עבודה זו מומנה על ידי משפחת סמית פרס למצוינות מחקר ביו NIH RO1 AI083426-01 (FW). פטריק Maschmeyer ומלאני Flach נתמכים על ידי מלגות PhD מן Boehringer Ingelheim קרן.

C57BL עכברים / 6 יש להשתמש ב ~ 20 שבועות ומעלה. השימוש עכברים זכרים במשקל של 25-30G מומלץ. התשואה של תאים stellate יכולה להיות מוגברת על ידי האכלה לעכברים דיאטה מועשר בויטמין עבור 2 חודשים לפני stellate בידוד התא. כ 2x10 5 stellate תאים בכבד יכולה להיות מטוהרים מהכבד של העכבר C57BL / 6 אחת, בעוד התשואה של תאים stellate מ Balb / c עכברים גבוה במידה ניכרת. פרוטוקול הבאים מותאם 5 עכברים. טיפול בבעלי חיים ניסויים בוצעו בהתאם טיפול בבעלי חיים אישרה מוסדיים ועדת פרוטוקולים שימוש. 1. זלוף באתרו של כבדי עכבר עם אנזימי עיכול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חם החיץ sc1 ו זלוף פתרונות האנזים אמבט מים 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר עירוי מכונף להגדיר על צינור סיליקון של משאבה peristaltic. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כייל את המשאבה עם PBS להשיג תזרים למינרית של 6.5ml/min, המהווה את קצב הזרימה כי ישמש ב זלוף באתרו של הכבד. לאזן את צינור סיליקון עם פתרון sc1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את העכבר באמצעות זריקה intraperitoneal של קטמין (90 מ&quot;ג / ק&quot;ג) ו Xylazine (10 מ&quot;ג / ק&quot;ג) פתרון מבחן עבור אובדן הרפלקסים, כדי להבטיח הרדמה עמוקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן את העכבר בעמדת פרקדן על בסיס מתאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש מספריים מלקחיים לבצע חתך אורכי בעור הבטן ולחשוף את הצפק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות לפתוח את הצפק ולהעביר את המעיים מתוך חלל הבטן בצד שמאל של החיה על מנת לחשוף את וריד השער. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את צינורית של אינפוזיה לווריד להגדיר את הפורטל. במשך שלב זה, השימוש stereomicroscope מומלץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את זלוף של הכבד עם פתרון sc1 30 מ&quot;ל. פתח את הווריד הנבוב נחות מיד לאחר שיזם את הזרימה. שטיפה מוצלחת של הכבד הוא הצביע על ידי הפסד של צבע של רקמת הכבד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Perfuse את הכבד עם פתרון Pronase 30 מ&quot;ל E. לאחר עיכול מוצלח, האונות בכבד יהיה להתנפח, האוניות יופיע נפרדות באמצעות הקפסולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Perfuse את הכבד עם פתרון collagenase 30 מ&quot;ל P. הכבד בשלב זה איבד את צורתו נראה טונוס אמורפי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות להפריד את הכבד מן הסרעפת והאיברים המקיפים ולאחסן אותו פתרון 70ml SC2 על הקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על התהליך עבור עכברים נוספים. </li></ol> 2. בשנת עיכול חוץ גופית של כבדי העכבר צעדים כל עובד נוסף צריך להתבצע בתנאים סטריליים במנדף זרימה למינרית. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את הכבדים לחתיכות של כ 3 2x2x2mm באמצעות מספריים חדים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את השעיית 70ml SC2 כולל חתיכות כבד עם 50 מ&quot;ל של תמיסת E-collagenase Pronase P ולהוסיף 1ml של תמיסת אני DNase. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקציר את הכבדים עבור 20min ב 37 ° C תוך ערבוב. </li></ol> 3. שיפוע צפיפות צנטריפוגה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סנן את ההשעיה התא דרך מסננות לתוך תא 70μm 6 צינורות פלקון 50 מ&quot;ל ולהוסיף לה עד 50 מ&quot;ל עם חיץ SC2. צנטריפוגה עבור 10min ב 600g ו 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב בזהירות 40ml של supernatant, ולאחר מכן להוסיף 150μl פתרון DNase אני לצינור כל resuspend התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בריכת השעיות התא לתוך 4 מבחנות פלקון 50 מ&quot;ל ולשטוף עם GBSS-B, צנטריפוגה עבור 10min ב 600g ו 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות לשאוב כמה שיותר supernatant ככל האפשר מבלי להפריע גלולה ולהוסיף 150μl DNase פתרון אני על צינור אחד. Resuspend את כדורי תא 10ml GBSS-B לכל צינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בריכת התאים לתוך 50 מ&quot;ל 2 צינורות פלקון ולהוסיף GBSS-B כדי בהיקף כולל של 36ml לכל צינור. הוסף פתרון 14ml Nycodenz אל צינור כל ומערבבים היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברה של 10 מ&quot;ל ההשעיה תא לאחת צינור 12ml צנטריפוגה שיפוע, וכתוצאה מכך 10 צינורות בסך הכל. בעדינות כיסוי על השעיית התא עם צינור 1.5ml לכל GBSS-B. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה הדרגתיים עבור 15min ב 1500g ו - 4 ° C ללא בלם. לאחר מכן, hepatocytes יהיה pelleted בתחתית הצינור ואילו תאים stellate נמצאים שלבי הביניים כמו טבעת לבנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות הקציר שלבי הביניים המכיל את התאים stellate לשטוף אותם עם GBSS-B; צנטריפוגות עבור 10min ב 600g ו 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב supernatant ו resuspend התאים DMEM 20ml בתוספת חום מומת 10% FBS, HEPES 1% פניצילין / סטרפטומיצין, 2mm L-גלוטמין, pyruvate 1mm נתרן 10mm. העברת התאים לתוך צלוחיות תרבות רקמות עם ריכוז של 2x10 4 תאים / 2 ס&quot;מ. דגירה התאים ב 37 ° C ו 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שנה את התקשורת ברגע stellate תאים בכבד הם חסיד (כ 2h לאחר ההכנה) כדי לשטוף תאים מתים ופסולת תאית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת, התא stellateזה צריך לפתח בצורת כוכב המורפולוגיה האופיינית שלהם עם perinuclear ויטמין A-אחסון שלפוחית ​​השומנים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בניסויים עוקבים, stellate תאים בכבד יכול בקלות להיות מנותקת מן הלא מצופה משטחי הפלסטיק באמצעות פתרונות אנזימטי מתון כגון Accutase, למשל </li></ol> 4. נציג תוצאות: בעקבות הכנת stellate תאים בכבד באמצעות פרוטוקול בתנאי, טוהר האוכלוסייה מבודדים ניתן לבדוק בהתחשב שלושת המאפיינים העיקריים של סוג זה התא, כגון צורת כוכב דמוי טיפות השומנים perinuclear, וביטוי של החלבון גליה חומצי fibrillary (GFAP ). התמונות נציג להופעת אופייני stellate 2h הכבד תאים לאחר בידוד התא, כמו גם ביום 1 ו -3 בתרבות במבחנה מתוארים באיור 1. איור 2 מראה מכתים immunofluorescence נציג GFAP ב stellate תאים בכבד, אשר היו בתרבית במשך 3 ימים לאחר בידוד התא. Stellate התאים להתמיין לתאי הכבד myofibroblastic במהלך בתרבות חוץ גופית. סימן ההיכר האופייני של תאים אלה מופעלים stellate היא הביטוי של אלפא חלקה השריר אקטין (αSMA). איור 3 מראה מכתים immunofluorescence עבור אסמא ו שרירן IIA בתאי stellate מופעל על יום של 7 בתרבות חוץ גופית. <img src="/files/ftp_upload/2710/2710fig1.jpg" alt="איור 1" /> באיור 1. מורפולוגיה אופיינית של תאים stellate הכבד. תאים Stellate נותקו מן הכבדים העכבר באמצעות פרוטוקול סיפק. התמונות מתארות stellate תאים 2h לאחר בידוד תא (a, b), כמו גם ביום 1 (ג) ו - יום 3 (ד) בתרבות חוץ גופית. Stellate תאים כבדית התערוכה כמויות גבוהות של שומנים בדם שלפוחית ​​באתרים perinuclear ולרכוש האסטרלי כמו מורפולוגיה ייחודית שלהם בימים הראשונים של תרבות חוץ גופית (הגדלה 200x). <img src="/files/ftp_upload/2710/2710fig2.jpg" alt="איור 2" /> איור 2. Stellate תאים כבדית במיוחד להביע GFAP בכבד. תאים Stellate בודדו ומוכתמת immunofluorescently עבור GFAP (אדום) ביום 3 של תרבות חוץ גופית. גרעין התא מתוארים כחול (Hoechst כתם). <img src="/files/ftp_upload/2710/2710fig3.jpg" alt="איור 3" /> איור 3. Stellate בתאי הכבד להתמיין myofibroblasts. Stellate כבדית תאים מבודדים מעכברים C57BL / 6 היו בתרבית למשך 7 ימים. לאחר מכן, הם הועברו שקופיות קאמרית מוכתם עבור אסמא (באדום) ו שרירן IIA (המתואר ירוק). גרעין התא היו counterstained עם Hoechst (כחול). <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td colspan="2"> Sc1 הצפת </td></tr><tr><td> EGTA </td><td> 190mg </td></tr><tr><td> גלוקוז </td><td> 900mg </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 10 מ&quot;ל של תמיסת מניות 1M </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 400mg </td></tr><tr><td> Na 2 HPO 4 x 2 H 2 O </td><td> 151mg </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 8G </td></tr><tr><td> לאא 2 PO 4 x H 2 O </td><td> 78mg </td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> 350mg </td></tr><tr><td> פנול אדום </td><td> 6mg </td></tr><tr><td> DH 2 O </td><td> ממלאים עד 1 ליטר </td></tr><tr><td colspan="2"> SC2 הצפת </td></tr><tr><td> CaCl 2 x 2H 2 O </td><td> 560mg </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 10 מ&quot;ל של תמיסת מניות 1M </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 400mg </td></tr><tr><td> Na 2 HPO 4 x 2 H 2 O </td><td> 151mg </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 8G </td></tr><tr><td> לאא 2 PO 4 x H 2 O </td><td> 78mg </td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> 350mg </td></tr><tr><td> פנול אדום </td><td> 6mg </td></tr><tr><td> DH 2 O </td><td> ממלאים עד 1 ליטר </td></tr><tr><td colspan="2"> GBSS-Buffer </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 370mg </td></tr><tr><td> CaCl 2 x 2H 2 O </td><td> 225mg </td></tr><tr><td> גלוקוז </td><td> 991mg </td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> 30mg </td></tr><tr><td> MgCl 2 x 6 H 2 O </td><td> 210mg </td></tr><tr><td> MgSO 4 x 7 H 2 O </td><td> 70mg </td></tr><tr><td> Na 2 HPO 4 x 2 H 2 O </td><td> 75 מ&quot;ג </td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> 227mg </td></tr><tr><td> פנול אדום </td><td> 6mg </td></tr><tr><td> DH 2 O </td><td> ממלאים עד 1 ליטר </td></tr><tr><td colspan="2">GBSS B-Buffer </td></tr><tr><td> CaCl 2 x 2H 2 O </td><td> 225mg </td></tr><tr><td> גלוקוז </td><td> 991mg </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 370mg </td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> 30mg </td></tr><tr><td> MgCl 2 x 6 H 2 O </td><td> 210mg </td></tr><tr><td> MgSO 4 x 7 H 2 O </td><td> 70mg </td></tr><tr><td> Na 2 HPO 4 x 2 H 2 O </td><td> 75 מ&quot;ג </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 8G </td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> 227mg </td></tr><tr><td> פנול אדום </td><td> 6mg </td></tr><tr><td> DH 2 O </td><td> ממלאים עד 1 ליטר </td></tr><tr><td colspan="2"> זלוף Pronase E פתרון </td></tr><tr><td> Pronase E </td><td> 100 מ&quot;ג (4,000 PU / מ&quot;ג דקות) </td></tr><tr><td> SC2 הצפת </td><td> 200 מ&quot;ל </td></tr><tr><td colspan="2"> Collagenase P פתרון זלוף </td></tr><tr><td> Collagenase P </td><td> 85mg (1.78 U / מ&quot;ג איו) </td></tr><tr><td> SC2 הצפת </td><td> 200 מ&quot;ל </td></tr><tr><td colspan="2"> Pronase E-collagenase P פתרון </td></tr><tr><td> Pronase E </td><td> 50 מ&quot;ג (4,000 PU / מ&quot;ג דקות) </td></tr><tr><td> Collagenase P </td><td> 85mg (1.78 U / מ&quot;ג איו) </td></tr><tr><td> SC2 הצפת </td><td> 50 מ&quot;ל </td></tr><tr><td colspan="2"> DNase פתרון אני </td></tr><tr><td> אני DNase </td><td> 6mg (2000U/mg בקירוב) </td></tr><tr><td> GBSS-B </td><td> 3ml </td></tr><tr><td colspan="2"> Nycodenz פתרון </td></tr><tr><td> Nycodenz </td><td> 8G </td></tr><tr><td> GBSS-A </td><td> 28ml </td></tr></tbody></table> טבלה 1. Buffers ופתרונות האנזים הדרוש בידוד של תאים stellate הכבד. ה-pH של חוצצי כל צריך להיות מותאם 7.3-7.4. יתר על כן, סינון סטרילי של חוצצי כל מומלץ. חשוב להתאים את כמות אנזים המשמש על פי הפעילות האנזימטית נתון.

<ol>
	<li>Friedman, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatic+stellate+cells:+protean,+multifunctional,+and+enigmatic+cells+of+the+liver.">Hepatic stellate cells: protean, multifunctional, and enigmatic cells of the liver.</a> Physiol Rev. 88, 125-172 (2008).</li><li>Geerts, A. H. i. s. t. o. r. y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=heterogeneity,+developmental+biology,+and+functions+of+quiescent+hepatic+stellate+cells.">heterogeneity, developmental biology, and functions of quiescent hepatic stellate cells.</a> Semin Liver Dis. 21, 311-335 (2001).</li><li>Gressner, A. M. &. a. m. p. ;. a. m. p., Weiskirchen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modern+pathogenetic+concepts+of+liver+fibrosis+suggest+stellate+cells+and+TGF-beta+as+major+players+and+therapeutic+targets.">Modern pathogenetic concepts of liver fibrosis suggest stellate cells and TGF-beta as major players and therapeutic targets.</a> J Cell Mol Med. 10, 76-99 (2006).</li><li>Reynaert, H., Thompson, M. G., Thomas, T., Geerts, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatic+stellate+cells:+role+in+microcirculation+and+pathophysiology+of+portal+hypertension.">Hepatic stellate cells: role in microcirculation and pathophysiology of portal hypertension.</a> Gut. 50, 571-581 (2002).</li><li>Winau, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ito+cells+are+liver-resident+antigen-presenting+cells+for+activating+T+cell+responses.">Ito cells are liver-resident antigen-presenting cells for activating T cell responses.</a> Immunity. 26, 117-129 (2007).</li><li>Minicis, S. D. e. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+profiles+during+hepatic+stellate+cell+activation+in+culture+and+in+vivo.">Gene expression profiles during hepatic stellate cell activation in culture and in vivo.</a> Gastroenterology. 132, 1937-1946 (2007).</li><li>Knittel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+liver+myofibroblasts+and+hepatic+stellate+cells+in+normal+and+diseased+rat+livers:+distinct+roles+of+(myo-)fibroblast+subpopulations+in+hepatic+tissue+repair.">Localization of liver myofibroblasts and hepatic stellate cells in normal and diseased rat livers: distinct roles of (myo-)fibroblast subpopulations in hepatic tissue repair.</a> Histochem Cell Biol. 112, 387-401 (1999).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

Stellate תאים כבדית לווסת תהליכים פיזיולוגיים חיוניים pathophysiological בכבד. יתר על כן, תאים בעלי תכונות stellate הצגת אנטיגן, טיוח אותם מרכיב חשוב של התגובה החיסונית בכבד. למרות stellate תאים בכבד מהווים 10-15% ממספר תאים הכולל בכבד, בידוד של תאים אלה הוא מאתגר בשל לוקליזציה שלהן בחלל perisi...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם מגיב </th><th> חברה </th><th> מס &#39;קטלוג </th></tr><tr><td> 70μm מסננת Cell </td><td> BD </td><td> 352350 </td></tr><tr><td> CaCL 2 x 2H 2 O </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> C3306 </td></tr><tr><td> Collagenase P </td><td> רוש </td><td> 11249002001 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Gibco </td><td> 11960 </td></tr><tr><td> אני DNase </td><td> רוש </td><td> 10104159001 </td></tr><tr><td> DPBS </td><td> Cellgro </td><td> 21-031-CV </td></tr><tr><td> EGTA </td><td> Fluka </td><td> 3777 </td></tr><tr><td> סרום שור עוברית </td><td> Gibco </td><td> 16000 </td></tr><tr><td> גלוקוז </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> G7528 </td></tr><tr><td> צנטריפוגה Gradient צינורות </td><td> גריינר Bio-One </td><td> 163160 </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Gibco </td><td> 15630 </td></tr><tr><td> KCl </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> P9541 </td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> P9791 </td></tr><tr><td> L-גלוטמין </td><td> Gibco </td><td> 25030 </td></tr><tr><td> MgCl 2 x 6 שעות 2 O </td><td> Fluka </td><td> 63068 </td></tr><tr><td> MgSO 4 x 7H 2 O </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> M2773 </td></tr><tr><td> Na 2 HPO 4 × 2H 2 O </td><td> Fluka </td><td> 71643 </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> S3014 </td></tr><tr><td> לאא 2 PO 4 x H 2 O </td><td> Fluka </td><td> 71507 </td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> Fluka </td><td> 71628 </td></tr><tr><td> Nycodenz </td><td> Accudenz AG </td><td> AN7050/BLK </td></tr><tr><td> פניצילין / סטרפטומיצין </td><td> Gibco </td><td> 15140 </td></tr><tr><td> Peristaltic משאבה </td><td> קול בן הזוג </td><td> HV-7523-70 </td></tr><tr><td> פנול אדום </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> P4633 </td></tr><tr><td> Pronase E </td><td> Calbiochem </td><td> 7433-2 </td></tr><tr><td> סיליקון Tube </td><td> Masterflex </td><td> HV-96440-14 </td></tr><tr><td> נתרן Pyruvate </td><td> Gibco </td><td> 11360 </td></tr><tr><td> תרבות רקמות צפחת (25cm 2) </td><td> BD </td><td> 353108 </td></tr><tr><td> עירוי מכונפת הגדר </td><td> Terumo </td><td> 1SV27EL </td></tr></tbody></table>

seven steps to stellate cells

Stellate תאים כבדית הם הכבד תושב מורפולוגיה של תאים דמויי כוכב ממוקמים בחלל Disse בין תאים בכבד סינוסי האנדותל 1,2 hepatocytes. תאים Stellate נגזרות מבשרי מח עצם לאחסן עד 80% של ויטמין הגוף הכולל 1, 2. עם ההפעלה, stellate תאים להתמיין myofibroblasts לייצר תאי מטריקס, ובכך לתרום לייפת הכבד 3. בהתבסס על יכולתם החוזה, תאים stellate myofibroblastic יכול לווסת את הטון כלי הדם הקשורים ליתר לחץ דם הפורטל 4. לאחרונה, הראינו כי stellate תאים בכבד הם תאים אנטיגן חזק הצגת ויכול להפעיל תאים NKT וכן לימפוציטים מסוג T קונבנציונאלי 5. כאן אנו מציגים שיטה להכנת יעילה של תאים בכבד stellate מהכבד העכבר. בשל לוקליזציה perisinusoidal שלהם, בידוד של תאים stellate הכבד הוא תהליך רב שלבי. על מנת להבהיר תאים stellate נגיש במנותק מן החלל של Disse, כבדי העכבר הם perfused באתרו עם אנזימי עיכול Pronase E ו collagenase זלוף פ בעקבות, רקמת הכבד נתונה טיפול אנזימטי נוסף עם Pronase E ו-P ב collagenase במבחנה. כתוצאה מכך, השיטה מנצלת את כמות מסיבית של ויטמין A, אחסון טיפות השומנים בתאי stellate הכבד. תכונה זו מאפשרת הפרדה של תאים stellate של סוגי תאים אחרים הכבד על ידי צנטריפוגה על שיפוע Nycodenz 8%. פרוטוקול המתואר כאן התשואות אוכלוסייה טהור מאוד הומוגני של תאים stellate. טוהר ההכנות ניתן להעריך על ידי מכתים את מולקולת חלבון סמן גליה חומצי fibrillary (GFAP), לפני הניתוח על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי או cytometry הזרימה. יתר על כן, במיקרוסקופ אור חושף את המראה הייחודי של בצורת כוכב stellate בתאי הכבד כי הנמל כמויות גדולות של טיפות השומנים. יחדיו, אנו מציגים פרוטוקול מפורט עבור בידוד יעיל של stellate בתאי הכבד, כולל תמונות של נציג המראה המורפולוגי שלהם ביטוי GFAP המסייעים להגדיר את הישות תא stellate.

Watch this Scientific Journal Video about Seven Steps to Stellate Cells at JoVE.com

Seven Steps to Stellate Cells

כאן אנו מתארים שיטת הבידוד של stellate בתאי הכבד מהכבד העכבר. עבור טיהור תא stellate, כבדי עכבר מתעכלים<em&gt; באתרו</em&gt; ו<em&gt; במבחנה</em&gt; על ידי טיפול pronase-collagenase לפני צנטריפוגה שיפוע צפיפות. טכניקה זו התשואות טהור מאוד stellate תאים בכבד.

שבעה צעדים Stellate תאים

Hepatic stellate cells are liver-resident  cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between  liver sinusoidal endothelial cells ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

33.5K Views.  Harvard Medical School. כאן אנו מתארים שיטת הבידוד של stellate בתאי הכבד מהכבד העכבר. עבור טיהור תא stellate, כבדי עכבר מתעכלים באתרו ו במבחנה על ידי טיפול pronase-collagenase לפני צנטריפוגה שיפוע צפיפות. טכניקה זו התשואות טהור מאוד stellate תאים בכבד.

Video: Seven Steps to Stellate Cells

Assessing Stomatal Response to Live Bacterial Cells using Whole Leaf Imaging

Stomata are natural openings in the plant epidermis responsible for gas exchange between plant interior and environment. They are formed by a pair of guard cells, which are able to close the stomatal pore in response to a number of external factors including light intensity, carbon dioxide concentration, and relative humidity (RH). The stomatal pore is also the main route for pathogen entry into leaves, a crucial step for disease development. Recent studies have unveiled that closure of the pore is effective in minimizing bacterial disease development in Arabidopsis plants; an integral part of plant innate immunity. Previously, we have used epidermal peels to assess stomatal response to live bacteria (Melotto et al. 2006); however maintaining favorable environmental conditions for both plant epidermal peels and bacterial cells has been challenging. Leaf epidermis can be kept alive and healthy with MES buffer (10 mM KCl, 25 mM MES-KOH, pH 6.15) for electrophysiological experiments of guard cells. However, this buffer is not appropriate for obtaining bacterial suspension. On the other hand, bacterial cells can be kept alive in water which is not proper to maintain epidermal peels for long period of times. When an epidermal peel floats on water, the cells in the peel that are exposed to air dry within 4 hours limiting the timing to conduct the experiment. An ideal method for assessing the effect of a particular stimulus on guard cells should present minimal interference to stomatal physiology and to the natural environment of the plant as much as possible. We, therefore, developed a new method to assess stomatal response to live bacteria in which leaf wounding and manipulation is greatly minimized aiming to provide an easily reproducible and reliable stomatal assay. The protocol is based on staining of intact leaf with propidium iodide (PI), incubation of staining leaf with bacterial suspension, and observation of leaves under laser scanning confocal microscope. Finally, this method allows for the observation of the same live leaf sample over extended periods of time using conditions that closely mimic the natural conditions under which plants are attacked by pathogens.

We have developed a simple and reproducible protocol to access stomatal response to live bacteria. This method minimizes wounding and manipulation of the leaf as compared to the use of epidermal peels reported previously.

הערכת התגובה הפיוניות לחיות תאים חיידקיים באמצעות הדמיה עלה שלמים

Stomata are natural openings in the plant epidermis responsible for gas exchange between plant interior and environment. They are formed by a pair of ...

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the simultaneous infection of the cell by a number of phages, one of two pathways is chosen: lytic (virulent) or lysogenic (dormant)3,4. We recently developed a method for fluorescently labeling individual phages, and were able to examine the post-infection decision in real-time under the microscope, at the level of individual phages and cells5. Here, we describe the full procedure for performing the infection experiments described in our earlier work5. This includes the creation of fluorescent phages, infection of the cells, imaging under the microscope and data analysis. The fluorescent phage is a "hybrid", co-expressing wild- type and YFP-fusion versions of the capsid gpD protein. A crude phage lysate is first obtained by inducing a lysogen of the gpD-EYFP (Enhanced Yellow Fluorescent Protein) phage, harboring a plasmid expressing wild type gpD. A series of purification steps are then performed, followed by DAPI-labeling and imaging under the microscope. This is done in order to verify the uniformity, DNA packaging efficiency, fluorescence signal and structural stability of the phage stock. The initial adsorption of phages to bacteria is performed on ice, then followed by a short incubation at 35&deg;C to trigger viral DNA injection6. The phage/bacteria mixture is then moved to the surface of a thin nutrient agar slab, covered with a coverslip and imaged under an epifluorescence microscope. The post-infection process is followed for 4 hr, at 10 min interval. Multiple stage positions are tracked such that ~100 cell infections can be traced in a single experiment. At each position and time point, images are acquired in the phase-contrast and red and green fluorescent channels. The phase-contrast image is used later for automated cell recognition while the fluorescent channels are used to characterize the infection outcome: production of new fluorescent phages (green) followed by cell lysis, or expression of lysogeny factors (red) followed by resumed cell growth and division. The acquired time-lapse movies are processed using a combination of manual and automated methods. Data analysis results in the identification of infection parameters for each infection event (e.g. number and positions of infecting phages) as well as infection outcome (lysis/lysogeny). Additional parameters can be extracted if desired.

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

This article describes the procedure for preparing a fluorescently-labeled version of bacteriophage lambda, infection of E. coli bacteria, following the infection outcome under the microscope, and analysis of infection results.

בעקבות Cell-גורל ב<em&gt; א coli</em&gt; לאחר זיהום על ידי phage מבדה

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the ...

A Modified EPA Method 1623 that Uses Tangential Flow Hollow-fiber Ultrafiltration and Heat Dissociation Steps to Detect Waterborne Cryptosporidium and Giardia spp.

Cryptosporidium and Giardia species are two of the most prevalent protozoa that cause waterborne diarrheal disease outbreaks worldwide. To better characterize the prevalence of these pathogens, EPA Method 1623 was developed and used to monitor levels of these organisms in US drinking water supplies 12. The method has three main parts; the first is the sample concentration in which at least 10 L of raw surface water is filtered. The organisms and trapped debris are then eluted from the filter and centrifuged to further concentrate the sample. The second part of the method uses an immunomagnetic separation procedure where the concentrated water sample is applied to immunomagnetic beads that specifically bind to the Cryptosporidium oocysts and Giardia cysts allowing for specific removal of the parasites from the concentrated debris. These (oo)cysts are then detached from the magnetic beads by an acid dissociation procedure. The final part of the method is the immunofluorescence staining and enumeration where (oo)cysts are applied to a slide, stained, and enumerated by microscopy.
Method 1623 has four listed sample concentration systems to capture Cryptosporidium oocysts and Giardia cysts in water: Envirochek filters (Pall Corporation, Ann Arbor, MI), Envirochek HV filters (Pall Corporation), Filta-Max filters (IDEXX, Westbrook, MA), or Continuous Flow Centrifugation (Haemonetics, Braintree, MA). However, Cryptosporidium and Giardia (oo)cyst recoveries have varied greatly depending on the source water matrix and filters used1,14. A new tangential flow hollow-fiber ultrafiltration (HFUF) system has recently been shown to be more efficient and more robust at recovering Cryptosporidium oocysts and Giardia cysts from various water matrices; moreover, it is less expensive than other capsule filter options and can concentrate multiple pathogens simultaneously1-3,5-8,10,11. In addition, previous studies by Hill and colleagues demonstrated that the HFUF significantly improved Cryptosporidium oocysts recoveries when directly compared with the Envirochek HV filters4. Additional modifications to the current methods have also been reported to improve method performance. Replacing the acid dissociation procedure with heat dissociation was shown to be more effective at separating Cryptosporidium from the magnetic beads in some matrices9,13 .
This protocol describes a modified Method 1623 that uses the new HFUF filtration system with the heat dissociation step. The use of HFUF with this modified Method is a less expensive alternative to current EPA Method 1623 filtration options and provides more flexibility by allowing the concentration of multiple organisms.

A Modified EPA Method 1623 that Uses Tangential Flow Hollow-fiber Ultrafiltration and Heat Dissociation Steps to Detect Waterborne Cryptosporidium and Giardia spp.

This protocol describes the use of a tangential flow hollow-fiber ultrafiltration sample concentration system and a heat dissociation as alternative steps for the detection of waterborne Cryptosporidium and Giardia species using EPA Method 1623.

שינוי שיטת EPA 1623 שמשתמש תזרים משיק הולו סיבים Ultrafiltration ומחממים צעדים ניתוק לזהות waterborne<em&gt; Cryptosporidium</em&gt; ו<em&gt; Giardia spp.</em

Cryptosporidium and Giardia species are two of the most prevalent protozoa that cause waterborne diarrheal disease outbreaks worldwide. To better ...

Adenoviral Transduction of Naive CD4 T Cells to Study Treg Differentiation

Regulatory T cells (Tregs) are essential to provide immune tolerance to self as well as to certain foreign antigens. Tregs can be generated from naive CD4 T cells in vitro with TCR- and co-stimulation in the presence of TGF&beta; and IL-2. This bears enormous potential for future therapies, however, the molecules and signaling pathways that control differentiation are largely unknown.
Primary T cells can be manipulated through ectopic gene expression, but common methods fail to target the most important naive state of the T cell prior to primary antigen recognition. Here, we provide a protocol to express ectopic genes in naive CD4 T cells in vitro before inducing Treg differentiation. It applies transduction with the replication-deficient adenovirus and explains its generation and production. The adenovirus can take up large inserts (up to 7 kb) and can be equipped with promoters to achieve high and transient overexpression in T cells. It effectively transduces naive mouse T cells if they express a transgenic Coxsackie adenovirus receptor (CAR). Importantly, after infection the T cells remain naive (CD44low, CD62Lhigh) and resting (CD25-, CD69-) and can be activated and differentiated into Tregs similar to non-infected cells. Thus, this method enables manipulation of CD4 T cell differentiation from its very beginning. It ensures that ectopic gene expression is already in place when early signaling events of the initial TCR stimulation induces cellular changes that eventually lead into Treg differentiation.

Adenoviral gene transfer into naive CD4 T cells with transgenic expression of the Coxsackie adenovirus receptor enables the molecular analysis of regulatory T cell differentiation in vitro.

התמרה adenoviral של CD4 תמימים תאי T ללמוד בידול Treg

Regulatory T cells (Tregs) are essential to provide immune tolerance to self as well as to certain foreign antigens. Tregs can be generated from naive CD4 ...

Development of an Antigen-driven Colitis Model to Study Presentation of Antigens by Antigen Presenting Cells to T Cells

Inflammatory bowel disease (IBD) is a chronic inflammation which affects the gastrointestinal tract (GIT). One of the best ways to study the immunological mechanisms involved during the disease is the T cell transfer model of colitis. In this model, immunodeficient mice (RAG-/- recipients) are reconstituted with naive CD4+ T cells from healthy wild type hosts.
This model allows examination of the earliest immunological events leading to disease and chronic inflammation, when the gut inflammation perpetuates but does not depend on a defined antigen. To study the potential role of antigen presenting cells (APCs) in the disease process, it is helpful to have an antigen-driven disease model, in which a defined commensal-derived antigen leads to colitis. An antigen driven-colitis model has hence been developed. In this model OT-II CD4+ T cells, that can recognize only specific epitopes in the OVA protein, are transferred into RAG-/- hosts challenged with CFP-OVA-expressing E. coli. This model allows the examination of interactions between APCs and T cells in the lamina propria.

In this antigen-driven colitis model, OT-II CD4+ T cells expressing a red fluorescent protein were adoptively transferred into RAG-/- mice that express a green fluorescent protein in mononuclear phagocytes (MPs). The hosts were challenged with Escherichia coli (E.coli) expressing the ovalbumin protein (OVA) fused to a cyan fluorescent protein (CFP).

פיתוח מודל קוליטיס מונחה Antigen ללמוד מצגת של אנטיגנים על ידי אנטיגן הצגת תאים לתאי T

Inflammatory bowel disease (IBD) is a chronic inflammation which affects the gastrointestinal tract (GIT). One of the best ways to study the immunological ...

Precision-cut Mouse Lung Slices to Visualize Live Pulmonary Dendritic Cells

Inhalation of allergens and pathogens elicits multiple changes in a variety of immune cell types in the lung. Flow cytometry is a powerful technique for quantitative analysis of cell surface proteins on immune cells, but it provides no information on the localization and migration patterns of these cells within the lung. Similarly,&#160;chemotaxis assays can be performed to study the potential of cells to respond to chemotactic factors in vitro, but these assays do not reproduce the complex environment of the intact lung. In contrast to these aforementioned techniques, the location of individual cell types within the lung can be readily visualized by generating Precision-cut Lung Slices (PCLS), staining them with commercially available, fluorescently tagged antibodies, and visualizing the sections by confocal microscopy. PCLS can be used for both live and fixed lung tissue, and the slices can encompass areas as large as a cross section of an entire lobe. We have used this protocol to successfully visualize the location of a wide variety of cell types in the lung, including distinct types of dendritic cells, macrophages, neutrophils, T cells and B cells, as well as structural cells such as lymphatic, endothelial, and epithelial cells. The ability to visualize cellular interactions, such as those between dendritic cells and T cells, in live, three-dimensional lung tissue, can reveal how cells move within the lung and interact with one another at steady state and during inflammation. Thus, when used in combination with other procedures, such as flow cytometry and quantitative PCR, PCLS can contribute to a comprehensive understanding of cellular events that underlie allergic and inflammatory diseases of the lung.

We describe a method for generating Precision-cut Lung Slices (PCLS) and immunostaining them to visualize the localization of various immune cell types in the lung. Our protocol can be extended to visualize the location and function of many different cell types under a variety of conditions.

Precision-לחתוך פרוסות ריאת עכבר לדמיין תאי דנדריטים ריאה חיים

Inhalation of allergens and pathogens elicits multiple changes in a variety of immune cell types in the lung. Flow cytometry is a powerful technique for ...

An All-on-chip Method for Rapid Neutrophil Chemotaxis Analysis Directly from a Drop of Blood

Neutrophil migration and chemotaxis are critical for our body's immune system. Microfluidic devices are increasingly used for investigating neutrophil migration and chemotaxis owing to their advantages in real-time visualization, precise control of chemical concentration gradient generation, and reduced reagent and sample consumption. Recently, a growing effort has been made by the microfluidic researchers toward developing integrated and easily operated microfluidic chemotaxis analysis systems, directly from whole blood. In this direction, the first all-on-chip method was developed for integrating the magnetic negative purification of neutrophils and the chemotaxis assay from small blood volume samples. This new method permits a rapid sample-to-result neutrophil chemotaxis test in 25 min. In this paper, we provide detailed construction, operation and data analysis method for this all-on-chip chemotaxis assay with a discussion on troubleshooting strategies, limitations and future directions. Representative results of the neutrophil chemotaxis assay testing a defined chemoattractant, N-Formyl-Met-Leu-Phe (fMLP), and sputum from a chronic obstructive pulmonary disease (COPD) patient, using this all-on-chip method are shown. This method is applicable to many cell migration-related investigations and clinical applications.

This article provides the detailed method of performing a rapid neutrophil chemotaxis assay by integrating the on-chip neutrophil isolation from whole blood and the chemotaxis test on a single microfluidic chip.

שיטה All-on- שבב עבור ניתוח נויטרופילי מהיר Chemotaxis ישירות מתוך ירידה של דם

Neutrophil migration and chemotaxis are critical for our body's immune system. Microfluidic devices are increasingly used for investigating neutrophil ...

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple condensation reactions. DHDDS (dehydrodolichyl diphosphate synthase) is a eukaryotic long-chain cis-PT (forming cis double bonds from the condensation reaction) that catalyzes chain elongation of farnesyl diphosphate (FPP, an allylic diphosphate) via multiple condensations with isopentenyl diphosphate (IPP). DHDDS is of biomedical importance, as a non-conservative mutation (K42E) in the enzyme results in retinitis pigmentosa, ultimately leading to blindness. Therefore, the present protocol was developed in order to acquire large quantities of purified DHDDS, suitable for mechanistic studies. Here, the usage of protein fusion, optimized culture conditions and codon-optimization were used to allow the overexpression and purification of functionally active human DHDDS in E. coli. The described protocol is simple, cost-effective and time sparing. The homology of cis-PT among different species suggests that this protocol may be applied for other eukaryotic cis-PT as well, such as those involved in natural rubber synthesis.

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

A simple protocol for overexpression and purification of codon-optimized, human cis-prenyltransferase, under non-denaturing conditions, from Escherichia coli, is described, along with an enzymatic activity assay. This protocol can be generalized for production of other cis- prenyltransferase proteins in quantity and quality suitable for mechanistic studies.

Overexpression וטיהור האדם<em&gt; Cis</em&gt; פרנליטרונפרפרז ב<em&gt; Escherichia coli</em

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple ...

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor microenvironment and the underlying mechanism is still largely unknown. The lack of a consistent and reliable source of NK cells limits the research progress of NK cell immunity. Here, we report an in vitro system that can provide high quality and quantity of bone marrow-derived murine NK cells under a feeder-free condition. More importantly, we also demonstrate that siRNA-mediated gene silencing successfully inhibits the E4bp4-dependent NK cell maturation by using this system. Thus, this novel in vitro NK cell differentiating system is a biomaterial solution for immunity research.

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

Here, we present a protocol to mass-produce gene-silencing murine NK cells by using a feeder-free differentiation system for mechanistic study in vitro and in vivo.

הרומן מזין ללא מערכת לייצור המוני של תאים רוצח טבעי מאתר במבחנה

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor ...

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-&#945;

The main aim of this protocol is to describe the development and validation of an interferon (IFN)-&#945; single molecule array digital Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA) assay. This system enables the quantification of human IFN-&#945; protein with unprecedented sensitivity, and with no cross-reactivity for other species of IFN.
The first key step of the protocol is the choice of the antibody pair, followed by the conjugation of the capture antibody to paramagnetic beads, and biotinylation of the detection antibody. Following this step, different parameters such as assay configuration, detector antibody concentration, and buffer composition can be modified until optimum sensitivity is achieved. Finally, specificity and reproducibility of the method are assessed to ensure confidence in the results. Here, we developed an IFN-&#945; single molecule array assay with a limit of detection of 0.69 fg/mL using high-affinity autoantibodies isolated from patients with biallelic mutations in the autoimmune regulator (AIRE) protein causing autoimmune polyendocrinopathy syndrome type 1/autoimmune polyendocrinopathy-candidiasis-ectodermal dystrophy (APS1/APECED). Importantly, these antibodies enabled detection of all 13 IFN-&#945; subtypes.
This new methodology allows the detection and quantification of IFN-&#945; protein in human biological samples at attomolar concentrations for the first time. Such a tool will be highly useful in monitoring the levels of this cytokine in human health and disease states, most particularly infection, autoimmunity, and autoinflammation.

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-&amp;#945;

Here we present a protocol to describe the development and validation of a single molecule array digital ELISA assay, which enables the ultra-sensitive detection of all IFN-&#945; subtypes in human samples.

פיתוח ובדיקת של מולקולה בודדת העדינה מערך דיגיטלי מקושרים-אנזים Immunosorbent Assay עבור אינטרפרון אנושי-α

The main aim of this protocol is to describe the development and validation of an interferon (IFN)-&#945; single molecule array digital Enzyme-Linked ...