שיטה חדשה זו של תרבויות ספרואיד יכול לשמש כדי ללמוד את tumorigenicity לנתח את נוכחותם של אוכלוסיות שונות של תאי גזע סרטניים וגם ניתן ליישם יפה דרך מסך לשים גבוה עבור תרופות חדשות. זוהי מערכת תרבותית חזקה וחוזרת על עצמו ליצירת מספר רב של ספרואידים בגודל הומוגני. יתר על כן, כדוריות אלה ניתן להשתמש כדי ללמוד תאי גזע סרטניים.
שיטה זו מוגדרת ללמוד ביולוגיה סרטן כרונית אבל זה יכול להיות מוגדר בקלות ללמוד סרטן אחרים על ידי שינוי התנאים תרבות 3D. הקפד לצפות בועות במדיום, לא להזיז את הצלחת יותר מדי במהלך היווצרות spheroids כדי להיות זהיר בעת קצירת spheroids לתוך מסננת. התחל על ידי טיפול מראש בארות של צלחת 24 גם עם 500 ליטרים של פתרון נגד דבקות שטיפה לכל באר.
לאחר מספר שניות צנטריפוגה את הצלחת רוטור דלי מתנדנד ולשטוף כל באר עם 2 מיליליטר של מדיום בזל חם. שימו לב לצלחת שמתחת למיקרוסקופ כדי לוודא שהבועות הוסרו לחלוטין מבארות המיקרו. אם אין בועות נצפו, לשטוף את הבארות שוב לפני הוספת מיליליטר אחד של מטריצת קרום מרתף DMEM חם בינוני לכל באר.
כדי לגרום להיווצרות ספרואידית, ראה את הריכוז הרצוי של תאי קאקו-2 בשכבת מונו דו-ממדית בצלחת של 10 ס"מ ב- DMEM בתוספת 10%FBS ו- 1%אנטיביוטיקה. לתרבות ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו-חמצני באטמוספירה לחה. כאשר מגיעים ל-80%, שטפו את התאים בחמישה מיליליטרים של PBS לפני הטיפול בתרבות בשני מיליליטרים של טריפסין-אדטה במשך שתיים עד חמש דקות ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו-חמצני.
כאשר התאים התנתקו לנטרל את טריפסין עם ארבעה מיליליטר של DMEM מלא. לאחר הספירה, לאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה ו resuspend את הצבעים בנפח המתאים של מדיום מטריצת קרום מרתף DMEM כדי להשיג את הריכוז הרצוי של תאים במיליליטר אחד של מדיום לכל באר. הוסף מיליליטר אחד של תאים לכל באר של צלחת 24 באר מראש, ואחריו תוספת של מיליליטר אחד של מטריצת קרום מרתף DMEM מדיום לכל באר.
לאחר הזריעה, מיד צנטריפוגה הצלחת ולהשתמש מיקרוסקופ אור כדי לוודא כי התאים הופצו באופן שווה על פני בארות מיקרו. לאחר מכן מניחים את הצלחת באינקובטור תרבות התא במשך 48 שעות מבלי להפריע לתאים. כדי לקצור את הספארוידים, בסוף הדגירה, השתמשו בפיפטה סרולוגית וחצי מהספרואידים בכל באר כדי לעקור בעדינות את הספרוידים מבארות המיקרו שלהם.
כאשר כל הספארוידים נותקו, השתמש בפיפט כדי להעביר בזהירות את תרביות ה-3D מכל באר למסננת הפיכה של 37 מיקרון על גבי צינור חרוט של 15 מיליליטר. לשטוף כל באר שלוש פעמים עם מיליליטר אחד של בינוני בזל מראש לכל לשטוף כדי לאסוף את כל spheroids הנותרים ולהוסיף אלה spheroids נוספים מסננת. לאחר הכביסה האחרונה לבדוק את הצלחת מתחת למיקרוסקופ כדי לאשר כי כל spheroids הוסרו מן בארות מיקרו.
ואז להפוך את מסננת מעל צינור חדש 15 מיליליטר ולשטוף את החלק התחתון של מסננת עם טרי DMEM מרתף מטריצת מדיום כדי לאסוף את spheroids לתוך הצינור. ספרואידים עולים מ 500 תאים להדגים את הגידול ההומוגניים ביותר בגודל לאורך זמן. עם 500 ו 600 תאים לכל ספרואיד לקבוע להיות המספר האופטימלי של תאים שתחתיו צמיחה טובה שונות נמוכה ניתן להשיג.
התוספת של מטריצת קרום מרתף משפרת את הצמיחה ספרואידית והומוגניות. בתרבות ארוכת טווח, התאים מופיעים כמו שכבות מרובות צפופות ביום השלישי. בעוד תאים שטוחים מסודרים בשכבות מונו גלויים בבירור ביום 10.
באופן מעניין, לומן מופיע בתוך הכדורואידים מהיום החמישי ואילך. בנוסף, עלייה ברורה בתאים המתרבים תאים גרעיניים אנטיגן חיובי נצפתה בימים חמש ושבע כי יורד ביום 10. באופן מפתיע, Caspace מופעל 3 נצפתה בתאים מעטים מאוד בימים שלוש וחמש בלבד.
בעוד רמות גבוהות של ביטוי בטא קטנין נצפים בכל נקודת זמן. הפוטנציאל של spheroids להבדיל לתוך Anterosites מעיד על ידי שלהם אלקליין Phosphatase ואת משפחת המוביל מסיס 2A5 ביטוי mRNA. בנוסף, ספירואידים זה מבטאים סמני תאי גזע סרטניים טיפוסיים ומגיבים לטיפולי כימותרפיה משולבים הניתנים באופן שגרתי לחולי סרטן המעי הגס.
אז ספרואידים מורכבים מאוכלוסיות תאים שונות. לאחר מכן הם יכולים לשמש יפה כדי לנתח תגובות ספציפיות לתאים לגירויים כגון עקשנים ובסופו של דבר לתגובות סמים.
