בסרטון זה, אנו מספקים מדריך צעד אחר צעד לאיסוף עטלפים בצורה הומנית, שנועד למזער את ההשפעה על אוכלוסיות ולמקסם את הערך המדעי. היתרונות של הגישה שלנו הם שאנחנו למקסם את כמות הנתונים המולקולריים והמורפולוגיים הפוטנציאליים עבור כל עטלף, לשמר רקמות כדי לשמור על הערך העתידי שלהם, ולמזער את קצירת אנשים פראיים. קשה להדגים פרוטוקולי ניתוח מילוליים.
רבות מטכניקות הכנת הרקמות שאנו מציגים כאן מועברות בצורה הטובה ביותר באמצעות הדמיה כיצד איברים שונים מזוהים, ולאחר מכן נותפו ומאוחסנים כראוי. הכן את כל הבקבוקונים לפני תחילת כל ניתוחים כדי למנוע עיכובים. עבור RNA, להפריש את מספר הבקבוקונים הדרושים עבור כל דגימה.
סמן כל צינור עם סוג הרקמה שייאסף, כמו גם מידע זיהוי דגימה סטנדרטי. ממלאים את הבקבוקונים 50% מלאים בתותבת ייצוב RNA, ומצננים לארבע מעלות צלזיוס. יש לדאוג לא למלא את הבקבוקונים לחלוטין עם פתרון ייצוב RNA, כמו הצינור עלול להתפוצץ בעת הצבת אותו חנקן נוזלי.
מיד לאחר המתת החסד, בצע עריפת ראש של דגימת העטלף כמתואר בפרוטוקול הטקסט. עור הגולגולת מן השיער, fascia, ושרירי הגולגולת, כולל העור על האף. תדאג לא לשבור את הקצה הקדמי של האף.
הסר את העיניים עם ממטרות, באמצעות כוח חזק מספיק כדי לנתק את עצב הראייה. מניחים את העיניים בבקבוקון שני מיליליטר של פתרון ייצוב RNA. השתמש במספריים כדי להפוך חתך קשתי על החלק הגבי של הגולגולת החל בצוואר, דואג לא לפגוע במוח.
לאחר מכן, השתמש במעצורים כדי למשוך בעדינות את שני צידי הגולגולת, עד שהוא סדוק פתוח לחשוף את המוח. ודא שהגולגולת של הקצה הגולגולתי הוסרה, כך שמדפים יכולים בקלות לגרד את המוח. מגרדים בעדינות את המוח במדפים.
המוח יהיה רך מאוד. נורת הריח תהפוך גלויה, יושבת בחלק הגחוני של פנים הגולגולת. נסה לשמור על נורת הריח מחוברת.
במידת האפשר, לשמור על צורת המוח שלם, ומיד למקם אותו על קרח יבש, או בקבוקון חמישה מיליליטר של פתרון ייצוב RNA. בקצה הגולגולת, הקוכלי צריך להיות גלוי כעת באופן צדדי בכל צד של הראש. השתמש במקלף כדי למשוך בעדינות את cochlei.
לאחר מכן, לשים אותם אחד שני מיליליטר בקבוקון של פתרון ייצוב RNA. בצע שני חתכים שבהם הלסת העליונה והתחתון להצטרף, ולהסיר את הלסת התחתונה. צלחת הקריבריפורם תתברר.
זוהי עצם קריטית כדי לשמור על החוקר מכוון. זה יכול להיות מזוהה כאזור הראשון ביותר של הגולגולת, עם foramen מרובים, ועם שני חריצים שבו נורת הריח מונחת. לאחר הישוב הוסר, להסיר את rostrum מהחלק הנותר של הגולגולת.
ודא שהלסת כוללת את צלחת הקריבריפורם. מניחים את האף בתתבת ייצוב RNA, ולאחסן בארבע מעלות צלזיוס לילה. מן הדם התחתון, לחתוך את הלשון עם מספריים, ומניחים בקבוקון שני מיליליטר של פתרון ייצוב RNA.
מניחים את בקבוקון האף בחנקן נוזלי בעקבות הלילה להשרות בתסכום ייצוב RNA. לאחר 24 שעות של השרייה על קרח, או במקרר, מניחים את הדגימות בחנקן נוזלי. השתמש אזמל לנקב דרך חלל הבטן, מה שהופך חתך אורך עד הצלעות.
זה מאבד את מסגרת השלד. להפשיט את העור כדי לחשוף את שריר החזה, ולקחת לפחות שתי דגימות של שריר. רקמות הן RNA והן DNA נאספים במהלך ניתוחים אלה.
מניחים רקמות עבור DNA משקל מולקולרי גבוה לתוך cryovials יבש, והקפאת פלאש בחנקן נוזלי. מניחים רקמות עבור RNA בת פתרון ייצוב RNA. חותכים דרך עצם החזה, ומרחיקים את הצלעות.
עכשיו, להחזיר את הריאה והלב. השתמש באזמל ומדפים כדי להפריד את הלב מן הריאה. השתמש אזמל כדי לשבור את הריאה, ולמקום פתרון ייצוב RNA.
לאסוף את הלב, אשר ניתן לקחת שלם, אבל צריך להיות חתך לתוך חצאים, כך פתרון ייצוב RNA ספוג ביסודיות. עכשיו, קח דגימות מהכבד. קח לפחות שתי דגימות של כבד.
מניחים דגימה אחת לתוך בקבוקון להישאר קפוא עבור DNA משקל מולקולרי גבוה, ומ מניחים את המדגם השני בתתבת ייצוב RNA. בצע את צינור ההפטר כדי למצוא את הלבלב ואת כיס המרה. מעבירים את כיס המרה לבקבוקון של פתרון ייצוב RNA.
מצא את הקיבה, ואת הטחול דמוי הנוצה בבסיסו, המופיע כגוון שונה של סגול. הלבלב צריך להיות גם גלוי כאן כמבנה משקל. לאסוף את הבטן, הטחול, ואת הלבלב, בקבוקונים בהתאמה של פתרון ייצוב RNA.
לאסוף דגימות קטנות של המעי הדק והגדול. מניחים בקבוקונים בהתאמה של פתרון ייצוב RNA. קח את אחת הכליות, ופעל צינורות שלהם לשלפוחית השתן, ולאחר מכן למקם בקבוקונים בהתאמה של פתרון ייצוב RNA.
השתמש בכליה האחרת כמדריך כדי למצוא את האשכים אם זכר, או רחם ושחלות אם נקבה. לאסוף אחד או שניהם gonads אם אפשר. כמו כן לקחת דגימות של חלקים שונים של העור של הכנף, ולשמור בקבוקונים נפרדים.
היתרון העיקרי של הגישה שלנו הוא שהיא מאפשרת לנו לדגום בעלי חיים בצורה לא קטלנית, תוך יצירת מספיק חומר למחקרים גנומיים, כמו גם מחקרים מולקולריים פונקציונליים. הפרוטוקול שלנו מאפשר הכנת פיברובלסטים ראשוניים מרקמה כנף. התאים מייצגים מקור מתחדש יקר של חומר גנטי, כמו גם מודל לחקר פונקציונלי ומולקולרי בעטלפים.
קטעי כנף שנשמרו במדיה צמיחה לפי סעיף שש של הפרוטוקול הכתוב יש להעביר למתקן תרבות הרקמה. מעבירים את תכולת הצינור לצינור צנטריפוגה חרוטי 15 מיליליטר. ביופסיית קרום הכנף משמשת להדגמה זו.
הסר בזהירות את מדיום הצמיחה. לשטוף בעדינות את הביופסיה פעמיים עם 500 microliters של PBS סטרילי. הוסף 500 מיקרוליטר של מיליגרם אחד לכל קולגנס מיליליטר ארבע לצינור.
זה יגרום לעיכול של הרקמה לתאים בודדים. דגירה לילה ב 37 מעלות צלזיוס ללא תסיסה. ביום השני, לעשות מדיום צמיחה טרי, ו prewarm אותו ל 37 מעלות צלזיוס.
הכן צלחת תרבות רקמה שש היטב על ידי הוספת שני מיליליטר של מדיום צמיחה טרום המלחמה טרי בכל באר של הצלחת לשמש. יש לאחסן את הצלחת ב-37 מעלות צלזיוס וב-5%פחמן דו-חמצני עד לצורך. הסר את הצינור 15 מיליליטר המכיל את התאים מן החממה, ומרווה את תגובת העיכול על ידי הוספת מיליליטר אחד של מדיום צמיחה טרי.
תן שימוש חוזר בתאים על-ידי טריטוריה זהירה של הפתרון עם קצה פיפטה P1000 כדי להשיג השעיה של תא יחיד. בעדינות לסובב את התאים בצנטריפוגה שולחן במשך שלוש דקות ב 300 פעמים G. להשליך את העל טבעי על ידי בעדינות הסרת 80 עד 90% של הנוזל עם פיפטה P1000. תן שימוש חוזר לכדור ב-500 מיקרוליטרים של מדיום צמיחה לפני המלחמה.
בעדינות triturate ההשעיה כדי להבטיח כי גלולה כבר לא גלוי, כי התאים מושעים מספיק, הקפדה להימנע חתיכות קטנות של רקמה אשר עדיין עשוי להיות גלוי על הקירות. בעדינות pipette את כל נפח של מתלים התא לתוך באר אחת של צלחת באר שש שהוכן קודם לכן, המכיל את התקשורת צמיחה לפני המלחמה. מטלטלים בעדינות את הצלחת מצד לצד ומקדים לאחור פעמיים עד שלוש פעמים כדי לעזור לתאים להפיץ על פני השטח של באר בשכבה אחת.
בדוק את התאים הצפויים מתחת למיקרוסקופ. הם צריכים להיות תאים בודדים שנראים מנוערים וצפים, אבל צפופים מאוד. מניחים בזהירות את הצלחת לתוך אינקובטור מוגדר מראש ל 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני.
לאחר כ 24 שעות, לבחון את התאים תחת מיקרוסקופ כדי לקבוע את בריאות התרבות. כעת יש לחבר תאים למשטח הלוח, ולהופיע שטוחים. שמרו על התאים באינקובטור לח קבוע מראש ל-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו-חמצני.
תאים יש לצפות תחת המיקרוסקופ באופן קבוע כדי לקבוע את הצורך רענון מדיה או פיצול. במידת הצורך, שאפו בזהירות כ-50% מהמדיום מהכרכרה, והוסיפו בעדינות מיליליטר אחד של מדיום צמיחה לפני המלחמה לצד הבאר, כדי לא להפריע לתאים. כאשר יש צורך לעבור את התאים, בזהירות שאף כ 90% של מדיום הצמיחה.
לשטוף את התאים בעדינות רבה על ידי הוספת מיליליטר אחד של PBS סטרילי לקיר של באר, כדי לא להפריע לתאים. מטלטלים בעדינות את הצלחת קדימה ואחורה וצד לצד פעמיים עד שלוש פעמים. בזהירות שאף את כל PBS מהצלחת לפני שטיפת התאים שוב.
מוסיפים את טריפסין EDTA לגם, ומטלטלים בעדינות את הצלחת כדי לכסות את כל פני השטח של באר עם טריפסין EDTA, ו דגירה במשך 1 וחצי דקות בטמפרטורת החדר. יש להתוות את התגובה על-ידי הוספת מיליליטר אחד של מדיום צמיחה טרי לפני המלחמה. פיפטה למעלה ולמטה כחמש פעמים כדי לשטוף את התאים מפני השטח של הצלחת, ולהבטיח את התאים הם בהשעיה.
מניחים את ההשעיה התא בצינור 15 מיליליטר, ולסובב את התאים בצנטריפוגה שולחן במשך שלוש דקות ב 300 פעמים G.השלך את העל טבעי על ידי בעדינות הסרת 80 עד 90 אחוזים של הנוזל עם פיפטה P1000. תן מחדש את גלולה במיליליטר אחד של מדיום צמיחה מראש, בעדינות triturate ההשעיה. ודא כי גלולה או שברים גדולים של גלולה אינם גלויים עוד, ותאים נמצאים בהשעיה תא יחיד.
כדי לספור את התא באמצעות מונה תאים אוטומטי, יש לערבב 10 מיליליטר של התאים התלויים אחד לאחד עם כחול טריפאן כדי לזהות תאים בני קיימא. דגירה לדקה אחת, ו pipette 10 microliters של הפתרון על שקופית הספירה. הוסף את שקופית הספירה לתוך מונה תאים אוטומטי כדי לספור את התאים באמצעות ההגדרות המתאימות.
הכן מדיה קפואה על-ידי שילוב מדיום צמיחה עם DMSO כדי לקבל ריכוז סופי של 10%DMSO. יש להכין את גלולה מ 80 עד 90% confluent גם של צלחת שש באר. תן את הכדור במיליליטר וחצי של מדיום מקפיא.
מניחים כ 750 microliters של השעיית תא בכל אחד משני cryovials נפרדים. מניחים את הבקבוקונים במיכל הקפאה קריוגני, כך התאים להקפיא לאט כדי לשמור על חיוניות התא. מיד מניחים אותם במינוס 80 מעלות צלזיוס.
כדי להפשיר את התאים הקפואים, הכינו צלחת בארות המכילה שני מיליליטר של מדיום צמיחה לפני המלחמה בכל באר שתשמש. שמור על הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני אינקובטור עד הצורך. קח בקבוקון אחד של תאים מחנקן נוזלי, והצב אותו באמבט מים חמים כדי להפשיר במהירות את התאים.
זה אמור לקחת שתיים עד שלוש דקות. ברגע שהפתרון בבקבוקון מופשר, בעדינות פיפטה למעלה ולמטה כדי הומוגניזציה של הפתרון, ומיד למקם את הפתרון כולו באר אחת מתוך שש צלחת היטב. מטלטלים בעדינות את הצלחת מצד לצד ומקדים לאחור פעמיים עד שלוש פעמים כדי לעזור לתאים להפיץ על פני השטח של באר בשכבה אחת.
מניחים את התאים באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס וחמישה אחוז פחמן דו חמצני במשך 24 עד 48 שעות. לפקח ולמעבר התאים כפי שהוכח. תוצאות מייצגות של עקירות DNA מוצגות לניתוחי דנ"א סטנדרטיים משלושה מיני עטלפים.
רצועה גדולה אחת מצביעה על פיצול מינימלי, ושברי דנ"א בגודל דומה מכל מיצוי בהתאמה. אינדיקטור נפוץ להצלחה עבור עקירות RNA הוא מספר שלמות RNA, או RIN, עם ערכים מעל שמונה המייצגים איכות גבוהה ב- RNA טקט. מוצגים להלן ערכי RIN של עקירות RNA מ -13 סוגים שונים של רקמות של מיני עטלפים נאוטרופיים, שנדגמו בארבעה יישובים שונים.
רקמות שנדגמו ממינים באנדים, קוסטה ריקה, ואת הרפובליקה הדומיניקנית הונחו ישירות חנקן נוזלי לאחר השרייה בתותבת ייצוב RNA בארבע מעלות צלזיוס לילה. רקמות שנדגמו ממינים באמזונס הונחו בחנקן נוזלי כשבוע לאחר שהציבו פתרון ייצוב RNA, והמשיכו לייצב בארבע מעלות צלזיוס ברציפות. גם במקרים כאלה, ערכי RIN היו דומים לאלה שהוצבו מיד בתתברית ייצוב RNA, ישירות לתוך חנקן נוזלי.
בעקבות תרבות הרקמה, תותבי תאי העטלף צריכים לכסות 80 עד 90% משטח הלוח, ולשמור על המורפולוגיה המקורית שלהם. זה מייצג את השלב האופטימלי לפיצול. לאחר יותר משישה קטעים, התאים ישנו את המורפולוגיה שלהם כדי להיות גדולים יותר ויותר, והתאים ייכנסו לחושים.
תאים בהירים עם כדורים מייצגים תאים מתים. תאים בתרבות מייצגים מקור מתחדש של חומר, כמו דנ"א, רנ"א וחלבון. ניתן להקפיא קווי תאים אלה, ובכך לספק משאב שניתן להשתמש בו לאורך שנים רבות של מחקר.
זה מאפשר מחקרים גנומיים, תעתיקים ופונקציונליים שיהיו מאתגרים באמצעות רקמות ראשוניות. לדוגמה, תאים ניתן לשנות גנטית או כימית כדי לבחון את ההשפעות על פנוטיפים הסלולר.
