Dr. Nael Alami ve Dr. Nam Chul Kim bu el yazması konusunda yararlı yorumlar için teşekkür ederim.

1. İmmünofloresan için hazırlanması: <ol><li> Diseksiyon bir yüzey oluşturmak için, küçük bir doku kültürü plaka Sylgard 184 Silikon Elastomer Base dökün. Tamamen disseksiyon alanında jant daha düşük olduğunu plaka doldurmak için değil emin olun. </li><li> Diseksiyonu pimleri manipülasyon artan kolaylığı için yaklaşık 3,5 mm uzunluğunda kesin ve larva başına en az 6 pin olduğundan emin olun. </li><li> Künt forseps diseksiyon için pimleri kavramak için izin gerekecek. </li></ol> 2. Larva, Diseksiyon: <ol><li> Flakonun kenarlara sürünerek ve pupa için henüz başlamamıştır üçüncü instar larvaları dolaşıp seçin. </li><li> Bir larva, bir stereomikroskopta altında diseksiyon yüzey üzerine yerleştirin. Uzak bir Kimwipe kullanarak aşırı nemli Wick. </li><li> Her larva dorsal yüzü yukarı bakacak şekilde yerleştirin. Larvaların dorsal kenarı boyunca iki trakea, beyaz çizgiler görmek mümkün olacak. Dorsal orta hat işaretleri çünkü ortada merkezi bu mümkün olduğunca deneyin. </li><li> Sadece ağız kanca üzerinde Yeri pin # 1 (Şekil 1). </li><li> Sadece trakea arasındaki spiracles yukarıdaki kuyruk pin # 2 yerleştirin. </li><li> Manikür kurumasını önlemek için küçük bir miktar larva PBS ekleyin. </li><li> Genotipleri her genotip arasında bir iğne koyarak mekansal ayrıldığından emin, tüm larvaları ile yukarıdaki adımları tekrarlayın. </li><li> Tracheas (Şekil 1) hem genelinde pin # 2 üzerinde bir küçük enine kesilmiş sağ olun. </li><li> Geçmiş pin up tracheas arasındaki dorsal orta hat boyunca ilk kes ve kesim yolu # 1 makas yerleştirin. </li><li> Sağ ve sol taraf manikür çekerek onları aşağı pin izin açılacaktır böylece, manikür her tarafında en üst ve altındaki diğer küçük kesikler yapmak gerekecektir. </li><li> Place pin # 3, 4, 5, ve her köşesinde az 6. </li><li> Oda sıcaklığında 20-25 dakika süreyle% 4 PFA örnek Fix </li><li> PFA Durusu ve her zaman şişeden, PBS 3-4 kez yıkayın. </li></ol> 3. Doku Temizleme: <ol><li> Genellikle beynin bulunduğu bölgeyi korumak için istiyorum çünkü posterior sonunda dokularda kaldırarak başlayın. </li><li> Steromicroscope kullanarak ve PBS bir damla altında larvaları, ilk trakea arka ucunu yakala ve onunla birlikte yağ vücudun bazı kaldırabilir çekin iken. Ikinci trakea için tekrarlayın. </li><li> Bazı posterior yağ vücut veya bağırsak alın ve onları hazırlık çekin. Posterior dokusunun en kaldırıldıktan sonra, beyin etrafındaki küçük dokular kaldırarak odaklanmak. Kaslar, veya NMJ morfolojisi sadece meraklı iseniz, aynı zamanda beyin kaldırabilirsiniz. </li><li> Kas 31, karın segment yönlendirmesi için yararlı bir belirteç daha iyi bir görünüm için beyin kaldırılması sağlar. </li></ol> 4. Aktif Bölgeleri için İmmünofloresan: <ol><li> Diseksiyon çanak disseke preparatlarıyla engelleme ajan (PBS içinde% 5 Normal Keçi Serum) ekleyin. Oda sıcaklığında 1 saat süreyle engelleyin. Sadece dilüsyonları engelleme ve antikor için bir çözüm yapmak istiyorsanız,% 0.1 TritonX-100 - doku permeabilization için bloke edici ajanlar içerir. </li><li> % 0.1 TritonX-100 ile reaktif engelleme seyreltilmiş İlköğretim antikor uygulayın. Aktif bölge antikor Gelişim Çalışmaları Hibridoma Bankası (DSHB, http://dshb.biology.uiowa.edu/) aracılığıyla ulaşılabilir. NMJ membran ve aksonlar etiket (örneğin horseradish peroksidaz-Cy3 konjuge) referans antikor kullanın. </li><li> 4 ° C gecede primer antikorlar inkübe edin. Buzdolabı kuruluk antikor çözüm buharlaşması, böylece kullanılan pipet kutusunun alt kısmında bir miktar su koyarak bir nem odası oluşturun. Floresan beyazlatma azaltmak için saydam kapak alüminyum folyo ile örtün. Nem odasında diseksiyonu slayt yerleştirin ve bir gecede 4 ° C inkübatör tüm kutusu koymalı. </li><li> Ertesi sabah, PBST (% 0.2 Triton X-100 ile PBS), her biri için 5-10 dakika 5-10 kat ile yıkayın. </li><li> Sekonder antikoru (anti-Mouse-488) kapalı nem odasında 2-4 saat boyunca oda sıcaklığında% 0.1 TritonX-100 ile reaktif engelleme seyreltilmiş örneğin Invitrogen Alexa Keçi ile inkübe edin. Ikincil (örneğin DAPI) bir nükleer leke dahil, kas veya beyin çekirdeğin konumunu belirlemek istiyorsanız. </li><li> PBST (% 0,02 Triton X-100 ile PBS) ile 5-10 dakika her biri için 5-10 kez yıkayın. </li></ol> 5. Slaytlar Larvaların Örnekleri Montaj: <ol><li> Durusu ve son PBST yıkama fitil. </li><li> Aşağı tuş larva postlarını kapsayacak şekilde Pipet yaklaşık 1 ml% 80 gliserol. </li><li> Tüm larvaları 6 pin 5 çıkarın. </li><li> Bu genoty tüm larvaları için son pin kaldırmak bir slayt üzerindeki ilk genotip koymak için hazır olduğunuzdape. </li><li> Temiz bir slayt montaj orta iki damla koyarak bir &quot;yıkama&quot; slayt hazırlayın. Bu adım, montaj ve net görüntü için larva kapalı su solüsyonu yıkamak için önemlidir. </li><li> Gliserol çoğunluğu kaldırmak için, künt forseps ile kuyruk bir larva tut larva gliserol etrafında sürükleyin ve sonra diseksiyon yemeğin kuru kenarlarında. Ilk montaj orta açılan larva yerleştirin. </li><li> Aynı genotip larvaları için 6. adımı tekrarlayın. </li><li> Bir kez tüm larvaları ilk montaj orta açılan, kuyruk tarafından ilk larva kapmak ve orta çoğunluğu kaldırmak için daha sonra yemeğin kuru kenarlarında açılan ve çekin. Sonra ikinci montaj orta açılan larva yerleştirin. </li><li> Aynı genotip ile tüm larvaları için adım 8 tekrarlayın. </li><li> Etiketleme ve slayt üzerinde montaj orta küçük bir &quot;T&quot; şeklinde yerleştirerek son slayt hazırlayın. </li><li> Adım 5.8 olduğu gibi, kuyruk larva kapmak; ile postu kuru kenarları boyunca &quot;Yıkama&quot; slayt sonra ikinci montaj orta bırak ve çekin. Çoğunluğu orta gelir sonra montaj orta son slaytta larva postu yerleştirin. </li><li> Tüm larva postlarını için tekrarlayın. </li><li> Tüm larva postlarını manikür tarafı aşağı yukarı bakacak şekilde ve açıkta kalan kas olduğunu emin olun istenilen düzenlenmiş olduğunu emin olun. </li><li> &quot;T&quot; üst satırında başlangıç ​​kenarı ile disseke larvaları karşılamak için slayt üzerinde bir kapak kayma yerleştirin </li><li> Montaj orta kapak kayma altında tamamen yayılır emin kapak kayma küçük bir ağırlık koyun (örneğin 9 voltluk pil). </li><li> Mümkün floresan su verme azaltmak için, bir çekmece veya koyu alan slayt montaj orta kürünü tamamlayana kadar yerleştirin. </li><li> Kapak kayma kenarlı taştı montaj orta temizleyin. % 70 etanol ile kapak kayma veya slayt aşırı kuru montaj orta temizleyin. </li><li> Tırnak cilası ile mühür, son bir mühür oluşturmak için. </li></ol> 6. Temsilcisi Sonuçlar: Disseke ve immunohistokimyasal larvaları bir örnek slayt Şekil 2&#39;de gösterilmiştir. Larvaları diseksiyonları, lekeler ve montaj düzgün yapılmazsa, kullanıcı segmentleri A2-A6 ilgi larvaları kas (Şekil 3) tespit edebilir. Hoang ve ark. Kas pozisyonu ayrıntılı tanımlarının yanı sıra belirli sinaptik BOUTONS (Hoang ve Chiba, 2001) karakterizasyonu sağlar. Yüksek güç bir hedef kullanarak kullanıcı tek bir sinaps odaklanmak ve z-yığın görüntü alabilir. 6 / 7 sinaps bir kısmını bir temsilcisi maksimum projeksiyon görüntü (Şekil 4) gösterilmiştir. Sonra, aktif bölgeleri görüntüleme yazılımı kullanarak kantitatif özellikle mutant fenotip özellikleri değerlendirilir olabilir. Belirli bir mutant fenotip değişmiş olabilir özellikler örnek olarak aktif bölgeleri arasındaki toplam sayısı, flöresan şiddeti ve aralık içerir. Potansiyel Tuzaklar: Larva nöromüsküler kavşak immünofloresan değerlendirme değerli bir sistem, bu sistemin yararı sınırı potansiyel tuzaklar olmasına rağmen, sinaptik biyoloji değerli öngörüler sağlayabilir. Örneğin, sık sık aynı örnek iki veya daha fazla primer antikor boyama desen, görüntünün arzu edilen bir durumdur. Uygun birincil antikorlar, uygun fluorophores ve uygun negatif kontroller seçim başarısı için önemlidir. Denemeniz görüntüleme iki antijen varsa, birincil antikorlar ilgi her protein benzersiz bir floresan etiketli sekonder antikoru ile tespit edilebilir, böylece farklı türler olduğundan emin olun. Arka plan azaltmak için önerilen yol, ikincil antikorlar (keçi anti-tavşan ya da anti-fare sekonder antikor kullanarak örneğin engelleyici bir ajan olarak normal keçi serumu kullanın) elde edildiği türlerin normal içeren serum engelleyici bir ajan kullanmak. Denemenizi kullanacağı birincil ve ikincil antikorlar planlama sonra, kontrolleri dahil olmak üzere sizin boyama de düşünmek gerekir Gördüğünüz floresan sinyal gerçek ve sadece arka plan olmasını sağlamak için ayarlar. Mümkünse, ilgi protein içermeyen negatif kontrol örnekleri yer alıyor. Bu kolay eksojen transgen aşırı ekspresyonu çalışmaları, vahşi bir hayvan da dahil olmak üzere tarafından yapılır, ancak bazı durumlarda sizin ilgi protein homozigot mutant kullanılarak yapılabilir. Floresan sinyal arka plan düzeylerini ölçmek için yararlı bir diğer önemli negatif kontrolü, birincil dahil olmak üzere ikincil antikor kullanmaktır. Zaman görüntüleme çıkan preparatlarıyla, gördüğünüz floresan sinyal tüm gerçek olmayabilir anlamak için önemlidir ve yo arka olabilirur ikincil antikor veya endojen doku arka plan. Floresan arasındaki değişiklikleri assaying yaparken arka plan floresan dikkate resimleri normalleştirmek için gerekebilir. Fluorofor seçimi dikkatli yapılmalıdır. Eksitasyon ve emisyon spektrumları her fluorofor ve her sinyali tespit etmek için benzersiz yeteneği göz önünde bulundurulması ile kanal kanama önlemek için şarttır. Herhangi bir belirsizlik, ile kanama ölçüde bir seferde tek bir fluorofor etiketli antikor immunostain ve son deney kullanarak olacağını, her bir kanal ile görüntü kontrol olup olmadığını belirlemek için basit bir yol var. Yoluyla kanama mikroskop filtre seti ile oluşup oluşmadığını Bu açığa çıkarmalıdır. <img src="/files/ftp_upload/2676/2676fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1 kütikula kesme ve yerleştirme pimleri 1-6 Akış şeması <a href="http://jove.com/files/ftp_upload/2676/2676fig1_large.jpg">, daha büyük bir resim görmek için buraya</a> tıklayın <img src="/files/ftp_upload/2676/2676fig2.jpg" alt="Şekil 2" /> Şekil 2 final slayt larvaların Yerleştirme. Larvaları preparatlarıyla kas tarafında aşağı maruz kalan ve manikür tarafında olduğunu emin olun. Her bir numune arasında en az bir larva gövde genişliği bırakın. <img src="/files/ftp_upload/2676/2676fig3.jpg" alt="Şekil 3" /> Şekil 3. Görüntüleme, ilgi kas ve segmentleri bulmak. Ortak nöromüsküler kavşakları innerve kaslar 6 / 7, 13 kas, kas 12, ya da kas 4 karakterizedir. Ventral orta hat karşı tarafta gösterilen hemi-segment bir ayna görüntüsü kas yapısı yoktur. Size görüntüleme hangi kesimi tanımlamak için bir belirteç olarak 31 Kas kullanın. Ölçümü için kullanılabilir genotip başına birçok sinaptik görüntü toplama Görüntü örneklerin geri kalanı için aynı sinaps ve segmentleri. <img src="/files/ftp_upload/2676/2676fig4.jpg" alt="Şekil 4" /> Şekil 4, NMJ innerve kas 6 / 7 bir kısmı bir temsilci maksimum projeksiyon görüntüsü gösterilir . NC82 (Bruchpilot) boyama yeşil gösterilir. Kırmızı leke HRP presinaptik gösterilmiştir. Daha fazla görüntüleme yazılımı ile belirlenebilir aktif bölge punctae unutmayın.

<ol>
	<li>Budnik, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synapse+maturation+and+structural+plasticity+at+Drosophila+neuromuscular+junctions.">Synapse maturation and structural plasticity at Drosophila neuromuscular junctions.</a> Curr Opin Neurobiol. 6, 858-867 (1996).</li><li>Fouquet, W., Owald, D., Wichmann, C., Mertel, S., Depner, H., Dyba, M., Hallermann, S., Kittel, R. J., Eimer, S., Sigrist, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maturation+of+active+zone+assembly+by+Drosophila+Bruchpilot.">Maturation of active zone assembly by Drosophila Bruchpilot.</a> J Cell Biol. 186, 129-145 (2009).</li><li>Hoang, B., Chiba, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell+Analysis+of+Drosophila+Larval+Neuromuscular+Synapses.">Single-Cell Analysis of Drosophila Larval Neuromuscular Synapses.</a> Developmental Biology. 229, 55-70 (2001).</li><li>Keshishian, H., Kim, Y. -. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orchestrating+development+and+function:+retrograde+BMP+signaling+in+the+Drosophila+nervous+system.">Orchestrating development and function: retrograde BMP signaling in the Drosophila nervous system.</a> Trends in Neurosciences. 27, 143-147 (2004).</li><li>Kittel, R. J., Wichmann, C., Rasse, T. M., Fouquet, W., Schmidt, M., Schmid, A., Wagh, D. A., Pawlu, C., Kellner, R. R., Willig, K. I., Hell, S. W., Buchner, E., Heckmann, M., Sigrist, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bruchpilot+Promotes+Active+Zone+Assembly,+Ca2++Channel+Clustering,+and+Vesicle+Release.">Bruchpilot Promotes Active Zone Assembly, Ca2+ Channel Clustering, and Vesicle Release.</a> Science. 312, 1051-1054 (2006).</li><li>Koh, Y. H., Gramates, L. S., Budnik, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+larval+neuromuscular+junction:+Molecular+components+and+mechanisms+underlying+synaptic+plasticity.">Drosophila larval neuromuscular junction: Molecular components and mechanisms underlying synaptic plasticity.</a> Microscopy Research and Technique. 49, 14-25 (2000).</li><li>Lloyd, T. E., Taylor, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flightless+flies:+Drosophila+models+of+neuromuscular+disease.">Flightless flies: Drosophila models of neuromuscular disease.</a> Ann N Y Acad Sci. 1184, e1-e20 (2010).</li><li>Ratnaparkhi, A., Lawless, G. M., Schweizer, F. E., Golshani, P., Jackson, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Drosophila+model+of+ALS:+human+ALS-associated+mutation+in+VAP33A+suggests+a+dominant+negative+mechanism.">A Drosophila model of ALS: human ALS-associated mutation in VAP33A suggests a dominant negative mechanism.</a> PLoS One. 3, e2334-e2334 (2008).</li><li>Wagh, D. A., Rasse, T. M., Asan, E., Hofbauer, A., Schwenkert, I., D&#252;rrbeck, H., Buchner, S., Dabauvalle, M. -. C., Schmidt, M., Qin, G., Wichmann, C., Kittel, R., Sigrist, S. J., Buchner, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bruchpilot,+a+Protein+with+Homology+to+ELKS/CAST,+Is+Required+for+Structural+Integrity+and+Function+of+Synaptic+Active+Zones+in+Drosophila.">Bruchpilot, a Protein with Homology to ELKS/CAST, Is Required for Structural Integrity and Function of Synaptic Active Zones in Drosophila.</a> Neuron. 49, 833-844 (2006).</li><li>Zweier, C., Jong, E. K. d. e., Zweier, M., Orrico, A., Ousager, L. B., Collins, A. L., Bijlsma, E. K., Oortveld, M. A., Ekici, A. B., Reis, A., Schenck, A., Rauch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CNTNAP2+and+NRXN1+are+mutated+in+autosomal-recessive+Pitt-Hopkins-like+mental+retardation+and+determine+the+level+of+a+common+synaptic+protein+in+Drosophila.">CNTNAP2 and NRXN1 are mutated in autosomal-recessive Pitt-Hopkins-like mental retardation and determine the level of a common synaptic protein in Drosophila.</a> Am J Hum Genet. 85, 655-666 (2009).</li></ol>

Nöronlar için, sinaptik terminal alanında kritik öneme sahip ve post ve pre-sinaptik hücreleri arasında doğru iletişim için köprü. Nöronun sağlık hastalık modelleri araştırmak için güçlü bir şekilde immünofloresan sinaptik terminal protein analiz etmektir. Burada sunulan immünofloresan yöntemi gruplar arasında çevresel farklılıklar sınırlandırarak araştırmacı aynı anda birçok larva incelemek sağlar. Drosophila üçüncü instar larvaları merkezi sinir sistemi glutamaterjik...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog Numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> Sylgard 184 Silikon Elastomer Base </td><td> Dow Corning </td><td> 68037-59-2 </td><td> Karıştırıldıktan sonra, yavaş yavaş rotator koyarak ya da 30 dakika veya daha fazla oturmak için izin yükselmeye baloncuklar için izin verir. </td></tr><tr><td> Paslanmaz Çelik Minutien Pins </td><td> Güzel Bilim Araçları </td><td> 26002-10 </td><td> Yaklaşık kesin. Düzenli makas ile uzunluğu 3-4mm </td></tr><tr><td> Laminektomi Forseps (pinleri açgözlü Blunt-Kullanılmış) </td><td> Güzel Bilim araçları </td><td> 11223-20 </td><td> Pimleri açgözlü künt forseps olarak kullanın </td></tr><tr><td> Diseksiyon Forseps </td><td> Dünya Hassas Aletler </td><td> 501985 </td><td></td></tr><tr><td> SuperFine Vannas Makas, uzun 8cm </td><td> Dünya Hassas Aletler </td><td> 501778 </td><td></td></tr><tr><td> Mouse anti-BRP antikor </td><td> DSHB </td><td> NC82 </td><td> 01:50 seyreltme kullanın. </td></tr><tr><td> Cy3 Affinipure Keçi Anti-Horseradish Peroksidaz </td><td> Jackson Immunoresearch </td><td> 123-165-021 </td><td> 1:200 oranında seyreltildiğinde </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 488 keçi anti-fare IgG </td><td> Invitrogen </td><td> A11001 </td><td> Yaklaşık kullanın. 1:200 oranında seyreltildiğinde </td></tr></tbody></table>

dissection and imaging of active zones in the drosophila neuromuscular junction

Drosophila larvaları nöromüsküler bileşke (NMJ) sinaptik yapısı ve fonksiyonu çalışma için mükemmel bir model. Drosophila güçlü genetik manipülasyonlar ve larva sinir sisteminin normal işlev sadece eğitim özellikle yararlı değil, aynı zamanda tedirginlikler kolaylığı için iyi bilinir bazı nörolojik hastalığı (Lloyd ve Taylor, 2010) eşlik ediyor. Drosophilia&#39;daki bulunan birçok anahtar sinaptik moleküller de, memeli canlılarda bulunan ve en çok CNS sinaps eksitatör memelilerde olduğu gibi, Drosophila NMJ glutamaterjik ve aktivite bağımlı remodeling (Koh ve ark, 2000 ) gösteriyor. Innervasyonu desen mümkün motor nöronlar ve vücut duvarı kas lifleri arasında bu gibi tespit sinaptik terminalleri, innerve (Keshishian ve Kim, 2004). Çalışma stereotipik ve yineleyici çünkü Ayrıca, Drosophila nöronların tek tek tespit edilebilir , Birlikte genetik ve fiziksel manipülasyon kolaylığı evrimsel olarak korunmuş sinaps bileşenlerinin varlığı sinaptik fonksiyon (Budnik 1996) altında yatan mekanizmaları araştıran Drosophila modeli ideal hale getirir . Sinaptik terminallerde aktif bölgeleri, bu nörotransmitter serbest siteleri, çünkü özellikle ilgisini çekmektedir. NC82 Drosophila protein Bruchpilot (BRP), aktif bölgesi (Wagh ve ark, 2006) önemli bir bileşeni olan bir CAST1/ERC aile üyesi tanıyan bir monoklonal antikor. BRP doğrudan aktif bölge T-bar şekline ve etkili bir şekilde Ca 2 kümeleme sorumlu + T-bar yoğunluğu altında kanallar (Fouquet ve ark, 2009). BRP, Mutants azalttı Ca 2 + kanal yoğunluğu, depresif uyarılmış vezikül serbest, ve değişen kısa vadeli plastisite (Kittel ve ark, 2006). Drosophila hastalık modellerinde aktif bölgeleri değişiklikler gözlenmiştir. Örneğin, NC82 antikor kullanarak immünofloresan aktif bölge yoğunluğu Amyotrofik lateral skleroz ve Pitt-Hopkins sendromu (. Zweier ve ark, 2009. Ratnaparkhi ve ark, 2008) modelleri azaldığını gösterdi. Böylece, hastalığın Drosophila larvaları modelleri aktif bölgeleri, ya da diğer sinaptik protein, değerlendirilmesi, sinaptik bir kusurun varlığı için değerli bir başlangıç ​​ipucu verebilir. NMJ immünofloresan analiz için tüm montaj disseke Drosophila larvaları hazırlanması biraz beceri gerektirir, ama en küçük bir uygulama ile bilim adamları tarafından yapılabilir. Sunan her genotip arasında çevresel farklılıklar sınırlayıcı ve tekrarlanabilirlik güven ve istatistiksel analiz için yeterli hayvanların sağlayan, aynı diseksiyon çanak disseke ve immunohistokimyasal olarak birden fazla larva sağlayan bir yöntem.

Watch this Scientific Journal Video about Dissection and Imaging of Active Zones in the Drosophila Neuromuscular Junction at JoVE.com

Dissection and Imaging of Active Zones in the Drosophila Neuromuscular Junction

Nöromüsküler bileşke (NMJ)<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Normal sinaptik fonksiyonu yanı sıra bazı nörolojik hastalıklar bulunan sinaptik fonksiyon için tedirginlikler eğitimi için önemli bir model sistem. Biz diseksiyonu için bir protokol mevcut<em&gt; Drosophila</emNMJ içinde aktif bölge proteinlerin&gt; larva motor sistemi ve immün.

Aktif Bölgeleri Diseksiyon ve Görüntüleme Drosophila Nöromüsküler Junction

The Drosophila  larvae neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model for the study of synaptic structure and function. Drosophila  is well known for ...

dissection-imaging-active-zones-drosophila-neuromuscular

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dissection and Imaging of Active Zones in the Drosophila Neuromuscular Junction

15.3K Görüntüleme.  St. Jude Children’s Research Hospital. Nöromüsküler bileşke (NMJ) Drosophila melanogaster Normal sinaptik fonksiyonu yanı sıra bazı nörolojik hastalıklar bulunan sinaptik fonksiyon için tedirginlikler eğitimi için önemli bir model sistem. Biz diseksiyonu için bir protokol mevcut Drosophila larva motor sistemi ve immün.

Video: Dissection and Imaging of Active Zones in the Drosophila Neuromuscular Junction

Single Drosophila Ommatidium Dissection and Imaging

The fruit fly Drosophila melanogaster has made invaluable contributions to neuroscience research and has been used widely as a model for neurodegenerative diseases because of its powerful genetics1. The fly eye in particular has been the organ of choice for neurodegeneration research, being the most accessible and life-dispensable part of the Drosophila nervous system. However the major caveat of intact eyes is the difficulty, because of the intense autofluorescence of the pigment, in imaging intracellular events, such as autophagy dynamics2, which are paramount to understanding of neurodegeneration.
We have recently used the dissection and culture of single ommatidia3 that has been essential for our understanding of autophagic dysfunctions in a fly model of Dentatorubro-Pallidoluysian Atrophy (DRPLA)3, 4.
We now report a comprehensive description of this technique (Fig. 1), adapted from electrophysiological studies5, which is likely to expand dramatically the possibility of fly models for neurodegeneration. This method can be adapted to image live subcellular events and to monitor effective drug administration onto photoreceptor cells (Fig. 2). If used in combination with mosaic techniques6-8, the responses of genetically different cells can be assayed in parallel (Fig. 2).

Single Drosophila Ommatidium Dissection and Imaging

The limiting factor in the use of the adult Drosophila eye to study neurodegeneration and cell biology is the difficult imaging of intracellular processes. We describe the dissection of single ommatidia to generate a bona-fide primary neuronal cell culture, which can be subject to drug treatment and advanced imaging.

Tek Drosophila Ommatidium Diseksiyon ve Görüntüleme

The fruit fly Drosophila melanogaster has made invaluable contributions to neuroscience research and has been used widely as a model for neurodegenerative ...

Nörobilim

Sequential Photo-bleaching to Delineate Single Schwann Cells at the Neuromuscular Junction

Sequential photo-bleaching provides a non-invasive way to label individual SCs at the NMJ. The NMJ is the largest synapse of the mammalian nervous system and has served as guiding model to study synaptic structure and function. In mouse NMJs motor axon terminals form pretzel-like contact sites with muscle fibers. The motor axon and its terminal are sheathed by SCs. Over the past decades, several transgenic mice have been generated to visualize motor neurons and SCs, for example Thy1-XFP1 and Plp-GFP mice2, respectively.
Along motor axons, myelinating axonal SCs are arranged in non-overlapping internodes, separated by nodes of Ranvier, to enable saltatory action potential propagation. In contrast, terminal SCs at the synapse are specialized glial cells, which monitor and promote neurotransmission, digest debris and guide regenerating axons. NMJs are tightly covered by up to half a dozen non-myelinating terminal SCs - these, however, cannot be individually resolved by light microscopy, as they are in direct membrane contact3.
Several approaches exist to individually visualize terminal SCs. None of these are flawless, though. For instance, dye filling, where single cells are impaled with a dye-filled microelectrode, requires destroying a labelled cell before filling a second one. This is not compatible with subsequent time-lapse recordings3. Multi-spectral "Brainbow" labeling of SCs has been achieved by using combinatorial expression of fluorescent proteins4. However, this technique requires combining several transgenes and is limited by the expression pattern of the promoters used. In the future, expression of "photo-switchable" proteins in SCs might be yet another alternative5. Here we present sequential photo-bleaching, where single cells are bleached, and their image obtained by subtraction. We believe that this approach - due to its ease and versatility - represents a lasting addition to the neuroscientist's technology palette, especially as it can be used in vivo and transferred to others cell types, anatomical sites or species6.
In the following protocol, we detail the application of sequential bleaching and subsequent confocal time-lapse microscopy to terminal SCs in triangularis sterni muscle explants. This thin, superficial and easily dissected nerve-muscle preparation7,8 has proven useful for studies of NMJ development, physiology and pathology9. Finally, we explain how the triangularis sterni muscle is prepared after fixation to perform correlated high-resolution confocal imaging, immunohistochemistry or ultrastructural examinations.

Visualizing individual cells in densely packed tissues, such as terminal Schwann cells (SCs) at neuromuscular junctions (NMJs), is challenging. "Sequential photo-bleaching" allows delineating single terminal SCs, for instance in the triangularis sterni muscle explant, a convenient nerve-muscle preparation, where sequential bleaching can be combined with time-lapse imaging and post-hoc immunostainings.

Sıralı Nöromusküler Kavşağı&#39;nda Tek Schwann Hücreleri belirginleştiren Photo-beyazlatma

Sequential photo-bleaching provides a non-invasive way to label individual SCs at the NMJ. The NMJ is the largest synapse of the mammalian nervous system ...

Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

Analysis of neuromuscular junction morphology can give important insight into the physiological status of a given motor neuron. Analysis of thin flat muscles can offer significant advantage over traditionally used thicker muscles, such as those from the hind limb (e.g. gastrocnemius). Thin muscles allow for comprehensive overview of the entire innervation pattern for a given muscle, which in turn permits identification of selectively vulnerable pools of motor neurons. These muscles also allow analysis of parameters such as motor unit size, axonal branching, and terminal/nodal sprouting. A common obstacle in using such muscles is gaining the technical expertise to dissect them. In this video, we detail the protocol for dissecting the transversus abdominis (TVA) muscle from young mice and performing immunofluorescence to visualize axons and neuromuscular junctions (NMJs). We demonstrate that this technique gives a complete overview of the innervation pattern of the TVA muscle&#160;and can be used to investigate NMJ pathology in a mouse model of the childhood motor neuron disease, spinal muscular atrophy.

Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

In this video we demonstrate a protocol for dissection of the transversus abdominis muscle of the mouse and use immunofluorescence and microscopy to visualize neuromuscular junctions.

Tüm Montajlı Nöromüsküler Kavşak Analizi için Enine Abdominis Kasının Diseksiyonu

Analysis of neuromuscular junction morphology can give important insight into the physiological status of a given motor neuron. Analysis of thin flat ...

Detection of In Situ Protein-protein Complexes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction Using Proximity Ligation Assay

Discs large (Dlg) is a conserved member of the membrane-associated guanylate kinase family, and serves as a major scaffolding protein at the larval neuromuscular junction (NMJ) in Drosophila. Previous studies have shown that the postsynaptic distribution of Dlg at the larval NMJ overlaps with that of Hu-li tai shao (Hts), a homologue to the mammalian adducins. In addition, Dlg and Hts are observed to form a complex with each other based on co-immunoprecipitation experiments involving whole adult fly lysates. Due to the nature of these experiments, however, it was unknown whether this complex exists specifically at the NMJ during larval development.
Proximity Ligation Assay (PLA) is a recently developed technique used mostly in cell and tissue culture that can detect protein-protein interactions in situ. In this assay, samples are incubated with primary antibodies against the two proteins of interest using standard immunohistochemical procedures. The primary antibodies are then detected with a specially designed pair of oligonucleotide-conjugated secondary antibodies, termed PLA probes, which can be used to generate a signal only when the two probes have bound in close proximity to each other. Thus, proteins that are in a complex can be visualized. Here, it is demonstrated how PLA can be used to detect in situ protein-protein interactions at the Drosophila larval NMJ. The technique is performed on larval body wall muscle preparations to show that a complex between Dlg and Hts does indeed exist at the postsynaptic region of NMJs.

Detection of In Situ Protein-protein Complexes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction Using Proximity Ligation Assay

This protocol demonstrates how Proximity Ligation Assay can be used to detect in situ protein-protein interactions at the Drosophila larval neuromuscular junction. With this technique, Discs large and Hu-li tai shao are shown to form a complex at the postsynaptic region, an association previously identified through co-immunoprecipitation.

Algılama<em&gt; In Situ</emEn&gt; Protein-protein kompleksleri<em&gt; Drosophila</emProximity ligasyon Testi Kullanımı&gt; Larva Nöromüsküler Junction

Discs large (Dlg) is a conserved member of the membrane-associated guanylate kinase family, and serves as a major scaffolding protein at the larval ...

The Neuromuscular Junction: Measuring Synapse Size, Fragmentation and Changes in Synaptic Protein Density Using Confocal Fluorescence Microscopy

The neuromuscular junction (NMJ) is the large, cholinergic relay synapse through which mammalian motor neurons control voluntary muscle contraction. Structural changes at the NMJ can result in neurotransmission failure, resulting in weakness, atrophy and even death of the muscle fiber. Many studies have investigated how genetic modifications or disease can alter the structure of the mouse NMJ. Unfortunately, it can be difficult to directly compare findings from these studies because they often employed different parameters and analytical methods. Three protocols are described here. The first uses maximum intensity projection confocal images to measure the area of acetylcholine receptor (AChR)-rich postsynaptic membrane domains at the endplate and the area of synaptic vesicle staining in the overlying presynaptic nerve terminal. The second protocol compares the relative intensities of immunostaining for synaptic proteins in the postsynaptic membrane. The third protocol uses Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) to detect changes in the packing of postsynaptic AChRs at the endplate. The protocols have been developed and refined over a series of studies. Factors that influence the quality and consistency of results are discussed and normative data are provided for NMJs in healthy young adult mice.

The neuromuscular junction (NMJ) is altered in a variety of conditions that can sometimes culminate in synaptic failure. This report describes fluorescence microscope-based methods to quantify such structural changes.

Nöromusküler Kavşak: Ölçme Synapse Boyut, Konfokal Floresan Mikroskobu kullanılarak sinaptik Protein Yoğunluk Parçalanma ve Değişiklikler

The neuromuscular junction (NMJ) is the large, cholinergic relay synapse through which mammalian motor neurons control voluntary muscle contraction. ...

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Most studies on morphogenesis rely on qualitative descriptions of how anatomical traits are affected by the disruption of specific genes and genetic pathways. Quantitative descriptions are rarely performed, although genetic manipulations produce a range of phenotypic effects and variations are observed even among individuals within control groups.&#160;Emerging evidence shows that morphology, size and location of organelles play a previously underappreciated, yet fundamental role in cell function and survival. Here we provide step-by-step instructions for performing quantitative analyses of phenotypes at the Drosophila larval neuromuscular junction (NMJ). We use several reliable immuno-histochemical markers combined with bio-imaging techniques and morphometric analyses to examine the effects of genetic mutations on specific cellular processes. In particular, we focus on the quantitative analysis of phenotypes affecting morphology, size and position of nuclei within the striated muscles of Drosophila larvae. The Drosophila larval NMJ is a valuable experimental model to investigate the molecular mechanisms underlying the structure and the function of the neuromuscular system, both in health and disease. However, the methodologies we describe here can be extended to other systems as well.

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Morphology, size and location of intracellular organelles are evolutionarily conserved and appear to directly affect their function. Understanding the molecular mechanisms underlying these processes has become an important goal of modern biology. Here we show how these studies can be facilitated by the application of quantitative techniques.

En fenotip Karakterizasyonu: Niceleme Matters Neden<em&gt; Drosophila</em&gt; Larva Nöromüsküler Junction

Most studies on morphogenesis rely on qualitative descriptions of how anatomical traits are affected by the disruption of specific genes and genetic ...

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the molecular and cellular basis of higher brain functions. A whole-mount preparation of adult brains with well-preserved morphology is critical for such whole brain-based studies, but can be technically challenging and time-consuming. This protocol describes an easy-to-learn, one-step dissection approach of an adult fly head in less than 10 s, while keeping the intact brain attached to the rest of the body to facilitate subsequent processing steps. The procedure helps remove most of the eye and tracheal tissues normally associated with the brain that can interfere with the later imaging step, and also places less demand on the quality of the dissecting forceps. Additionally, we describe a simple method that allows convenient flipping of the mounted brain samples on a coverslip, which is important for imaging both sides of the brains with similar signal intensity and quality. As an example of the protocol, we present an analysis of dopaminergic (DA) neurons in adult brains of WT (w1118) flies. The high efficacy of the dissection method makes it particularly useful for large-scale adult brain-based studies in Drosophila.

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

The adult Drosophila brain is a valuable system for studying neuronal circuitry, higher brain functions, and complex disorders. An efficient method to dissect whole brain tissue from the small fly head will facilitate brain-based studies. Here we describe a simple, one-step dissection protocol of adult brains with well-preserved morphology.

Basit Bir adım Yetişkin Tüm montaj Hazırlama Diseksiyon Protokolü<em&gt; Drosophila</em&gt; Brain

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the ...

Measuring Neuromuscular Junction Functionality

Neuromuscular junction (NMJ) functionality plays a pivotal role when studying diseases in which the communication between motor neuron and muscle is impaired, such as aging and amyotrophic lateral sclerosis (ALS). Here we describe an experimental protocol that can be used to measure NMJ functionality by combining two types of electrical stimulation: direct muscle membrane stimulation and the stimulation through the nerve. The comparison of the muscle response to these two different stimulations can help to define, at the functional level, potential alterations in the NMJ that lead to functional decline in muscle.
Ex vivo preparations are suited to well-controlled studies. Here we describe an intensive protocol to measure several parameters of muscle and NMJ functionality for the soleus-sciatic nerve preparation and for the diaphragm-phrenic nerve preparation. The protocol lasts approximately 60 min and is conducted uninterruptedly by means of a custom-made software that measures the twitch kinetics properties, the force-frequency relationship for both muscle and nerve stimulations, and two parameters specific to NMJ functionality, i.e. neurotransmission failure and intratetanic fatigue. This methodology was used to detect damages in soleus and diaphragm muscle-nerve preparations by using SOD1G93A transgenic mouse, an experimental model of ALS that ubiquitously overexpresses the mutant antioxidant enzyme superoxide dismutase 1 (SOD1).

A functional assessment of the neuromuscular junction (NMJ) can provide essential information on the communication between muscle and nerve. Here we describe a protocol to comprehensively evaluate both the NMJ and muscle functionality using two different muscle-nerve preparations, i.e. soleus-sciatic and diaphragm-phrenic.

Nöromüsküler kavşak işlevleri ölçme

Neuromuscular junction (NMJ) functionality plays a pivotal role when studying diseases in which the communication between motor neuron and muscle is ...

Two Algorithms for High-throughput and Multi-parametric Quantification of Drosophila Neuromuscular Junction Morphology

Synaptic morphology is tightly related to synaptic efficacy, and in many cases morphological synapse defects ultimately lead to synaptic malfunction. The Drosophila larval neuromuscular junction (NMJ), a well-established model for glutamatergic synapses, has been extensively studied for decades. Identification of mutations causing NMJ morphological defects revealed a repertoire of genes that regulate synapse development and function. Many of these were identified in large-scale studies that focused on qualitative approaches to detect morphological abnormalities of the Drosophila NMJ. A drawback of qualitative analyses is that many subtle players contributing to NMJ morphology likely remain unnoticed. Whereas quantitative analyses are required to detect the subtler morphological differences, such analyses are not yet commonly performed because they are laborious. This protocol describes in detail two image analysis algorithms "Drosophila NMJ Morphometrics" and "Drosophila NMJ Bouton Morphometrics", available as Fiji-compatible macros, for quantitative, accurate and objective morphometric analysis of the Drosophila NMJ. This methodology is developed to analyze NMJ terminals immunolabeled with the commonly used markers Dlg-1 and Brp. Additionally, its wider application to other markers such as Hrp, Csp and Syt is presented in this protocol. The macros are able to assess nine morphological NMJ features: NMJ area, NMJ perimeter, number of boutons, NMJ length, NMJ longest branch length, number of islands, number of branches, number of branching points and number of active zones in the NMJ terminal.

Two Algorithms for High-throughput and Multi-parametric Quantification of Drosophila Neuromuscular Junction Morphology

Two image analysis algorithms, "Drosophila NMJ Morphometrics" and "Drosophila NMJ Bouton Morphometrics" were created, to automatically quantify nine morphological features of the Drosophila neuromuscular junction (NMJ).

Yüksek throughput ve Çok parametrik Nicelik için iki Algoritmalar<em&gt; Drosophila</em&gt; Nöromusküler Junction Morfoloji

Synaptic morphology is tightly related to synaptic efficacy, and in many cases morphological synapse defects ultimately lead to synaptic malfunction. The ...

Focal Macropatch Recordings of Synaptic Currents from the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model system to study glutamatergic synaptic transmission. We describe the technique of focal macropatch recordings of synaptic currents from visualized boutons at the Drosophila larval NMJ. This technique requires customized fabrication of recording micropipettes, as well as a compound microscope equipped with a high magnification, long-distance water immersion objective, differential interference contrast (DIC) optics, and a fluorescent attachment. The recording electrode is positioned on the top of a selected synaptic bouton visualized with DIC optics, epi-fluorescence, or both. The advantage of this technique is that it allows monitoring the synaptic activity of a limited number of sites of release. The recording electrode has&#160;a diameter of several microns, and the release sites positioned outside of the electrode rim do&#160;not significantly affect the recorded currents. The recorded synaptic currents have fast kinetics and can be readily resolved. These advantages are especially important for the studies of mutant fly lines with enhanced spontaneous or asynchronous synaptic activity.

Focal Macropatch Recordings of Synaptic Currents from the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Synaptic currents can be recorded focally from visualized synaptic boutons at the Drosophila third instar larvae neuromuscular junction. This technique enables monitoring the activity of a single synaptic bouton.

Drosophila larva nöromüsküler kavşak sinaptik akımlardan Fokal Macropatch kayıtları

Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model system to study glutamatergic synaptic transmission. We describe the technique of focal ...