אנו מודים שאו-Ming Lu ו האריס א גלברד לשימוש משאבה vibratome peristaltic ו, כמו גם קארן ל בנטלי וגייל שניידר במתקן Core מיקרוסקופ אלקטרונים מחקר של אוניברסיטת רוצ&#39;סטר המרכז הרפואי לקבלת סיוע טכני. עבודה זו מומנה על ידי מענקים מ-NIH (EY019277), וייטהול Foundation, קרן Wellcome בורוז, ואת פ אלפרד סלואן קרן אל AKM. M.-È.T. ממומנת על ידי דה Fonds en la משוכלל ונדיר סנטה קוויבק (FRSQ) בפרס אימון דוקטורט.

1. בעלי חיים זלוף <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום שלפני זלוף, להכין: - 2 ליטר של חיץ פוספט (PB, 100 מ&quot;מ, pH 7.4) ו - 1 ליטר של סודיום פוספט בופר סליין (PBS; 0.9% NaCl ב 50 מ&quot;מ PB, pH 7.4) במים מזוקקים כפול. חנות PBS ו 1 ליטר של PB ב 4 ° C. אלה ישמשו זלוף והטבעה מראש immunocytochemistry. - 1 ליטר של paraformaldehyde 4.0% (PFA, pH 7.4) מקבע פתרון, אשר יאפשר זלוף של 6 עכברים. לשם כך, לחמם 1 ליטר מתחת למכסה המנוע של PB קטר. שקול 40 גרם של גרגירי paraformaldehyde (PFA) ויוצקים לתוך הפתרון PB כאשר הוא מגיע 60 ° C. כאשר הפתרון הוא ברור, עם PFA נמס לגמרי, להתקרר לטמפרטורת החדר (RT) ולאחסן ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום זלוף, להכין 500 מ&quot;ל של תמיסת acrolein 3.5% ב PB מתחת למכסה המנוע קטר. ואז, המסנן acrolein 3.5% ו -4.0% באמצעות פתרונות PFA נייר הסינון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור הרדמה העכבר, להזריק נתרן pentobarbital (80 מ&quot;ג / ק&quot;ג) תוך הצפק עם מד 27 ½ &quot;מחט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך זלוף, 50 מ&quot;ל של PBS, 75 מ&quot;ל של acrolein, ו -150 מ&quot;ל של PFA יהיה ברצף לעבור למחזור העכבר. כדי להגדיר את המשאבה peristaltic, למלא את צינורות עם PBS ולתקן מד 23 ¾ &quot;מחט פרפר בקצה אחד. לטבול את הקצה השני של הצינור לתוך הפתרון זלוף (PBS, acrolein או PFA). קבע את המהירות של peristaltic משאבת 20-25 mL / min עבור עכברים צעירים ומבוגרים. ברחבי זלוף, בזהירות למנוע בועות אוויר להרכיב בצינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המתן עד העכבר מורדם כבר לא מגיב לגירויים מכאיבים, כגון צביטה זנב, לפני שתמשיך. הנח את החיה מגש לנתיחה ולתקן את הכפות באמצעות קלטת. עם פינצטה ומספריים, לפתוח את עור החזה כדי לחשוף את הלב. כדי למזער איסכמיה, זלוף צריך להיות נכתבו במהירות. גזור לפתוח את אטריום ימין עם מספריים קטנים להתחיל את המשאבה peristaltic. בעוד מחזיק את הלב עם פינצטה, הכנס את המחט לתוך פרפר לשיא של החדר השמאלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעת שינוי הפתרון, להפסיק את המשאבה peristaltic, להעביר את צינורות מפתרון אחד למשנהו, ולהפעיל מחדש את המשאבה מיד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר 150 מ&quot;ל של PFA עבר, להפסיק את המשאבה peristaltic. בעזרת מספריים קטנים, חותכים את הראש, לפתוח את העור, לשבור את הגולגולת בין העיניים. בעזרת פינצטה קטנה, שבב בזהירות את חתיכות קטנות של הגולגולת עד שהמוח ניתן להסיר בקלות. פוסט לתקן את המוח 2 שעות 4 מעלות צלזיוס PFA. לשטוף 3 פעמים 10 דקות PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיד לחתוך את המוח רוחבי (50 חלקים עבים מיקרומטר) בקרח מקורר PBS באמצעות vibratome. בעזרת מברשת עדינה, העברת חלקים נבחרים immunocytochemistry לתוך בקבוקון זכוכית המכיל PBS. אחסן את החלקים הנותרים ב -20 מעלות צלזיוס cryoprotectant (30% אתילן גליקול גליצרול ו 30% ב-PBS) עד מספר שנים. </li></ol> 2. טרום הטבעה immunocytochemistry <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור immunocytochemistry, קטעים מעובדים בחופשיות צף צלוחיות זכוכית. לאורך כל ההליך, צריך להיזהר לתת חלקים להתייבש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ראשית, להסיר את PBS בעזרת פיפטה העברה מיד להחליף עם פתרון חדש של borohydride נתרן 0.1% ב PBS במשך 30 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף חלקים עם PBS 3 פעמים 10 דקות, להסיר את כל הבועות, ו דגירה עבור 2 שעות RT בפתרון חסימת PBS המכיל 0.5% לטין בסרום נורמלי 5% של החיה שבה נוגדנים משני שנוצר (נסיוב עז נורמלית הדוגמה הנוכחית immunostaining-Iba1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה של 48 שעות עם נוגדן ראשוני חסימת פתרון. עבור immunostaining-Iba1, להשתמש אנטי Iba1 ארנבת הנוגדן (1:1000). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף חלקים עם PBS 3 פעמים 10 דקות דגירה של נוגדנים משני מצומדות כדי ביוטין (1:1000) בחסימת פתרון 2 שעות RT. עבור immunostaining-Iba1, השתמש נגד ארנב IgGs עז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף חלקים עם PBS 3 פעמים 10 דקות דגירה של peroxidase-streptavidin חזרת (1:1000) בחסימת פתרון לשעה 1 ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף חלקים עם PBS 10 דקות עם טריס / HCl שנאגרו מלוחים (TBS, 50 מ&quot;מ, ה-pH 7.4) 2 פעמים 10 דקות. כדי לחשוף את התיוג, דגירה קטעים עם DAB 0.05% ו 0.01% חמצן ב TBS (פתרון מוכן טרי). כאשר מכתים הוא חום כהה (ראה דוגמה באיור 1), לעצור את התגובה על ידי שטיפה ב TBS. בכל מקרה, בסוף התגובה לאחר למקסימום של 5 דקות. לשטוף חלקים עם כפות 10 דקות עם PB 2 פעמים 10 דקות. </li></ol> 3. עיבוד עבור במיקרוסקופ אלקטרונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת חלקים לתוך PB בצלחת תרבות multiwell בעזרת מברשת בסדר. הכן 1% tetroxide אוסמיום פתרון PB מתחת למכסה המנוע רותח. הסר PB מבארות הצלחת תרבות<html> להפיץ את הסעיפים שטוח עם מברשת עדינה. סעיפים לטבול מיד אוסמיום 1% למשך 30 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת חלקים לתוך צלוחיות זכוכית, לשטוף עם PB 3 פעמים 10 דקות, מייבשים דרך התעמקות 2 דקות לתוך עולה ריכוזי אתנול: 2 פעמים 35%, 1 בכל פעם של 50%, 70%, 80%, 90% ו 95 %, 3 פעמים 100%, ואחריו 3 פעמים פרופילן אוקסיד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להכין את שרף Durcupan, לשלב 20 גרם של רכיב, 20 גרם של רכיב ב &#39;, 0.6 גרם של רכיב C, ו - 0.4 גרם של מרכיב D לכוס חד פעמיות, ומערבבים היטב עד שהצבע הופך אחיד, ויוצקים לתוך אלומיניום לשקול צלחת. במידת הצורך, אבני שרף יכול להיות מוכן על ידי שפיכת שרף לתוך הטבעת תבניות תנור ריפוי ב 55 מעלות צלזיוס במשך 48-72 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מברשת בסדר לשטוף עם פרופילן אוקסיד, להסיר קטעים מתוך תחמוצת פרופילן לטבול לתוך שרף Durcupan הספגה עבור לילה בבית RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת, לשים האלומיניום לשקול מאכל לתוך תנור 55 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות כדי לרכך את שרף. בעזרת מברשת שטפה עם פרופילן אוקסיד, מעיל סרט הטבעה ACLAR בשכבה דקה של שרף, שכב הסעיפים, מכסים עם סרט אחר הטבעה, ובאופן שווה להפיץ משקולות קלות (כ -2 גרם, למשל את פקקי פלסטיק של צלוחיות זכוכית) על גבי לעזור שרף מתפשטת. עבור פילמור שרף, דגירה בתנור למשך 48-72 שעות (ב 55 ° C). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר פילמור, להסיר את המשקולות אור הסרט הטבעה על החלק העליון של הסעיפים. תחת מיקרוסקופ המשקפת, בחר תחומי עניין מרובע (כ 2x2 מ&quot;מ) ובלו אותם בקפידה מתוך הסרט באמצעות סכין גילוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דבק תחומי עניין בקצה גושי שרף באמצעות דבק מגע מרפא את התנור ב 55 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקראת חתך, חתוך את גוש שרף בצורת טרפז שווה שוקיים עם סכין גילוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש ultramicrotome וסכין זכוכית, להסיר את דבק שרף על פני השטח של הרקמה. ממלאים את הסירה של סכין זכוכית עם מים מזוקקים כפול לחתוך כמה חצי דקה חלקים (0.5-1 מיקרומטר עבה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת חלקים לשקופית SuperFrost עם לולאה מושלמת. יבש את החלקים על ידי הצבת את השקופית על צלחת חימום על 80 מעלות צלזיוס למשך דקה 1. מכסים עם כמה טיפות של 0.1% toluidine כחול (borate 2 גרם נתרן ו -0.2 גרם toluidine כחול במים מזוקקים 200 מ&quot;ל כפול) כתם במשך דקה 1. יש לשטוף את הכתם עם עודף מים מזוקקים כפול. בחינת הסעיפים עם מיקרוסקופ אור יאפשר להבחין בין רקמה צבעונית של שרף (איור 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קורות חיים חיתוך עד הגבול בין רקמות שרף מגיע באמצע הקטעים. שים לב כי ההליך הבא דורש הכשרה. החלף את הסכין בכוס עם סכין יהלום ולמלא את הסירה במים מזוקקים כפול. גזור כסף כסף זהב סעיפים Ultrathin (60-80 ננומטר עבה) בזהירות לאסוף אותם על רשת רשתות נחושת באמצעות פינצטה הפוכה בסדר. יבש את רשתות על נייר הסינון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לשפר לעומת זאת, בסעיפים Ultrathin יכול להיות מוכתם להוביל ציטראט (citrate 0.03 גרם עופרת 0.1 מ&quot;ל נתרן הידרוקסיד 10N במים מזוקקים 10 מ&quot;ל כפול 1). בעזרת פינצטה הפוכה בסדר, העברת רשת ירידה של ציטרט להוביל במשך 2 דקות. הסר את הרשת בעדינות ולשטוף ב 3 אמבטיות רצופים של מים מזוקקים כפול. לבסוף, לייבש את רשתות על נייר לסנן ולאחסן אותם בתוך קופסת רשת עד בדיקה מיקרוסקופית אלקטרונים (איורים 3-6). </li></ol> 4. נציג תוצאות <img src="/files/ftp_upload/2021/2021fig1.jpg" alt="איור 1" /> באיור 1. Iba1 מוכתם בסעיף ברמה המיקרוסקופית אור. הפצה הסלולר של Iba1 מוגבל microglia, אשר מציג את הספציפיות של immunostaining. בר סולם = 100 מיקרומטר. <img src="/files/ftp_upload/2021/2021fig2.jpg" alt="איור 2" /> 2. איור Toluidine כחול מוכתם חצי דקה בסעיף ברמה המיקרוסקופית אור. הערה הגבול בין רקמות שרף שבו immunostaining יופיע אינטנסיבי ביותר מיקרוסקופ אלקטרונים. <img src="/files/ftp_upload/2021/2021fig3.jpg" alt="איור 3" /> 3. איור Ultrathin סעיף מראה Iba1-immunopositive perikaryon microglial ותהליכים ברמה מיקרוסקופית אלקטרונים. אלמנטים מבניים Iba1 חיובי מוכרים על ידי המשקע אימונו-DAB אלקטרונים צפופה שלהם. בר סולם = 2 מיקרומטר. <img src="/files/ftp_upload/2021/2021fig4.jpg" alt="איור 4" /> 4. איור Ultrathin סעיף הצגת Iba1-immunopositive תהליכים microglial גדלים וצורות שונים ברמה מיקרוסקופית אלקטרונים. בר סולם = 2 מיקרומטר. ה 5 &quot;/&gt; איור 5. סעיף Ultrathin מראה בהגדלה גבוהה תהליך Iba1 חיובי microglial מ איור 4, המאפשר זיהוי של אברונים תאיים שלה. בר סולם = 1 מיקרומטר. <img src="/files/ftp_upload/2021/2021fig6.jpg" alt="איור 6" /> איור 6. Ultrathin סעיף חושף בהגדלה גבוהה יותר את היחסים בין ultrastructural Iba1 תהליך חיובי microglial אלמנטים הסמוך neuropil כולל סינפסות. בר סולם = 1μm.

<ol>
	<li>Venable, J. H., Coggeshall, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simplified+lead+citrate+stain+for+use+in+electron+microscopy.">A simplified lead citrate stain for use in electron microscopy.</a> J Cell Biol. 25, 407-407 (1965).</li><li>Riad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatodendritic+localization+of+5-HT1A+and+preterminal+axonal+localization+of+5-HT1B+serotonin+receptors+in+adult+rat+brain.">Somatodendritic localization of 5-HT1A and preterminal axonal localization of 5-HT1B serotonin receptors in adult rat brain.</a> J Comp Neurol. 417 (2), 181-181 (2000).</li><li>Tremblay, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+EphA4+in+axon+terminals+and+dendritic+spines+of+adult+rat+hippocampus.">Localization of EphA4 in axon terminals and dendritic spines of adult rat hippocampus.</a> J Comp Neurol. 501 (5), 691-691 (2007).</li><li>Tremblay, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+course+of+EphA4+cellular+and+subcellular+localization+in+the+postnatal+rat+hippocampus.">Developmental course of EphA4 cellular and subcellular localization in the postnatal rat hippocampus.</a> J Comp Neurol. 512 (6), 798-798 (2009).</li><li>Bouvier, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-synaptic+and+post-synaptic+localization+of+EphA4+and+EphB2+in+adult+mouse+forebrain.">Pre-synaptic and post-synaptic localization of EphA4 and EphB2 in adult mouse forebrain.</a> J Neurochem. 106 (2), 682-682 (2008).</li><li>Bouvier, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EphA4+is+localized+in+clathrin-coated+and+synaptic+vesicles+in+adult+mouse+brain.">EphA4 is localized in clathrin-coated and synaptic vesicles in adult mouse brain.</a> J Neurochem. , (2010).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

כאן יש לנו תיאר פרוטוקול להכנת רקמת המוח העכבר עבור מיקרוסקופיה immunoelectron המספק פשרה מצוינת בין שימור ultrastructural אופטימלית זיהוי immunocytochemical, כאשר הנהלים מבוצעים בקפדנות. בשילוב עם TEM, שיטה זו מאפשרת להבחין בין אלמנטים הסלולר עם מאפיי?...

* תמיד צריך לעבוד מתחת למכסה המנוע קטר ללבוש כפפות בעת טיפול nitrile acrolein, paraformaldehyde ו אוסמיום ויש גם להשליך את הפסולת שלהם כראוי.

preparation of mouse brain tissue for immunoelectron microscopy

הילוכים במיקרוסקופ אלקטרונים (TEM) הוא מאוד שימושי עבור חזותי microglial, תאים subcellular oligodendrocytic, astrocytic, ואת עצבי (דנדריט, עמוד השדרה דנדריטים, האקסון, האקסון לטרמינל, perikaryon), כמו גם אברונים תאיים שלהם cytoskeleton, במערכת העצבים המרכזית ברזולוציה מרחבית גבוהה. בשילוב עם TEM, טרום הטבעה immunocytochemistry מאפשר את האפליה של אלמנטים הסלולר עם מאפיינים בולטים כמה קריטריונים הזדהות (למשל, microglial perikarya ותהליכים, כאשר באמצעות נוגדן כנגד סמן microglia ספציפית Iba1 (סידן מיונן מחייב מתאם המולקולה 1, כפי שהוצגו כאן)), זיהוי תוכן הנוירוטרנסמיטר של אלמנטים הסלולרי (למשל, serotonergic) ולוקליזציה ultrastructural שלהם של חלבונים מסיסים או קרום הנכנס (למשל, 5 ו HT1A EphA4 קולטנים). כאן אנו מתארים פרוטוקול זלוף transcardiac של עכברים עם acrolein מקבע, הסרת חתך של המוח, כמו גם אימונו-diaminobenzidine (DAB) מכתים, הטבעה שרף, Ultrathin חתך של בסעיפים המוח. עם השלמת הליכים אלה, החומר immunostained מוכן לבדיקה עם TEM. כאשר מבוצע בקפידה, טכניקה זו מהווה פשרה מצוינת בין שימור ultrastructural אופטימלית זיהוי immunocytochemical.

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Mouse Brain Tissue for Immunoelectron Microscopy at JoVE.com

Preparation of Mouse Brain Tissue for Immunoelectron Microscopy

אנו מתארים פרוטוקול עבור זלוף transcardiac של הסרת, עכברים חתך של המוח, כמו גם מכתים אימונו, הטבעה שרף, Ultrathin חתך של חלקים במוח. עם השלמת הליכים אלה, החומר immunostained מוכן בדיקה עם מיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים.

הכנת רקמות מוח עכבר מיקרוסקופית Immunoelectron

Transmission electron microscopy (TEM) is extremely useful for visualizing microglial, oligodendrocytic, astrocytic, and neuronal subcellular compartments ...

preparation-of-mouse-brain-tissue-for-immunoelectron-microscopy

Research

JoVE Journal

Neuroscience

36.7K Views.  University of Rochester. אנו מתארים פרוטוקול עבור זלוף transcardiac של הסרת, עכברים חתך של המוח, כמו גם מכתים אימונו, הטבעה שרף, Ultrathin חתך של חלקים במוח. עם השלמת הליכים אלה, החומר immunostained מוכן בדיקה עם מיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים.

Video: Preparation of Mouse Brain Tissue for Immunoelectron Microscopy

Focussed Ion Beam Milling and Scanning Electron Microscopy of Brain Tissue

This protocol describes how biological samples, like brain tissue, can be imaged in three dimensions using the focussed ion beam/scanning electron microscope (FIB/SEM). The samples are fixed with aldehydes, heavy metal stained using osmium tetroxide and uranyl acetate. They are then dehydrated with alcohol and infiltrated with resin, which is then hardened. Using a light microscope and ultramicrotome with glass knives, a small block containing the region interest close to the surface is made. The block is then placed inside the FIB/SEM, and the ion beam used to roughly mill a vertical face along one side of the block, close to this region. Using backscattered electrons to image the underlying structures, a smaller face is then milled with a finer ion beam and the surface scrutinised more closely to determine the exact area of the face to be imaged and milled. The parameters of the microscope are then set so that the face is repeatedly milled and imaged so that serial images are collected through a volume of the block. The image stack will typically contain isotropic voxels with dimenions as small a 4 nm in each direction. This image quality in any imaging plane enables the user to analyse cell ultrastructure at any viewing angle within the image stack.

This protocol describes how resin embedded brain tissue can be prepared and imaged in the three dimensions in the focussed ion beam, scanning electron microscope.

אלומת יונים ממוקדת כרסום מיקרוסקופיית אלקטרונים של רקמת המוח

This protocol describes how biological samples, like brain tissue, can be imaged in three dimensions using the focussed ion beam/scanning electron ...

Multiphoton Microscopy of Cleared Mouse Brain Expressing YFP

Multiphoton microscopy of intrinsic fluorescence and second harmonic generation (SHG) of whole mouse organs is made possible by optically clearing the organ before imaging.1,2 However, for organs that contain fluorescent proteins such as GFP and YFP, optical clearing protocols that use methanol dehydration and clear using benzyl alcohol:benzyl benzoate (BABB) while unprotected from light3 do not preserve the fluorescent signal. The protocol presented here is a novel way in which to perform whole organ optical clearing on mouse brain while preserving the fluorescence signal of YFP expressed in neurons. Altering the optical clearing protocol such that the organ is dehydrated using an ethanol graded series has been found to reduce the damage to the fluorescent proteins and preserve their fluorescent signal for multiphoton imaging.4 Using an optimized method of optical clearing with ethanol-based dehydration and clearing by BABB while shielded from light, we show high-resolution multiphoton images of yellow fluorescent protein (YFP) expression in the neurons of a mouse brain more than 2 mm beneath the tissue surface.

Multiphoton microscopy of whole mouse organs is possible by optically clearing the organ before imaging, but not all protocols preserve the fluorescent signal of fluorescent proteins. Using an optical clearing method with ethanol-based dehydration and benzyl alcohol:benzyl benzoate clearing, we show high-resolution multiphoton images of whole mouse brain expressing YFP.

Multiphoton מיקרוסקופי של מוח העכבר הותר הבעת YFP

Multiphoton microscopy of intrinsic fluorescence and second harmonic generation (SHG) of whole mouse organs is made possible by optically clearing the ...

Micron-scale Resolution Optical Tomography of Entire Mouse Brains with Confocal Light Sheet Microscopy

Understanding the architecture of mammalian brain at single-cell resolution is one of the key issues of neuroscience. However, mapping neuronal soma and projections throughout the whole brain is still challenging for imaging and data management technologies. Indeed, macroscopic volumes need to be reconstructed with high resolution and contrast in a reasonable time, producing datasets in the TeraByte range. We recently demonstrated an optical method (confocal light sheet microscopy, CLSM) capable of obtaining micron-scale reconstruction of entire mouse brains labeled with enhanced green fluorescent protein (EGFP). Combining light sheet illumination and confocal detection, CLSM allows deep imaging inside macroscopic cleared specimens with high contrast and speed. Here we describe the complete experimental pipeline to obtain comprehensive and human-readable images of entire mouse brains labeled with fluorescent proteins. The clearing and the mounting procedures are described, together with the steps to perform an optical tomography on its whole volume by acquiring many parallel adjacent stacks. We showed the usage of open-source custom-made software tools enabling stitching of the multiple stacks and multi-resolution data navigation. Finally, we illustrated some example of brain maps: the cerebellum from an L7-GFP transgenic mouse, in which all Purkinje cells are selectively labeled, and the whole brain from a thy1-GFP-M mouse, characterized by a random sparse neuronal labeling.

In this article we describe the full experimental procedure to reconstruct, with high resolution, the fine brain anatomy of fluorescently labeled mouse brains. The described protocol includes sample preparation and clearing, specimen mounting for imaging, data post-processing and multi-scale visualization.

מיקרון בקנה מידת רזולוציה אופטית טומוגרפיה של מוח עכבר השלם עם מיקרוסקופית גיליון Confocal אור

Understanding the architecture of mammalian  brain at single-cell resolution is one of the key issues of neuroscience.  However, mapping neuronal soma and ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow for an in-depth characterization to identify pathways involved in these events. Cerebellar granule neurons (CGNs) that are derived from the developing cerebellum are an ideal model system that allows for morphological analyses. Here, we describe a method of how to genetically manipulate CGNs and how to study axono- and dendritogenesis of individual neurons. With this method the effects of RNA interference, overexpression or small molecules can be compared to control neurons. In addition, the rodent cerebellar cortex is an easily accessible in vivo system owing to its predominant postnatal development. We also present an in vivo electroporation technique to genetically manipulate the developing cerebella and describe subsequent cerebellar analyses to assess neuronal morphology and migration.

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Neuronal morphogenesis and migration are crucial events underlying proper brain development. Here, we describe methods to genetically manipulate cultured cerebellar granule neurons and the developing cerebellum for the assessment of morphology and migratory characteristics of neurons.

מניפולציה גנטית של Cerebellar גרגיר נוירונים<em&gt; במבחנה</em&gt; ו<em&gt; בVivo</em&gt; ללמוד עצבי מורפולוגיה וגירה

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of the olfactory epithelium continuously give rise to new sensory neurons that extend their axons into the olfactory bulb, where they face the challenge to integrate into existing circuitry. Because of this particular feature, the olfactory system represents a unique opportunity to monitor axonal wiring and guidance, and to investigate synapse formation. Here we describe a procedure for in vivo labeling of sensory neurons and subsequent visualization of axons in the olfactory system of larvae of the amphibian Xenopus laevis. To stain sensory neurons in the olfactory organ we adopt the electroporation technique. In vivo electroporation is an established technique for delivering fluorophore-coupled dextrans or other macromolecules into living cells. Stained sensory neurons and their axonal processes can then be monitored in the living animal either using confocal laser-scanning or multiphoton microscopy. By reducing the number of labeled cells to few or single cells per animal, single axons can be tracked into the olfactory bulb and their morphological changes can be monitored over weeks by conducting series of in vivo time lapse imaging experiments. While the described protocol exemplifies the labeling and monitoring of olfactory sensory neurons, it can also be adopted to other cell types within the olfactory and other systems.

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

We describe a protocol for in vivo labeling of olfactory sensory neurons by electroporation and subsequent confocal laser-scanning or multiphoton microscopy to visualize neuronal morphology and its development over time.

מערכת חוש הריח כמודל לחקר דפוסי axonal צמיחה ומורפולוגיה<em&gt; In vivo</em

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of ...

Preparation of Non-human Primate Brain Tissue for Pre-embedding Immunohistochemistry and Electron Microscopy

Despite all the technological advances at the light microscopy&#160;level, electron microscopy remains the only tool in neuroscience to examine and characterize ultrastructural and morphological details of neurons, such as synaptic contacts. Good preservation of brain tissue for electron microscopy can be obtained by rigorous cryo-fixation methods, but these techniques are rather costly and limit the use of immunolabeling, which is crucial to understand the connectivity of identified neuronal systems. Freeze-substitution methods have been developed to allow the combination of cryo-fixation with immunolabeling. However, the reproducibility of these methodological approaches usually relies on costly freezing devices. Moreover, achieving reliable results with this technique is very time-consuming and skill-challenging. Hence, the traditional chemically fixed brain, particularly with acrolein fixative, remains a time-efficient and low-cost method to combine electron microscopy with immunohistochemistry. Here, we provide a reliable experimental protocol using chemical acrolein fixation that leads to the preservation of primate brain tissue and is compatible with pre-embedding immunohistochemistry and transmission electron microscopic examination.

Here, we provide an easy, low-cost, and time-efficient protocol to chemically fix primate brain tissue with acrolein fixative, allowing for long-term preservation that is compatible with pre-embedding immunohistochemistry for transmission electron microscopy.

הכנה של רקמת מוח הפרימאטים לא-אנושית עבור טרום הטבעת אימונוהיסטוכימיה ו מיקרוסקופי אלקטרונים

Despite all the technological advances at the light microscopy&#160;level, electron microscopy remains the only tool in neuroscience to examine and ...

Combined Mechanical and Enzymatic Dissociation of Mouse Brain Hippocampal Tissue

This neural dissociation protocol (an adaptation of the protocol accompanying a commercial adult brain dissociation kit) optimizes tissue processing in preparation for detailed downstream analysis such as flow cytometry or single-cell sequencing. Neural dissociation can be conducted via mechanical dissociation (such as using filters, chopping techniques, or pipette trituration), enzymatic digestion, or a combination thereof. The delicate nature of neuronal cells can complicate efforts to obtain the highly viable, true single-cell suspension with minimal cellular debris that is required for single-cell analysis. The data demonstrate that this combination of automated mechanical dissociation and enzymatic digestion consistently yields a highly viable (&gt;90%) single-cell suspension, overcoming the aforementioned difficulties. While a few of the steps require manual dexterity, these steps lessen sample handling and potential cell loss. This manuscript details each step of the process to equip other laboratories to successfully dissociate small quantities of neural tissue in preparation for downstream analysis.

This neural cell dissociation protocol is intended for samples with a low amount of starting material and yields a highly viable single-cell suspension for downstream analysis, with optional fixation and staining steps.

דיסוציאציה מכנית ואנזימטית משולבת של רקמת היפוקמפל במוח העכבר

This neural dissociation protocol (an adaptation of the protocol accompanying a commercial adult brain dissociation kit) optimizes tissue processing in ...

Deep-Tissue Three-Photon Fluorescence Microscopy in Intact Mouse and Zebrafish Brain

Multiphoton microscopy techniques, such as two-photon microscopy (2PM) and three-photon microscopy (3PM), are powerful tools for deep-tissue in vivo imaging with subcellular resolution. 3PM has two major advantages for deep-tissue imaging over 2PM that has been widely used in biology laboratories: (i) longer attenuation length in scattering tissues by employing ~1,300 nm or ~1,700 nm excitation laser; (ii) less background fluorescence generation due to higher-order nonlinear excitation. As a result, 3PM allows high-contrast structural and functional imaging deep within scattering tissues such as intact mouse brain from the cortical layers to the hippocampus and the entire forebrain of adult zebrafish.
Today, laser sources suitable for 3PM are commercially available, enabling the conversion of an existing two-photon (2P) imaging system to a three-photon (3P) system. Additionally, multiple commercial 3P microscopes are available, which makes this technique readily available to biology research laboratories. This paper shows the optimization of a typical 3PM setup, particularly targeting biology groups that already have a 2P setup, and demonstrates intravital 3D imaging in intact mouse and adult zebrafish brains. This protocol covers the full experimental procedure of 3P imaging, including microscope alignment, prechirping of ~1,300 and ~1,700 nm laser pulses, animal preparation, and intravital 3P fluorescence imaging deep in adult zebrafish and mouse brains.

Three-photon microscopy enables high-contrast fluorescence imaging deep in living biological tissues, such as mouse and zebrafish brains, with high spatiotemporal resolution.

מיקרוסקופיה פלואורסצנטית תלת-פוטונית של שלושה פוטונים ברקמות עמוקות במוח של עכברים ושל דגי זברה שלמים

Multiphoton microscopy techniques, such as two-photon microscopy (2PM) and three-photon microscopy (3PM), are powerful tools for deep-tissue in vivo ...

Whole-Brain Single-Cell Imaging and Analysis of Intact Neonatal Mouse Brains Using MRI, Tissue Clearing, and Light-Sheet Microscopy

Tissue clearing followed by light-sheet microscopy (LSFM) enables cellular-resolution imaging of intact brain structure, allowing quantitative analysis of structural changes caused by genetic or environmental perturbations. Whole-brain imaging results in more accurate quantification of cells and the study of region-specific differences that may be missed with commonly used microscopy of physically sectioned tissue. Using light-sheet microscopy to image cleared brains greatly increases acquisition speed as compared to confocal microscopy. Although these images produce very large amounts of brain structural data, most computational tools that perform feature quantification in images of cleared tissue are limited to counting sparse cell populations, rather than all nuclei.
Here, we demonstrate NuMorph (Nuclear-Based Morphometry), a group of analysis tools, to quantify all nuclei and nuclear markers within annotated regions of a postnatal day 4 (P4) mouse brain after clearing and imaging on a light-sheet microscope. We describe magnetic resonance imaging (MRI) to measure brain volume prior to shrinkage caused by tissue clearing dehydration steps, tissue clearing using the iDISCO+ method, including immunolabeling, followed by light-sheet microscopy using a commercially available platform to image mouse brains at cellular resolution. We then demonstrate this image analysis pipeline using NuMorph, which is used to correct intensity differences, stitch image tiles, align multiple channels, count nuclei, and annotate brain regions through registration to publicly available atlases.
We designed this approach using publicly available protocols and software, allowing any researcher with the necessary microscope and computational resources to perform these techniques. These tissue clearing, imaging, and computational tools allow measurement and quantification of the three-dimensional (3D) organization of cell-types in the cortex and should be widely applicable to any wild-type/knockout mouse study design.

This protocol describes methods for conducting magnetic resonance imaging, clearing, and immunolabeling of intact mouse brains using iDISCO+, followed by a detailed description of imaging using light-sheet microscopy, and downstream analyses using NuMorph.

הדמיה וניתוח של כל המוח החד-תאי של מוחות עכברים שלמים של ילודים באמצעות MRI, ניקוי רקמות ומיקרוסקופיה של יריעות אור

Tissue clearing followed by light-sheet microscopy (LSFM) enables cellular-resolution imaging of intact brain structure, allowing quantitative analysis of ...

הדמיית סידן דו-פוטונית ורחבת שדה בקוליקולוס העליון

Calcium Imaging in Mouse Superior Colliculus

The superior colliculus (SC), an evolutionarily conserved midbrain structure in all vertebrates, is the most sophisticated visual center before the emergence of the cerebral cortex. It receives direct inputs from ~30 types of retinal ganglion cells (RGCs), with each encoding a specific visual feature. It remains elusive whether the SC simply inherits retinal features or if additional and potentially de novo processing occurs in the SC. To reveal the neural coding of visual information in the SC, we provide here a detailed protocol to optically record visual responses with two complementary methods in awake mice. One method uses two-photon microscopy to image calcium activity at single-cell resolution without ablating the overlaying cortex, while the other uses wide-field microscopy to image the whole SC of a mutant mouse whose cortex is largely undeveloped. This protocol details these two methods, including animal preparation, viral injection, headplate implantation, plug implantation, data acquisition, and data analysis. The representative results show that the two-photon calcium imaging reveals visually evoked neuronal responses at single-cell resolution, and the wide-field calcium imaging reveals&#160;neural activity across the entire SC. By combining these two methods, one can reveal the neural coding in the SC at different scales, and such combination can also be applied to other brain regions.

מחבר זרקור: חשיפת קידוד עצבי ומנגנונים של עיבוד חזותי בקוליקולוס העליון 

This protocol details the procedure for imaging calcium responses in the superior colliculus (SC) of awake mice, including imaging single-neuron activity with two-photon microscopy while leaving the cortex intact in wild-type mice, and imaging the entire SC with wide-field microscopy in partial-cortex mutant mice.

הדמיית סידן בעכבר קוליקולוס מעולה

The superior colliculus (SC), an evolutionarily conserved midbrain structure in all vertebrates, is the most sophisticated visual center before the ...