיים לבריאות.

1. דור של aAPC <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני הוספת חלבונים לחרוזים, להכין את כל המגיבים וחוצצים: 0.1M borate החיץ; 1X D-PBS (ללא Ca 2 + וMg 2 +); מאגר שטפי חרוז (1X PBS +5% אנוש א.ב. סרום + 0.02% יזיד נתרן) ; בינוני שלם (100 פירובט RPMI הבינוני mM נתרן, ויטמין פתרון שאינו חיוני 10 מ&quot;מ, 100 מ&quot;מ פתרון MEM ויטמין, 1% -2 mercaptoethanol, ציפרופלוקסאצין מיקרומטר 10, 5% אנוש א.ב. סרום); חיץ MACS (1 ליטר PBS החופשי של Ca 2 + וMg 2 +, 5 גרם BSA, וmmol EDTA 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף 1 M-450 חרוזי מיליליטר Dynabeads אפוקסי עם חיץ 3 מ&quot;ל סטרילי 0.1 מ &#39;borate (חומצה בורה ומים, ה-pH 7.0-7.4) בבקבוקון 5 מ&quot;ל ברור ורוסיליקט זכוכית מושחלת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצינור נפרד microcentrifuge 1.5 מ&quot;ל, להוסיף 100 מיקרוגרם איג hCD1d-dimer ו20 מולקולות costimulatory מיקרוגרם (לדוגמה: אנטי CD28mAb) למיליליטר PBS w / o Ca 1 2 + או Mg 2 +. </li> &lt;li&gt; מקום חרוז המכיל בקבוקון זכוכית על מגנט וחיץ borate aspirate מחרוזים. מוסיף את תערובת חלבונים מצעד 1.2 לבקבוקון ולהחליף כובע. מערבב מייד על ידי היפוך הבקבוקון, לכסות את המכסה עם parafilm, ומניח על כתף ודגירת הלילה ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת, בקבוקון זכוכית המקום על מגנט ולהסיר תערובת חלבונים, תוך הימנעות חרוזים בזהירות. שטוף את החרוזים על ידי הוספת 3 מיליליטר חיץ חרוז לשטוף (PBS עם 5% AB סרום 0.02% יזיד נתרן), ודוגרים ב 4 ° C על כתף למשך 5 דקות. חזור פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חרוזים יכולים להיות מאוחסנים בתערובת לשטוף החרוז הזה. כדי להפוך aAPC הפונקציונלי, להסיר aliquot קטן ולספור את החרוזים באמצעות hemacytometer. בדקו כי החלבונים נטענים ביציבות על החרוזים ע&quot;י השאירו עם נוגדנים (אנטי עכבר דוגמה PE-מצומדות IgG1) וביצוע ניתוחיים תזרים cytometric. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לטעון חרוזים עם אנטיגן, להסיר 5 x 10 7 חרוזים, ולהוסיף לבקבוקון 1.5 מ&quot;ל, לשטוף עם חרוזי המ&quot;ל סטרילי PBS 1. Resuspend שטף עם חרוזי המ&quot;ל סטרילי PBS 1 ולהוסיף אנטיגן; דוגמה: טעינה עם α-GalCer/KRN7000 (5mg/ml). * הערה: אמנם, יש לנו לא זוהו בעיות כלשהן עם מסיסות שומנים או היווצרות micelle, שומנים צריכים יטופל בהתאם להמלצות יצרן. באופן ספציפי, KRN7000 הורכב מחדש בDMSO (1mg/ml) ללימודים אלה. KRN7000 ואנטיגנים glycolipid אחרים יכולים גם להיות מומס ב0.2 מ&quot;ג / המ&quot;ל PBS המכיל 0.5% Tween-20 (sonicate 2 שעות. על 37 מעלות צלזיוס). חשוב-aAPC צריך להיות טעון לפחות 48-72 שעות לפני שימוש. </li></ol> 2. בידוד של CD161 + + תאי CD3 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף תאי mononuclear דם היקפיים (PBMC). להפרדת Ficoll צפיפות שיפוע צנטריפוגה של לימפוציטים ממעייל באפים או חפיסת leukopheresis, לדלל את דם heparinized ראשון עם נפח שווה של 1X PBS בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 15 מ&quot;ל של Ficoll (חמם לטמפרטורת חדר) עד 50 צינורות חרוטי מ&quot;ל. לאט כיסוי25 מ&quot;ל של תערובת הדם המדוללת על גבי Ficoll. צנטריפוגה בסל&quot;ד 2000 למשך 30 דקות בטמפרטורת חדר עם הבלם כבוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציא בזהירות את ממשק הלימפוציטים (טבעת לבנה בין התקשורת וFicoll) עם פיפטה פסטר ולהעביר לצינור חדש 50 מיליליטר חרוטים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את התאים על ידי מילוי הצינור עד 50 מ&quot;ל עם PBS וצנטריפוגה בסל&quot;ד 1500 למשך 5 דקות. בטל supernatant ולשלב את השפופרות מאדם אחד ליחיד צינור ולשטוף את תאי mononuclear דם ההיקפיים (PBMC) שוב עם 20 המ&quot;ל PBS. ואז לספור PBMC וresuspend בריכוז של 5 10 7 תאים / מ&quot;ל במאגר MACS x (1 ליטר PBS ללא Ca 2 + וMg 2 +, 5 גרם BSA, ו 2 mmol EDTA). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לבודד את החלק היחסי של תאי T, להתחיל עם 2 מ&quot;ל של PBMC (10 8 תאים) ולהוסיף 100 μl של פתרון פאן תא T העשרה מקיט EasySep אנוש T Cell ההעשרה. דגירה בטמפרטורת חדר למשך 10 דקות. </li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 100 μl של חלקיקים מגנטיים לפתרון ולדגור בטמפרטורת חדר למשך 10 דקות נוספות. להביא את הנפח הסופי של מיליליטר הממס ל -2.5 ולמקם את הצינור במגנט הסגול למשך 5 דקות. מהירות לשפוך את CD3 + השבריר לתוך צינור חרוטים 15 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את התאים על ידי הוספת 5 מיליליטר חיץ קר MACS, לספור את מספר תאי קיימא, ולהסיר aliquot להכתמת FACS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לבחור את CD161 + תאים, תאי T מועשר 1 resuspend במאגר 980 μl קרח קר MACS, להוסיף 10 מיקרוגרם אנטי CD161 מאב, ודגירה במקרר למשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה התאים ב 1500 סל&quot;ד ב 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. ואז לשחזר את התא גלול ב 800 μl של חיץ MACS. הוסיפו 200 μl של IgG1 microbeads אנטי עכבר ודגירת הפתרון עבור 10 דקות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך שלב דגירה זה, לאזן עמודת LS ידי הוספת חיץ 3 מ&quot;ל MACS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלב בא, לשטוף את התאים על ידי צנטריפוגה 1500 סל&quot;ד ב 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. Resuמבלה את התאים בחיץ 3 מ&quot;ל MACS. אז פיפטה את התאים לעמודה המפרידה MACS LS. הקפידו להימנע מיצירת בועות על ידי pipetting באיטיות. שטוף את העמודה על ידי הוספת 3 מ&quot;ל של חיץ MACS. חזור פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 3 מיליליטר חיץ MACS טרי ולהסיר עמודה ממגנט. עמודת מקום לתוך צינור חרוטי 15 מ&quot;ל. הכנס בוכנה ולדחוף את התכולה להשיג מטוהרים CD161 + CD3 + תאים. תא NKT רוזן מועשר שבריר. אתה צריך 2-4000000 תאים. </li></ol> 3. הרחבת תא NKT aAPC בתיווך <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת שיתוף תרבות על ידי הוספת 10 6 מועשרים CD161 + CD3 + תאי T ו10 6 aAPC במדיום שלם מ&quot;ל 16 (בינוני מלאים + IL-2, 100 U / ml). צלחת תערובת זו על ידי הוספת הנפח 160 μl / גם סופי ל96 פוליסטירן טופל רקמות תרבות היטב, צלחת U-תחתונה עם מכסה-אידוי נמוך. לבצע חילופים בינוניים בכל יום 7 בידי הוספת 80 μl של מדיום טרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קצירתאים, לספור ולבצע צביעת FACS ביום 12-14. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי NKT המורחבים ניתן replated כפי שתואר לעיל בשלב 3.1, במיוחד resuspend 10 6 תאי T מורחבים ו10 6 aAPC במדיום 16 מ&quot;ל מלא. צלחת תערובת זו על ידי הוספת 160 μl / גם ל96 גם צלחת U-תחתונה. תמשיך לרענן בינוני coculture כל יום 7 בידי הוספת 80 μl של מדיום טרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עדיף להקפיא תאי NKT נוספים בעקבות הסיבוב השני של רחבה (1 6 x10 / cryovial ב1 מ&quot;ל-5% DMSO / 95% FBS). </li></ol> 4. מבחן פונקציונלי: גירוי aAPC בתיווך של תאי NKT <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת 5x10 4 תאי NKT / היטב עם 5x10 5 aAPC בנפח 200 μl סופי (בינוני מלא) ב96 גם צלחת U-תחתונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> supernatant קציר תא התרבות לELISA לאחר 24-48 שעות. </li></ol>

<ol>
	<li>Fowlkes, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+population+of+T-cell+receptor+&#945;&#946;-bearing+thymocytes+which+predominantly+expresses+a+single+V&#946;+gene+family.">A novel population of T-cell receptor &#945;&#946;-bearing thymocytes which predominantly expresses a single V&#946; gene family.</a> Nature. 329, 251-254 (1987).</li><li>Prigozy, T. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycolipid+antigen+presentation+by+CD1d+molecules.">Glycolipid antigen presentation by CD1d molecules.</a> Science. 291, 664-667 (2001).</li><li>Davodeau, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Close+phenotypic+and+functional+similarities+between+human+and+murine+&#945;&#946;+T+cells+expressing+invariant+TCR+&#945;-chains.">Close phenotypic and functional similarities between human and murine &#945;&#946; T cells expressing invariant TCR &#945;-chains.</a> J. Immunol. 158, 5603-5611 (1997).</li><li>Exley, M., Garcia, J., Balk, S. P., Porcelli, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirements+for+CD1d+recognition+by+human+invariant+V&#945;24++CD4-CD8-+T+cells.">Requirements for CD1d recognition by human invariant V&#945;24+ CD4-CD8- T cells.</a> J. Exp. Med. 186, 109-120 (1997).</li><li>Koseki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dominant+expression+of+a+distinctive+V14++T-cell+antigen+receptor+&#945;+chain+in+mice.">Dominant expression of a distinctive V14+ T-cell antigen receptor &#945; chain in mice.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88, 7518-7522 (1991).</li><li>Dellabona, P., Padovan, E., Casorati, G., Brockhaus, M., Lanzavecchia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+invariant+V&#945;24-J&#945;Q/V&#946;11+T+cell+receptor+is+expressed+in+all+individuals+by+clonally+expanded+CD4-8-+T+cells.">An invariant V&#945;24-J&#945;Q/V&#946;11 T cell receptor is expressed in all individuals by clonally expanded CD4-8- T cells.</a> J. Exp. Med. 180, 1171-1176 (1994).</li><li>Porcelli, S. A., Modlin, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CD1+System:+Antigen-presenting+molecules+for+T+cell+recognition+of+lipids+and+glycolipids.">The CD1 System: Antigen-presenting molecules for T cell recognition of lipids and glycolipids.</a> Annu. Rev. Immunol. 17, 297-329 (1999).</li><li>Harada, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+of+alpha-galactosylceramide-stimulated+Valpha24++NKT+cells+cultured+in+the+absence+of+animal+materials.">Expansion of alpha-galactosylceramide-stimulated Valpha24+ NKT cells cultured in the absence of animal materials.</a> J. Immunother. 28, 314-321 (2005).</li><li>Bella, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+maturation+of+peripheral+blood+dendritic+cells+in+patients+with+breast+cancer.">Altered maturation of peripheral blood dendritic cells in patients with breast cancer.</a> Br. J. Cancer. 89, 1463-1472 (2003).</li><li>Onishi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysfunctional+and+Short-Lived+Subsets+in+Monocyte-Derived+Dendritic+Cells+from+Patients+with+Advanced+Cancer.">Dysfunctional and Short-Lived Subsets in Monocyte-Derived Dendritic Cells from Patients with Advanced Cancer.</a> Clinical Immunology. 105, 286-295 (2002).</li><li>Shimizu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+function+of+human+invariant+NKT+cells+from+cancer+patients+using+alpha-galactosylceramide-loaded+murine+dendritic+cells.">Evaluation of the function of human invariant NKT cells from cancer patients using alpha-galactosylceramide-loaded murine dendritic cells.</a> J. Immunol. 177, 3484-3492 (2006).</li><li>Shiratsuchi, T., Schneck, J., Kawamura, A., Tsuji, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+CD1+dimeric+proteins+as+indispensable+tools+for+research+on+CD1-binding+lipids+and+CD1-restricted+T+cells.">Human CD1 dimeric proteins as indispensable tools for research on CD1-binding lipids and CD1-restricted T cells.</a> Journal of immunological. 345, 49-59 (2009).</li><li>Webb, T. J., Bieler, J. G., Schneck, J. P., Oelke, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+induction+and+expansion+of+natural+killer+T+cells+by+CD1d1-Ig+coated+artificial+antigen+presenting+cells.">Ex vivo induction and expansion of natural killer T cells by CD1d1-Ig coated artificial antigen presenting cells.</a> J. Immunol. Methods. 346, 38-44 (2009).</li><li>Tham, E. L., Jensen, P. L., Mescher, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+antigen-specific+T+cells+by+artificial+cell+constructs+having+immobilized+multimeric+peptide-class+I+complexes+and+recombinant+B7-Fc+proteins.">Activation of antigen-specific T cells by artificial cell constructs having immobilized multimeric peptide-class I complexes and recombinant B7-Fc proteins.</a> J. Immunol. Methods. 249, 111-119 (2001).</li><li>Goldberg, J., Shrikant, P., Mescher, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+augmentation+of+tumor-specific+CTL+responses+by+class+I/peptide+antigen+complexes+on+microspheres+(large+multivalent+immunogen).">In vivo augmentation of tumor-specific CTL responses by class I/peptide antigen complexes on microspheres (large multivalent immunogen).</a> J. Immunol. 170, 228-235 (2003).</li><li>Dal Porto, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+soluble+divalent+class+I+major+histocompatibility+complex+molecule+inhibits+alloreactive+T+cells+at+nanomolar+concentrations.">A soluble divalent class I major histocompatibility complex molecule inhibits alloreactive T cells at nanomolar concentrations.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90, 6671-6675 (1993).</li><li>Greten, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+visualization+of+antigen-specific+T+cells:+HTLV-1+Tax11-19-specific+CD8++T+cells+are+activated+in+peripheral+blood+and+accumulate+in+cerebrospinal+fluid+from+HAM/TSP+patients.">Direct visualization of antigen-specific T cells: HTLV-1 Tax11-19-specific CD8+ T cells are activated in peripheral blood and accumulate in cerebrospinal fluid from HAM/TSP patients.</a> PNAS. 95, 7568-7573 (1998).</li><li>Oelke, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+induction+and+expansion+of+antigen-specific+cytotoxic+T+cells+by+HLA-Ig-coated+artificial+antigen-presenting+cells.">Ex vivo induction and expansion of antigen-specific cytotoxic T cells by HLA-Ig-coated artificial antigen-presenting cells.</a> Nat. Med. 9, 619-625 (2003).</li><li>Huang, M. M. S., Borszcz, P., Sidobre, S., Kronenberg, M., Kane, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD1d1+Displayed+on+Cell+Size+Beads+Identifies+and+Enriches+an+NK+Cell+Population+Negatively+Regulated+by+CD1d1.">CD1d1 Displayed on Cell Size Beads Identifies and Enriches an NK Cell Population Negatively Regulated by CD1d1.</a> J. Immunol. 172, 5304-5312 (2004).</li><li>Bourgeois, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pro-Th2+cytokine+IL-33+directly+interacts+with+invariant+NKT+and+NK+cells+to+induce+IFN-gamma+production.">The pro-Th2 cytokine IL-33 directly interacts with invariant NKT and NK cells to induce IFN-gamma production.</a> Eur. J. Immunol. 39, 1046-1055 (2009).</li><li>Ugel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+administration+of+artificial+antigen-presenting+cells+activates+low-avidity+T+cells+for+treatment+of+cancer.">In vivo administration of artificial antigen-presenting cells activates low-avidity T cells for treatment of cancer.</a> Cancer Res. 69, 9376-9384 (2009).</li></ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

aAPC ניתן להשתמש כדי ללמוד את הדרישות הבסיסיות להפעלת תא NKT ויש לה ערך קליני פוטנציאל התרחבות vivo לשעבר של תאי NK T לחיסון מאמצת. Mescher et al. תאר אחת מהמערכות המבוססות על החרוז הראשונות, שבו כיתת MHC עכברית biotinylated I-פפטיד בודד מבני שרשרת בשילוב עם מולקולות costimulatory biotinylated B7.1 וB7.2 דרך streptavidin למשטח הלטקס microspheres 14, 15. גישה זו הצלחה נוצלה כדי לעורר תאי T אנטיגן ספציפיים מעכברים מהונדסים. בנוסף, מאחר שגישה זו משתמשת מורכבת שרשרת אחת MHC-פפטיד כדי להבטיח טעינה הומוגנית של מולקולות MHC, כל אנטיגן פפטיד היעד ידרוש transfection חדש לביטוי המורכב שרשרת האחת הרצוי MHC-פפטיד, ובכך להגביל את הכלליות של גישה. חשוב מכך, קבוצתו של ד&quot;ר שנק חלוץ מבוסס aAPC חרוז, על ידי פיתוח aAPC מבוסס חרוז אחר בלתי תאי, שנעשה על ידי צימוד HLA-איג, אות 1, ואנטי CD28, אות 2, על חרוזים מגנטיים. HLA-איג, צורת multimeric ייחודית של HLA התמזגה לאימונוגלובולינים 16 פיגום מולקולרי, 17 פותח על ידי קבוצתו. כתוצאה מכך, הם פתחו איג-MHC המבוסס aAPC, אשר הוכח ביעילות להרחיב CMV וMART-1 CTL 18 ספציפי. הנה, יש לנו הראינו כי aAPC המבוסס CD1d-איג יכול לשמש כדי להרחיב את תאי NKT פונקציונליים. מחקר אחד השתמש במערכת דומה כדי לבחון את האינטראקציה הפיסית של תאי NK עם CD1d 19. יש לציין, שתוכננו תא מציג אנטיגן מלאכותי הניתן להתאמה לכל דרישות שאנו מוצאים הכרחיים לשגשוג תאי NKT אופטימלי. שיטת התרחבות aAPC מספקת שיטה פשוטה ואמינה להרחבה והעשרת תאי NKT אדם. aAPC שלנו יכולה להיות שונה באופן שיטתי כדי להעריך את תפקידו של פנל של מולקולות costimulatory פוטנציאליות ולהעריך את תפקידם בתא NKT proliferation ותפקודו. לפיכך, aAPC מייצג טכנולוגיה תכליתית חזקה שימושית לזירוז והרחבת תאי NKT. הדור של aAPCs לוקח פחות משבוע והוא מתאים לייצור כמויות גדולות של חרוזים. עם זאת, שלב קריטי בהפקת aAPC הוא לאשר שCD1d-איג משותק ביציבות על פני השטח של החרוזים ולהעריך את הפונקציונליות שלהם על מנת להבטיח עקביות מ תצוו תצווה. הגבלת פוטנציאל של המערכת היא שאין מנגנון במקום כדי לכבות את הגירוי, מלבד הסרה מכאנית של החרוזים. באופן ספציפי, המעורבות של הקולטן התא T (TCR) עם אנטיגן: המורכב בדרך כלל לייצר CD1d/MHC סינפסה האימונולוגית בתיאום עם מולקולות אבזר / הדבקה, מה שיכול לגרום לאינדוקציה של גורמים מעכבים או מדכאים הוא בתא וטי מציגי אנטיגן תא. במערכת aAPC, גורמים אלה עשויים להיות upregulated ידי תא T, אבל החרוז לא יביע את ligands מאותו המקורלקולטנים אלה. בנוסף, תאים מסוג CD4 + NKT הוכחו לדכא תגובות antitumor בעכברים ובבני אדם, ולכן ייתכן כי הפעלת סלקטיבי של כל תאי NKT (גירוי הגלובלי כלומר עם α-GalCer) או ההפעלה של המשנה השגוי עלולה לגרום חיסוני לא רצוי תוצאות. כתוצאה מכך, יש phenotypically ופונקציונלי לאפיין את אוכלוסיית תא NKT aAPC-המורחבת. כפי שמוצג בתרשים 4, שגילינו כי גירוי עם α-GalCer הטעון aAPC להביע אנטי CD28 יכול לגרום תאי NKT ייצור Th1, Th2, וציטוקינים סוג Th17. מחקרי Murine דיווחו כי אתגר עם IL-33, ציטוקינים זוהו לאחרונה, הביא לעלייה ברמות מחזור ציטוקינים דלקתיים כגון IL-5 ו IL-13. טיפול בתאי NKT עם IL-33 שופר ייצור ציטוקינים 20 שלהם. IL-33 הוא ספציפי לליגנד ST2 והוכיח שמסיס ST2 can לחסום IL-33 איתות. כך, כדוגמה ליישום בעתיד, ST2 להביע aAPC יכול להיות שנוצר ומשמש כדי לקבוע אם אחד סלקטיבי יכול לעכב את הייצור של ציטוקינים Th2 תוך גרימת הפרשת ציטוקינים על ידי תאי Th1 NKT. כמו כן, דווח כי זריקת IV של Kb-להביע aAPC לC57BL / 6 עכברים גרמו לגרורות ריאות ירידה של 21 גידול. חשוב לציין, הנתונים אלה מראים כי תנועת aAPC לריאות והם מסוגלים להפעיל את תאי ה T תת מפעיל. לכן, אפשר להפיק סוגים שונים של aAPC ולבחון את יחסי הגומלין בין תת קבוצות של תאי T הספציפיות לאנטיגן. לסיכום, מחקרים אלה מראים כי aAPC המבוסס CD1d-איג יכול לשמש תחליף APC הסלולרי הרגיל, ויש לפוטנציאל לשפר גישות קליניות נוכחיות לטיפול חיסוני תא NKT מבוסס מאמץ.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם המגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td><td> תגובות (אופציונלי) </td></tr><tr><td> Ficoll-Paque PLUS </td><td> GE מדעי חיים </td><td> 17-1440 </td><td></td></tr><tr><td> ערכת EasySep אנוש T Cell העשרה </td><td> טכנולוגיות StemCell </td><td> 19051 </td><td></td></tr><tr><td> Allophycocyanin CD161 האנושי MAB </td><td> Pharmingen </td><td> 550968 </td><td></td></tr><tr><td> EasySep מגנט </td><td> טכנולוגיות StemCell </td><td> 18002 </td><td></td></tr><tr><td> אנטי עכבר IgG1 microbeads </td><td> Miltenyi BIOTEC </td><td> 130-047-101 </td><td></td></tr><tr><td> דימר XI רקומביננטי המסיס dimeric העכבר CD1d: חלבון היתוך IG </td><td> BD Biosciences </td><td> 557599 </td><td></td></tr><tr><td&gt; Anti-CD28 MAB </td><td> Biolegend </td><td> 302914 </td><td></td></tr><tr><td> חרוזי M-450 אפוקסי </td><td> חי טכנולוגיות </td><td> 150-11 </td><td></td></tr><tr><td> Alpha-galactosylceramide (KRN7000) </td><td> Axxora, LLC </td><td> BML-SL232-0100 </td><td></td></tr><tr><td> 1640 בינוניים RPMI </td><td> סיגמה אולדריץ </td><td> R 0883 </td><td></td></tr><tr><td> פירובט נתרן </td><td> Gibco </td><td> 11360-070 </td><td></td></tr><tr><td> חומצות אמינו לא חיוניות </td><td> Gibco </td><td> 11140-050 </td><td></td></tr><tr><td> פתרון ויטמין </td><td> Gibco </td><td> 11120-052 </td><td></td></tr><tr><td> 2-mercaptoethanol </td><td> Gibco </td><td></td><td></td></tr><tr><td> ציפרופלוקסאצין </td><td> Biochemicals אלקסיס </td><td> 380-288-G025 </td><td></td></tr><tr><td> PE-Vα24Jα18 </td><td> Biolegend </td><td> 342904 </td><td></td></tr><tr><td> PE-Vα24 (Clone C15) </td><td> Beckman Coulter </td><td> A66907 </td><td></td></tr><tr><td> FITC-Vβ11 (Clone C21) </td><td> Beckman Coulter </td><td> A66905 </td><td></td></tr><tr><td> PE-CD1d </td><td> Biolegend </td><td> 123510 </td><td></td></tr><tr><td> PE אנטי העכבר IgG1 </td><td> BD Biosciences </td><td> 556650 </td><td></td></tr><tr><td> FITC אנטי עכבר IgG2a </td><td> Biolegend </td><td> 407105 </td><td></td></tr><tr><td> DPBS, לא סידן, מגנזיום לא </td><td> חי טכנולוגיות </td><td> 14190250 </td><td></td></tr><tr><td> יזיד הנתרן </td><td> סיגמה אולדריץ </td><td> S8032 </td><td></td></tr><tr><td> שור הסרום אלבומין </td><td> אמריקאי Bioanalytical </td><td> AB00440-00100 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA </td><td> סיגמה אולדריץ </td><td> 431788 </td><td></td></tr><tr><td> IL-2 (Proleukin) </td><td> BD Biosciences </td><td> 354043 </td><td></td></tr><tr><td> אדם א.ב. סרום </td><td> אטלנטה ביולוגית </td><td> S40110 </td><td></td></tr><tr><td> Rotator Tube Labquake </td><td> הפישר סיינטיפיק </td><td> 13-687-10Q </td><td></td></tr><tr><td> BD פלקון 5 צינורות קלקר מיליליטר ישבן עגול </td><td> הפישר סיינטיפיק </td><td> 14-959-1A </td><td></td></tr><tr><td> בקבוקוני זכוכית לדוגמא יטון עם כובע </td><td> הפישר סיינטיפיק </td><td> קטן (03-343-6A) גדול (03-343-6E) </td><td></td></tr></tbody></table>

artificial antigen presenting cell (aapc) mediated activation and expansion of natural killer t cells

רוצח תאי T טבעיים (NKT) הם תת קבוצה ייחודית של תאי T המציגים סמנים אופייניים לשניהם רוצח טבעי (NK) תאים ותאי T 1. בניגוד לתאי T קלסיים, תאי NKT להכיר אנטיגן שומנים בהקשר של מולקולות CD1 2. תאי NKT להביע התארגנות שרשרת TCRα invariant: Vα14Jα18 בעכברים וVα24Jα18 בבני אדם, אשר מזוהים עם שרשרות Vβ גיוון מוגבל 3-6, והם מכונים תאים קנוניים או invariant NKT (i NKT). בדומה לתאי T קונבנציונליים, תאי NKT מתפתחים מתאי T מסוג CD4-CD8 מבשרים-הרתי לאחר האיתות המתאימה של 7 CD1d. הפוטנציאל לניצול תאי NKT למטרות טיפוליות גדל באופן משמעותי ביכולת לעורר ולהרחיב תאי NKT אדם עם α-Galactosylceramide (α-GalCer) ומגוון של ציטוקינים 8. חשוב מכך, תאים אלה נשמרים phenotyp המקורי שלהםדואר, ציטוקינים מופרשים, ותפקוד ציטוטוקסיות מוצג נגד שורות תאים סרטניות. לכן, תאי גופיים מורחבים NKT להישאר פונקציונליים ויכולים לשמש לחיסון מאמצת. עם זאת, טיפול חיסוניים מבוסס-תא NKT הוגבל על ידי השימוש בתאי מציגי אנטיגן autologous והכמות והאיכות של תאי ממריץ אלה יכולים להשתנות במידה ניכרת. DC Monocyte המופק מחולי הסרטן כבר דיווח להביע רמות הנמוכות של מולקולות costimulatory ולייצר ציטוקינים דלקתיים פחות 9,10. למעשה, DC עכברי ולא APC העצמי כבר בשימוש על מנת לבחון את תפקודם של תאי NKT מחולי CML 11. עם זאת, מערכת זו יכולה לשמש רק לבדיקות במבחנה שכן לא ניתן להרחיב על ידי תאי NKT DC העכברי ולאחר מכן משמשים לחיסון מאמצת. לפיכך, מערכת סטנדרטית המסתמכת על תאים המציגים Antigen מלאכותיים (aAPC) יכולה לייצר את ההשפעות הממריצות של DC ללא חסרונות של allo או xenogeneic ce12 LLS, 13. בזאת, אנו מתארים שיטה ליצירת aAPC CD1d מבוסס. מאז האירוסים של הקולטן תא T (TCR) קומפלקסי אנטיגן CD1d הוא דרישה בסיסית של הפעלת NKT תא, אנטיגן: קומפלקסי CD1d-IG לספק שיטה אמינה לבודד, להפעיל, ולהרחיב את אוכלוסיות תאי NKT מפעיל.

מסמך זה אנו מתארים שיטה ליצירת CD1d-איג aAPC מבוסס, שנעשה על ידי צימוד קוולנטי של CD1d-איג ואנטי CD28 מאב לחרוזים מגנטיים כדי לעורר תאי NKT כשיטה סטנדרטית להפצת תאי NKT (איור 1). ראשית, יש להוכיח כי חלבוני היתוך CD1d-IG הם משותקים ביציבות על פני השטח של החרוזים המגנטיים. כפי שמוצג באיור 2 א, CD1d-איג ואנטי CD28 נוגדנים הן הביעו על פני השטח של החרוזים המגנטיים. כדי לבחון את היכולת של גירוי aAPC, אנחנו hybridomas סלולארי שיתוף עם תרבית NKT aAPC הלילה, נקצר supernatants התרבות וייצור IL-2 שנמדד על ידי ELISA. מצאנו כי CD1d-איג המבוסס aAPC הצליח לעורר את hybridomas הסלולרי NKT ברמות שווות או גבוהות יותר מאשר עמיתיהם הסלולריים (איור 3, נתונים אינם מוצגים). מעניין, מצא כי hybridomas הסלולרי NKT עכברנו מומרצים ע&quot;י aAPC האנושי CD1d המבוסס (Figure 2B), אשר מספק שיטה פשוטה לבדיקה של כל אצווה של aAPC. בשלב בא, אנו מבקשים להדגים את פוטנציאל ההתפשטות של aAPC, תאי T וכך אדם בודדו מהדם ההיקפי. ראשית CD161 + + CD3 שבריר תא T הועשר על ידי הפרדת חרוז מגנטית. לאחר מכן, תאי T היו מגורה מידי שבועות עם α-GalCer הטעון aAPC. חשוב מכך, מצאנו כי גם באוכלוסייה נמוכה יחסית ראשונית NKT תא (0.03%), הצליח להרחיב את התאים ל ~ 67% + Vα24 Vβ11 + (איור 3). הרחבנו תאי NKT מPBMC של מתנדבים בריאים וחולי סרטן רבים ומצאנו כי α-GalCer הטעון aAPC הצליח להרחיב את אוכלוסיית NKT תאים בשתי הקבוצות. יש לציין, כי קצב ההתפשטות היה מאוד תורם תלוי. כצפוי אוכלוסייה הראשונית הגבוהה יותר של תאי Vα24 +, האחוז הגדול יותר של התרחבות. בנוסף,בעת שימוש באוכלוסיית מוצא של 2 מיליון תאים CD161 + CD3 + תאי T, ניתן לקבל&gt; 10 7 תאים אחרי שני סיבובים של התרחבות (טבלה 1). כ 80-90% מתאי NKT המורחבים הם מסוג CD4 +, 5% ~ CD8 +, והנותרים הם כנראה תאי NKT שליליים CD4-CD8-כפולים. תאי NKT מורחבים אלו יכולים לשמש למחקרים פונקציונליים כפי שמוצגים באיור 4A-C. אנחנו גילינו שvivo לשעבר שלנו התרחב תאי NKT יישארו מגיבים לגירוי α-GalCer ומפיקים עצמה של IL-17A, TNF-α, IFN-γ ו. יש לציין שאם אוכלוסיית העשרת תא T הראשונית היא נמוכה, והוא אינו מסוגל לבצע את צעד העשרת CD161 השני, התרחבות aAPC בתיווך לא תניב את התוצאות מקוות (ראה איור 4D, תורם 1). עם זאת, אם אחוז התאים במחזור NKT גבוה מ -0.1%, אחד עדיין צריכה להיות מסוגל לקבל הרחבה משמעותיתשל תאי i NKT. באופן קולקטיבי, נתונים אלה מראים כי מבוססי aAPC CD1d ניתן להשתמש ביעילות כדי להרחיב ולעורר תאי NKT אנושיים ראשוניים. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/4333/4333fig1.jpg" /> איור 1. תרשים סכמטי של CD1d: aAPCs איג מבוסס מנות תאיות של מולקולת CD1d מתמזגים לאזור הקבוע של שרשרת כבדה חלבון אימונוגלובולין מופרד על ידי מקשר חומצת אמינו קצר. מולקולות אלה ניתן לטעון בקלות עם אנטיגנים שומנים, כגון α-GalCer, פשוט על ידי דוגר אותם עם עודף של השומנים בדם של עניין. aAPC נעשה על ידי צימוד CD1d-איג ואנטי תקליטור Abs לחרוזים מגנטיים. במערכת זו, CD1d-איג משמש כדי לספק את האות מאותו המקור של אנטיגן הספציפי לדרך TCR ואנטי CD28 MAB מספק את אות costimulatory. <img alt="איור 2" fo:content-width="4.25in" fo: src = &quot;/ files/ftp_upload/4333/4333fig2highres.jpg&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/4333/4333fig2.jpg&quot; /&gt; איור 2. . מכתים FACS של חלבונים שעל פני aAPCs) A aAPCs נבדקו לנוכחות של CD1d: IgG דימר (באמצעות צביעה עם PE-מצומדות IgG1 אנטי עכבר) כמו גם הנוגדן אנטי-CD28 (באמצעות אנטי עכבר IgG2a FITC מצומדות) היסטוגרמות. פתוחה מצביעה שליטת אלוטיפ; היסטוגרמות מלאה מייצגת את הנוגדנים שצוינו. CD1d-איג aAPC הבעה יכולה לעורר IL-2 ייצור על ידי תאי NKT. B) Vα14 + עכבר NKT תאי היברידומה, DN32.D3, הייתה cocultured עם או בינוני, אנטיגן המסיס (α-GalCer), נפרק aAPC או α-GalCer הטעון aAPC. supernatants התרבות נקצרו והכריך ELISA הסטנדרטי שמש למדידת IL-2 ייצור. <img alt="איור 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/4333/4333fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4333/4333fig3.jpg" /> איור 3. התרחבות של תאים על ידי תאי NKT CD1d-IG מצופים מלאכותיים מציגי אנטיגן. () ראשוני CD3 + CD161 + תאים חיוביים כפולים בודדו מPBMCs באמצעות הפרדה מגנטית. התאים הממוינים היו מגורה עם α-GalCer טעון, aAPC המצופה CD1d-איג במשך 14 ימים. התאים היו מוכתמים לגירוי Vα24 וVβ11 aAPC הבא. (ב) תא NKT האנושי ראשוני מתווך תמוגה של קו לימפומה תא B. תאי C1R-CD1d מודגרות עם תאי NKT ביחסים המצוינים בנוכחותו או היעדריו של אנטיגן,-GalCer (100 ng / ml) בצלחות U-96-תחתון גם עבור 20-24 שעות. תמוגה תא בתיווך תא NKT הוערכה על ידי על ידי assay הסטנדרטי 51Cr לשחרור. <img alt="איור 4" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/4333/4333fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4333/4333fig4.jpg" /> איור 4. פרופילי ציטוקינים של תאי NKT aAPC-מורחבים. </stronז&gt; לאחר גירוי עם α GalCer הטעון aAPC במשך שבועות, את תאי NKT המורחבים (1 × 10 5 / הטובים) היו cocultured עם מסיס α-GalCer, PMA / Ionomycin, anti-CD3/28 microbeads, או α-GalCer הטעון aAPC (2 × 10 5 / טוב) עבור 48 שעות. () IL-17 א, (ב) TNF-α, ו( C) IFN-γ ייצור נמדד על ידי ציטוקינים ELISA הסטנדרטית. נתונים המוצגים הם ייצור ציטוקינים נטה לאחר הפחתת הפקדים השליליים (תקשורת וחרוזים ריקים). (ד) תאי T ראשוניים בודדו מPBMC באמצעות הפרדת חרוז מגנטית. התאים הממוינים היו מגורה במשך שבועות עם האינדיקציה טעונה-aAPC-GalCer. התאים הוכתמו באמצעות שרירי בטן ספציפיים לVα24 + + וVβ11 ונותח על ידי cytometry זרימה.

Watch this Scientific Journal Video about Artificial Antigen Presenting Cell aAPC Mediated Activation and Expansion of Natural Killer T Cells at JoVE.com

Artificial Antigen Presenting Cell aAPC Mediated Activation and Expansion of Natural Killer T Cells

כאן אנו מתארים שיטה להפעלה והרחבת תאי NKT אדם מאוכלוסיות תאי T בתפזורת באמצעות תאי מציגי אנטיגן מלאכותיים (aAPC). השימוש בaAPC CD1d המבוסס מספק שיטה סטנדרטית ליצירת מספר רב של תאי NKT פונקציונליים.

Antigen המלאכותי הצגת תא הפעלה (aAPC) מתווכות והרחבת תאי T קטלניים טבעיים

Natural killer T (NKT) cells are a unique subset of T cells that display markers characteristic of both natural killer (NK) cells and T cells1. Unlike ...

artificial-antigen-presenting-cell-aapc-mediated-activation-expansion

Google

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Artificial Antigen Presenting Cell (aAPC) Mediated Activation and Expansion of Natural Killer T Cells

17.9K Views.  University of Maryland. כאן אנו מתארים שיטה להפעלה והרחבת תאי NKT אדם מאוכלוסיות תאי T בתפזורת באמצעות תאי מציגי אנטיגן מלאכותיים (aAPC). השימוש בaAPC CD1d המבוסס מספק שיטה סטנדרטית ליצירת מספר רב של תאי NKT פונקציונליים.

Video: Artificial Antigen Presenting Cell aAPC Mediated Activation and Expansion of Natural Killer T Cells

Preparation and Use of HIV-1 Infected Primary CD4+ T-Cells as Target Cells in Natural Killer Cell Cytotoxic Assays

Natural killer (NK) cells are a vital component of the innate immune response to virus-infected cells. It is important to understand the ability of NK cells to recognize and lyse HIV-1 infected cells because identifying any aberrancy in NK cell function against HIV-infected cells could potentially lead to therapies that would enhance their cytolytic activity. There is a need to use HIV-infected primary T-cell blasts as target cells rather then infected-T-cell lines in the cytotoxicity assays. T-cell lines, even without infection, are quite susceptible to NK cell lysis. Furthermore, it is necessary to use autologous primary cells to prevent major histocompatibility complex class I mismatches between the target and effector cell that will result in lysis. Early studies evaluating NK cell cytolytic responses to primary HIV-infected cells failed to show significant killing of the infected cells 1,2. However, using HIV-1 infected primary T-cells as target cells in NK cell functional assays has been difficult due the presence of contaminating uninfected cells 3. This inconsistent infected cell to uninfected cell ratio will result in variation in NK cell killing between samples that may not be due to variability in donor NK cell function. Thus, it would be beneficial to work with a purified infected cell population in order to standardize the effector to target cell ratios between experiments 3,4. Here we demonstrate the isolation of a highly purified population of HIV-1 infected cells by taking advantage of HIV-1's ability to down-modulate CD4 on infected cells and the availability of commercial kits to remove dead or dying cells 3-6. The purified infected primary T-cell blasts can then be used as targets in either a degranulation or cytotoxic assay with purified NK cells as the effector population 5-7. Use of NK cells as effectors in a degranulation assay evaluates the ability of an NK cell to release the lytic contents of specialized lysosomes 8 called "cytolytic granules". By staining with a fluorochrome conjugated antibody against CD107a, a lysosomal membrane protein that becomes expressed on the NK cell surface when the cytolytic granules fuse to the plasma membrane, we can determine what percentage of NK cells degranulate in response to target cell recognition. Alternatively, NK cell lytic activity can be evaluated in a cytotoxic assay that allows for the determination of the percentage of target cells lysed by release of 51Cr from within the target cell in the presence of NK cells.

Cytotoxicity assays to measure natural killer cell lytic responses to HIV-infected cells is limited by the purity of the target cells. We demonstrate here the isolation of a highly purified population of HIV-1 infected primary T-cell blasts by taking advantage of HIV-1 s ability to down-modulate CD4.

הכנה ושימוש של HIV-1 CD4 ראשי מאשרום + T-תאים כמו תאים היעד של טבע Cell מבחני Killer ציטוטוקסיות

 Natural killer (NK) cells are a vital component of the innate immune response to virus-infected cells. It is important to understand the ability of NK ...

HLA-Ig Based Artificial Antigen Presenting Cells for Efficient ex vivo Expansion of Human CTL

CTL with optimal effector function play critical roles in mediating protection against various intracellular infections and cancer. However, individuals may exhibit suppressive immune microenvironment and, in contrast to activating CTL, their autologous antigen presenting cells may tend to tolerize or anergize antigen specific CTL. As a result, although still in the experimental phase, CTL-based adoptive immunotherapy has evolved to become a promising treatment for various diseases such as cancer and virus infections. In initial experiments ex vivo expanded CMV (cytomegalovirus) specific CTL have been used for treatment of CMV infection in immunocompromised allogeneic bone marrow transplant patients. While it is common to have life-threatening CMV viremia in these patients, none of the patients receiving expanded CTL develop CMV related illness, implying the anti-CMV immunity is established by the adoptively transferred CTL1. Promising results have also been observed for melanoma and may be extended to other types of cancer2. 
While there are many ways to ex vivo stimulate and expand human CTL, current approaches are restricted by the cost and technical limitations. For example, the current gold standard is based on the use of autologous DC. This requires each patient to donate a significant number of leukocytes and is also very expensive and laborious. Moreover, detailed in vitro characterization of DC expanded CTL has revealed that these have only suboptimal effector function 3. 
Here we present a highly efficient aAPC based system for ex vivo expansion of human CMV specific CTL for adoptive immunotherapy (Figure 1). The aAPC were made by coupling cell sized magnetic beads with human HLA-A2-Ig dimer and anti-CD28mAb4. Once aAPC are made, they can be loaded with various peptides of interest, and remain functional for months. In this report, aAPC were loaded with a dominant peptide from CMV, pp65 (NLVPMVATV). After culturing purified human CD8+ CTL from a healthy donor with aAPC for one week, CMV specific CTL can be increased dramatically in specificity up to 98% (Figure 2) and amplified more than 10,000 fold. If more CMV-specific CTL are required, further expansion can be easily achieved by repetitive stimulation with aAPC. Phenotypic and functional characterization shows these expanded cells have an effector-memory phenotype and make significant amounts of both TNF&alpha; and IFN&gamma; (Figure 3).

HLA-Ig Based Artificial Antigen Presenting Cells for Efficient ex vivo Expansion of Human CTL

A new DC independent method for induction and expansion of antigen-specific T cells is described. HLA A2-Ig based artificial Antigen Presenting Cells (aAPC) are loaded with HLA-A2 restricted peptides to efficiently expand CTL of diverse antigen specificity. This technology holds great potential for CTL-based adoptive immunotherapy.

HLA-איג בהתבסס Antigen תאים מלאכותיים הצגת עבור יעיל לשעבר vivo הרחבת CTL האדם

CTL with optimal effector function play critical roles in mediating protection against various intracellular infections and cancer. However, individuals ...

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

The potency of clinical-grade T cells can be improved by combining gene therapy with immunotherapy to engineer a biologic product with the potential for superior (i) recognition of tumor-associated antigens (TAAs), (ii) persistence after infusion, (iii) potential for migration to tumor sites, and (iv) ability to recycle effector functions within the tumor microenvironment. Most approaches to genetic manipulation of T cells engineered for human application have used retrovirus and lentivirus for the stable expression of CAR1-3. This approach, although compliant with current good manufacturing practice (GMP), can be expensive as it relies on the manufacture and release of clinical-grade recombinant virus from a limited number of production facilities. The electro-transfer of nonviral plasmids is an appealing alternative to transduction since DNA species can be produced to clinical grade at approximately 1/10th the cost of recombinant GMP-grade virus. To improve the efficiency of integration we adapted Sleeping Beauty (SB) transposon and transposase for human application4-8. Our SB system uses two DNA plasmids that consist of a transposon coding for a gene of interest (e.g. 2nd generation CD19-specific CAR transgene, designated CD19RCD28) and a transposase (e.g. SB11) which inserts the transgene into TA dinucleotide repeats9-11. To generate clinically-sufficient numbers of genetically modified T cells we use K562-derived artificial antigen presenting cells (aAPC) (clone #4) modified to express a TAA (e.g. CD19) as well as the T cell costimulatory molecules CD86, CD137L, a membrane-bound version of interleukin (IL)-15 (peptide fused to modified IgG4 Fc region) and CD64 (Fc-&gamma; receptor 1) for the loading of monoclonal antibodies (mAb)12. In this report, we demonstrate the procedures that can be undertaken in compliance with cGMP to generate CD19-specific CAR+ T cells suitable for human application. This was achieved by the synchronous electro-transfer of two DNA plasmids, a SB transposon (CD19RCD28) and a SB transposase (SB11) followed by retrieval of stable integrants by the every-7-day additions (stimulation cycle) of &gamma;-irradiated aAPC (clone #4) in the presence of soluble recombinant human IL-2 and IL-2113. Typically 4 cycles (28 days of continuous culture) are undertaken to generate clinically-appealing numbers of T cells that stably express the CAR. This methodology to manufacturing clinical-grade CD19-specific T cells can be applied to T cells derived from peripheral blood (PB) or umbilical cord blood (UCB). Furthermore, this approach can be harnessed to generate T cells to diverse tumor types by pairing the specificity of the introduced CAR with expression of the TAA, recognized by the CAR, on the aAPC.

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

T cells expressing a CD19-specific chimeric antigen receptor (CAR) are infused as investigational treatment of B-cell malignancies in our first-in-human gene therapy trials. We describe genetic modification of T cells using the Sleeping Beauty (SB) system to introduce CD19-specific CAR and selective propagation on designer CD19+ artificial antigen presenting cells.

יישום קליני של<em&gt; יפהפה נרדם</em&gt; ומלאכותי תאי מציגי אנטיגן גנטי לשינוי תאי T מדם טבורים היקפי וטבורים

The potency of clinical-grade T cells can be improved by combining gene therapy with immunotherapy to engineer  a biologic product with the potential for ...

Killer Artificial Antigen Presenting Cells (KaAPC) for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Current treatment of T cell mediated autoimmune diseases relies mostly on strategies of global immunosuppression, which, in the long term, is accompanied by adverse side effects such as a reduced ability to control infections or malignancies. Therefore, new approaches need to be developed that target only the disease mediating cells and leave the remaining immune system intact. Over the past decade a variety of cell based immunotherapy strategies to modulate T cell mediated immune responses have been developed. Most of these approaches rely on tolerance-inducing antigen presenting cells (APC). However, in addition to being technically difficult and cumbersome, such cell-based approaches are highly sensitive to cytotoxic T cell responses, which limits their therapeutic capacity. Here we present a protocol for the generation of non-cellular killer artificial antigen presenting cells (KaAPC), which allows for the depletion of pathologic T cells while leaving the remaining immune system untouched and functional. KaAPC is an alternative solution to cellular immunotherapy which has potential for treating autoimmune diseases and allograft rejections by regulating undesirable T cell responses in an antigen specific fashion.

Killer Artificial Antigen Presenting Cells KaAPC for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Guidelines are presented for the generation of killer artificial antigen presenting cells, KaAPC, an efficient tool for in vitro depletion of human antigen-specific T cells and an alternative solution to cellular immunotherapy for the treatment of T cell-mediated autoimmune diseases in an antigen-specific fashion without compromising the remaining immune system.

תאי מציגי הרוצח המלאכותי Antigen (KaAPC) ליעיל<em&gt; במבחנה</em&gt; דלדול של תאי T אנושי אנטיגן ספציפי

Current treatment of T cell mediated autoimmune diseases relies mostly on strategies of global immunosuppression, which, in the long term, is accompanied ...

An Optimized Method for Isolating and Expanding Invariant Natural Killer T Cells from Mouse Spleen

The ability to rapidly secrete cytokines upon stimulation is a functional characteristic of the invariant natural killer T (iNKT) cell lineage. iNKT cells are therefore characterized as an innate T cell population capable of activating and steering adaptive immune responses. The development of improved techniques for the culture and expansion of murine iNKT cells facilitates the study of iNKT cell biology in in vitro and in vivo model systems. Here we describe an optimized procedure for the isolation and expansion of murine splenic iNKT cells.
Spleens from C57Bl/6 mice are removed, dissected and strained and the resulting cellular suspension is layered over density gradient media. Following centrifugation, splenic mononuclear cells (MNCs) are collected and CD5-positive (CD5+) lymphocytes are enriched for using magnetic beads. iNKT cells within the CD5+ fraction are subsequently stained with &#945;GalCer-loaded CD1d tetramer and purified by fluorescence activated cell sorting (FACS). FACS sorted iNKT cells are then initially cultured in vitro using a combination of recombinant murine cytokines and plate-bound T cell receptor (TCR) stimuli before being expanded in the presence of murine recombinant IL-7. Using this technique, approximately 108 iNKT cells can be generated within 18-20 days of culture, after which they can be used for functional assays in vitro, or for in vivo transfer experiments in mice.

Here we present an adapted protocol that can be used to generate a large number of murine invariant natural killer T cells from mouse spleen. The protocol outlines an approach by which splenic iNKT cells can be enriched for, isolated and expanded in vitro using a limited number of animals and reagents.

שיטה אופטימלית עבור בידוד והרחבת תאי Invariant הטבעי רוצח T מטחול העכבר

The ability to rapidly secrete cytokines upon stimulation is a functional characteristic of the invariant natural killer T (iNKT) cell lineage. iNKT cells ...

Development of an Antigen-driven Colitis Model to Study Presentation of Antigens by Antigen Presenting Cells to T Cells

Inflammatory bowel disease (IBD) is a chronic inflammation which affects the gastrointestinal tract (GIT). One of the best ways to study the immunological mechanisms involved during the disease is the T cell transfer model of colitis. In this model, immunodeficient mice (RAG-/- recipients) are reconstituted with naive CD4+ T cells from healthy wild type hosts.
This model allows examination of the earliest immunological events leading to disease and chronic inflammation, when the gut inflammation perpetuates but does not depend on a defined antigen. To study the potential role of antigen presenting cells (APCs) in the disease process, it is helpful to have an antigen-driven disease model, in which a defined commensal-derived antigen leads to colitis. An antigen driven-colitis model has hence been developed. In this model OT-II CD4+ T cells, that can recognize only specific epitopes in the OVA protein, are transferred into RAG-/- hosts challenged with CFP-OVA-expressing E. coli. This model allows the examination of interactions between APCs and T cells in the lamina propria.

In this antigen-driven colitis model, OT-II CD4+ T cells expressing a red fluorescent protein were adoptively transferred into RAG-/- mice that express a green fluorescent protein in mononuclear phagocytes (MPs). The hosts were challenged with Escherichia coli (E.coli) expressing the ovalbumin protein (OVA) fused to a cyan fluorescent protein (CFP).

פיתוח מודל קוליטיס מונחה Antigen ללמוד מצגת של אנטיגנים על ידי אנטיגן הצגת תאים לתאי T

Inflammatory bowel disease (IBD) is a chronic inflammation which affects the gastrointestinal tract (GIT). One of the best ways to study the immunological ...

Development of Stem Cell-derived Antigen-specific Regulatory T Cells Against Autoimmunity

Autoimmune diseases arise due to the loss of immunological self-tolerance. Regulatory T cells (Tregs) are important mediators of immunologic self-tolerance. Tregs represent about 5 - 10% of the mature CD4+ T cell subpopulation in mice and humans, with about 1 - 2% of those Tregs circulating in the peripheral blood. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) can be differentiated into functional Tregs, which have a potential to be used for cell-based therapies of autoimmune diseases. Here, we present a method to develop antigen (Ag)-specific Tregs from iPSCs (i.e., iPSC-Tregs). The method is based on incorporating the transcription factor FoxP3 and an Ag-specific T cell receptor (TCR) into iPSCs and then differentiating on OP9 stromal cells expressing Notch ligands delta-like (DL) 1 and DL4. Following in vitro differentiation, the iPSC-Tregs express CD4, CD8, CD3, CD25, FoxP3, and Ag-specific TCR and are able to respond to Ag stimulation. This method has been successfully applied to cell-based therapy of autoimmune arthritis in a murine model. Adoptive transfer of these Ag-specific iPSC-Tregs into Ag-induced arthritis (AIA)-bearing mice has the ability to reduce joint inflammation and swelling and to prevent bone loss.

We present here a method to develop functional antigen (Ag)-specific regulatory T cells (Tregs) from induced pluripotent stem cells (iPSCs) for immunotherapy of autoimmune arthritis in a murine model.

פיתוח תאי גזע שמקורם אנטיגן ספציפי תקינים בתאי T נגד אוטואימוניות

Autoimmune diseases arise due to the loss of immunological self-tolerance. Regulatory T cells (Tregs) are important mediators of immunologic ...

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and reproducibility of this assay can be considered unstable, either because of user&#39;s errors or because of the sensitivity of NK cells to experimental manipulation. To eliminate these issues, a workflow that reduces them to a minimum was established and is presented here. To illustrate, we obtained blood samples, at various time points, from runners (n = 4) that were submitted to an intense bout of exercise. First, NK cells are simultaneously identified and isolated through CD56 tagging and magnetic-based sorting, directly from whole blood and from as little as one milliliter. The sorted NK cells are removed of any reagent or capping antibodies. They can be counted in order to establish an accurate NK cell count per milliliter of blood. Secondly, the sorted NK cells (effectors cells or E) can be mixed with 3,3&#39;-Diotadecyloxacarbocyanine Perchlorate (DiO) tagged K562 cells (target cells or T) at an assay-optimal 1:5 T:E ratio, and analyzed using an imaging flow-cytometer that allows for the visualization of each event and the elimination of any false positive or false negatives (such as doublets or effector cells). This workflow can be completed in about 4 h, and allows for very stable results even when working with human samples. When available, research teams can test several experimental interventions in human subjects, and compare measurements across several time points without compromising the data&#39;s integrity.

This work describes an advanced workflow for the accurate and fast determination of NK (Natural Killer) cell count and NK cell cytotoxicity in human blood samples.

ניתוח תזרים Cytometric של תא הטבעי Killer ממס פעילות דם מלא אנוש

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor microenvironment and the underlying mechanism is still largely unknown. The lack of a consistent and reliable source of NK cells limits the research progress of NK cell immunity. Here, we report an in vitro system that can provide high quality and quantity of bone marrow-derived murine NK cells under a feeder-free condition. More importantly, we also demonstrate that siRNA-mediated gene silencing successfully inhibits the E4bp4-dependent NK cell maturation by using this system. Thus, this novel in vitro NK cell differentiating system is a biomaterial solution for immunity research.

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

Here, we present a protocol to mass-produce gene-silencing murine NK cells by using a feeder-free differentiation system for mechanistic study in vitro and in vivo.

הרומן מזין ללא מערכת לייצור המוני של תאים רוצח טבעי מאתר במבחנה

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor ...

Isolation and Adoptive Transfer of High Salt Treated Antigen-presenting Dendritic Cells

Excess dietary salt intake contributes to inflammation and plays a vital role in the development of hypertension. We previously found that antigen-presenting dendritic cells (DCs) can sense elevated extracellular sodium leading to the activation of the NADPH oxidase and formation of isolevuglandin (IsoLG)-protein adducts. These IsoLG-protein adducts react with self-proteins and promote an autoimmune-like state and hypertension. We have developed and optimized state-of-the-art methods to study DC function in hypertension. Here, we provide a detailed protocol for isolation, in vitro treatment with elevated sodium, and adoptive transfer of murine splenic CD11c+ cells into recipient mice to study their role in hypertension.

Here, we present a protocol to isolate dendritic cells from murine spleens by magnetic cell sorting and subsequent adoptive transfer into na&#239;ve mice. The model of high-salt activated dendritic cells was chosen to explain the step-by-step procedures of adoptive transfer and flow cytometry.