Nous remercions le Dr Nael Alami et le Dr Nam Chul Kim pour leurs précieux commentaires sur ce manuscrit.

1. Préparation pour immunofluorescence: <ol><li> Pour créer une surface de dissection, versez Sylgard 184 base élastomère de silicone dans une plaque de culture de tissus de petite taille. Assurez-vous de ne pas remplir complètement la plaque afin que la zone de dissection est inférieure à la jante. </li><li> Garniture broches de dissection d&#39;une longueur d&#39;environ 3,5 mm pour une plus grande facilité de manipulation, et assurez-vous d&#39;avoir au moins 6 broches par larve. </li><li> Vous aurez besoin d&#39;une pince émoussé qui vous permettra de vous saisir des broches pour la dissection. </li></ol> 2. Dissection des larves: <ol><li> Sélectionnez errance troisième stade larvaire qui grouille autour des côtés de la fiole et n&#39;ont pas commencé à se nymphoser. </li><li> Placez une larve à la surface dissection sous une loupe binoculaire. Évacuer l&#39;excès humide en utilisant un Kimwipe. </li><li> Disposez chaque larve de telle sorte que la face dorsale vers le haut. Vous serez en mesure de voir deux trachée, des lignes blanches le long de la face dorsale de la larve. Essayez de centre de ceux-ci dans le milieu autant que possible, car cela marque la ligne médiane dorsale. </li><li> # 1 pin lieu juste au-dessus des crochets buccaux (figure 1). </li><li> Placez la broche N ° 2 dans la queue juste au-dessus les stigmates entre les trachées. </li><li> Ajoutez une petite quantité de PBS aux larves pour éviter le dessèchement de la cuticule. </li><li> Répétez les étapes ci-dessus avec toutes les larves, en s&#39;assurant que les génotypes sont séparés spatialement en plaçant une épingle entre chaque génotype. </li><li> Faites une petite coupe transversale à droite ci-dessus broche N ° 2 sur les deux trachées (figure 1). </li><li> Insérez vos ciseaux dans la première coupe et couper le long de la ligne médiane dorsale entre les trachées tout le chemin jusqu&#39;à broches passé # 1. </li><li> Vous aurez besoin de faire d&#39;autres petites coupures dans le bas tout en haut et de chaque côté de la cuticule, de sorte que les côtés gauche et droit seront ouverts jusqu&#39;à vous permettant de les épingler sans tirer sur la cuticule. </li><li> Placez la broche # &#39;s 3, 4, 5, et 6 à chaque coin. </li><li> Fixer l&#39;échantillon avec 4% PFA pendant 20-25 minutes à température ambiante </li><li> Décanter le PFA et rincer à l&#39;époque du PBS 3-4, décantation à chaque fois. </li></ol> 3. Prélèvement de tissus: <ol><li> Commencez par enlever les tissus à l&#39;extrémité postérieure, car généralement vous voulez protéger la zone où le cerveau se trouve. </li><li> Tout en utilisant un steromicroscope et avec les larves dans une goutte de PBS, d&#39;abord saisir l&#39;extrémité postérieure de l&#39;un de la trachée et tirez-ce qui peut éliminer une partie des graisses corporelles avec elle. Répétez l&#39;opération pour la trachée secondes. </li><li> Prenez un peu postérieure du corps gras ou intestin et les sortir de la préparation. Une fois que la plupart des tissus postérieure a été enlevée, viser à supprimer les tissus petits autour du cerveau. Si vous êtes uniquement intéressé par les muscles, ou la morphologie de la JNM vous pouvez enlever le cerveau aussi. </li><li> Retrait du cerveau permet de mieux visualiser Muscle 31, qui est un marqueur utile pour l&#39;orientation du segment abdominal. </li></ol> 4. Immunofluorescence pour les zones actives: <ol><li> Ajouter un agent bloquant (5% sérum de chèvre normal dans du PBS) à l&#39;preps disséqué dans le plat de dissection. Bloc pour 1 heure à température ambiante. Si vous souhaitez faire une seule solution pour le blocage et d&#39;anticorps dilutions, notamment 0,1% TritonX-100 à votre agent de blocage pour la perméabilisation des tissus. </li><li> Appliquer l&#39;anticorps primaire dilué dans le réactif de blocage avec 0,1% TritonX-100. L&#39;anticorps zone active est réalisable à travers le développement de la Banque études hybridomes (DSHB, http://dshb.biology.uiowa.edu/). Utilisez un anticorps de référence (par exemple la peroxydase de raifort conjugué Cy3) à l&#39;étiquette de la membrane NMJ et des axones. </li><li> Incuber les anticorps primaires à 4 ° C pendant la nuit. Alors que la sécheresse du réfrigérateur ne s&#39;évapore pas la solution d&#39;anticorps, de créer une chambre d&#39;humidité en mettant un peu d&#39;eau dans le fond d&#39;une boîte pointe de la pipette utilisée. Couvrir le couvercle translucide avec du papier d&#39;aluminium afin de réduire fluorescentes blanchiment. Placer la lame de dissection dans la chambre d&#39;humidité et de mettre toute la boîte dans l&#39;incubateur de 4 ° C la nuit. </li><li> Le lendemain matin, laver avec du PBST (PBS avec 0,2% de Triton-X-100) 5-10 fois pendant 5-10 minutes chacun. </li><li> Incuber avec l&#39;anticorps secondaire (par exemple, Invitrogen Alexa chèvre anti-souris-488) dilué dans le réactif de blocage avec 0,1% TritonX-100 à la température ambiante pendant 2-4 heures dans la chambre humide couverte. Inclure une tache nucléaire (par exemple DAPI) dans le secondaire, si vous souhaitez identifier l&#39;emplacement du noyau dans les muscles ou le cerveau. </li><li> Laver avec du PBST (PBS avec 0,02% de Triton-X-100) 5-10 fois pendant 5-10 minutes chacun. </li></ol> 5. Montage du échantillons de larves sur des diapositives: <ol><li> Décanter et la mèche hors du lavage PBST dernier. </li><li> Pipeter 1ml de glycérol d&#39;environ 80% pour couvrir les peaux épinglé larvaire. </li><li> Retirer 5 des 6 broches dans toutes les larves. </li><li> Lorsque vous êtes prêt à mettre le génotype d&#39;abord sur une diapositive enlever la goupille dernière pour toutes les larves de cette genotype. </li><li> Préparer un &quot;lavage&quot; slide en mettant deux gouttes de votre milieu de montage sur une lame propre. Cette étape est importante pour laver la solution d&#39;eau hors des larves pour le montage et claire l&#39;imagerie. </li><li> Prenez une larve par la queue avec votre pince émoussée, faites glisser la larve autour de la glycérine et ensuite le long des bords secs de votre plat de dissection, pour enlever la majorité de la glycérine. Placer les larves dans la chute de milieu de montage en premier. </li><li> Répétez l&#39;étape 6 pour toutes les larves de la même génotype. </li><li> Une fois que toutes les larves sont dans la chute de milieu de montage d&#39;abord, prenez la première larve par la queue et tirer à travers la baisse et ensuite le long des bords du plat à sec pour enlever la majorité de la moyenne. Ensuite, placez les larves dans la chute de milieu de montage secondes. </li><li> Répétez l&#39;étape 8 pour toutes les larves ayant le même génotype. </li><li> Préparez votre dernière diapositive en l&#39;étiquetage et de placer un petit &quot;T&quot; du milieu de montage sur la lame. </li><li> Comme dans l&#39;étape 5.8, prenez la larve par la queue; tirez la peau grâce à la baisse le milieu de montage secondes et ensuite le long des côtés sèches du &quot;Wash&quot; diapositive. Après la majorité du milieu est venu éteint, placez la peau des larves sur la lame finale dans le milieu de montage. </li><li> Répétez l&#39;opération pour toutes les peaux de larves. </li><li> Assurez-vous que toutes les peaux de larves sont disposées comme vous le souhaitez en vous assurant que le côté cuticule est bas et le muscle exposée est orientée vers le haut. </li><li> Placer une lamelle sur la lame afin de couvrir les larves disséqué, avec le bord à partir de la ligne supérieure de l&#39;indicateur &quot;T.&quot; </li><li> Mettez un petit poids (par exemple pile de 9 volts) sur la lamelle, en s&#39;assurant que le milieu de montage s&#39;étend entièrement sous la lamelle. </li><li> Afin de réduire possibles extinction de fluorescence, placer la lame dans un tiroir ou un espace sombre jusqu&#39;à ce que le milieu de montage a guéri. </li><li> Nettoyer le support de montage qui débordait du tranchant de la lamelle. Nettoyer l&#39;excès demi-sec de montage sur la lamelle ou une diapositive à l&#39;éthanol 70%. </li><li> Pour créer un sceau final, sceller avec du vernis à ongles. </li></ol> 6. Les résultats représentatifs: Un exemple de glisser des larves disséquées et immunocolorés est montré dans la figure 2. Lorsque les dissections des larves, des taches, et le montage sont réalisés correctement, l&#39;utilisateur peut identifier le muscle larves d&#39;intérêt (figure 3) dans les segments de A2-A6. Hoang et al. Fournit une description détaillée de la position des muscles ainsi que la caractérisation des boutons synaptiques spécifiques (Hoang et Chiba, 2001). En utilisant un objectif de forte puissance, l&#39;utilisateur peut se concentrer sur une seule synapse et de prendre z-stack image. Une image de projection maximale représentant d&#39;une partie de la synapse 6 / 7 est montré (figure 4). Ensuite, en utilisant un logiciel d&#39;imagerie, les zones actives peuvent être quantitativement évalué les caractéristiques qui sont particulières à votre phénotype mutant. Exemples de fonctionnalités qui peuvent être modifiées dans un phénotype particulier mutant comprennent le nombre total, l&#39;intensité de fluorescence, et l&#39;espacement entre les zones actives. Pièges potentiels: L&#39;évaluation par immunofluorescence de la jonction neuromusculaire des larves est un système de valeur qui peuvent fournir de précieuses informations sur la biologie synaptique, bien qu&#39;il existe des pièges potentiels qui peuvent limiter l&#39;utilité de ce système. Par exemple, souvent, il est souhaitable de l&#39;image du motif de coloration de deux ou plusieurs anticorps primaires dans le même échantillon. Le choix des anticorps primaires appropriés, les fluorophores appropriés, et des contrôles appropriés négative est essentielle à la réussite. Si l&#39;imagerie deux antigènes dans votre expérience, être certain que les anticorps primaires sont de différentes espèces de sorte que chaque protéine d&#39;intérêt peut être identifié de façon unique avec un anticorps marqué par fluorescence secondaire. Une méthode recommandée pour réduire de fond est d&#39;utiliser un agent de blocage contenant le sérum normal de l&#39;espèce à partir de laquelle les anticorps secondaires ont été obtenues (par exemple l&#39;utilisation de sérum de chèvre normal comme agent de blocage lors de l&#39;utilisation de chèvre anti-lapin ou anticorps anti-souris secondaire). Après la planification de l&#39;anticorps primaire et secondaire que vous utiliserez dans votre expérience, vous devez également tenir compte notamment des contrôles dans votre coloration fixe pour s&#39;assurer que le signal fluorescent que vous voyez est réel et pas seulement de fond. Si possible, inclure des échantillons de contrôle négatif qui ne contiennent pas la protéine d&#39;intérêt. Ceci se fait facilement dans les études de surexpression exogène par transgène, y compris un animal de type sauvage, mais dans certains cas peut être accompli en utilisant un mutant homozygote de votre protéine d&#39;intérêt. Un autre contrôle essentiel négative, utile pour mesurer les niveaux de fond de votre signal fluorescent, est d&#39;utiliser l&#39;anticorps secondaire sans inclure le primaire. Quand l&#39;imagerie de votre preps qui en résulte, il est important de comprendre que tous les signaux fluorescents que vous voyez peut-être pas réel, et peut-être de fond de Your anticorps secondaire ou du fond de tissu endogène. Vous pouvez avoir besoin de normaliser vos images à considérer la fluorescence de fond lors des changements entre les dosant l&#39;intensité de fluorescence. Choix du fluorophore doit également être fait avec soin. Examen de l&#39;excitation et les spectres d&#39;émission pour chaque fluorophore et la capacité à détecter de façon unique chaque signal est indispensable pour éviter saignent canal à travers. S&#39;il ya une incertitude, une façon simple de déterminer si l&#39;ampleur de la saigner à travers est d&#39;immunocoloration avec un seul fluorophore anticorps marqué à la fois et vérifier l&#39;image à chaque canal que vous utiliserez dans votre dernière expérience. Cela devrait révéler si saigner à travers survient avec votre jeu de microscope filtre. <img src="/files/ftp_upload/2676/2676fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1. Organigramme de la coupe cuticule et le placement des broches 1-6. <a href="http://jove.com/files/ftp_upload/2676/2676fig1_large.jpg">Cliquez ici pour agrandir l&#39;image</a> <img src="/files/ftp_upload/2676/2676fig2.jpg" alt="Figure 2" /> Figure 2. Placement des larves sur la dernière diapositive. Assurez-vous que les larves sont exposées preps secondaires musculaires et la cuticule côté vers le bas. Laissez au moins une largeur du corps larvaire dans-entre chaque échantillon. <img src="/files/ftp_upload/2676/2676fig3.jpg" alt="Figure 3" /> Figure 3. Lorsque l&#39;imagerie, de localiser les muscles et les segments d&#39;intérêt. Commune jonctions neuromusculaires caractérisées muscles innervent 6 / 7, 13 musculaire, le muscle 12, ou musculaires 4. Sur le côté opposé de la ligne médiane ventrale, il ya une structure musculaire image miroir de l&#39;hémi-segment montré. Utilisez Muscle 31 en tant que marqueur pour identifier quel segment vous imagerie. Image des synapses et des segments de même pour le reste de vos échantillons, la collecte de nombreuses images synaptique par génotype qui peut être utilisé pour la quantification. <img src="/files/ftp_upload/2676/2676fig4.jpg" alt="Figure 4" /> Figure 4. Une image représentant un maximum de projection d&#39;une partie du muscle JNM innervant 6 / 7 est montré. NC82 (Bruchpilot) coloration est représenté en vert. HRP pré-synaptique tache est représentée en rouge. Notez le punctae zone active qui peut encore être quantifiée par un logiciel d&#39;imagerie.

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	<li>Budnik, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synapse+maturation+and+structural+plasticity+at+Drosophila+neuromuscular+junctions.">Synapse maturation and structural plasticity at Drosophila neuromuscular junctions.</a> Curr Opin Neurobiol. 6, 858-867 (1996).</li><li>Fouquet, W., Owald, D., Wichmann, C., Mertel, S., Depner, H., Dyba, M., Hallermann, S., Kittel, R. J., Eimer, S., Sigrist, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maturation+of+active+zone+assembly+by+Drosophila+Bruchpilot.">Maturation of active zone assembly by Drosophila Bruchpilot.</a> J Cell Biol. 186, 129-145 (2009).</li><li>Hoang, B., Chiba, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell+Analysis+of+Drosophila+Larval+Neuromuscular+Synapses.">Single-Cell Analysis of Drosophila Larval Neuromuscular Synapses.</a> Developmental Biology. 229, 55-70 (2001).</li><li>Keshishian, H., Kim, Y. -. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orchestrating+development+and+function:+retrograde+BMP+signaling+in+the+Drosophila+nervous+system.">Orchestrating development and function: retrograde BMP signaling in the Drosophila nervous system.</a> Trends in Neurosciences. 27, 143-147 (2004).</li><li>Kittel, R. J., Wichmann, C., Rasse, T. M., Fouquet, W., Schmidt, M., Schmid, A., Wagh, D. A., Pawlu, C., Kellner, R. R., Willig, K. I., Hell, S. W., Buchner, E., Heckmann, M., Sigrist, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bruchpilot+Promotes+Active+Zone+Assembly,+Ca2++Channel+Clustering,+and+Vesicle+Release.">Bruchpilot Promotes Active Zone Assembly, Ca2+ Channel Clustering, and Vesicle Release.</a> Science. 312, 1051-1054 (2006).</li><li>Koh, Y. H., Gramates, L. S., Budnik, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+larval+neuromuscular+junction:+Molecular+components+and+mechanisms+underlying+synaptic+plasticity.">Drosophila larval neuromuscular junction: Molecular components and mechanisms underlying synaptic plasticity.</a> Microscopy Research and Technique. 49, 14-25 (2000).</li><li>Lloyd, T. E., Taylor, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flightless+flies:+Drosophila+models+of+neuromuscular+disease.">Flightless flies: Drosophila models of neuromuscular disease.</a> Ann N Y Acad Sci. 1184, e1-e20 (2010).</li><li>Ratnaparkhi, A., Lawless, G. M., Schweizer, F. E., Golshani, P., Jackson, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Drosophila+model+of+ALS:+human+ALS-associated+mutation+in+VAP33A+suggests+a+dominant+negative+mechanism.">A Drosophila model of ALS: human ALS-associated mutation in VAP33A suggests a dominant negative mechanism.</a> PLoS One. 3, e2334-e2334 (2008).</li><li>Wagh, D. A., Rasse, T. M., Asan, E., Hofbauer, A., Schwenkert, I., D&#252;rrbeck, H., Buchner, S., Dabauvalle, M. -. C., Schmidt, M., Qin, G., Wichmann, C., Kittel, R., Sigrist, S. J., Buchner, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bruchpilot,+a+Protein+with+Homology+to+ELKS/CAST,+Is+Required+for+Structural+Integrity+and+Function+of+Synaptic+Active+Zones+in+Drosophila.">Bruchpilot, a Protein with Homology to ELKS/CAST, Is Required for Structural Integrity and Function of Synaptic Active Zones in Drosophila.</a> Neuron. 49, 833-844 (2006).</li><li>Zweier, C., Jong, E. K. d. e., Zweier, M., Orrico, A., Ousager, L. B., Collins, A. L., Bijlsma, E. K., Oortveld, M. A., Ekici, A. B., Reis, A., Schenck, A., Rauch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CNTNAP2+and+NRXN1+are+mutated+in+autosomal-recessive+Pitt-Hopkins-like+mental+retardation+and+determine+the+level+of+a+common+synaptic+protein+in+Drosophila.">CNTNAP2 and NRXN1 are mutated in autosomal-recessive Pitt-Hopkins-like mental retardation and determine the level of a common synaptic protein in Drosophila.</a> Am J Hum Genet. 85, 655-666 (2009).</li></ol>

Pour les neurones, la zone du terminal synaptique est d&#39;une importance cruciale, et il est le pont pour une bonne communication entre les post-et pré-synaptique des cellules. Un moyen puissant pour étudier la santé des neurones dans des modèles de la maladie est d&#39;analyser les protéines du terminal synaptique par immunofluorescence. La méthode d&#39;immunofluorescence présenté ici permet au chercheur d&#39;examiner de nombreuses larves simultanément tout en limitant les différences entre les groupes en...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom de réactif </td><td> Société </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> Sylgard 184 base élastomère de silicone </td><td> Dow Corning </td><td> 68037-59-2 </td><td> Après le mélange permettent de bulles d&#39;augmenter lentement en mettant sur des rotateurs lents ou permettant de s&#39;asseoir pendant 30 minutes ou plus. </td></tr><tr><td> Acier inoxydable Pins Minutien </td><td> Outils Fine Science </td><td> 26002-10 </td><td> Garniture à env. 3-4mm de long avec des ciseaux ordinaires </td></tr><tr><td> Pince Laminectomie (Blunt-Utilisé pour saisir broches) </td><td> Outils de Fine Science </td><td> 11223-20 </td><td> Utilisez-le comme une pince émoussée pour saisir broches </td></tr><tr><td> Pinces à dissection </td><td> Instruments de précision du monde </td><td> 501985 </td><td></td></tr><tr><td> Vannas SuperFine Ciseaux, 8cm de long </td><td> Instruments de précision du monde </td><td> 501778 </td><td></td></tr><tr><td> De souris anti-BRP d&#39;anticorps </td><td> DSHB </td><td> NC82 </td><td> Utilisez dilution 1:50 </td></tr><tr><td> Cy3 chèvre AffiniPure anti-peroxydase de raifort </td><td> Jackson Immunoresearch </td><td> 123-165-021 </td><td> Utilisez au 1:200 dilution </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 488 chèvre anti-souris IgG </td><td> Invitrogen </td><td> A11001 </td><td> Utilisez environ. 1:200 dilution </td></tr></tbody></table>

dissection and imaging of active zones in the drosophila neuromuscular junction

La drosophile larves jonction neuromusculaire (JNM) est un excellent modèle pour l&#39;étude de la structure synaptique et la fonction. Drosophile est bien connue pour la facilité de puissantes manipulations génétiques et le système nerveux des larves s&#39;est révélée particulièrement utile pour étudier non seulement la fonction normale, mais aussi des perturbations qui accompagnent certaines maladies neurologiques (Lloyd et Taylor, 2010). Bon nombre des principaux molécules synaptiques trouvés chez la drosophile sont également présents chez les mammifères et comme la plupart des synapses excitatrices du système nerveux central chez les mammifères, la drosophile est JNM glutamatergique et démontre dépendant de l&#39;activité de remodelage (Koh et al., 2000). En outre, les neurones de drosophile peuvent être identifiés individuellement, car leurs habitudes innervation sont stéréotypés et répétitifs permettant d&#39;étude a identifié terminaisons synaptiques, telles que celles entre les motoneurones et les fibres musculaires du corps-mur qu&#39;ils innervent (Keshishian et Kim, 2004). L&#39;existence de composants synapse évolutivement conservés avec la facilité de la manipulation génétique et physique rendre le modèle idéal pour étudier la drosophile mécanismes sous-jacents de la fonction synaptique (Budnik, 1996). Les zones actives à terminaisons synaptiques sont d&#39;un intérêt particulier parce que ce sont les sites de la libération des neurotransmetteurs. NC82 est un anticorps monoclonal qui reconnaît la drosophile la protéine Bruchpilot (BRP), une membre de la famille CAST1/ERC qui est un élément important de la zone active (Wagh et al., 2006). BRP a montré d&#39;adapter directement la zone active T-bar et est responsable de regroupement efficace canaux Ca 2 + sous la barre en T de densité (Fouquet et al., 2009). Mutants de BRP ont réduit de Ca 2 + densité de canaux, déprimé communiqué vésicules évoqués, et modifié à court terme de plasticité (Kittel et al., 2006). Modifications aux zones actives ont été observées dans les modèles de la maladie chez la drosophile. Par exemple, l&#39;immunofluorescence utilisant l&#39;anticorps NC82 a montré que la densité de la zone active a diminué dans les modèles de la sclérose latérale amyotrophique et Pitt-Hopkins syndrome (Ratnaparkhi et al, 2008;. Zweier et al, 2009).. Ainsi, l&#39;évaluation des zones actives, ou d&#39;autres protéines synaptiques, dans les modèles de larves de drosophile de la maladie peut fournir un indice précieux initiale à la présence d&#39;un défaut synaptique. Préparer l&#39;ensemble de montage des larves de drosophile disséquées pour l&#39;analyse par immunofluorescence de l&#39;JNM exige une certaine habileté, mais qui peut être accompli par la plupart des scientifiques avec un peu de pratique. Présenté est une méthode qui permet aux larves de plusieurs à être disséqués et immunocolorés dans le plat même dissection, limitant les différences environnementales entre chaque génotype et en fournissant suffisamment d&#39;animaux pour la confiance dans la reproductibilité et l&#39;analyse statistique.

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Dissection and Imaging of Active Zones in the Drosophila Neuromuscular Junction

La jonction neuromusculaire (JNM) de<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Est un système modèle important pour étudier la fonction synaptique normale ainsi que des perturbations de la fonction synaptique dans certaines maladies neurologiques. Nous présentons un protocole de dissection de la<em&gt; Drosophile</em&gt; Larvaires système de moteur et immunocoloration des protéines zone active au sein du MNJ.

Dissection et l&#39;imagerie de zones actives dans le Drosophile Jonction neuromusculaire

The Drosophila  larvae neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model for the study of synaptic structure and function. Drosophila  is well known for ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dissection and Imaging of Active Zones in the Drosophila Neuromuscular Junction

15.3K vues.  St. Jude Children’s Research Hospital. La jonction neuromusculaire (JNM) de Drosophila melanogaster Est un système modèle important pour étudier la fonction synaptique normale ainsi que des perturbations de la fonction synaptique dans certaines maladies neurologiques. Nous présentons un protocole de dissection de la Drosophile Larvaires système de moteur et immunocoloration des protéines zone active au sein du MNJ.

Vidéo: Dissection and Imaging of Active Zones in the Drosophila Neuromuscular Junction

Single Drosophila Ommatidium Dissection and Imaging

The fruit fly Drosophila melanogaster has made invaluable contributions to neuroscience research and has been used widely as a model for neurodegenerative diseases because of its powerful genetics1. The fly eye in particular has been the organ of choice for neurodegeneration research, being the most accessible and life-dispensable part of the Drosophila nervous system. However the major caveat of intact eyes is the difficulty, because of the intense autofluorescence of the pigment, in imaging intracellular events, such as autophagy dynamics2, which are paramount to understanding of neurodegeneration.
We have recently used the dissection and culture of single ommatidia3 that has been essential for our understanding of autophagic dysfunctions in a fly model of Dentatorubro-Pallidoluysian Atrophy (DRPLA)3, 4.
We now report a comprehensive description of this technique (Fig. 1), adapted from electrophysiological studies5, which is likely to expand dramatically the possibility of fly models for neurodegeneration. This method can be adapted to image live subcellular events and to monitor effective drug administration onto photoreceptor cells (Fig. 2). If used in combination with mosaic techniques6-8, the responses of genetically different cells can be assayed in parallel (Fig. 2).

Single Drosophila Ommatidium Dissection and Imaging

The limiting factor in the use of the adult Drosophila eye to study neurodegeneration and cell biology is the difficult imaging of intracellular processes. We describe the dissection of single ommatidia to generate a bona-fide primary neuronal cell culture, which can be subject to drug treatment and advanced imaging.

Simple Drosophile Dissection ommatidie et imagerie

The fruit fly Drosophila melanogaster has made invaluable contributions to neuroscience research and has been used widely as a model for neurodegenerative ...

Recherche

Neurosciences

Sequential Photo-bleaching to Delineate Single Schwann Cells at the Neuromuscular Junction

Sequential photo-bleaching provides a non-invasive way to label individual SCs at the NMJ. The NMJ is the largest synapse of the mammalian nervous system and has served as guiding model to study synaptic structure and function. In mouse NMJs motor axon terminals form pretzel-like contact sites with muscle fibers. The motor axon and its terminal are sheathed by SCs. Over the past decades, several transgenic mice have been generated to visualize motor neurons and SCs, for example Thy1-XFP1 and Plp-GFP mice2, respectively.
Along motor axons, myelinating axonal SCs are arranged in non-overlapping internodes, separated by nodes of Ranvier, to enable saltatory action potential propagation. In contrast, terminal SCs at the synapse are specialized glial cells, which monitor and promote neurotransmission, digest debris and guide regenerating axons. NMJs are tightly covered by up to half a dozen non-myelinating terminal SCs - these, however, cannot be individually resolved by light microscopy, as they are in direct membrane contact3.
Several approaches exist to individually visualize terminal SCs. None of these are flawless, though. For instance, dye filling, where single cells are impaled with a dye-filled microelectrode, requires destroying a labelled cell before filling a second one. This is not compatible with subsequent time-lapse recordings3. Multi-spectral "Brainbow" labeling of SCs has been achieved by using combinatorial expression of fluorescent proteins4. However, this technique requires combining several transgenes and is limited by the expression pattern of the promoters used. In the future, expression of "photo-switchable" proteins in SCs might be yet another alternative5. Here we present sequential photo-bleaching, where single cells are bleached, and their image obtained by subtraction. We believe that this approach - due to its ease and versatility - represents a lasting addition to the neuroscientist's technology palette, especially as it can be used in vivo and transferred to others cell types, anatomical sites or species6.
In the following protocol, we detail the application of sequential bleaching and subsequent confocal time-lapse microscopy to terminal SCs in triangularis sterni muscle explants. This thin, superficial and easily dissected nerve-muscle preparation7,8 has proven useful for studies of NMJ development, physiology and pathology9. Finally, we explain how the triangularis sterni muscle is prepared after fixation to perform correlated high-resolution confocal imaging, immunohistochemistry or ultrastructural examinations.

Visualizing individual cells in densely packed tissues, such as terminal Schwann cells (SCs) at neuromuscular junctions (NMJs), is challenging. "Sequential photo-bleaching" allows delineating single terminal SCs, for instance in the triangularis sterni muscle explant, a convenient nerve-muscle preparation, where sequential bleaching can be combined with time-lapse imaging and post-hoc immunostainings.

Séquentielle photo-blanchiment sur le tracé de cellules de Schwann simple à la jonction neuromusculaire

Sequential photo-bleaching provides a non-invasive way to label individual SCs at the NMJ. The NMJ is the largest synapse of the mammalian nervous system ...

Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

Analysis of neuromuscular junction morphology can give important insight into the physiological status of a given motor neuron. Analysis of thin flat muscles can offer significant advantage over traditionally used thicker muscles, such as those from the hind limb (e.g. gastrocnemius). Thin muscles allow for comprehensive overview of the entire innervation pattern for a given muscle, which in turn permits identification of selectively vulnerable pools of motor neurons. These muscles also allow analysis of parameters such as motor unit size, axonal branching, and terminal/nodal sprouting. A common obstacle in using such muscles is gaining the technical expertise to dissect them. In this video, we detail the protocol for dissecting the transversus abdominis (TVA) muscle from young mice and performing immunofluorescence to visualize axons and neuromuscular junctions (NMJs). We demonstrate that this technique gives a complete overview of the innervation pattern of the TVA muscle&#160;and can be used to investigate NMJ pathology in a mouse model of the childhood motor neuron disease, spinal muscular atrophy.

Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

In this video we demonstrate a protocol for dissection of the transversus abdominis muscle of the mouse and use immunofluorescence and microscopy to visualize neuromuscular junctions.

Dissection du muscle Transversus Abdominis pour l’analyse de jonction neuromusculaire à montage entier

Analysis of neuromuscular junction morphology can give important insight into the physiological status of a given motor neuron. Analysis of thin flat ...

Detection of In Situ Protein-protein Complexes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction Using Proximity Ligation Assay

Discs large (Dlg) is a conserved member of the membrane-associated guanylate kinase family, and serves as a major scaffolding protein at the larval neuromuscular junction (NMJ) in Drosophila. Previous studies have shown that the postsynaptic distribution of Dlg at the larval NMJ overlaps with that of Hu-li tai shao (Hts), a homologue to the mammalian adducins. In addition, Dlg and Hts are observed to form a complex with each other based on co-immunoprecipitation experiments involving whole adult fly lysates. Due to the nature of these experiments, however, it was unknown whether this complex exists specifically at the NMJ during larval development.
Proximity Ligation Assay (PLA) is a recently developed technique used mostly in cell and tissue culture that can detect protein-protein interactions in situ. In this assay, samples are incubated with primary antibodies against the two proteins of interest using standard immunohistochemical procedures. The primary antibodies are then detected with a specially designed pair of oligonucleotide-conjugated secondary antibodies, termed PLA probes, which can be used to generate a signal only when the two probes have bound in close proximity to each other. Thus, proteins that are in a complex can be visualized. Here, it is demonstrated how PLA can be used to detect in situ protein-protein interactions at the Drosophila larval NMJ. The technique is performed on larval body wall muscle preparations to show that a complex between Dlg and Hts does indeed exist at the postsynaptic region of NMJs.

Detection of In Situ Protein-protein Complexes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction Using Proximity Ligation Assay

This protocol demonstrates how Proximity Ligation Assay can be used to detect in situ protein-protein interactions at the Drosophila larval neuromuscular junction. With this technique, Discs large and Hu-li tai shao are shown to form a complex at the postsynaptic region, an association previously identified through co-immunoprecipitation.

Détection de<em&gt; In Situ</em&gt; complexes protéine-protéine à la<em&gt; Drosophila</em&gt; Larvaire jonction neuromusculaire Utilisation Proximité ligature Assay

Discs large (Dlg) is a conserved member of the membrane-associated guanylate kinase family, and serves as a major scaffolding protein at the larval ...

The Neuromuscular Junction: Measuring Synapse Size, Fragmentation and Changes in Synaptic Protein Density Using Confocal Fluorescence Microscopy

The neuromuscular junction (NMJ) is the large, cholinergic relay synapse through which mammalian motor neurons control voluntary muscle contraction. Structural changes at the NMJ can result in neurotransmission failure, resulting in weakness, atrophy and even death of the muscle fiber. Many studies have investigated how genetic modifications or disease can alter the structure of the mouse NMJ. Unfortunately, it can be difficult to directly compare findings from these studies because they often employed different parameters and analytical methods. Three protocols are described here. The first uses maximum intensity projection confocal images to measure the area of acetylcholine receptor (AChR)-rich postsynaptic membrane domains at the endplate and the area of synaptic vesicle staining in the overlying presynaptic nerve terminal. The second protocol compares the relative intensities of immunostaining for synaptic proteins in the postsynaptic membrane. The third protocol uses Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) to detect changes in the packing of postsynaptic AChRs at the endplate. The protocols have been developed and refined over a series of studies. Factors that influence the quality and consistency of results are discussed and normative data are provided for NMJs in healthy young adult mice.

The neuromuscular junction (NMJ) is altered in a variety of conditions that can sometimes culminate in synaptic failure. This report describes fluorescence microscope-based methods to quantify such structural changes.

La jonction neuromusculaire: Synapse mesurer la taille, fragmentation et les changements dans Synaptic Protein densité en utilisant microscopie de fluorescence confocale

The neuromuscular junction (NMJ) is the large, cholinergic relay synapse through which mammalian motor neurons control voluntary muscle contraction. ...

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Most studies on morphogenesis rely on qualitative descriptions of how anatomical traits are affected by the disruption of specific genes and genetic pathways. Quantitative descriptions are rarely performed, although genetic manipulations produce a range of phenotypic effects and variations are observed even among individuals within control groups.&#160;Emerging evidence shows that morphology, size and location of organelles play a previously underappreciated, yet fundamental role in cell function and survival. Here we provide step-by-step instructions for performing quantitative analyses of phenotypes at the Drosophila larval neuromuscular junction (NMJ). We use several reliable immuno-histochemical markers combined with bio-imaging techniques and morphometric analyses to examine the effects of genetic mutations on specific cellular processes. In particular, we focus on the quantitative analysis of phenotypes affecting morphology, size and position of nuclei within the striated muscles of Drosophila larvae. The Drosophila larval NMJ is a valuable experimental model to investigate the molecular mechanisms underlying the structure and the function of the neuromuscular system, both in health and disease. However, the methodologies we describe here can be extended to other systems as well.

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Morphology, size and location of intracellular organelles are evolutionarily conserved and appear to directly affect their function. Understanding the molecular mechanisms underlying these processes has become an important goal of modern biology. Here we show how these studies can be facilitated by the application of quantitative techniques.

Pourquoi Quantification Matters: Caractérisation des phénotypes au<em&gt; Drosophila</em&gt; Larvaire jonction neuromusculaire

Most studies on morphogenesis rely on qualitative descriptions of how anatomical traits are affected by the disruption of specific genes and genetic ...

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the molecular and cellular basis of higher brain functions. A whole-mount preparation of adult brains with well-preserved morphology is critical for such whole brain-based studies, but can be technically challenging and time-consuming. This protocol describes an easy-to-learn, one-step dissection approach of an adult fly head in less than 10 s, while keeping the intact brain attached to the rest of the body to facilitate subsequent processing steps. The procedure helps remove most of the eye and tracheal tissues normally associated with the brain that can interfere with the later imaging step, and also places less demand on the quality of the dissecting forceps. Additionally, we describe a simple method that allows convenient flipping of the mounted brain samples on a coverslip, which is important for imaging both sides of the brains with similar signal intensity and quality. As an example of the protocol, we present an analysis of dopaminergic (DA) neurons in adult brains of WT (w1118) flies. The high efficacy of the dissection method makes it particularly useful for large-scale adult brain-based studies in Drosophila.

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

The adult Drosophila brain is a valuable system for studying neuronal circuitry, higher brain functions, and complex disorders. An efficient method to dissect whole brain tissue from the small fly head will facilitate brain-based studies. Here we describe a simple, one-step dissection protocol of adult brains with well-preserved morphology.

Une seule étape simple protocole Dissection pour Whole-mount Préparation des adultes<em&gt; Drosophila</em&gt; Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the ...

Measuring Neuromuscular Junction Functionality

Neuromuscular junction (NMJ) functionality plays a pivotal role when studying diseases in which the communication between motor neuron and muscle is impaired, such as aging and amyotrophic lateral sclerosis (ALS). Here we describe an experimental protocol that can be used to measure NMJ functionality by combining two types of electrical stimulation: direct muscle membrane stimulation and the stimulation through the nerve. The comparison of the muscle response to these two different stimulations can help to define, at the functional level, potential alterations in the NMJ that lead to functional decline in muscle.
Ex vivo preparations are suited to well-controlled studies. Here we describe an intensive protocol to measure several parameters of muscle and NMJ functionality for the soleus-sciatic nerve preparation and for the diaphragm-phrenic nerve preparation. The protocol lasts approximately 60 min and is conducted uninterruptedly by means of a custom-made software that measures the twitch kinetics properties, the force-frequency relationship for both muscle and nerve stimulations, and two parameters specific to NMJ functionality, i.e. neurotransmission failure and intratetanic fatigue. This methodology was used to detect damages in soleus and diaphragm muscle-nerve preparations by using SOD1G93A transgenic mouse, an experimental model of ALS that ubiquitously overexpresses the mutant antioxidant enzyme superoxide dismutase 1 (SOD1).

A functional assessment of the neuromuscular junction (NMJ) can provide essential information on the communication between muscle and nerve. Here we describe a protocol to comprehensively evaluate both the NMJ and muscle functionality using two different muscle-nerve preparations, i.e. soleus-sciatic and diaphragm-phrenic.

Mesurer la fonctionnalité jonction neuromusculaire

Neuromuscular junction (NMJ) functionality plays a pivotal role when studying diseases in which the communication between motor neuron and muscle is ...

Two Algorithms for High-throughput and Multi-parametric Quantification of Drosophila Neuromuscular Junction Morphology

Synaptic morphology is tightly related to synaptic efficacy, and in many cases morphological synapse defects ultimately lead to synaptic malfunction. The Drosophila larval neuromuscular junction (NMJ), a well-established model for glutamatergic synapses, has been extensively studied for decades. Identification of mutations causing NMJ morphological defects revealed a repertoire of genes that regulate synapse development and function. Many of these were identified in large-scale studies that focused on qualitative approaches to detect morphological abnormalities of the Drosophila NMJ. A drawback of qualitative analyses is that many subtle players contributing to NMJ morphology likely remain unnoticed. Whereas quantitative analyses are required to detect the subtler morphological differences, such analyses are not yet commonly performed because they are laborious. This protocol describes in detail two image analysis algorithms "Drosophila NMJ Morphometrics" and "Drosophila NMJ Bouton Morphometrics", available as Fiji-compatible macros, for quantitative, accurate and objective morphometric analysis of the Drosophila NMJ. This methodology is developed to analyze NMJ terminals immunolabeled with the commonly used markers Dlg-1 and Brp. Additionally, its wider application to other markers such as Hrp, Csp and Syt is presented in this protocol. The macros are able to assess nine morphological NMJ features: NMJ area, NMJ perimeter, number of boutons, NMJ length, NMJ longest branch length, number of islands, number of branches, number of branching points and number of active zones in the NMJ terminal.

Two Algorithms for High-throughput and Multi-parametric Quantification of Drosophila Neuromuscular Junction Morphology

Two image analysis algorithms, "Drosophila NMJ Morphometrics" and "Drosophila NMJ Bouton Morphometrics" were created, to automatically quantify nine morphological features of the Drosophila neuromuscular junction (NMJ).

Deux algorithmes pour Quantification haut débit et multi-paramétrique de<em&gt; drosophile</em&gt; Junction neuromusculaires Morphology

Synaptic morphology is tightly related to synaptic efficacy, and in many cases morphological synapse defects ultimately lead to synaptic malfunction. The ...

Focal Macropatch Recordings of Synaptic Currents from the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model system to study glutamatergic synaptic transmission. We describe the technique of focal macropatch recordings of synaptic currents from visualized boutons at the Drosophila larval NMJ. This technique requires customized fabrication of recording micropipettes, as well as a compound microscope equipped with a high magnification, long-distance water immersion objective, differential interference contrast (DIC) optics, and a fluorescent attachment. The recording electrode is positioned on the top of a selected synaptic bouton visualized with DIC optics, epi-fluorescence, or both. The advantage of this technique is that it allows monitoring the synaptic activity of a limited number of sites of release. The recording electrode has&#160;a diameter of several microns, and the release sites positioned outside of the electrode rim do&#160;not significantly affect the recorded currents. The recorded synaptic currents have fast kinetics and can be readily resolved. These advantages are especially important for the studies of mutant fly lines with enhanced spontaneous or asynchronous synaptic activity.

Focal Macropatch Recordings of Synaptic Currents from the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Synaptic currents can be recorded focally from visualized synaptic boutons at the Drosophila third instar larvae neuromuscular junction. This technique enables monitoring the activity of a single synaptic bouton.

Focal Macropatch enregistrements de courants synaptiques de la jonction neuromusculaire larves de drosophile

Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model system to study glutamatergic synaptic transmission. We describe the technique of focal ...