وقد تم تمويل هذا العمل من قبل على جائزة عائلة سميث للتميز في مجال الأبحاث الطبية الحيوية والمعاهد الوطنية للصحة RO1 AI083426 - 01 (مهاجم). معتمدة باتريك Maschmeyer وفلاتش بواسطة ميلاني زمالات الدكتوراه من مؤسسة بورنغير إنغلهايم.

وينبغي أن تستخدم C57BL / 6 أسابيع في الفئران 20 ~ من العمر أو المسنين. فمن المستحسن استخدام الفئران الذكور وزنها 25 - 30G. ويمكن زيادة الغلة من الخلايا النجمية عن طريق تغذية الفئران فيتامين A - المخصب الوجبة الغذائية لمدة 2 أشهر قبل نجمي العزلة الخلية. يمكن تنقية حوالي 2x10 5 خلايا الكبدية النجمية من كبد الفأر C57BL / 6 واحد ، في حين أن العائد من الخلايا النجمية من BALB / ج الفئران هي أعلى بكثير. ويتم تعديل البروتوكول التالي ل5 الفئران. وأجريت التجارب ورعاية الحيوانات وفقا للرعاية الحيوان وافق المؤسسية وبروتوكولات اللجنة الاستخدام. 1. نضح في الموقع من كبد الفأر مع الإنزيمات الهضمية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدفئة العازلة SC1 والحلول نضح الانزيم في حمام ماء C ° 37. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شن مجموعة التسريب المجنح على أنبوب السيليكون من مضخة تمعجية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> معايرة المضخة مع برنامج تلفزيوني للحصول على تدفق الصفحي من 6.5ml/min ، وهو معدل التدفق الذي سيتم استخدامه لنضح في الوضع الطبيعي للكبد. يوازن أنبوب السيليكون مع SC1 الحل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخدير الماوس عن طريق الحقن داخل الصفاق من الكيتامين (90 ملغ / كلغ) وزيلازين (10 ملغ / كلغ) حل واختبار ردود الافعال عن خسارة لضمان التخدر عميقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الإصلاح الماوس في موقف ضعيف على قاعدة مناسبة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام المقص والملقط لإجراء شق طولي في جلد البطن وفضح البريتوني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فتح بعناية الصفاق وتحريك الأمعاء خارج تجويف البطن إلى الجانب الأيمن من الحيوانات من أجل فضح الوريد البابي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إدراج قنية التسريب من مجموعة إلى الوريد البابي. لهذه الخطوة ، فمن المستحسن استعمال stereomicroscope. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدء نضح من الكبد مع الحل SC1 30ml. فتح الوريد الأجوف السفلي مباشرة بعد بدء التدفق. يشار بيغ النجاح في الكبد عن طريق فقدان لون أنسجة الكبد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يروي الكبد مع 30ml Pronase حل E. على الهضم ناجحة ، سوف فصوص الكبد تضخم ، وسوف تظهر فصيصات متميزة من خلال الكبسولة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يروي الكبد مع 30ml كولاجيناز حل ف. فقد الكبد عند هذه النقطة يبدو شكله ونائي وغير متبلور. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعناية فصل الكبد من الحجاب الحاجز والأجهزة المحيطة بها وتخزينها في 70ml SC2 الحل على الجليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الإجراء بالنسبة للفئران إضافية. </li></ol> 2. في الهضم من كبد فأر المختبر وينبغي تنفيذ جميع الخطوات الأخرى العاملة تحت ظروف معقمة في تدفق الصفحي هود. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع الكبد إلى قطع ما يقرب من 3 2x2x2mm باستخدام مقص حاد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الجمع بين تعليق 70ml SC2 بما في ذلك قطع الكبد مع 50ml من محلول Pronase P - E كولاجيناز وإضافة 1ml من محلول أنا الدناز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> هضم للكبد في 37 20min C مع التحريك درجة. </li></ol> 3. تنبيذ متدرج الكثافة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعليق تصفية خلية خلية من خلال مصافى 70μm في أنابيب فالكون 6 50ml وتضيف ما يصل الى 50ml مع SC2 العازلة. الطرد المركزي ل10min في 600G و 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح بعناية 40ml من طاف ، ثم تضاف حل 150μl أنا الدناز لكل أنبوب وresuspend الخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجمع تعليق خلية في أنابيب فالكون 4 50ml وتغسل مع GBSS - B ، في الطرد المركزي ل10min 600G و 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح بعناية أكبر قدر من طاف ممكن من دون إزعاج بيليه وإضافة 150μl أنا الدناز حل لكل أنبوب. Resuspend الكريات خلية في 10ML GBSS - B في الأنبوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجمع الخلايا في أنابيب فالكون 2 50ml وإضافة GBSS - B إلى إجمالي حجم 36ml في الأنبوب. إضافة 14ml Nycodenz حل لكل أنبوب وتخلط جيدا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل 10ML لتعليق خلية في واحدة 12ml التدرج أنبوب الطرد المركزي ، مما أدى في 10 أنابيب في المجموع. تراكب بلطف مع التعليق الخلية في أنبوب 1.5ml GBSS - B. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي ل15min التدرجات في 1500g و 4 درجات مئوية دون فرامل. في وقت لاحق ، وسوف تكون مكعبات الكبد في الجزء السفلي من الأنبوب في حين تم العثور على الخلايا النجمية في الطور البيني باعتباره حلقة بيضاء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصاد بعناية الطور البيني الذي يحتوي على الخلايا النجمية ، ويغسل لهم GBSS - B ؛ ل10min الطرد المركزي في 600G و 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح في وطاف resuspend الخلايا في DMEM 20ml تستكمل مع الحرارة المعطل FBS 10 ٪ ، 1 ٪ HEPES البنسلين / الستربتوميسين ، L - 2mm والجلوتامين ، البيروفات 1MM الصوديوم ، و10MM. نقل الخلايا في قوارير زراعة الأنسجة مع تركيز 2x10 4 خلية / سم 2. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5 ٪ CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغيير وسائل الإعلام في أقرب وقت الخلايا الكبدية النجمية هي ملتصقة (حوالي 2H بعد الإعداد) ليغسل خلايا ميتة والحطام الخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في اليوم التالي ، الخلية النجميةوينبغي ليالي تطوير قدراتها المميزة على شكل نجمة التشكل مع حويصلات فيتامين A - محيط بالنواة الدهون تخزينها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتجارب لاحقة ، يمكن بسهولة الخلايا الكبدية النجمية يمكن فصل من السطوح البلاستيكية غير المغلفة باستخدام حلول الأنزيمية خفيفة مثل Accutase ، على سبيل المثال </li></ol> 4. ممثل النتائج : بعد إعداد الخلايا الكبدية النجمية باستخدام بروتوكول المقدمة ، ويمكن اختبار نقاء السكان المعزولين النظر في ثلاث خصائص رئيسية من هذا نوع من الخلايا ، مثل النجوم التي تشبه شكل ، قطرات الدهون محيط بالنواة ، والتعبير عن بروتين الدبقية ييفي الحمضية (GFAP ). وصفت الصور ممثل لظهور سمات نجمي الخلايا الكبدية 2H بعد عزل الخلايا ، وكذلك في يوم 1 و 3 من الثقافة في المختبر في الشكل 1. الشكل 2 يبين تلطيخ ممثل المناعي للخلايا النجمية GFAP في الكبد ، والتي تم تربيتها لمدة 3 أيام بعد عزل الخلية. الخلايا النجمية في الخلايا الكبدية التفريق myofibroblastic في المختبر خلال الثقافة. ومن السمات المميزة لهذه الخاصية تنشيط الخلايا النجمية هو تعبير عن العضلات ألفا أكتين السلس (αSMA). الشكل 3 يبين تلطيخ المناعي للأسماء وIIA الميوسين في تنشيط الخلايا النجمية في يوم 7 من الثقافة في المختبر. <img src="/files/ftp_upload/2710/2710fig1.jpg" alt="الشكل 1" /> الشكل 1. التشكل المميزة من الخلايا النجمية الكبدية. تم عزل الخلايا النجمية من كبد فأر باستخدام بروتوكول المقدمة. وتصور هذه المشاهد الخلايا النجمية 2H بعد عزل الخلية (أ ، ب) ، وكذلك في يوم 1 (ج) ويوم 3 (د) من الثقافة في المختبر. الخلايا النجمية الكبدية يحمل كميات كبيرة من الدهون في مواقع حويصلات محيط بالنواة واكتساب المتميزة مثل نجمي التشكل خلال الأيام الأولى من المختبر في الثقافة (التكبير 200X). <img src="/files/ftp_upload/2710/2710fig2.jpg" alt="الشكل 2" /> الشكل 2. الخلايا النجمية الكبدية أعرب GFAP تحديدا في الكبد. وكانت الخلايا النجمية معزولة والملون لimmunofluorescently GFAP (الحمراء) في يوم 3 من الثقافة في المختبر. وصفت نواة خلية في الزرقاء (هويشت صمة عار). <img src="/files/ftp_upload/2710/2710fig3.jpg" alt="الشكل 3" /> الشكل 3. خلايا الكبد النجمية تفرق في myofibroblasts. ومثقف الخلايا النجمية الكبدية المعزولة من الفئران C57BL / 6 لمدة 7 أيام. في وقت لاحق ، تم نقلهم إلى غرفة الشرائح والملون لأسماء (كما هو موضح باللون الأحمر) والميوسين IIA (كما هو مبين باللون الأخضر). وكانت نواة الخلية counterstained مع هويشت (الأزرق). <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td colspan="2"> SC1 العازلة </td></tr><tr><td> EGTA </td><td> 190mg </td></tr><tr><td> جلوكوز </td><td> 900mg </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 10 مل من محلول المخزون 1M </td></tr><tr><td> بوكل </td><td> 400mg </td></tr><tr><td> غ 2 هبو 4 × 2 H 2 O </td><td> 151mg </td></tr><tr><td> كلوريد الصوديوم </td><td> 8G </td></tr><tr><td> ناه 2 ص 4 × H 2 O </td><td> 78mg </td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> 350mg </td></tr><tr><td> الفينول الأحمر </td><td> 6mg </td></tr><tr><td> DH 2 O </td><td> ملء تصل إلى 1L </td></tr><tr><td colspan="2"> SC2 العازلة </td></tr><tr><td> CaCl 2 × 2H 2 O </td><td> 560mg </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 10ML من محلول المخزون 1M </td></tr><tr><td> بوكل </td><td> 400mg </td></tr><tr><td> غ 2 هبو 4 × 2 H 2 O </td><td> 151mg </td></tr><tr><td> كلوريد الصوديوم </td><td> 8G </td></tr><tr><td> ناه 2 ص 4 × H 2 O </td><td> 78mg </td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> 350mg </td></tr><tr><td> الفينول الأحمر </td><td> 6mg </td></tr><tr><td> DH 2 O </td><td> ملء تصل إلى 1L </td></tr><tr><td colspan="2"> GBSS - A العازلة </td></tr><tr><td> بوكل </td><td> 370mg </td></tr><tr><td> CaCl 2 × 2H 2 O </td><td> 225mg </td></tr><tr><td> جلوكوز </td><td> 991mg </td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> 30mg </td></tr><tr><td> MgCl 2 × 6 H 2 O </td><td> 210mg </td></tr><tr><td> MgSO 4 × 7 H 2 O </td><td> 70mg </td></tr><tr><td> غ 2 هبو 4 × 2 H 2 O </td><td> 75mg </td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> 227mg </td></tr><tr><td> الفينول الأحمر </td><td> 6mg </td></tr><tr><td> DH 2 O </td><td> ملء تصل إلى 1L </td></tr><tr><td colspan="2">GBSS - B العازلة </td></tr><tr><td> CaCl 2 × 2H 2 O </td><td> 225mg </td></tr><tr><td> جلوكوز </td><td> 991mg </td></tr><tr><td> بوكل </td><td> 370mg </td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> 30mg </td></tr><tr><td> MgCl 2 × 6 H 2 O </td><td> 210mg </td></tr><tr><td> MgSO 4 × 7 H 2 O </td><td> 70mg </td></tr><tr><td> غ 2 هبو 4 × 2 H 2 O </td><td> 75mg </td></tr><tr><td> كلوريد الصوديوم </td><td> 8G </td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> 227mg </td></tr><tr><td> الفينول الأحمر </td><td> 6mg </td></tr><tr><td> DH 2 O </td><td> ملء تصل إلى 1L </td></tr><tr><td colspan="2"> Pronase الحل E الإرواء </td></tr><tr><td> Pronase E </td><td> 100mg (4000 PU / دقيقة ملغ) </td></tr><tr><td> SC2 العازلة </td><td> 200ml </td></tr><tr><td colspan="2"> كولاجيناز الحل ف الإرواء </td></tr><tr><td> ف كولاجيناز </td><td> 85mg (1.78 U / ليو ملغ) </td></tr><tr><td> SC2 العازلة </td><td> 200ml </td></tr><tr><td colspan="2"> Pronase الحل P - E كولاجيناز </td></tr><tr><td> Pronase E </td><td> 50mg (4000 PU / دقيقة ملغ) </td></tr><tr><td> ف كولاجيناز </td><td> 85mg (1.78 U / ليو ملغ) </td></tr><tr><td> SC2 العازلة </td><td> 50ml </td></tr><tr><td colspan="2"> الدناز أنا الحل </td></tr><tr><td> أنا الدناز </td><td> 6mg (2000U/mg كاليفورنيا.) </td></tr><tr><td> GBSS - B </td><td> 3ml </td></tr><tr><td colspan="2"> Nycodenz الحل </td></tr><tr><td> Nycodenz </td><td> 8G </td></tr><tr><td> GBSS - A </td><td> 28ml </td></tr></tbody></table> الجدول 1. مخازن والحلول المطلوبة لانزيم عزل الخلايا النجمية الكبدية. ينبغي تعديل الرقم الهيدروجيني للجميع المخازن المؤقتة إلى 7،3-7،4. وعلاوة على ذلك ، فمن المستحسن الترشيح معقمة من جميع المخازن. فمن المهم للتكيف مع كمية الانزيم المستعملة وفقا لنشاط الأنزيمي معين.

<ol>
	<li>Friedman, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatic+stellate+cells:+protean,+multifunctional,+and+enigmatic+cells+of+the+liver.">Hepatic stellate cells: protean, multifunctional, and enigmatic cells of the liver.</a> Physiol Rev. 88, 125-172 (2008).</li><li>Geerts, A. H. i. s. t. o. r. y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=heterogeneity,+developmental+biology,+and+functions+of+quiescent+hepatic+stellate+cells.">heterogeneity, developmental biology, and functions of quiescent hepatic stellate cells.</a> Semin Liver Dis. 21, 311-335 (2001).</li><li>Gressner, A. M. &. a. m. p. ;. a. m. p., Weiskirchen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modern+pathogenetic+concepts+of+liver+fibrosis+suggest+stellate+cells+and+TGF-beta+as+major+players+and+therapeutic+targets.">Modern pathogenetic concepts of liver fibrosis suggest stellate cells and TGF-beta as major players and therapeutic targets.</a> J Cell Mol Med. 10, 76-99 (2006).</li><li>Reynaert, H., Thompson, M. G., Thomas, T., Geerts, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatic+stellate+cells:+role+in+microcirculation+and+pathophysiology+of+portal+hypertension.">Hepatic stellate cells: role in microcirculation and pathophysiology of portal hypertension.</a> Gut. 50, 571-581 (2002).</li><li>Winau, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ito+cells+are+liver-resident+antigen-presenting+cells+for+activating+T+cell+responses.">Ito cells are liver-resident antigen-presenting cells for activating T cell responses.</a> Immunity. 26, 117-129 (2007).</li><li>Minicis, S. D. e. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+profiles+during+hepatic+stellate+cell+activation+in+culture+and+in+vivo.">Gene expression profiles during hepatic stellate cell activation in culture and in vivo.</a> Gastroenterology. 132, 1937-1946 (2007).</li><li>Knittel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+liver+myofibroblasts+and+hepatic+stellate+cells+in+normal+and+diseased+rat+livers:+distinct+roles+of+(myo-)fibroblast+subpopulations+in+hepatic+tissue+repair.">Localization of liver myofibroblasts and hepatic stellate cells in normal and diseased rat livers: distinct roles of (myo-)fibroblast subpopulations in hepatic tissue repair.</a> Histochem Cell Biol. 112, 387-401 (1999).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

الخلايا النجمية الكبدية تنظيم العمليات الأساسية الفسيولوجية والمرضية في جسم المريض في الكبد. علاوة على ذلك ، تمتلك خصائص الخلايا النجمية تقديم المستضد ، جعلها عنصرا هاما من عناصر الاستجابة الكبد المناعي. على الرغم من أن الخلايا الكبدية النجمية تشكل 10-15 ٪ من إجمالي ع...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> اسم الكاشف </th><th> شركة </th><th> رقم الكتالوج </th></tr><tr><td> 70μm خلية مصفاة </td><td> دينار بحريني </td><td> 352350 </td></tr><tr><td> CaCL 2 × 2H 2 O </td><td> سيغما الدريخ </td><td> C3306 </td></tr><tr><td> ف كولاجيناز </td><td> روش </td><td> 11249002001 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Gibco </td><td> 11960 </td></tr><tr><td> أنا الدناز </td><td> روش </td><td> 10104159001 </td></tr><tr><td> DPBS </td><td> Cellgro </td><td> 21-031 - CV </td></tr><tr><td> EGTA </td><td> Fluka </td><td> 3777 </td></tr><tr><td> المصل البقري الجنين </td><td> Gibco </td><td> 16000 </td></tr><tr><td> جلوكوز </td><td> سيغما الدريخ </td><td> G7528 </td></tr><tr><td> أنابيب الطرد المركزي الانحدار </td><td> غرينر بيو واحد </td><td> 163160 </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Gibco </td><td> 15630 </td></tr><tr><td> بوكل </td><td> سيغما الدريخ </td><td> P9541 </td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> سيغما الدريخ </td><td> P9791 </td></tr><tr><td> L - الجلوتامين </td><td> Gibco </td><td> 25030 </td></tr><tr><td> MgCl 2 × 6H 2 O </td><td> Fluka </td><td> 63068 </td></tr><tr><td> MgSO 4 × 7H 2 O </td><td> سيغما الدريخ </td><td> M2773 </td></tr><tr><td> غ 2 هبو 4 × 2H 2 O </td><td> Fluka </td><td> 71643 </td></tr><tr><td> كلوريد الصوديوم </td><td> سيغما الدريخ </td><td> S3014 </td></tr><tr><td> ناه 2 ص 4 × H 2 O </td><td> Fluka </td><td> 71507 </td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> Fluka </td><td> 71628 </td></tr><tr><td> Nycodenz </td><td> Accudenz AG </td><td> AN7050/BLK </td></tr><tr><td> البنسلين / الستربتوميسين </td><td> Gibco </td><td> 15140 </td></tr><tr><td> مضخة تمعجية </td><td> كول Parmer </td><td> HV - 7523-70 </td></tr><tr><td> الفينول الأحمر </td><td> سيغما الدريخ </td><td> P4633 </td></tr><tr><td> Pronase E </td><td> Calbiochem </td><td> 7433-2 </td></tr><tr><td> سيليكون الخراطيم </td><td> Masterflex </td><td> HV - 96440-14 </td></tr><tr><td> الصوديوم البيروفات </td><td> Gibco </td><td> 11360 </td></tr><tr><td> نسيج قارورة الثقافة (25cm 2) </td><td> دينار بحريني </td><td> 353108 </td></tr><tr><td> المجنح تسريب مجموعة </td><td> Terumo </td><td> 1SV27EL </td></tr></tbody></table>

seven steps to stellate cells

الخلايا النجمية الكبدية والكبد وخلايا المقيمين النجوم مثل التشكل وتقع في فضاء Disse بين خلايا الكبد والبطانية الجيبية 1،2 خلايا الكبد. يتم اشتقاق الخلايا النجمية من السلائف نخاع العظم وتخزين ما يصل الى 80 ٪ من فيتامين A الجسم الكلي 1 و 2. عند التنشيط ، والخلايا النجمية تفرق في myofibroblasts لإنتاج المصفوفة خارج الخلية ، مما يسهم في تليف الكبد 3. على أساس قدرتهم على العقد ، يمكن أن الخلايا النجمية myofibroblastic ينظم نغمة الأوعية الدموية وارتفاع ضغط الدم يرتبط المدخل 4. مؤخرا ، أظهرت لنا أن الخلايا الكبدية النجمية هي خلايا مولدة قوية ، ويمكن تقديم تنشيط خلايا NKT فضلا عن الخلايا اللمفية تي التقليدية 5. هنا نقدم طريقة لإعداد كفاءة الخلايا الكبدية النجمية من كبد الفأر. نظرا لتوطين perisinusoidal بهم ، وعزل الخلايا الكبدية النجمية هي عملية متعددة الخطوات. لجعل الخلايا النجمية للوصول إلى العزلة من مساحة Disse ، يتم perfused كبد الفأر في الموقع مع Pronase E الهضمي الانزيمات وكولاجيناز P. التروية بعد ، يخضع للعلاج أنسجة الكبد الأنزيمية إضافية مع Pronase E و P في كولاجيناز المختبر. في وقت لاحق ، وطريقة الاستفادة من كمية هائلة من قطرات الدهون فيتامين A - تخزينها في الخلايا الكبدية النجمية. هذه الميزة تسمح للانفصال عن غيرها من الخلايا النجمية أنواع الخلايا الكبدية بواسطة الطرد المركزي على التدرج Nycodenz 8 ٪. بروتوكول الموصوفة هنا تعطي السكان نقية جدا ومتجانسة من الخلايا النجمية. ويمكن تقييم نقاء استعدادات لتلوين هذا البروتين علامة الدبقية جزيء ييفي الحمضية (GFAP) ، قبل التحليل المجهري مضان أو التدفق الخلوي. مزيد من الضوء ويكشف المجهر مظهر فريد من النجوم على شكل خلايا الكبدية النجمية التي تؤوي على كميات عالية من الدهون قطرات. أخذت معا ، نقدم بروتوكول مفصلة للعزلة كفاءة الخلايا الكبدية النجمية ، بما في ذلك الصور ممثل مظهرهم المورفولوجية والتعبير GFAP التي تساعد على تحديد الجهة الخلايا النجمية.

Watch this Scientific Journal Video about Seven Steps to Stellate Cells at JoVE.com

Seven Steps to Stellate Cells

نحن هنا تصف طريقة لعزل الخلايا الكبدية النجمية من كبد الفأر. لتنقية الخلايا النجمية ، يتم هضمها كبد الفأر<em&gt; في الموقع</em&gt; و<em&gt; في المختبر</em&gt; من جانب pronase - كولاجيناز العلاج قبل الطرد المركزي المتدرج الكثافة. هذه التقنية عالية الغلة نقية الخلايا النجمية الكبدية.

سبع خطوات لخلايا النجمية

Hepatic stellate cells are liver-resident  cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between  liver sinusoidal endothelial cells ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

33.5K Views.  Harvard Medical School. نحن هنا تصف طريقة لعزل الخلايا الكبدية النجمية من كبد الفأر. لتنقية الخلايا النجمية ، يتم هضمها كبد الفأر في الموقع و في المختبر من جانب pronase - كولاجيناز العلاج قبل الطرد المركزي المتدرج الكثافة. هذه التقنية عالية الغلة نقية الخلايا النجمية الكبد...

Video: Seven Steps to Stellate Cells

Assessing Stomatal Response to Live Bacterial Cells using Whole Leaf Imaging

Stomata are natural openings in the plant epidermis responsible for gas exchange between plant interior and environment. They are formed by a pair of guard cells, which are able to close the stomatal pore in response to a number of external factors including light intensity, carbon dioxide concentration, and relative humidity (RH). The stomatal pore is also the main route for pathogen entry into leaves, a crucial step for disease development. Recent studies have unveiled that closure of the pore is effective in minimizing bacterial disease development in Arabidopsis plants; an integral part of plant innate immunity. Previously, we have used epidermal peels to assess stomatal response to live bacteria (Melotto et al. 2006); however maintaining favorable environmental conditions for both plant epidermal peels and bacterial cells has been challenging. Leaf epidermis can be kept alive and healthy with MES buffer (10 mM KCl, 25 mM MES-KOH, pH 6.15) for electrophysiological experiments of guard cells. However, this buffer is not appropriate for obtaining bacterial suspension. On the other hand, bacterial cells can be kept alive in water which is not proper to maintain epidermal peels for long period of times. When an epidermal peel floats on water, the cells in the peel that are exposed to air dry within 4 hours limiting the timing to conduct the experiment. An ideal method for assessing the effect of a particular stimulus on guard cells should present minimal interference to stomatal physiology and to the natural environment of the plant as much as possible. We, therefore, developed a new method to assess stomatal response to live bacteria in which leaf wounding and manipulation is greatly minimized aiming to provide an easily reproducible and reliable stomatal assay. The protocol is based on staining of intact leaf with propidium iodide (PI), incubation of staining leaf with bacterial suspension, and observation of leaves under laser scanning confocal microscope. Finally, this method allows for the observation of the same live leaf sample over extended periods of time using conditions that closely mimic the natural conditions under which plants are attacked by pathogens.

We have developed a simple and reproducible protocol to access stomatal response to live bacteria. This method minimizes wounding and manipulation of the leaf as compared to the use of epidermal peels reported previously.

تقييم الاستجابة للعيش فوهي الخلايا البكتيرية باستخدام التصوير الجامعة ليف

Stomata are natural openings in the plant epidermis responsible for gas exchange between plant interior and environment. They are formed by a pair of ...

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the simultaneous infection of the cell by a number of phages, one of two pathways is chosen: lytic (virulent) or lysogenic (dormant)3,4. We recently developed a method for fluorescently labeling individual phages, and were able to examine the post-infection decision in real-time under the microscope, at the level of individual phages and cells5. Here, we describe the full procedure for performing the infection experiments described in our earlier work5. This includes the creation of fluorescent phages, infection of the cells, imaging under the microscope and data analysis. The fluorescent phage is a "hybrid", co-expressing wild- type and YFP-fusion versions of the capsid gpD protein. A crude phage lysate is first obtained by inducing a lysogen of the gpD-EYFP (Enhanced Yellow Fluorescent Protein) phage, harboring a plasmid expressing wild type gpD. A series of purification steps are then performed, followed by DAPI-labeling and imaging under the microscope. This is done in order to verify the uniformity, DNA packaging efficiency, fluorescence signal and structural stability of the phage stock. The initial adsorption of phages to bacteria is performed on ice, then followed by a short incubation at 35&deg;C to trigger viral DNA injection6. The phage/bacteria mixture is then moved to the surface of a thin nutrient agar slab, covered with a coverslip and imaged under an epifluorescence microscope. The post-infection process is followed for 4 hr, at 10 min interval. Multiple stage positions are tracked such that ~100 cell infections can be traced in a single experiment. At each position and time point, images are acquired in the phase-contrast and red and green fluorescent channels. The phase-contrast image is used later for automated cell recognition while the fluorescent channels are used to characterize the infection outcome: production of new fluorescent phages (green) followed by cell lysis, or expression of lysogeny factors (red) followed by resumed cell growth and division. The acquired time-lapse movies are processed using a combination of manual and automated methods. Data analysis results in the identification of infection parameters for each infection event (e.g. number and positions of infecting phages) as well as infection outcome (lysis/lysogeny). Additional parameters can be extracted if desired.

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

This article describes the procedure for preparing a fluorescently-labeled version of bacteriophage lambda, infection of E. coli bacteria, following the infection outcome under the microscope, and analysis of infection results.

بعد الخلوي في مصير<em&gt; E. القولونية</em&gt; بعد الإصابة التي كتبها لامدا بالعاثية

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the ...

A Modified EPA Method 1623 that Uses Tangential Flow Hollow-fiber Ultrafiltration and Heat Dissociation Steps to Detect Waterborne Cryptosporidium and Giardia spp.

Cryptosporidium and Giardia species are two of the most prevalent protozoa that cause waterborne diarrheal disease outbreaks worldwide. To better characterize the prevalence of these pathogens, EPA Method 1623 was developed and used to monitor levels of these organisms in US drinking water supplies 12. The method has three main parts; the first is the sample concentration in which at least 10 L of raw surface water is filtered. The organisms and trapped debris are then eluted from the filter and centrifuged to further concentrate the sample. The second part of the method uses an immunomagnetic separation procedure where the concentrated water sample is applied to immunomagnetic beads that specifically bind to the Cryptosporidium oocysts and Giardia cysts allowing for specific removal of the parasites from the concentrated debris. These (oo)cysts are then detached from the magnetic beads by an acid dissociation procedure. The final part of the method is the immunofluorescence staining and enumeration where (oo)cysts are applied to a slide, stained, and enumerated by microscopy.
Method 1623 has four listed sample concentration systems to capture Cryptosporidium oocysts and Giardia cysts in water: Envirochek filters (Pall Corporation, Ann Arbor, MI), Envirochek HV filters (Pall Corporation), Filta-Max filters (IDEXX, Westbrook, MA), or Continuous Flow Centrifugation (Haemonetics, Braintree, MA). However, Cryptosporidium and Giardia (oo)cyst recoveries have varied greatly depending on the source water matrix and filters used1,14. A new tangential flow hollow-fiber ultrafiltration (HFUF) system has recently been shown to be more efficient and more robust at recovering Cryptosporidium oocysts and Giardia cysts from various water matrices; moreover, it is less expensive than other capsule filter options and can concentrate multiple pathogens simultaneously1-3,5-8,10,11. In addition, previous studies by Hill and colleagues demonstrated that the HFUF significantly improved Cryptosporidium oocysts recoveries when directly compared with the Envirochek HV filters4. Additional modifications to the current methods have also been reported to improve method performance. Replacing the acid dissociation procedure with heat dissociation was shown to be more effective at separating Cryptosporidium from the magnetic beads in some matrices9,13 .
This protocol describes a modified Method 1623 that uses the new HFUF filtration system with the heat dissociation step. The use of HFUF with this modified Method is a less expensive alternative to current EPA Method 1623 filtration options and provides more flexibility by allowing the concentration of multiple organisms.

A Modified EPA Method 1623 that Uses Tangential Flow Hollow-fiber Ultrafiltration and Heat Dissociation Steps to Detect Waterborne Cryptosporidium and Giardia spp.

This protocol describes the use of a tangential flow hollow-fiber ultrafiltration sample concentration system and a heat dissociation as alternative steps for the detection of waterborne Cryptosporidium and Giardia species using EPA Method 1623.

والطريقة وكالة حماية البيئة معدلة 1623 يستخدم تماسي تدفق الجوف الألياف الترشيح الفائق والحرارة خطوات تمييز لكشف تنتقل عن طريق الماء<em&gt; الكريبتوسبوريديوم</em&gt; و<em&gt; الجيارديات النيابة.</em

Cryptosporidium and Giardia species are two of the most prevalent protozoa that cause waterborne diarrheal disease outbreaks worldwide. To better ...

Adenoviral Transduction of Naive CD4 T Cells to Study Treg Differentiation

Regulatory T cells (Tregs) are essential to provide immune tolerance to self as well as to certain foreign antigens. Tregs can be generated from naive CD4 T cells in vitro with TCR- and co-stimulation in the presence of TGF&beta; and IL-2. This bears enormous potential for future therapies, however, the molecules and signaling pathways that control differentiation are largely unknown.
Primary T cells can be manipulated through ectopic gene expression, but common methods fail to target the most important naive state of the T cell prior to primary antigen recognition. Here, we provide a protocol to express ectopic genes in naive CD4 T cells in vitro before inducing Treg differentiation. It applies transduction with the replication-deficient adenovirus and explains its generation and production. The adenovirus can take up large inserts (up to 7 kb) and can be equipped with promoters to achieve high and transient overexpression in T cells. It effectively transduces naive mouse T cells if they express a transgenic Coxsackie adenovirus receptor (CAR). Importantly, after infection the T cells remain naive (CD44low, CD62Lhigh) and resting (CD25-, CD69-) and can be activated and differentiated into Tregs similar to non-infected cells. Thus, this method enables manipulation of CD4 T cell differentiation from its very beginning. It ensures that ectopic gene expression is already in place when early signaling events of the initial TCR stimulation induces cellular changes that eventually lead into Treg differentiation.

Adenoviral gene transfer into naive CD4 T cells with transgenic expression of the Coxsackie adenovirus receptor enables the molecular analysis of regulatory T cell differentiation in vitro.

تنبيغ الفيروسة الغدانية من CD4 الخلايا التائية ساذج لدراسة التمايز Treg

Regulatory T cells (Tregs) are essential to provide immune tolerance to self as well as to certain foreign antigens. Tregs can be generated from naive CD4 ...

Development of an Antigen-driven Colitis Model to Study Presentation of Antigens by Antigen Presenting Cells to T Cells

Inflammatory bowel disease (IBD) is a chronic inflammation which affects the gastrointestinal tract (GIT). One of the best ways to study the immunological mechanisms involved during the disease is the T cell transfer model of colitis. In this model, immunodeficient mice (RAG-/- recipients) are reconstituted with naive CD4+ T cells from healthy wild type hosts.
This model allows examination of the earliest immunological events leading to disease and chronic inflammation, when the gut inflammation perpetuates but does not depend on a defined antigen. To study the potential role of antigen presenting cells (APCs) in the disease process, it is helpful to have an antigen-driven disease model, in which a defined commensal-derived antigen leads to colitis. An antigen driven-colitis model has hence been developed. In this model OT-II CD4+ T cells, that can recognize only specific epitopes in the OVA protein, are transferred into RAG-/- hosts challenged with CFP-OVA-expressing E. coli. This model allows the examination of interactions between APCs and T cells in the lamina propria.

In this antigen-driven colitis model, OT-II CD4+ T cells expressing a red fluorescent protein were adoptively transferred into RAG-/- mice that express a green fluorescent protein in mononuclear phagocytes (MPs). The hosts were challenged with Escherichia coli (E.coli) expressing the ovalbumin protein (OVA) fused to a cyan fluorescent protein (CFP).

تطوير التهاب القولون نموذج مدفوعة مستضد لدراسة عرض المستضدات التي كتبها مستضد الخلايا إلى خلايا T

Inflammatory bowel disease (IBD) is a chronic inflammation which affects the gastrointestinal tract (GIT). One of the best ways to study the immunological ...

Precision-cut Mouse Lung Slices to Visualize Live Pulmonary Dendritic Cells

Inhalation of allergens and pathogens elicits multiple changes in a variety of immune cell types in the lung. Flow cytometry is a powerful technique for quantitative analysis of cell surface proteins on immune cells, but it provides no information on the localization and migration patterns of these cells within the lung. Similarly,&#160;chemotaxis assays can be performed to study the potential of cells to respond to chemotactic factors in vitro, but these assays do not reproduce the complex environment of the intact lung. In contrast to these aforementioned techniques, the location of individual cell types within the lung can be readily visualized by generating Precision-cut Lung Slices (PCLS), staining them with commercially available, fluorescently tagged antibodies, and visualizing the sections by confocal microscopy. PCLS can be used for both live and fixed lung tissue, and the slices can encompass areas as large as a cross section of an entire lobe. We have used this protocol to successfully visualize the location of a wide variety of cell types in the lung, including distinct types of dendritic cells, macrophages, neutrophils, T cells and B cells, as well as structural cells such as lymphatic, endothelial, and epithelial cells. The ability to visualize cellular interactions, such as those between dendritic cells and T cells, in live, three-dimensional lung tissue, can reveal how cells move within the lung and interact with one another at steady state and during inflammation. Thus, when used in combination with other procedures, such as flow cytometry and quantitative PCR, PCLS can contribute to a comprehensive understanding of cellular events that underlie allergic and inflammatory diseases of the lung.

We describe a method for generating Precision-cut Lung Slices (PCLS) and immunostaining them to visualize the localization of various immune cell types in the lung. Our protocol can be extended to visualize the location and function of many different cell types under a variety of conditions.

الرئة ماوس شرائح لتصور لايف الخلايا الجذعية الرئوي قطع الدقة

Inhalation of allergens and pathogens elicits multiple changes in a variety of immune cell types in the lung. Flow cytometry is a powerful technique for ...

An All-on-chip Method for Rapid Neutrophil Chemotaxis Analysis Directly from a Drop of Blood

Neutrophil migration and chemotaxis are critical for our body's immune system. Microfluidic devices are increasingly used for investigating neutrophil migration and chemotaxis owing to their advantages in real-time visualization, precise control of chemical concentration gradient generation, and reduced reagent and sample consumption. Recently, a growing effort has been made by the microfluidic researchers toward developing integrated and easily operated microfluidic chemotaxis analysis systems, directly from whole blood. In this direction, the first all-on-chip method was developed for integrating the magnetic negative purification of neutrophils and the chemotaxis assay from small blood volume samples. This new method permits a rapid sample-to-result neutrophil chemotaxis test in 25 min. In this paper, we provide detailed construction, operation and data analysis method for this all-on-chip chemotaxis assay with a discussion on troubleshooting strategies, limitations and future directions. Representative results of the neutrophil chemotaxis assay testing a defined chemoattractant, N-Formyl-Met-Leu-Phe (fMLP), and sputum from a chronic obstructive pulmonary disease (COPD) patient, using this all-on-chip method are shown. This method is applicable to many cell migration-related investigations and clinical applications.

This article provides the detailed method of performing a rapid neutrophil chemotaxis assay by integrating the on-chip neutrophil isolation from whole blood and the chemotaxis test on a single microfluidic chip.

طريقة الكل على رقاقة للتحليل الكيميائي العدلات السريعة مباشرة من قطرة الدم

Neutrophil migration and chemotaxis are critical for our body's immune system. Microfluidic devices are increasingly used for investigating neutrophil ...

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple condensation reactions. DHDDS (dehydrodolichyl diphosphate synthase) is a eukaryotic long-chain cis-PT (forming cis double bonds from the condensation reaction) that catalyzes chain elongation of farnesyl diphosphate (FPP, an allylic diphosphate) via multiple condensations with isopentenyl diphosphate (IPP). DHDDS is of biomedical importance, as a non-conservative mutation (K42E) in the enzyme results in retinitis pigmentosa, ultimately leading to blindness. Therefore, the present protocol was developed in order to acquire large quantities of purified DHDDS, suitable for mechanistic studies. Here, the usage of protein fusion, optimized culture conditions and codon-optimization were used to allow the overexpression and purification of functionally active human DHDDS in E. coli. The described protocol is simple, cost-effective and time sparing. The homology of cis-PT among different species suggests that this protocol may be applied for other eukaryotic cis-PT as well, such as those involved in natural rubber synthesis.

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

A simple protocol for overexpression and purification of codon-optimized, human cis-prenyltransferase, under non-denaturing conditions, from Escherichia coli, is described, along with an enzymatic activity assay. This protocol can be generalized for production of other cis- prenyltransferase proteins in quantity and quality suitable for mechanistic studies.

أوفيركسريسيون وتنقية الإنسان<em&gt; رابطة الدول المستقلة</em&gt; -prenyltransferase في<em&gt; الإشريكية القولونية</em

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple ...

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor microenvironment and the underlying mechanism is still largely unknown. The lack of a consistent and reliable source of NK cells limits the research progress of NK cell immunity. Here, we report an in vitro system that can provide high quality and quantity of bone marrow-derived murine NK cells under a feeder-free condition. More importantly, we also demonstrate that siRNA-mediated gene silencing successfully inhibits the E4bp4-dependent NK cell maturation by using this system. Thus, this novel in vitro NK cell differentiating system is a biomaterial solution for immunity research.

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

Here, we present a protocol to mass-produce gene-silencing murine NK cells by using a feeder-free differentiation system for mechanistic study in vitro and in vivo.

نظام تغذية خالية رواية للإنتاج الضخم للخلايا القاتلة الطبيعية مورين في المختبر

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor ...

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-&#945;

The main aim of this protocol is to describe the development and validation of an interferon (IFN)-&#945; single molecule array digital Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA) assay. This system enables the quantification of human IFN-&#945; protein with unprecedented sensitivity, and with no cross-reactivity for other species of IFN.
The first key step of the protocol is the choice of the antibody pair, followed by the conjugation of the capture antibody to paramagnetic beads, and biotinylation of the detection antibody. Following this step, different parameters such as assay configuration, detector antibody concentration, and buffer composition can be modified until optimum sensitivity is achieved. Finally, specificity and reproducibility of the method are assessed to ensure confidence in the results. Here, we developed an IFN-&#945; single molecule array assay with a limit of detection of 0.69 fg/mL using high-affinity autoantibodies isolated from patients with biallelic mutations in the autoimmune regulator (AIRE) protein causing autoimmune polyendocrinopathy syndrome type 1/autoimmune polyendocrinopathy-candidiasis-ectodermal dystrophy (APS1/APECED). Importantly, these antibodies enabled detection of all 13 IFN-&#945; subtypes.
This new methodology allows the detection and quantification of IFN-&#945; protein in human biological samples at attomolar concentrations for the first time. Such a tool will be highly useful in monitoring the levels of this cytokine in human health and disease states, most particularly infection, autoimmunity, and autoinflammation.

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-&amp;#945;

Here we present a protocol to describe the development and validation of a single molecule array digital ELISA assay, which enables the ultra-sensitive detection of all IFN-&#945; subtypes in human samples.

التنمية والتحقق من جزيء واحد أولتراسينسيتيفي الصفيف الرقمي المرتبط بالانزيم مقايسة الممتز للبشرية انترفيرون-α

The main aim of this protocol is to describe the development and validation of an interferon (IFN)-&#945; single molecule array digital Enzyme-Linked ...