אנו מודים לד&quot;ר Nael עלמי וד&quot;ר נאם צ&#39;ול קים על הערותיו המועילות שלהם על כתב היד הזה.

1. הכנה immunofluorescence: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי ליצור משטח לנתח, לשפוך Sylgard 184 אלסטומר בסיס סיליקון לתוך צלחת קטנה רקמת תרבות. הקפד לא למלא את הצלחת לחלוטין כך שאזור לנתיחה נמוך יותר שולי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חתוך סיכות לנתיחה לאורך של כ 3.5 מ&quot;מ על מנת להקל מוגברת של מניפולציה, וודא שיש לפחות 6 פינים לכל זחל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יהיה עליך מלקחיים בוטה שיאפשרו לך לתפוס את הפינים לנתיחה. </li></ol> 2. Dissection של הזחלים: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר נדודים third הזחלים instar כי הם זוחלים סביב צדי הבקבוקון ולא החלו pupate. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הצב זחל על פני דיסקציה תחת stereomicroscope. וויק משם moister עודף באמצעות Kimwipe. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סדר כל זחל כך את הצד הגבי הוא פונה כלפי מעלה. תוכל לראות שני קנה הנשימה, קווים לבנים בצד הגבי של הזחלים. נסו מרכז אלה באמצע ככל האפשר כי זה מסמן את קו האמצע הגבי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום להצמיד # 1 בדיוק מעל הפה ווים (איור 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום להצמיד # 2 בזנב בדיוק מעל spiracles בין tracheae. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת כמות קטנה של PBS על הזחלים כדי למנוע התייבשות לציפורן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על השלבים לעיל עם זחלים כל, לוודא כי גנוטיפים מופרדים מרחבית על ידי הצבת סיכה בין גנוטיפ אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פנו ימינה קטן חתך רוחבי מעל סיכה מס &#39;2 על פני שניהם וקנה הנשימה (איור 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס מספריים שלך לחתוך את החתך הראשון לאורך קו האמצע הגבי בין וקנה הנשימה כל הדרך עד פינים בעבר # 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יהיה עליך לבצע חתכים קטנים אחרים בתחתית הדף מאוד של כל צד של לציפורן, כך הצדדים על ימין ועל שמאל יפתח המאפשר לך להצמיד אותם ללא משיכת לציפורן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום להצמיד # של 3, 4, 5, ו -6 בכל פינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן את המדגם עם PFA 4% עבור 20-25 דקות בטמפרטורת החדר </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למזוג PFA ולשטוף עם 3-4 פעמים PBS, decanting בכל פעם. </li></ol> 3. הסרה של רקמה: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל על ידי הסרת רקמות בקצה האחורי כי בדרך כלל אתה רוצה להגן על האזור שבו נמצא המוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תוך שימוש steromicroscope עם הזחלים תחת ירידה של PBS, הראשון לתפוס את הקצה האחורי של אחד קנה הנשימה ולשלוף אותו החוצה אשר עשוי להסיר חלק של הגוף את השומן עם זה. חזור על קנה הנשימה עבור השני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תפוס כמה שומן הגוף המעי האחורי או למשוך אותם מתוך הכנה. לאחר שרוב רקמת האחורי הוסר, להתמקד בהסרת רקמות קטנות סביב המוח. אם אתה מעוניין רק את השרירים, או המורפולוגיה של NMJ ניתן להסיר את המוח גם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרה של המוח מאפשר ראיה טובה יותר של 31 שרירים, אשר מהווה סמן מועיל אוריינטציה קטע הבטן. </li></ol> 4. Immunofluorescence עבור אזורי פעילות: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף את סוכן חוסם (5% סרום עיזים רגיל ב PBS) ל preps גזור בצלחת לנתיחה. חסום במשך שעה 1 בטמפרטורת החדר. אם אתה רוצה לעשות רק פתרון אחד עבור חסימת נוגדן דילולים, כולל 0.1% TritonX-100 לסוכן חסימת שלך permeabilization רקמות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל את הנוגדן ראשי מדולל חסימת מגיב עם 0.1% TritonX-100. הנוגדן אזור פעיל ניתנת להשגה דרך התפתחותית מחקרים Hybridoma בנק (DSHB, http://dshb.biology.uiowa.edu/). השתמש נוגדן התייחסות (למשל חזרת peroxidase-Cy3 המצומד) לתווית קרום NMJ וגם אקסונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה נוגדנים העיקרי ב 4 ° C למשך הלילה. אז זה היובש של המקרר לא יתאדה הפתרון נוגדן, ליצור תא לחות על ידי הצבת קצת מים בחלק התחתון של תיבת בשימוש קצה פיפטה. מכסים את מכסה שקוף עם רדיד אלומיניום כדי להפחית את הניאון הלבנה. מניחים את השקופית לנתיחה בתא לחות לשים את הקופסה כולה ב 4 ° C חממה לילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת בבוקר, לשטוף עם PBST (PBS עם 0.2% Triton-X-100) 50-10 פעמים למשך 5-10 דקות כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה עם נוגדן המשני (למשל עיזים Invitrogen אלקסה אנטי Mouse-488) מדולל חסימת מגיב עם 0.1% TritonX-100 בטמפרטורת החדר למשך 2-4 שעות בחדר מכוסה לחות. כלול כתם גרעיני (למשל DAPI) ב המשני, אם אתה רוצה לזהות את המיקום של גרעין בשרירים או המוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף עם PBST (PBS עם 0.02% Triton-X-100) 50-10 פעמים למשך 5-10 דקות כל אחד. </li></ol> 5. הרכבה דוגמאות הזחל על שקופיות: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למזוג ואת הפתיל את לשטוף PBST האחרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה גליצרול 80% 1mL כ לכסות את פרוות הזחל מרותקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרה של 5 מתוך 6 סיכות הזחלים כל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר אתה מוכן לשים את גנוטיפ הראשון בשקופית להסיר את הסיכה האחרונה הזחלים כל genoty כיPE. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן שקופית &quot;לשטוף&quot; על ידי הצבת שתי טיפות בינוני הרכבה שלך בשקופית נקי. שלב זה חשוב לשטוף את הפתרון מים את הזחלים עבור הרכבה וברורה הדמיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לתפוס את אחד הזחל בזנב עם מלקחיים הבוטה שלך, גרור את הזחל סביב גליצרול ולאחר מכן בשולי יבש מנה דיסקציה שלך, להסיר את רוב גליצרול. מניחים את הזחלים לירידה בינונית הראשון גובר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלב 6 עבור כל הזחלים של גנוטיפ זהה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר כל הזחלים נמצאים ירידה בינונית הראשון גובר, לתפוס את הזחל הראשון הזנב ולמשוך אותו דרך ירידה, ואז בשולי יבש הצלחת להסיר רוב של המדיום. אז במקום הזחלים לירידה בינוני השני גובר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלב 8 עבור הזחלים כל עם גנוטיפ זהה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את השקופית הסופי שלך על ידי תיוג זה הצבת קטן בצורת &quot;T&quot; של המדיום הרכבה בשקופית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כמו בשלב 5.8, לתפוס את הזחל בזנבו; למשוך את העור באמצעות ירידה בינונית השני גובר ולאחר מכן בצדי יבש של השקופית &quot;לשטוף&quot;. לאחר שרוב בינוני הגיע משם, במקום לזרוק הזחל בשקופית האחרונה המדיום גובר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור לכל פרוות הזחל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא כי כל פרוות הזחל מסודרים לפי הצורך לוודא שהצד לציפורן הוא מטה את השריר חשוף הוא פונה כלפי מעלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים פיסת לכסות בשקופית כדי לכסות את הזחלים גזור, עם קצה ההתחלה בשורה העליונה של &quot;טי&quot; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים משקל קטן (למשל 9 וולט סוללה) על להחליק את המכסה, ולוודא כי המדיום הרכבה מתפשט לחלוטין תחת להחליק את המכסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להפחית מרווה פלורסנט האפשר, במקום להחליק במגירה או מקום חשוך עד בינוני הרכבה ריפא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנקות את המדיום הזה גובר על גדותיו קצוות של להחליק את המכסה. נקה את עודפי בינוני הרכבה יבש על להחליק את מכסה או שקופיות עם אתנול 70%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי ליצור חותם סופי, חותם עם לציפורניים. </li></ol> 6. נציג תוצאות: שקופית דוגמה הזחלים גזור ו immunostained מוצג באיור 2. כאשר והניתוחים זחלים, כתמים, הרכבה מתבצעים כראוי, המשתמש יכול לזהות את שריר זחלים של עניין (איור 3) במגזרי A2-A6. הואנג et al. מספק תיאור מפורט של עמדת שרירים, כמו גם אפיון של boutons סינפטי ספציפי (Hoang ו צ&#39;יבה, 2001). שימוש למטרה מתח גבוה המשתמש יכול להתמקד סינפסה אחת ולקחת Z-מחסנית התמונה. מקסימום נציג הקרנת תמונה של חלק סינפסה 6 / 7 מוצג (איור 4). לאחר מכן באמצעות תוכנת הדמיה, אזורים פעילה ניתן להעריך כמותית עבור המאפיינים כי הם במיוחד פנוטיפ מוטנטי שלך. דוגמאות של תכונות שעשויות להשתנות פנוטיפ מוטנט מסוים לכלול את המספר הכולל, עוצמת flourescence, ואת המרווח בין אזורי פעיל. פוטנציאל החסרונות: הערכה immunofluorescence לצומת neuromuscular הזחל היא מערכת יקר שיכול לספק תובנה חשובה בביולוגיה הסינפטי, אם כי יש בעיות פוטנציאליות שיכולות להגביל את השירות של מערכת זו. לדוגמה, לעתים קרובות רצוי התמונה דפוס מכתים של שניים או יותר נוגדנים העיקרי מדגם זהה. הבחירה העיקרית של נוגדנים מתאימים, fluorophores המתאים, בקרות שליליות מתאימות חיונית להצלחה. אם הדמיה two אנטיגנים בניסוי שלך, להיות בטוח כי נוגדנים העיקריים הם ממינים שונים, כך שכל חלבון של עניין ניתן לזהות באופן ייחודי עם נוגדן משנית שכותרתו fluorescently. הדרך המומלצת כדי להפחית את הרקע היא להשתמש סוכן חסימת המכיל את בסרום נורמלי של המין שממנו נגזרו משני נוגדנים (למשל להשתמש בסרום עז נורמלי כסוכן חסימת בעת השימוש עז נגד ארנב או עכבר אנטי נוגדנים משני). לאחר תכנון נוגדנים ראשוניים ומשניים כי תשתמש בניסוי שלך, עליך לשקול גם כולל בקרות מכתים שלך קובע כדי להבטיח את האות ניאון שאתם רואים הוא אמיתי ולא רק רקע. במידת האפשר, כולל דגימות בקרה שלילית שאינם מכילים את החלבון של עניין. זה נעשה בקלות על ידי בעל חיים, כולל סוג בר במחקרים של overexpression transgene אקסוגניים, אך במקרים מסוימים ניתן לבצע באמצעות מוטציה הומוזיגוטים של חלבון העניין שלך. עוד לשלוט שלילי חיוני, שימושי למדידת רמות הרקע של האות ניאון שלך, היא להשתמש נוגדנים משני ללא לרבות הראשי. כאשר preps הדמיה וכתוצאה שלך, חשוב להבין כי כל אות ניאון שאתם רואים לא יכול להיות אמיתי, יכול להיות הרקע יונוגדנים משני ur או מרקע רקמות אנדוגני. ייתכן שיהיה עליך לנרמל את התמונות שלך לשקול הקרינה רקע כאשר assaying לשינויים בין עוצמת הקרינה. בחירת fluorophore חייב להיות גם עם טיפול. בחינת עירור לבין ספקטרום הפליטה fluorophore כל יכולת ייחודית לזהות כל אות היא חיונית כדי למנוע דימום דרך הערוץ. אם יש חוסר ודאות, דרך פשוטה לקבוע אם היקף לדמם דרך היא immunostain עם נוגדן fluorophore שכותרתו אחד בכל פעם, לבדוק את התמונה עם כל ערוץ כי תשתמש בניסוי הסופי. זה צריך לגלות אם לדמם דרך מתרחש עם סט מיקרוסקופ מסנן שלך. <img src="/files/ftp_upload/2676/2676fig1.jpg" alt="איור 1" /> באיור 1. תרשים זרימה של חיתוך לציפורן והמיקום של סיכות 1-6. <a href="http://jove.com/files/ftp_upload/2676/2676fig1_large.jpg">לחץ כאן כדי להציג תמונה מוגדלת</a> <img src="/files/ftp_upload/2676/2676fig2.jpg" alt="איור 2" /> איור 2. המיקום של הזחלים בשקופית האחרונה. ודא preps הזחלים נחשפים לצד שריר מעלה מטה בצד לציפורן. השאירו לפחות רוחב גוף הזחל שביניהם מדגם זה. <img src="/files/ftp_upload/2676/2676fig3.jpg" alt="איור 3" /> איור 3. כאשר הדמיה, לאתר את השרירים קטעים של עניין. בצמתים neuromuscular נפוצות מאופיין השרירים innervate 6 / 7, 13 שרירים, 12 שרירים, או שריר 4. בצד השני של קו האמצע הגחון, יש תמונת ראי שריר המבנה של קטע, חמי המוצג. השתמש שרירים 31 כסמן לזהות איזה קטע שאתה הדמיה. תמונה הסינפסות אותו וקטעי לשארית דגימות שלך, איסוף תמונות סינפטיים רבים לכל גנוטיפ שניתן להשתמש בהם עבור כימות. <img src="/files/ftp_upload/2676/2676fig4.jpg" alt="איור 4" /> איור 4. המרבי נציג הקרנת תמונה של חלק של שריר NMJ innervating 6 / 7 מוצג. NC82 (Bruchpilot) מכתים מוצג ירוק. HRP מראש הסינפטי כתם מוצג באדום. שים לב punctae אזור פעיל כי ניתן לכמת עוד יותר על ידי תוכנת הדמיה.

<ol>
	<li>Budnik, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synapse+maturation+and+structural+plasticity+at+Drosophila+neuromuscular+junctions.">Synapse maturation and structural plasticity at Drosophila neuromuscular junctions.</a> Curr Opin Neurobiol. 6, 858-867 (1996).</li><li>Fouquet, W., Owald, D., Wichmann, C., Mertel, S., Depner, H., Dyba, M., Hallermann, S., Kittel, R. J., Eimer, S., Sigrist, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maturation+of+active+zone+assembly+by+Drosophila+Bruchpilot.">Maturation of active zone assembly by Drosophila Bruchpilot.</a> J Cell Biol. 186, 129-145 (2009).</li><li>Hoang, B., Chiba, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell+Analysis+of+Drosophila+Larval+Neuromuscular+Synapses.">Single-Cell Analysis of Drosophila Larval Neuromuscular Synapses.</a> Developmental Biology. 229, 55-70 (2001).</li><li>Keshishian, H., Kim, Y. -. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orchestrating+development+and+function:+retrograde+BMP+signaling+in+the+Drosophila+nervous+system.">Orchestrating development and function: retrograde BMP signaling in the Drosophila nervous system.</a> Trends in Neurosciences. 27, 143-147 (2004).</li><li>Kittel, R. J., Wichmann, C., Rasse, T. M., Fouquet, W., Schmidt, M., Schmid, A., Wagh, D. A., Pawlu, C., Kellner, R. R., Willig, K. I., Hell, S. W., Buchner, E., Heckmann, M., Sigrist, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bruchpilot+Promotes+Active+Zone+Assembly,+Ca2++Channel+Clustering,+and+Vesicle+Release.">Bruchpilot Promotes Active Zone Assembly, Ca2+ Channel Clustering, and Vesicle Release.</a> Science. 312, 1051-1054 (2006).</li><li>Koh, Y. H., Gramates, L. S., Budnik, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+larval+neuromuscular+junction:+Molecular+components+and+mechanisms+underlying+synaptic+plasticity.">Drosophila larval neuromuscular junction: Molecular components and mechanisms underlying synaptic plasticity.</a> Microscopy Research and Technique. 49, 14-25 (2000).</li><li>Lloyd, T. E., Taylor, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flightless+flies:+Drosophila+models+of+neuromuscular+disease.">Flightless flies: Drosophila models of neuromuscular disease.</a> Ann N Y Acad Sci. 1184, e1-e20 (2010).</li><li>Ratnaparkhi, A., Lawless, G. M., Schweizer, F. E., Golshani, P., Jackson, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Drosophila+model+of+ALS:+human+ALS-associated+mutation+in+VAP33A+suggests+a+dominant+negative+mechanism.">A Drosophila model of ALS: human ALS-associated mutation in VAP33A suggests a dominant negative mechanism.</a> PLoS One. 3, e2334-e2334 (2008).</li><li>Wagh, D. A., Rasse, T. M., Asan, E., Hofbauer, A., Schwenkert, I., D&#252;rrbeck, H., Buchner, S., Dabauvalle, M. -. C., Schmidt, M., Qin, G., Wichmann, C., Kittel, R., Sigrist, S. J., Buchner, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bruchpilot,+a+Protein+with+Homology+to+ELKS/CAST,+Is+Required+for+Structural+Integrity+and+Function+of+Synaptic+Active+Zones+in+Drosophila.">Bruchpilot, a Protein with Homology to ELKS/CAST, Is Required for Structural Integrity and Function of Synaptic Active Zones in Drosophila.</a> Neuron. 49, 833-844 (2006).</li><li>Zweier, C., Jong, E. K. d. e., Zweier, M., Orrico, A., Ousager, L. B., Collins, A. L., Bijlsma, E. K., Oortveld, M. A., Ekici, A. B., Reis, A., Schenck, A., Rauch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CNTNAP2+and+NRXN1+are+mutated+in+autosomal-recessive+Pitt-Hopkins-like+mental+retardation+and+determine+the+level+of+a+common+synaptic+protein+in+Drosophila.">CNTNAP2 and NRXN1 are mutated in autosomal-recessive Pitt-Hopkins-like mental retardation and determine the level of a common synaptic protein in Drosophila.</a> Am J Hum Genet. 85, 655-666 (2009).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

עבור נוירונים, אזור מסוף סינפטי היא בעלת חשיבות קריטית, הוא הגשר תקשורת נאותה בין הפוסט לבין מראש הסינפטי התאים. דרך רבת עוצמה כדי לחקור את בריאותם של הנוירון במודלים של המחלה היא לנתח חלבונים של המסוף הסינפטי ידי immunofluorescence. השיטה המוצגת כאן immunofluorescence מאפשרת לחוקר לב...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> Sylgard 184 אלסטומר בסיס סיליקון </td><td> Dow Corning </td><td> 68037-59-2 </td><td> לאחר ערבוב לאפשר לבועות לעלות באיטיות על ידי לשים על הכתף או איטי המאפשר לשבת במשך 30 דקות או יותר. </td></tr><tr><td> נירוסטה Minutien סיכות </td><td> המדע כלים פיין </td><td> 26002-10 </td><td> Trim כדי כ. 3-4 מ&quot;מ באורך קבוע עם מספריים </td></tr><tr><td> Laminectomy מלקחיים (בלאנט, משמש אחיזה סיכות) </td><td> המדע כלים פיין </td><td> 11223-20 </td><td> השתמש כמו מלקחיים בוטה עבור אחיזה סיכות </td></tr><tr><td> Dissection מלקחיים </td><td> העולם מכשירי דיוק </td><td> 501985 </td><td></td></tr><tr><td> Vannas עדין מאוד מספריים, 8cm רב </td><td> העולם מכשירי דיוק </td><td> 501778 </td><td></td></tr><tr><td> עכבר אנטי Brp נוגדן </td><td> DSHB </td><td> NC82 </td><td> השתמש 1:50 דילול </td></tr><tr><td> Cy3 Affinipure נגד חזרת עיזים peroxidase </td><td> ג&#39;קסון Immunoresearch </td><td> 123-165-021 </td><td> השתמש ב דילול 1:200 </td></tr><tr><td> אלקסה פלואוריד 488 אנטי עכבר עיזים IgG </td><td> Invitrogen </td><td> A11001 </td><td> השתמש כ. דילול 1:200 </td></tr></tbody></table>

dissection and imaging of active zones in the drosophila neuromuscular junction

Neuromuscular הזחלים תסיסנית צומת (NMJ) הוא מודל מצוין לחקר מבנה ותפקוד הסינפטי ו. תסיסנית ידועה הקלות של מניפולציות גנטיות חזק ומערכת העצבים הזחל הוכיחה שימושי במיוחד ללמוד לא רק על התפקוד התקין אלא גם הפרעות המלווים כמה מחלות נוירולוגיות (לויד טיילור, 2010). רבים מולקולות הסינפטי המפתח נמצא תסיסנית מצויים גם יונקים כמו רוב CNS סינפסות מעוררות אצל יונקים, NMJ תסיסנית הוא glutamatergic ומדגים פעילות תלויי שיפוץ (Koh et al., 2000). בנוסף, נוירונים תסיסנית ניתן לזהות בנפרד כי דפוסי העצבוב שלהם סטריאוטיפי וחוזר על עצמו כך שניתן ללמוד המסופים הסינפטיים מזוהה, כגון אלה בין הנוירונים המוטוריים בגוף קיר סיבי השריר שהם innervate (Keshishian וקים, 2004). קיומם של מרכיבים סינפסה שמור באבולוציה, יחד עם הקלות של מניפולציה גנטית ופיזית הדגם תסיסנית אידיאלי לחקור את המנגנונים פונקציה הסינפטי (Budnik, 1996). אזורי הפעילות במסופים הסינפטי הם בעלי עניין מיוחד, כי אלה הם האתרים של שחרור הנוירוטרנסמיטר. NC82 היא נוגדן חד שבטי המזהה את החלבון תסיסנית Bruchpilot (Brp), חבר משפחה CAST1/ERC כי היא מרכיב חשוב של אזור פעיל (Wagh et al. 2006). Brp הוצגה ישירות לעצב את אזור פעיל T-בר אחראי ביעילות באשכולות Ca 2 + ערוצי מתחת צפיפות T-בר (פוקה et al. 2009). מוטציות של Brp צמצמו Ca 2 + צפיפות הערוץ, שלפוחית ​​מדוכא שחרור עורר, ואת הפלסטיות שינה לטווח קצר (קיטל et al. 2006). שינויים לאזורי פעיל נצפו דגמים תסיסנית המחלה. לדוגמה, immunofluorescence באמצעות נוגדן NC82 הראו כי צפיפות אזור פעיל צומצם במודלים של טרשת לרוחב amyotrophic ופיט-הופקינס תסמונת (Ratnaparkhi et al, 2008;. Zweier et al, 2009).. לפיכך, ההערכה של אזורי פעילות, או חלבונים סינפטיים אחרים, מודלים תסיסנית זחלים של המחלה עשויה לספק רמז ראשוני ערך לנוכחות של פגם הסינפטי. הכנת כל הר גזור הזחלים תסיסנית לניתוח immunofluorescence של NMJ דורש מיומנות מסוימת, אך ניתן להשיג על ידי רוב המדענים עם קצת תרגול. מוגש היא שיטה המספק עבור הזחלים מרובים כדי להיות גזור ו immunostained בצלחת לנתיחה אותו, הגבלת הבדלים סביבתיים בין גנוטיפ כל ומתן חיות מספיק אמון שחזור וניתוח סטטיסטי.

Watch this Scientific Journal Video about Dissection and Imaging of Active Zones in the Drosophila Neuromuscular Junction at JoVE.com

Dissection and Imaging of Active Zones in the Drosophila Neuromuscular Junction

צומת neuromuscular (NMJ) של<em&gt; תסיסנית melanogaster</em&gt; היא מערכת מודל חשוב ללימוד פונקציה הסינפטי נורמלי, כמו גם הפרעות לתפקוד סינפטי נמצא מחלות נוירולוגיות מסוימות. אנו מציגים פרוטוקול לנתיחה של<em&gt; תסיסנית</em&gt; הזחל מנוע מערכת immunostaining עבור חלבונים אזור פעיל בתוך NMJ.

Dissection והדמיה של אזורי פעיל תסיסנית Neuromuscular צומת

The Drosophila  larvae neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model for the study of synaptic structure and function. Drosophila  is well known for ...

dissection-imaging-active-zones-drosophila-neuromuscular

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dissection and Imaging of Active Zones in the Drosophila Neuromuscular Junction

15.3K Views.  St. Jude Children’s Research Hospital. צומת neuromuscular (NMJ) של תסיסנית melanogaster היא מערכת מודל חשוב ללימוד פונקציה הסינפטי נורמלי, כמו גם הפרעות לתפקוד סינפטי נמצא מחלות נוירולוגיות מסוימות. אנו מציגים פרוטוקול לנתיחה של תסיסנית הזחל מנוע מערכת immunostaining עבור חלבונים אזור פעיל בתוך NMJ.

Video: Dissection and Imaging of Active Zones in the Drosophila Neuromuscular Junction

Single Drosophila Ommatidium Dissection and Imaging

The fruit fly Drosophila melanogaster has made invaluable contributions to neuroscience research and has been used widely as a model for neurodegenerative diseases because of its powerful genetics1. The fly eye in particular has been the organ of choice for neurodegeneration research, being the most accessible and life-dispensable part of the Drosophila nervous system. However the major caveat of intact eyes is the difficulty, because of the intense autofluorescence of the pigment, in imaging intracellular events, such as autophagy dynamics2, which are paramount to understanding of neurodegeneration.
We have recently used the dissection and culture of single ommatidia3 that has been essential for our understanding of autophagic dysfunctions in a fly model of Dentatorubro-Pallidoluysian Atrophy (DRPLA)3, 4.
We now report a comprehensive description of this technique (Fig. 1), adapted from electrophysiological studies5, which is likely to expand dramatically the possibility of fly models for neurodegeneration. This method can be adapted to image live subcellular events and to monitor effective drug administration onto photoreceptor cells (Fig. 2). If used in combination with mosaic techniques6-8, the responses of genetically different cells can be assayed in parallel (Fig. 2).

Single Drosophila Ommatidium Dissection and Imaging

The limiting factor in the use of the adult Drosophila eye to study neurodegeneration and cell biology is the difficult imaging of intracellular processes. We describe the dissection of single ommatidia to generate a bona-fide primary neuronal cell culture, which can be subject to drug treatment and advanced imaging.

אחד תסיסנית אומטידיום Dissection והדמיה

The fruit fly Drosophila melanogaster has made invaluable contributions to neuroscience research and has been used widely as a model for neurodegenerative ...

Sequential Photo-bleaching to Delineate Single Schwann Cells at the Neuromuscular Junction

Sequential photo-bleaching provides a non-invasive way to label individual SCs at the NMJ. The NMJ is the largest synapse of the mammalian nervous system and has served as guiding model to study synaptic structure and function. In mouse NMJs motor axon terminals form pretzel-like contact sites with muscle fibers. The motor axon and its terminal are sheathed by SCs. Over the past decades, several transgenic mice have been generated to visualize motor neurons and SCs, for example Thy1-XFP1 and Plp-GFP mice2, respectively.
Along motor axons, myelinating axonal SCs are arranged in non-overlapping internodes, separated by nodes of Ranvier, to enable saltatory action potential propagation. In contrast, terminal SCs at the synapse are specialized glial cells, which monitor and promote neurotransmission, digest debris and guide regenerating axons. NMJs are tightly covered by up to half a dozen non-myelinating terminal SCs - these, however, cannot be individually resolved by light microscopy, as they are in direct membrane contact3.
Several approaches exist to individually visualize terminal SCs. None of these are flawless, though. For instance, dye filling, where single cells are impaled with a dye-filled microelectrode, requires destroying a labelled cell before filling a second one. This is not compatible with subsequent time-lapse recordings3. Multi-spectral "Brainbow" labeling of SCs has been achieved by using combinatorial expression of fluorescent proteins4. However, this technique requires combining several transgenes and is limited by the expression pattern of the promoters used. In the future, expression of "photo-switchable" proteins in SCs might be yet another alternative5. Here we present sequential photo-bleaching, where single cells are bleached, and their image obtained by subtraction. We believe that this approach - due to its ease and versatility - represents a lasting addition to the neuroscientist's technology palette, especially as it can be used in vivo and transferred to others cell types, anatomical sites or species6.
In the following protocol, we detail the application of sequential bleaching and subsequent confocal time-lapse microscopy to terminal SCs in triangularis sterni muscle explants. This thin, superficial and easily dissected nerve-muscle preparation7,8 has proven useful for studies of NMJ development, physiology and pathology9. Finally, we explain how the triangularis sterni muscle is prepared after fixation to perform correlated high-resolution confocal imaging, immunohistochemistry or ultrastructural examinations.

Visualizing individual cells in densely packed tissues, such as terminal Schwann cells (SCs) at neuromuscular junctions (NMJs), is challenging. "Sequential photo-bleaching" allows delineating single terminal SCs, for instance in the triangularis sterni muscle explant, a convenient nerve-muscle preparation, where sequential bleaching can be combined with time-lapse imaging and post-hoc immunostainings.

תמונה רציפה-הלבנה להתוות תאי שווא יחידים בצומת Neuromuscular

Sequential photo-bleaching provides a non-invasive way to label individual SCs at the NMJ. The NMJ is the largest synapse of the mammalian nervous system ...

Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

Analysis of neuromuscular junction morphology can give important insight into the physiological status of a given motor neuron. Analysis of thin flat muscles can offer significant advantage over traditionally used thicker muscles, such as those from the hind limb (e.g. gastrocnemius). Thin muscles allow for comprehensive overview of the entire innervation pattern for a given muscle, which in turn permits identification of selectively vulnerable pools of motor neurons. These muscles also allow analysis of parameters such as motor unit size, axonal branching, and terminal/nodal sprouting. A common obstacle in using such muscles is gaining the technical expertise to dissect them. In this video, we detail the protocol for dissecting the transversus abdominis (TVA) muscle from young mice and performing immunofluorescence to visualize axons and neuromuscular junctions (NMJs). We demonstrate that this technique gives a complete overview of the innervation pattern of the TVA muscle&#160;and can be used to investigate NMJ pathology in a mouse model of the childhood motor neuron disease, spinal muscular atrophy.

Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

In this video we demonstrate a protocol for dissection of the transversus abdominis muscle of the mouse and use immunofluorescence and microscopy to visualize neuromuscular junctions.

ניתוח של השריר Transversus Abdominis לניתוח צומת נוירומוסקולרי הר שלם

Analysis of neuromuscular junction morphology can give important insight into the physiological status of a given motor neuron. Analysis of thin flat ...

Detection of In Situ Protein-protein Complexes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction Using Proximity Ligation Assay

Discs large (Dlg) is a conserved member of the membrane-associated guanylate kinase family, and serves as a major scaffolding protein at the larval neuromuscular junction (NMJ) in Drosophila. Previous studies have shown that the postsynaptic distribution of Dlg at the larval NMJ overlaps with that of Hu-li tai shao (Hts), a homologue to the mammalian adducins. In addition, Dlg and Hts are observed to form a complex with each other based on co-immunoprecipitation experiments involving whole adult fly lysates. Due to the nature of these experiments, however, it was unknown whether this complex exists specifically at the NMJ during larval development.
Proximity Ligation Assay (PLA) is a recently developed technique used mostly in cell and tissue culture that can detect protein-protein interactions in situ. In this assay, samples are incubated with primary antibodies against the two proteins of interest using standard immunohistochemical procedures. The primary antibodies are then detected with a specially designed pair of oligonucleotide-conjugated secondary antibodies, termed PLA probes, which can be used to generate a signal only when the two probes have bound in close proximity to each other. Thus, proteins that are in a complex can be visualized. Here, it is demonstrated how PLA can be used to detect in situ protein-protein interactions at the Drosophila larval NMJ. The technique is performed on larval body wall muscle preparations to show that a complex between Dlg and Hts does indeed exist at the postsynaptic region of NMJs.

Detection of In Situ Protein-protein Complexes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction Using Proximity Ligation Assay

This protocol demonstrates how Proximity Ligation Assay can be used to detect in situ protein-protein interactions at the Drosophila larval neuromuscular junction. With this technique, Discs large and Hu-li tai shao are shown to form a complex at the postsynaptic region, an association previously identified through co-immunoprecipitation.

זיהוי של<em&gt; באתר</em&gt; מכלולי חלבון-חלבון ב<em&gt; דרוזופילה</em&gt; הזחל Neuromuscular צומת שימוש סמיכות קשירת Assay

Discs large (Dlg) is a conserved member of the membrane-associated guanylate kinase family, and serves as a major scaffolding protein at the larval ...

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Most studies on morphogenesis rely on qualitative descriptions of how anatomical traits are affected by the disruption of specific genes and genetic pathways. Quantitative descriptions are rarely performed, although genetic manipulations produce a range of phenotypic effects and variations are observed even among individuals within control groups.&#160;Emerging evidence shows that morphology, size and location of organelles play a previously underappreciated, yet fundamental role in cell function and survival. Here we provide step-by-step instructions for performing quantitative analyses of phenotypes at the Drosophila larval neuromuscular junction (NMJ). We use several reliable immuno-histochemical markers combined with bio-imaging techniques and morphometric analyses to examine the effects of genetic mutations on specific cellular processes. In particular, we focus on the quantitative analysis of phenotypes affecting morphology, size and position of nuclei within the striated muscles of Drosophila larvae. The Drosophila larval NMJ is a valuable experimental model to investigate the molecular mechanisms underlying the structure and the function of the neuromuscular system, both in health and disease. However, the methodologies we describe here can be extended to other systems as well.

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Morphology, size and location of intracellular organelles are evolutionarily conserved and appear to directly affect their function. Understanding the molecular mechanisms underlying these processes has become an important goal of modern biology. Here we show how these studies can be facilitated by the application of quantitative techniques.

למה כימות Matters: אפיון פנוטיפים בבית<em&gt; תסיסנית</em&gt; זחל Neuromuscular צומת

Most studies on morphogenesis rely on qualitative descriptions of how anatomical traits are affected by the disruption of specific genes and genetic ...

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the molecular and cellular basis of higher brain functions. A whole-mount preparation of adult brains with well-preserved morphology is critical for such whole brain-based studies, but can be technically challenging and time-consuming. This protocol describes an easy-to-learn, one-step dissection approach of an adult fly head in less than 10 s, while keeping the intact brain attached to the rest of the body to facilitate subsequent processing steps. The procedure helps remove most of the eye and tracheal tissues normally associated with the brain that can interfere with the later imaging step, and also places less demand on the quality of the dissecting forceps. Additionally, we describe a simple method that allows convenient flipping of the mounted brain samples on a coverslip, which is important for imaging both sides of the brains with similar signal intensity and quality. As an example of the protocol, we present an analysis of dopaminergic (DA) neurons in adult brains of WT (w1118) flies. The high efficacy of the dissection method makes it particularly useful for large-scale adult brain-based studies in Drosophila.

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

The adult Drosophila brain is a valuable system for studying neuronal circuitry, higher brain functions, and complex disorders. An efficient method to dissect whole brain tissue from the small fly head will facilitate brain-based studies. Here we describe a simple, one-step dissection protocol of adult brains with well-preserved morphology.

צעד-אחד פשוט פרוטוקול לנתיחה עבור כל הר הכנה למבוגרים<em&gt; תסיסנית</em&gt; Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the ...

Measuring Neuromuscular Junction Functionality

Neuromuscular junction (NMJ) functionality plays a pivotal role when studying diseases in which the communication between motor neuron and muscle is impaired, such as aging and amyotrophic lateral sclerosis (ALS). Here we describe an experimental protocol that can be used to measure NMJ functionality by combining two types of electrical stimulation: direct muscle membrane stimulation and the stimulation through the nerve. The comparison of the muscle response to these two different stimulations can help to define, at the functional level, potential alterations in the NMJ that lead to functional decline in muscle.
Ex vivo preparations are suited to well-controlled studies. Here we describe an intensive protocol to measure several parameters of muscle and NMJ functionality for the soleus-sciatic nerve preparation and for the diaphragm-phrenic nerve preparation. The protocol lasts approximately 60 min and is conducted uninterruptedly by means of a custom-made software that measures the twitch kinetics properties, the force-frequency relationship for both muscle and nerve stimulations, and two parameters specific to NMJ functionality, i.e. neurotransmission failure and intratetanic fatigue. This methodology was used to detect damages in soleus and diaphragm muscle-nerve preparations by using SOD1G93A transgenic mouse, an experimental model of ALS that ubiquitously overexpresses the mutant antioxidant enzyme superoxide dismutase 1 (SOD1).

A functional assessment of the neuromuscular junction (NMJ) can provide essential information on the communication between muscle and nerve. Here we describe a protocol to comprehensively evaluate both the NMJ and muscle functionality using two different muscle-nerve preparations, i.e. soleus-sciatic and diaphragm-phrenic.

מדידת פונקציונליות צומת עצב-שריר

Neuromuscular junction (NMJ) functionality plays a pivotal role when studying diseases in which the communication between motor neuron and muscle is ...

Two Algorithms for High-throughput and Multi-parametric Quantification of Drosophila Neuromuscular Junction Morphology

Synaptic morphology is tightly related to synaptic efficacy, and in many cases morphological synapse defects ultimately lead to synaptic malfunction. The Drosophila larval neuromuscular junction (NMJ), a well-established model for glutamatergic synapses, has been extensively studied for decades. Identification of mutations causing NMJ morphological defects revealed a repertoire of genes that regulate synapse development and function. Many of these were identified in large-scale studies that focused on qualitative approaches to detect morphological abnormalities of the Drosophila NMJ. A drawback of qualitative analyses is that many subtle players contributing to NMJ morphology likely remain unnoticed. Whereas quantitative analyses are required to detect the subtler morphological differences, such analyses are not yet commonly performed because they are laborious. This protocol describes in detail two image analysis algorithms "Drosophila NMJ Morphometrics" and "Drosophila NMJ Bouton Morphometrics", available as Fiji-compatible macros, for quantitative, accurate and objective morphometric analysis of the Drosophila NMJ. This methodology is developed to analyze NMJ terminals immunolabeled with the commonly used markers Dlg-1 and Brp. Additionally, its wider application to other markers such as Hrp, Csp and Syt is presented in this protocol. The macros are able to assess nine morphological NMJ features: NMJ area, NMJ perimeter, number of boutons, NMJ length, NMJ longest branch length, number of islands, number of branches, number of branching points and number of active zones in the NMJ terminal.

Two Algorithms for High-throughput and Multi-parametric Quantification of Drosophila Neuromuscular Junction Morphology

Two image analysis algorithms, "Drosophila NMJ Morphometrics" and "Drosophila NMJ Bouton Morphometrics" were created, to automatically quantify nine morphological features of the Drosophila neuromuscular junction (NMJ).

שני אלגוריתמים עבור תפוקה גבוהה וכימות Multi-פרמטרית של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; מורפולוגיה צומת Neuromuscular

Synaptic morphology is tightly related to synaptic efficacy, and in many cases morphological synapse defects ultimately lead to synaptic malfunction. The ...

Focal Macropatch Recordings of Synaptic Currents from the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model system to study glutamatergic synaptic transmission. We describe the technique of focal macropatch recordings of synaptic currents from visualized boutons at the Drosophila larval NMJ. This technique requires customized fabrication of recording micropipettes, as well as a compound microscope equipped with a high magnification, long-distance water immersion objective, differential interference contrast (DIC) optics, and a fluorescent attachment. The recording electrode is positioned on the top of a selected synaptic bouton visualized with DIC optics, epi-fluorescence, or both. The advantage of this technique is that it allows monitoring the synaptic activity of a limited number of sites of release. The recording electrode has&#160;a diameter of several microns, and the release sites positioned outside of the electrode rim do&#160;not significantly affect the recorded currents. The recorded synaptic currents have fast kinetics and can be readily resolved. These advantages are especially important for the studies of mutant fly lines with enhanced spontaneous or asynchronous synaptic activity.

Focal Macropatch Recordings of Synaptic Currents from the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Synaptic currents can be recorded focally from visualized synaptic boutons at the Drosophila third instar larvae neuromuscular junction. This technique enables monitoring the activity of a single synaptic bouton.

מוקד Macropatch הקלטות של זרמי סינפטית מצומת דרוזופילה Neuromuscular זחל

Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model system to study glutamatergic synaptic transmission. We describe the technique of focal ...

Dissection and Immunohistochemistry of the Drosophila Adult Leg to Detect Changes at the Neuromuscular Junction for an Identified Motor Neuron

Drosophila melanogaster represents a genetically tractable model to study neuronal structure and function, and subsequent changes in disease states. The well characterized larval neuromuscular junction is often used for such studies. However, rapid larval development followed by muscle histolysis and nervous system remodeling during metamorphosis makes this model problematic for the study of slow age-dependent degenerative changes like those occurring in amyotrophic lateral sclerosis. Alternatively, adult flies live for 90 days and the adult leg can be used to study motor neuron changes over the course of adult lifespan using in vivo fluorescent imaging through the cuticle. Here, we describe a leg dissection technique coupled with immunocytochemistry, which allows for the study of molecular changes at the neuromuscular junction of identified adult leg motor neurons. These techniques can be coupled with a myriad of antibodies labeling both pre- and post-synaptic structures. Together these procedures allow a more complete characterization of slow age-dependent changes in adult flies and can be applied across multiple motor neuron disease models.

Dissection and Immunohistochemistry of the Drosophila Adult Leg to Detect Changes at the Neuromuscular Junction for an Identified Motor Neuron

We describe a dissection technique that preserves the architecture of the neuromuscular junction and enables a detailed immunocytochemical study of motor neurons in the adult Drosophila leg.

ניתוח ואימונוהיסטוכימיה של הרגל הבוגרת של דרוסופילה לזיהוי שינויים בצומת הנוירו-שרירי עבור נוירון מוטורי מזוהה

Drosophila melanogaster represents a genetically tractable model to study neuronal structure and function, and subsequent changes in disease states. The ...