עבודה זו נתמכה על ידי קרן המחקר הגרמני (DFG) SCHU-2681 / 1-1 (CS) וKFO 146 (MF), מחלקת DOD של מחשב מענק הגנה 040,972 (MO) והמכון הלאומי לבריאות מעניקים RO1 CA108835 , RO1 Ai44129 (JPS)

.1 ייצור של HLA-A2-איג בהתבסס KaAPC <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן חיץ borate סטרילי. בצע פתרון 0.1 M של חומצה בור במים ולהתאים את רמת החומציות ל7.0. סינון סטרילי (0.22 מיקרומטר) חיץ ולאחסן ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן לשטוף חיץ חרוז סטרילי. השתמש בופר פוספט (PBS) ללא מגנזיום וסידן. להוסיף סרום AB אנושי ל3% ריכוז סופי. הוספת חומצת ethylenediaminetetraacetic (EDTA) ל2 מ&quot;מ ריכוז סופי. להוסיף אזיד הנתרן (NaN 3) ל0.01% ריכוז סופי. סינון סטרילי (0.22 מיקרומטר) חיץ ולאחסן ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את 250 μl של חרוזים אפוקסי (כ -100 x 10 6 חרוזים) ממניות לסטרילי, לדפוק בקבוקון זכוכית עליון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 250 μl של חיץ borate. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים בקבוקון זכוכית על מגנט ולתת חרוזים לדבוק למשך 2 דקות; לשאוב חיץ ולהסיר בקבוקון זכוכית ממגנט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף חרוזים פעם אחת עם 1 מ&quot;ל חיץ borate. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חרוזים Resuspend ל550 μl של 0.018 מיקרוגרם/ מ&quot;ל ​​HLA-A2 איג ו3.64 מיקרוגרם / CD95 מב (CH11 שיבוט) מ&quot;ל אנטי אנושי ולערבב בעדינות על ידי רועד. (אנא ראה סעיף דיון לקבלת מידע נוסף.) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה בקבוקון זכוכית בסופו של דבר מסובב מעל הסוף, ב 4 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין למטה חרוזים XG 300 2 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח בקבוקון זכוכית על מגנט במשך 2 דקות ולשאוב &quot;פתרון טעינת KaAPC&quot;; להסיר בקבוקון זכוכית ממגנט, להוסיף 1 מ&quot;ל של חיץ לשטוף חרוז וresuspend בקפידה על ידי רועד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלב 1.10 פעמיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה בקבוקון זכוכית על הכתף על 4 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות בחיץ לשטוף חרוז 1 מ&quot;ל. בשלב זה, כל החלבון שיורית אתרי קישור יהיה חסום על ידי סרום AB האנושי הכלול במאגר לשטוף חרוז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין למטה חרוזים XG 300 2 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זכוכית מקום בקבוקון על מגנט במשך 2 דקות ולשטוף חיץ חרוז לשאוב; להסיר בקבוקון זכוכית מהמגנט ולהחליף פתרון עם 1 מ&quot;ל של PBS. </li></ol> .2 טוען בקרת האיכות, פפטיד, Washing, חפצים, ויציבות של KaAPC <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את 1.5 x 10 5 KaAPC לתוך צינור FACS ולשטוף עם 1 מ&quot;ל FACS לשטוף חיץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חרוזים גלולים ב100 μl FACS הצפה לשטוף ולהוסיף 1 μl של אנטי עכבר IgG1 PE (לצורך זיהוי של חלק Fc של HLA-A2 איג) וμl 1 של אנטי העכבר IgM FITC (שיבוט R6-60.2, לגילוי של מב CD95 אנטי האנושי). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה של 15 דקות ב 4 ° C, לשטוף עם 1 מ&quot;ל FACS לשטוף חיץ, וגלול ב250 FACS μl לשטוף הצפה ולקרוא הכתמה על ידי cytometry זרימה. </li></ol><img alt="איור 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51859/51859fig1highres.jpg" width="500" /> איור 1 כתם QC של אצווה KaAPC עשה כאמור בסעיף בפרוטוקול. מכתים בוצע כפי שתואר בסעיף 2 פרוטוקול HLA-A2 איג זוהה באמצעות אנטי עכבר IgG1 PE מב, ואילו אנטי אנושי-CD95 (Anti-Fas) זוהה עם אנטי עכבר IgM FITC מב (ראה פרוטוקול section 2.2) (קו כחול). גרפים שחורים מילאו לייצג חרוזים ריקים מוכתמים אנטי עכבר IgG1 PE מב או אנטי עכבר IgM FITC מב, בהתאמה. מספרים בפינה הימנית העליונה מצביעים על עוצמת הניאון הממוצעת (MFI). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51859/51859fig1highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <ol start="4" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעברת טעינת פפטיד 20 x 10 6 KaAPC לתוך בקבוקון זכוכית סטרילית חדש, למקם על גבי מגנט במשך 2 דקות, חרוזים לשאוב PBS והגלול ל500 PBS μl טרי עם 5 פפטיד מיקרוגרם (זכרו, פפטידים HLA-A2 רק מוגבלים יהיו להיקשר אל דימר!). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חנות עמוסה KaAPC ב 4 ° C עד שימוש, לפחות 3 ימים כדי לאפשר טעינת פפטיד מספיק על דימר HLA-A2 איג. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייד לפני השימוש, לשטוף את הפפטיד הטעון KaAPC כפי שצוין ב1.14; חזור על שלב זה לפחות 6x. הערה: מדוברת בצעד חיוני כדי להבטיח כי יש פפטיד החופשי to להסיר לחלוטין, כדי למנוע תוצאות הרג חיוביות כוזבות; פפטיד החופשי השיורי הוכח לגרום למות תאים מתוכנת בתרביות תאי T אנטיגן הספציפיים 9. כדי לשלול השפעת פפטיד מסיסה, להפעיל דגימות שליטת supernatant של הפפטיד הטעון ורחץ KaAPC (ראה 3.8). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לספור החרוזים באמצעות hemocytometer ותווית עם תאריך, שמו של פפטיד וריכוז. הערה: טעון KaAPC להישאר פונקציונלי ב 4 מעלות צלזיוס למשך חודש אחד לפחות. לאחר חודש אחד, מחדש טעינה עם אותו פפטיד מאפשרת KaAPC כדי להיות מנוצלת לעד שנה. </li></ol> Assay הריגת 3 KaAPC במבחנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן תקשורת תרבות משותפת. להכין מדיום RPMI מלא בתוספת 3% גורם גדילת תאי T (שנעשה במעבדה 6) ו -3% הפלזמה אוטולוגית תורם. אם פלזמה אוטולוגית תורם אינה זמינה, להשתמש בסרום AB אנושי חום מומת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן הכנת חיץ מחייב AnnexinV. לפזר 8.12 כלוריד גרם נתרן (NaCl) ו0.12 ​​calc גרםכלוריד ium (CaCl 2) ל990 DDH מ&quot;ל 2 O.Add 10 מ&quot;ל חיץ 1M HEPES. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לייצר תאי T אנטיגן ספציפי לאדם. (לפרוטוקול מפורט בבקשה לראות פרסום קודם 7 ניצול תאים מלאכותיים הצגת אנטיגן (aAPC)). ודא שהספציפיות פפטיד היא לפחות&gt; 75% כפי שנקבע על ידי מכתים tetramer. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור כל דגימת דגירה 2 x 10 5 תאי T אנטיגן ספציפי היטב (בצלחת תחתונה 96 גם עגולה) ב200 μl של מדיום התרבות המשותפת ב1 /: 1 יחס עם KaAPC ל48 שעות בחממה humidified על 37 מעלות C ו 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגימות קציר ולהעביר לתוך צינור FACS; לשטוף עם 1 מ&quot;ל AnnexinV מאגר מחייב, ספין למטה XG 300 5 דקות, להשליך supernatant וגלול בשל חיץ מחייב AnnexinV 100 μl </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגימות כתם עם μl 1 AnnexinV FITC ו5 μl 7-AAD ל10-15 דקות ב RT, לשטוף עם 1 מ&quot;ל חיץ מחייב AnnexinV; ספין למטה XG 300 5 דקות, להשליך supernatantresuspend ד בחיץ מחייב 250 μl AnnexinV </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קראו דגימות באופן מיידי על זרימת cytometer. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הדגימות הבאות כדי לקבוע הרג אנטיגן הספציפי על ידי KaAPC: תאי T בלבד; תאי T אנטי CD95 + המסיס; תאי T + פרק KaAPC; + פפטיד שאינו מאותו מקור התאים T נטען KaAPC; + פפטיד מקור תאי T נטען KaAPC; תאים + supernatant T של פפטיד המקור טעון KaAPC. </li></ol><img alt="איור 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51859/51859fig2highres.jpg" width="500" /> . איור 2 KaAPC assay הרג פפטיד טעון KaAPC או חרוזים שליטה (HLA-A2 איג רק חרוזים) היו בתרבית למשך 48 שעות ב1: 1 עם תאי CMVpp65 ספציפיים T (~ 80%), שנקטפו ולאחר מכן מוכתם בAnnexinV ויודיד propidium (PI) כדי לקבוע אפופטוזיס על ידי cytometry זרימה (ראה סעיף פרוטוקול 3.3-3.7). &quot;מאותו המקור&quot; מתייחס לחרוזים עמוסים CMVpp65 ו&quot; שאינו מאותו המקור &quot;להיותמודעות עמוסות בפפטיד מארט-1. מספרים מציינים את אחוז תאי T קיימא ברבע השמאלי התחתון של כל עלילה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51859/51859fig2highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <ol start="9" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לבצע שתי וערב-ניסויים, לייצר תאי T אנטיגן הספציפי של שתי ספציפיות שונות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בהמשך להעריך את הדלדול-יכולות אנטיגן ספציפי של KaAPC עם ניתוח סימולטני של חיסול אנטיגן הספציפי של תאי T באוכלוסיית תאי T הטרוגנית. (לפרוטוקול מפורט בבקשה לראות אל שיץ et. 10). </li></ol>

<ol>
	<li>Bizzaro, N., Tozzoli, R., Shoenfeld, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Are+we+at+a+stage+to+predict+autoimmune+rheumatic+diseases.">Are we at a stage to predict autoimmune rheumatic diseases.</a> Arthritis and rheumatism. 56 (6), 1736-1744 (2007).</li><li>Sch&#252;tz, C., Oelke, M., Schneck, J. P., Mackensen, A., Killer Fleck, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=artificial+antigen-presenting+cells:+the+synthetic+embodiment+of+a+&#8220;guided+missile.">artificial antigen-presenting cells: the synthetic embodiment of a &#8220;guided missile.</a> Immunotherapy. 2 (4), 539-550 (2010).</li><li>Hoves, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mature+but+not+immature+Fas+ligand+(CD95L)-transduced+human+monocyte-derived+dendritic+cells+are+protected+from+Fas-mediated+apoptosis+and+can+be+used+as+killer+APC.">Mature but not immature Fas ligand (CD95L)-transduced human monocyte-derived dendritic cells are protected from Fas-mediated apoptosis and can be used as killer APC.</a> Journal of immunology (Baltimore, Md.: 1950). 170 (11), 5406-5413 (2003).</li><li>Hoves, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elimination+of+activated+but+not+resting+primary+human+CD4++and+CD8++T+cells+by+Fas+ligand+(FasL/CD95L)-expressing+Killer-dendritic+cells.">Elimination of activated but not resting primary human CD4+ and CD8+ T cells by Fas ligand (FasL/CD95L)-expressing Killer-dendritic cells.</a> Immunobiology. 208 (5), 463-475 (2004).</li><li>Sch&#252;tz, C., Hoves, S., Halbritter, D., Zhang, H. -. G., Mountz, J. D., Fleck, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alloantigen+specific+deletion+of+primary+human+T+cells+by+Fas+ligand+(CD95L)-transduced+monocyte-derived+killer-dendritic+cells.">Alloantigen specific deletion of primary human T cells by Fas ligand (CD95L)-transduced monocyte-derived killer-dendritic cells.</a> Immunology. 133 (1), 115-122 (2011).</li><li>Oelke, M., Maus, M. V., Didiano, D., June, C. H., Mackensen, A., Schneck, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+induction+and+expansion+of+antigen-specific+cytotoxic+T+cells+by+HLA-Ig-coated+artificial+antigen-presenting+cells.">Ex vivo induction and expansion of antigen-specific cytotoxic T cells by HLA-Ig-coated artificial antigen-presenting cells.</a> Nature. 9 (5), 619-624 (2003).</li><li>Chiu, Y. -. L., Schneck, J. P., Oelke, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HLA-Ig+based+artificial+antigen+presenting+cells+for+efficient+ex+vivo+expansion+of+human+CTL.">HLA-Ig based artificial antigen presenting cells for efficient ex vivo expansion of human CTL.</a> Journal of Visualized Experiments : JoVE. (50), (2011).</li><li>Sch&#252;tz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Killer+artificial+antigen-presenting+cells:+a+novel+strategy+to+delete+specific+T+cells.">Killer artificial antigen-presenting cells: a novel strategy to delete specific T cells.</a> Blood. 111 (7), 3546-3552 (2008).</li><li>Snow, A. L., Pandiyan, P., Zheng, L., Krummey, S. M., Lenardo, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+power+and+the+promise+of+restimulation-induced+cell+death+in+human+immune+diseases.">The power and the promise of restimulation-induced cell death in human immune diseases.</a> Immunological reviews. 236 (1), 68-82 (2010).</li><li>Sch&#252;tz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+flow+cytometric+assay+for+the+simultaneous+analysis+of+antigen-specific+elimination+of+T+cells+in+heterogeneous+T+cell+populations.">A new flow cytometric assay for the simultaneous analysis of antigen-specific elimination of T cells in heterogeneous T cell populations.</a> Journal of immunological. 344 (2), 98-108 (2009).</li><li>Shen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=artificial+antigen-presenting+cells+deplete+alloantigen-specific+T+cells+in+a+murine+model+of+alloskin+transplantation.">artificial antigen-presenting cells deplete alloantigen-specific T cells in a murine model of alloskin transplantation.</a> Immunology letters. 138 (2), 144-155 (2011).</li><li>Perica, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+artificial+antigen+presenting+Cells+for+T+cell+immunotherapy.">Nanoscale artificial antigen presenting Cells for T cell immunotherapy.</a> Nanomedicine nanotechnology, biology, and medicine. 10 (1), 119-129 (2013).</li><li>Sunshine, J. C., Perica, K., Schneck, J. P., Green, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Particle+shape+dependence+of+CD8++T+cell+activation+by+artificial+antigen+presenting+cells.">Particle shape dependence of CD8+ T cell activation by artificial antigen presenting cells.</a> Biomaterials. 35 (1), 269-277 (2013).</li></ol>

יש לי CS וMF שום דבר לגלות. תחת הסכם רישוי בין NexImmune ואוניברסיטת ג&#39;ונס הופקינס, בני הזוג. שנק וOelke זכאים למניות של תמלוגים שהתקבלו על ידי האוניברסיטה במכירות של מוצרי aAPC המתוארים במאמר זה. הם גם בעלי מניות NexImmune, אשר כפופה למגבלות מסוימות על פי פוליסת אוניברסיטה. ד&quot;ר שנק הוא חבר של חברת המועצה של &quot;המנהלים וועדה מדעית מייעצת. המונחים של הסדר זה מנוהלים על ידי אוניברסיטת ג&#39;ונס הופקינס בהתאם לסכסוך שלה של מדיניות ריבית.

השלב הקריטי ביותר בפרוטוקול הוא להבטיח היחס המתאים של (פפטיד MHC) אות 1 ואות 2 (אנטי Fas מב). אנחנו ביצענו ניסויי טיטרציה אינטנסיביים כדי להגדיר את היחס המושלם לאות 1 ו -2; התברר כי וריאציות מינימליות, בשל הבדלים בדימר HLA-A2 איג או ריכוזי מב-Fas אנטי יכולות להפריע לפעולה התקינה של KaAPC. לפיכך, הריכוז של שני האותות תמיד צריך להיות מאומת ואיכות של שני החלבונים יש לעתים קרובות נבדקה גם אם זה הוזמן ממקור מסחרי. יתר על כן, תמיד צריכים להיקבע הריכוזים על ידי אותו assay כמבחני זיהוי שונים עלולים לגרום לריכוזים שונים. הפונקציונליות של HLA-A2 איג גם יכולה להיפגע בשל refolding שלם ו / או טעינת פפטיד לא יעילה. יתר על כן מולקולות דימר יכולות לצבור בדרגות שונות, אשר עשוי להשפיע על הפעילות הפונקציונלית של החלבון. לכן, actuסכום אל של דימר דרוש לדור של KaAPC פונקציונלי וספציפי עשויים להשתנות. בנוסף, מצאנו כי הטווח האידיאלי למוות גרימת אות נגד פאס מב על KaAPC הוא הדוק ביותר. בכמויות הידיים שלנו גדול יותר 3.64 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​יגרום להרג הלא ספציפי של תאי T החיובי Fas ואילו סכומים מתחת 3.64 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​הביאו לפעילות הרג מופחתת בהתאם מינון. בעוד תנאים אלה נראים די הדוקים, תשומת לב לפרטים אלה יגרום לדור של KaAPC פונקציונלי וספציפי. בעוד פנוטיפ KaAPC הנוכחי הוא פונקציונלי לדלדול של תאים מופעלים אנטיגן ספציפי T, ניסויים ראשוניים מיקוד תאי T אנטיגן הספציפי לנאיביים או מנוחה לא גילה אינדוקציה משמעותית של אפופטוזיס אנטיגן הספציפי לאוכלוסיות אלה הקטינו ביטוי Fas. לכן, אפשר לדמיין הוספת אות שיתוף גירוי על KaAPC לגרום עד תקנה של פאס במנוחת תאי T כדי להפוך להפוך אותם<html> ליעד לKaAPC. אמנם זה אפשרי כל שלושת האותות יצטרכו להיות טיטרציה בקפידה כדי להבטיח פנוטיפ KaAPC פונקציונלי. התאמת פלטפורמת חרוז למטריצה ​​ביולוגית או מתכלה תשפר KaAPC בתחולת vivo. לאחרונה, שן et al. דיווחו מוצלח בשימוש vivo של KaAPC ניצול 5 חרוזים לטקס מיקרומטר מצומדת לנגד פאס (שיבוט Jo2) ואנטי / H2-K ב -TRP2 11. אנחנו כבר הצלחנו להראות כי הרעיון הכללי של תאים מלאכותיים הצגת אנטיגן (aAPC) ניתן להעביר בהצלחה ממיקרומטר בגודל חלקיקים בגודל ננומטר 12 ופונקציונליות שמושפעת מגיאומטרית חלקיקי 13. כך, על ידי שינוי הגודל ו / או צורה של KaAPC עתיד עיצובים אחד יוכל להשפיע על הפונקציונליות in vivo ו ביו הפצה, אשר יכול להיות מפתח לטיפול מוצלח במחל אוטואימוניות מסוימות איבר. ילדה = &quot;jove_content&quot;&gt; KaAPC להתגבר על החסרונות העיקריים של אסטרטגיות שחסכו בתאים מבוססים כקלה לשימוש &quot;מהמדף&quot;, זמן וגישה יעילה עלות שאינו תלוי במצב תורם וטיפול מקדים. KaAPC אינו מטרה של עצמי או איתות הרג אוטוקריני ואינו רגישה לפונקציות מפעיל cytolytic של CTL. KaAPC ידרוש זיהוי של אנטיגן המחלה הרלוונטי ולהסתמך על סוג HLA הספציפי שלהם. בעוד אנטיגנים HLA-A2 מוגבלים רבים כיום מתאימים לסוכרת מהסוג 1, מחלת שתל נגד מאחסן וטרשת כפולות זוהו 2, פיתוח של נוספת HLA כיתה אני דימר מולקולות כמו גם זיהוי השוטף של אנטיגנים רלוונטיים אוטואימוניות חדשים יגדיל עוד יותר ולהרחיב את תחולתו של KaAPC. יתר על כן אחד יכול לחשוב על שימוש KaAPC מכוון אפיטופים שונים כדי למקד אנטיגנים מרובים בו זמנית. לסיכום, KaAPC מייצג פלטפורמה טכנולוגית גמישה לtigen ספציפי שחסך בתאי T. הטבע &quot;כמו לגו-&quot; שלהם מאפשר ההכללה של אותות חדשים כגון אותות נוספים שיתוף גירוי או מעכבות כגון PD1 או TRAIL על מטריצות שונות, אשר יכול להרחיב ולשפר הבאים שלהם במבחנה ובתחולת vivo. אנחנו במסמך זה נציג את פרוטוקול צעד אחר צעד כדי ליצור KaAPC, הגישה מבוססת חרוז הראשון לחיסולם של תאי T אנטיגן ספציפי מתערובות תא T עם ספציפיות שונות. <img alt="איור 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51859/51859fig3highres.jpg" width="500" /> איור 3 KaAPC לחסל CTL באופנת אנטיגן ספציפי PKH26 שכותרתו הופעלה CTL מפעיל זיכרון Fas + וPKH67 שכותרתו CTL CMVpp65 הספציפי מאותו התורם היו מעורב ל1:. יחס 1 ושיתוף תרבותי עם CMVpp65 KaAPC ל48 שעות. טופלו תרבויות שליטה עם KaAPC נפרק, או 1 מיקרוגרם / מ&quot;לשל מסיס נגד פאס-מב (CH11 שיבוט). הפסד מינימאלי של תאי קיימא נקבע בתרבויות שלא טופלו מעורבות CTL (תערובת T). נתונים FACS מקוריים לכל אוכלוסיית CTL של תמהיל T מוצגים. ניתוח של אפופטוזיס בוצע כפי שפורסם בעבר על ידי gating הנפרד בשתי אוכלוסיות תאי T 10. מספרים המתוארים ברביעים שמאלי העליונים מייצגים% מתאים בסך הכל. הדמות הממחישה נגזרת מניסוי נציג אחד מתוך שלושה ניסויים בלתי תלויים. מחקר זה פורסם במקור בדם. . שיץ, ג et al Killer תאי מציגי אנטיגן מלאכותיים: אסטרטגית רומן למחוק תאי T ספציפיים דם.. 2008; 111, 3,546-52. כל הזכויות שמורות האגודה להמטולוגיה האמריקנית. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51859/51859fig3highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

במהלך שני העשורים האחרונים התקדמות רבה נעשתה בהבנת המנגנונים פתוגניים של מחלות אוטואימוניות. עם זאת, הטיפולים הנפוצים ביותר עדיין מסתמכים על סטרואידים, כמו גם תרופות לדיכוי מערכת חיסון כגון תחליפי פורין, סוכני אלקילציה ומעכבי calcineurin 1. השימוש בתרופות מסוג זה שיפר מאוד את סיכויי ההחלמה של חולים, עדיין הטיפול אינו מספק תרופה של התקלה החיסונית הבסיסית. יתר על כן, החולים נעשים פגיעים לזיהומים ולהתפתחות של הסרטן. מכאן המטרה האולטימטיבית לטיפול במחל תאי T בתיווך אוטואימוניות ודחייה של שתל היא למקד מחלה רק גורמת לתאי T בזמן, באותו הזמן, והשאיר את המערכת החיסונית שנותרה ללא שינוי ומוסמך להילחם בהפרעות חיסוניות ספציפי. תאי מציגי אנטיגן ניצול (APC) כטיפול לדיכוי תגובות תא T היקפיים תוארו לראשונה מוקדם ככל1970s על ידי מספר קבוצות. מאז רבות גישות מבוססות תאים פותחו (שנסקר בשיץ et al. 2). אסטרטגיות באמצעות להביע מקאל רוצח-APC כתאי immunoregulatory הראו תוצאות מבטיחות מציינות פוטנציאל טיפולי לטיפול במחלת חיסון עצמי, דחייה של שתל וזיהומים כרוניים. עם זאת, קיימות מגבלות משמעותיות באסטרטגיות ניצול מקאל Killer-APC שסופו של דבר מוגבל היישום הקליני שלהם; דור (i) או בידוד של APC הוא זמן, עבודה ועלות אינטנסיבית (ii) לחולים הסובלים מcytopenia בשל דיכוי חיסוני לספק כמויות ואיכות של תאים מוגבלים (iii) ציפוי או התמרה של APC עם אותות אפופטוזיס גרימה כגון תוצאות מקאל במאוד פנוטיפים משתנים ו( iv) Killer-APC רגיש לציטוטוקסיות פונקציות מפעיל של תאי T וכתוצאה מכך צמצום הפוטנציאל הטיפולי שלהם. לכן, קשה להבטיח pheno Killer-APC מוגדר לשחזורסוג שיכול להיות מנוצל לאפנון אנטיגן הספציפי של תגובות תא T in vivo. בהתבסס על העבודה הקודמת שלנו עם מקאל להביע Killer-APC 3-5 ותאים מלאכותיים הצגת אנטיגן (aAPC) 6,7 פיתחנו גישה המבוססת על חרוז (KaAPC) לעיכוב אנטיגן ספציפי או חיסול של תאי T אוטומטי-reactive ב מבחנה. KaAPC מורכב של דימר HLA-A2 איג (אות 1) ומב נגד פאס (אות גרימת אפופטוזיס) המשותק קוולנטית על גבי משטח של 4.5 מיקרומטר חרוז לטקס פאראמגנטיים. הם מרוקנים את תאי T אנטיגן ספציפי באופנה בתיווך Fas / מקאל מתרביות תאי T של ספציפיות מרובות באופן אנטיגן ספציפי ועצמאיים של המוות של תאי הפעלה מושרה המסלול (AICD). אפופטוזיס התלוי מינון בתאי T ממוקד מושרה במהירות כבר לאחר 30 דקות 8. KaAPC יכול להיות שנוצר בקלות בצורה מבוקרת להבטיח מוגדר מphenot המדףype ולהתגבר על רוב החסרונות של אסטרטגיות שחסכו בתאים מבוססים. כתוצאה מכך, KaAPC להציג פוטנציאל גדול לטיפול במחל תאי T בתיווך אוטואימוניות ודחייה של שתל, קידום תחום אסטרטגיות טיפול ספציפיים תא T.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="654">
	<tbody>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:185px;">Name</td>
			<td style="width:157px;">Company</td>
			<td style="width:148px;">Cat #</td>
			<td style="width:164px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">human AB serum</td>
			<td>Atlanta biologicals</td>
			<td>S40110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EDTA</td>
			<td>Sigma/Aldrich</td>
			<td>E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">sodium azide</td>
			<td>Sigma/Aldrich</td>
			<td>71289</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">M-450 epoxybeads</td>
			<td>Invitrogen/Dynal</td>
			<td>14011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MPC-1 magnet</td>
			<td>Invitrogen/Dynal</td>
			<td>12001D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">screw top glass vial</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>03-338AA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MACSmix Tube Rotator</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-090-753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-CD95 (clone CH11)</td>
			<td>Milliore</td>
			<td>05-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HLA-A2-Ig dimer</td>
			<td>BD/Pharmingen</td>
			<td>551263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cryo-tube 2ml</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-mouse IgG1 PE</td>
			<td>BD/Pharmingen</td>
			<td>559320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-mouse IgM FITC</td>
			<td>BD/Pharmingen</td>
			<td>553408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">sodium chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>S271-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">calcium chloride</td>
			<td>Sigma/Aldrich</td>
			<td>C5080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES&#160;</td>
			<td>cellgro/Mediatech</td>
			<td>25-060-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RPMI</td>
			<td>gibco/life technologies</td>
			<td>11875-085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">96well round bottom plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">AnnexinV FITC</td>
			<td>PromoKine</td>
			<td>PK-CA577-1001-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">7-AAD</td>
			<td>BD/Pharmingen</td>
			<td>51-68981E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FACS tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352008</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

killer artificial antigen presenting cells (kaapc) for efficient in vitro depletion of human antigen-specific t cells

טיפול שוטף של מחלות אוטואימוניות בתיווך תא T מסתמך בעיקר על אסטרטגיות של דיכוי חיסוני הגלובלי, אשר, בטווח הארוך, מלווה בתופעות לוואי שליליות כגון יכולת מופחתת לשלוט זיהומים או ממאירויות. לכן, גישות חדשות צריכים להיות מפותחות המתמקדים רק תאי המחלה תיווך ולעזוב את המערכת החיסונית שנותרה ללא פגע. בעשור האחרון במגוון של אסטרטגיות טיפול חיסוני תא מבוסס לווסת תגובות חיסוניות תא בתיווך T פותחו. רוב הגישות אלו מסתמכות על תאים וישכנע סובלנות הצגת אנטיגן (APC). עם זאת, בנוסף להיותו קשה ומסורבל מבחינה טכנית, גישות מבוססות תאים כאלה הן רגישות מאוד לתגובות רעילות לתאי T תא, אשר מגבילה את היכולת הטיפולית שלהם. כאן אנו מציגים פרוטוקול לדור של תאי הצגת אנטיגן מלאכותיים רוצח בלתי תאי (KaAPC), המאפשר לדלדול של תאי T פתולוגיים תוך השארת מחדשמערכת חיסונית נותרת ללא שינוי ופונקציונלי. KaAPC הוא פתרון חלופי לטיפול חיסוני התאי שבו יש פוטנציאל לטיפול במחלות אוטואימוניות ודחיות של שתל על ידי ויסות תגובות תא T לא רצויות באופנה ספציפית אנטיגן.

התכונות של פרוטוקול זה כוללות את הדור מוגדר של פנוטיפ KaAPC שמציג HLA-A2 איג (אות 1) ונגד פאס מב (אות אפופטוזיס) באותו הזמן, אשר בהשוואה לגישות המבוססות על תא אינו משתנה על ידי ציפוי או יכול להיות מווסת efficacies ותמרה בקלות במהלך הייצור (איור 1). יתר על כן, KaAPC, אינם רגיש לפונקציות מפעיל ציטוטוקסיות של תאי T והפונקציונליות שלהם אינו תלוי באיכות של תאי מציגי אנטיגן אוטולוגי לפני ואחרי במניפולצית מבחנה. KaAPC מסוגל כלה את תאי T אנטיגן ספציפי במבחנה כאשר היא עמוסה עם פפטיד המקור, בעוד שאינו מאותו המקור טעון KaAPC לא לרוקן תאי T (איור 2). לכן, KaAPC לגרום למות תאים מתוכנת של תאי T באופן אנטיגן ספציפי. בהמשך לכך, אנו משמשים KaAPC לדלדול סלקטיבית של תאי T אנטיגן ספציפי מתערובת של SPE תא T שונהcificities, הוכחה שרק רעיל מינימאלי היה דולף לתוך תאי T השכן (איור 3). לפיכך, KaAPC מייצג כלי מעולה לדלדול אנטיגן ספציפי במבחנה של תאי T אנטיגן ספציפי לאדם פעיל עם יישום קליני פוטנציאלי לטיפול במחלות אוטואימוניות ובדחיות של שתל.

Watch this Scientific Journal Video about Killer Artificial Antigen Presenting Cells KaAPC for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells at JoVE.com

Killer Artificial Antigen Presenting Cells KaAPC for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

הנחיות מוצגות עבור הדור של אנטיגן המלאכותי רוצח הצגת תאים, KaAPC, כלי יעיל לדלדול במבחנה של תאי T אנטיגן ספציפי לאדם ולפתרון חלופי לטיפול חיסוני תאי לטיפול במחלות אוטואימוניות בתיווך תא T בantigen- אופנה ספציפית מבלי להתפשר על המערכת החיסונית שנותרה.

תאי מציגי הרוצח המלאכותי Antigen (KaAPC) ליעיל<em&gt; במבחנה</em&gt; דלדול של תאי T אנושי אנטיגן ספציפי

Current treatment of T cell mediated autoimmune diseases relies mostly on strategies of global immunosuppression, which, in the long term, is accompanied ...

killer-artificial-antigen-presenting-cells-kaapc-for-efficient-vitro

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Killer Artificial Antigen Presenting Cells (KaAPC) for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

9.6K Views.  Johns Hopkins University.  הנחיות מוצגות עבור הדור של אנטיגן המלאכותי רוצח הצגת תאים, KaAPC, כלי יעיל לדלדול במבחנה של תאי T אנטיגן ספציפי לאדם ולפתרון חלופי לטיפול חיסוני תאי לטיפול במחלות אוטואימוניות בתיווך תא T בantigen- אופנה ספציפית מבלי להתפשר על המערכת החיסוני...

Video: Killer Artificial Antigen Presenting Cells KaAPC for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Antigen Specific In Vivo Killing Assay using CFSE Labeled Target Cells

Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) can be used to easily and quickly label a cell population of interest for in vivo investigation. This labeling has classically been used to study proliferation and migration. In the method presented here, we have shortened the timeline after adoptive transfer to look at survival and killing of epitope specific CFSE labeled target cells4-6. The level of specific killing of a CD8 + T cell clone can indicate the quality of the response, as their quantity may be misleading. Specific CD8+ T cells can become functionally exhausted over time with a decline in cytokine production and killing7,8. Also, certain CD8 + T cell clones may not kill as well as others with differing TCR specificities9. For effective Cell Mediated Immunity (CMI), antigens must be identified that produce not only adequate numbers of responding T cells, but also functionally robust responding T cells. Here we assess the percent cell specific killing of two peptide specific T cell clones in BALB/c mice.

Antigen Specific In Vivo Killing Assay using CFSE Labeled Target Cells

Many infections elicit a strong CTL response, but occasionally, the quantity of responding cells does not correlate to control of the pathogen1. One measure of CTL quality is their ability to kill specifically2. CFSE labeling of target cells can be used to investigate this CTL response quality in vivo3,4.

אנטיגן ספציפי In vivo להרוג Assay באמצעות תווית CFSE תאים היעד

Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) can be used to easily and quickly label a cell population of interest for in vivo investigation.  ...

HLA-Ig Based Artificial Antigen Presenting Cells for Efficient ex vivo Expansion of Human CTL

CTL with optimal effector function play critical roles in mediating protection against various intracellular infections and cancer. However, individuals may exhibit suppressive immune microenvironment and, in contrast to activating CTL, their autologous antigen presenting cells may tend to tolerize or anergize antigen specific CTL. As a result, although still in the experimental phase, CTL-based adoptive immunotherapy has evolved to become a promising treatment for various diseases such as cancer and virus infections. In initial experiments ex vivo expanded CMV (cytomegalovirus) specific CTL have been used for treatment of CMV infection in immunocompromised allogeneic bone marrow transplant patients. While it is common to have life-threatening CMV viremia in these patients, none of the patients receiving expanded CTL develop CMV related illness, implying the anti-CMV immunity is established by the adoptively transferred CTL1. Promising results have also been observed for melanoma and may be extended to other types of cancer2. 
While there are many ways to ex vivo stimulate and expand human CTL, current approaches are restricted by the cost and technical limitations. For example, the current gold standard is based on the use of autologous DC. This requires each patient to donate a significant number of leukocytes and is also very expensive and laborious. Moreover, detailed in vitro characterization of DC expanded CTL has revealed that these have only suboptimal effector function 3. 
Here we present a highly efficient aAPC based system for ex vivo expansion of human CMV specific CTL for adoptive immunotherapy (Figure 1). The aAPC were made by coupling cell sized magnetic beads with human HLA-A2-Ig dimer and anti-CD28mAb4. Once aAPC are made, they can be loaded with various peptides of interest, and remain functional for months. In this report, aAPC were loaded with a dominant peptide from CMV, pp65 (NLVPMVATV). After culturing purified human CD8+ CTL from a healthy donor with aAPC for one week, CMV specific CTL can be increased dramatically in specificity up to 98% (Figure 2) and amplified more than 10,000 fold. If more CMV-specific CTL are required, further expansion can be easily achieved by repetitive stimulation with aAPC. Phenotypic and functional characterization shows these expanded cells have an effector-memory phenotype and make significant amounts of both TNF&alpha; and IFN&gamma; (Figure 3).

HLA-Ig Based Artificial Antigen Presenting Cells for Efficient ex vivo Expansion of Human CTL

A new DC independent method for induction and expansion of antigen-specific T cells is described. HLA A2-Ig based artificial Antigen Presenting Cells (aAPC) are loaded with HLA-A2 restricted peptides to efficiently expand CTL of diverse antigen specificity. This technology holds great potential for CTL-based adoptive immunotherapy.

HLA-איג בהתבסס Antigen תאים מלאכותיים הצגת עבור יעיל לשעבר vivo הרחבת CTL האדם

CTL with optimal effector function play critical roles in mediating protection against various intracellular infections and cancer. However, individuals ...

Artificial Antigen Presenting Cell (aAPC) Mediated Activation and Expansion of Natural Killer T Cells

Natural killer T (NKT) cells are a unique subset of T cells that display markers characteristic of both natural killer (NK) cells and T cells1. Unlike classical T cells, NKT cells recognize lipid antigen in the context of CD1 molecules2. NKT cells express an invariant TCR&alpha; chain rearrangement: V&alpha;14J&alpha;18 in mice and V&alpha;24J&alpha;18 in humans, which is associated with V&beta; chains of limited diversity3-6, and are referred to as canonical or invariant NKT (iNKT) cells. Similar to conventional T cells, NKT cells develop from CD4-CD8- thymic precursor T cells following the appropriate signaling by CD1d 7. The potential to utilize NKT cells for therapeutic purposes has significantly increased with the ability to stimulate and expand human NKT cells with &alpha;-Galactosylceramide (&alpha;-GalCer) and a variety of cytokines8. Importantly, these cells retained their original phenotype, secreted cytokines, and displayed cytotoxic function against tumor cell lines. Thus, ex vivo expanded NKT cells remain functional and can be used for adoptive immunotherapy. However, NKT cell based-immunotherapy has been limited by the use of autologous antigen presenting cells and the quantity and quality of these stimulator cells can vary substantially. Monocyte-derived DC from cancer patients have been reported to express reduced levels of costimulatory molecules and produce less inflammatory cytokines9,10. In fact, murine DC rather than autologous APC have been used to test the function of NKT cells from CML patients11. However, this system can only be used for in vitro testing since NKT cells cannot be expanded by murine DC and then used for adoptive immunotherapy. Thus, a standardized system that relies on artificial Antigen Presenting Cells (aAPC) could produce the stimulating effects of DC without the pitfalls of allo- or xenogeneic cells12, 13. Herein, we describe a method for generating CD1d-based aAPC. Since the engagement of the T cell receptor (TCR) by CD1d-antigen complexes is a fundamental requirement of NKT cell activation, antigen: CD1d-Ig complexes provide a reliable method to isolate, activate, and expand effector NKT cell populations.

Artificial Antigen Presenting Cell aAPC Mediated Activation and Expansion of Natural Killer T Cells

Here we describe a method for activating and expanding human NKT cells from bulk T cell populations using artificial antigen presenting cells (aAPC). The use of CD1d-based aAPC provides a standardized method for generating high numbers of functional NKT cells.

Antigen המלאכותי הצגת תא הפעלה (aAPC) מתווכות והרחבת תאי T קטלניים טבעיים

Natural killer T (NKT) cells are a unique subset of T cells that display markers characteristic of both natural killer (NK) cells and T cells1. Unlike ...

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

The potency of clinical-grade T cells can be improved by combining gene therapy with immunotherapy to engineer a biologic product with the potential for superior (i) recognition of tumor-associated antigens (TAAs), (ii) persistence after infusion, (iii) potential for migration to tumor sites, and (iv) ability to recycle effector functions within the tumor microenvironment. Most approaches to genetic manipulation of T cells engineered for human application have used retrovirus and lentivirus for the stable expression of CAR1-3. This approach, although compliant with current good manufacturing practice (GMP), can be expensive as it relies on the manufacture and release of clinical-grade recombinant virus from a limited number of production facilities. The electro-transfer of nonviral plasmids is an appealing alternative to transduction since DNA species can be produced to clinical grade at approximately 1/10th the cost of recombinant GMP-grade virus. To improve the efficiency of integration we adapted Sleeping Beauty (SB) transposon and transposase for human application4-8. Our SB system uses two DNA plasmids that consist of a transposon coding for a gene of interest (e.g. 2nd generation CD19-specific CAR transgene, designated CD19RCD28) and a transposase (e.g. SB11) which inserts the transgene into TA dinucleotide repeats9-11. To generate clinically-sufficient numbers of genetically modified T cells we use K562-derived artificial antigen presenting cells (aAPC) (clone #4) modified to express a TAA (e.g. CD19) as well as the T cell costimulatory molecules CD86, CD137L, a membrane-bound version of interleukin (IL)-15 (peptide fused to modified IgG4 Fc region) and CD64 (Fc-&gamma; receptor 1) for the loading of monoclonal antibodies (mAb)12. In this report, we demonstrate the procedures that can be undertaken in compliance with cGMP to generate CD19-specific CAR+ T cells suitable for human application. This was achieved by the synchronous electro-transfer of two DNA plasmids, a SB transposon (CD19RCD28) and a SB transposase (SB11) followed by retrieval of stable integrants by the every-7-day additions (stimulation cycle) of &gamma;-irradiated aAPC (clone #4) in the presence of soluble recombinant human IL-2 and IL-2113. Typically 4 cycles (28 days of continuous culture) are undertaken to generate clinically-appealing numbers of T cells that stably express the CAR. This methodology to manufacturing clinical-grade CD19-specific T cells can be applied to T cells derived from peripheral blood (PB) or umbilical cord blood (UCB). Furthermore, this approach can be harnessed to generate T cells to diverse tumor types by pairing the specificity of the introduced CAR with expression of the TAA, recognized by the CAR, on the aAPC.

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

T cells expressing a CD19-specific chimeric antigen receptor (CAR) are infused as investigational treatment of B-cell malignancies in our first-in-human gene therapy trials. We describe genetic modification of T cells using the Sleeping Beauty (SB) system to introduce CD19-specific CAR and selective propagation on designer CD19+ artificial antigen presenting cells.

יישום קליני של<em&gt; יפהפה נרדם</em&gt; ומלאכותי תאי מציגי אנטיגן גנטי לשינוי תאי T מדם טבורים היקפי וטבורים

The potency of clinical-grade T cells can be improved by combining gene therapy with immunotherapy to engineer  a biologic product with the potential for ...

Development of an Antigen-driven Colitis Model to Study Presentation of Antigens by Antigen Presenting Cells to T Cells

Inflammatory bowel disease (IBD) is a chronic inflammation which affects the gastrointestinal tract (GIT). One of the best ways to study the immunological mechanisms involved during the disease is the T cell transfer model of colitis. In this model, immunodeficient mice (RAG-/- recipients) are reconstituted with naive CD4+ T cells from healthy wild type hosts.
This model allows examination of the earliest immunological events leading to disease and chronic inflammation, when the gut inflammation perpetuates but does not depend on a defined antigen. To study the potential role of antigen presenting cells (APCs) in the disease process, it is helpful to have an antigen-driven disease model, in which a defined commensal-derived antigen leads to colitis. An antigen driven-colitis model has hence been developed. In this model OT-II CD4+ T cells, that can recognize only specific epitopes in the OVA protein, are transferred into RAG-/- hosts challenged with CFP-OVA-expressing E. coli. This model allows the examination of interactions between APCs and T cells in the lamina propria.

In this antigen-driven colitis model, OT-II CD4+ T cells expressing a red fluorescent protein were adoptively transferred into RAG-/- mice that express a green fluorescent protein in mononuclear phagocytes (MPs). The hosts were challenged with Escherichia coli (E.coli) expressing the ovalbumin protein (OVA) fused to a cyan fluorescent protein (CFP).

פיתוח מודל קוליטיס מונחה Antigen ללמוד מצגת של אנטיגנים על ידי אנטיגן הצגת תאים לתאי T

Inflammatory bowel disease (IBD) is a chronic inflammation which affects the gastrointestinal tract (GIT). One of the best ways to study the immunological ...

Generating De Novo Antigen-specific Human T Cell Receptors by Retroviral Transduction of Centric Hemichain

T cell receptors (TCRs) are used clinically to direct the specificity of T cells to target tumors as a promising modality of immunotherapy. Therefore, cloning TCRs specific for various tumor-associated antigens has been the goal of many studies. To elicit an effective T cell response, the TCR must recognize the target antigen with optimal affinity. However, cloning such TCRs has been a challenge and many available TCRs possess sub-optimal affinity for the cognate antigen. In this protocol, we describe a method of cloning de novo high affinity antigen-specific TCRs using existing TCRs by exploiting hemichain centricity. It is known that for some TCRs, each TCR&#945; or TCR&#946; hemichain do not contribute equally to antigen recognition, and the dominant hemichain is referred to as the centric hemichain. We have shown that by pairing the centric hemichain with counter-chains differing from the original counter-chain, we are able to maintain the antigen specificity, while modulating its interaction strength for the cognate antigen. Thus, the therapeutic potential of a given TCR can be improved by optimizing the pairing between the centric and counter hemichains.

Generating De Novo Antigen-specific Human T Cell Receptors by Retroviral Transduction of Centric Hemichain

Herein we describe a novel method to generate antigen-specific T cell receptors (TCRs) by pairing the TCR&#945; or TCR&#946; of an existing TCR, possessing the antigen-specificity of interest, with complementary hemichain of the peripheral T cell receptor repertoire. The de novo generated TCRs retain antigen-specificity with varying affinity.

יצירה<em&gt; דה נובו</em&gt; לקולטנים המצויים בתאי אנטיגן ספציפי האדם T על ידי retroviral התמרה של Centric Hemichain

T cell receptors (TCRs) are used clinically to direct the specificity of T cells to target tumors as a promising modality of immunotherapy. Therefore, ...

Development of Stem Cell-derived Antigen-specific Regulatory T Cells Against Autoimmunity

Autoimmune diseases arise due to the loss of immunological self-tolerance. Regulatory T cells (Tregs) are important mediators of immunologic self-tolerance. Tregs represent about 5 - 10% of the mature CD4+ T cell subpopulation in mice and humans, with about 1 - 2% of those Tregs circulating in the peripheral blood. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) can be differentiated into functional Tregs, which have a potential to be used for cell-based therapies of autoimmune diseases. Here, we present a method to develop antigen (Ag)-specific Tregs from iPSCs (i.e., iPSC-Tregs). The method is based on incorporating the transcription factor FoxP3 and an Ag-specific T cell receptor (TCR) into iPSCs and then differentiating on OP9 stromal cells expressing Notch ligands delta-like (DL) 1 and DL4. Following in vitro differentiation, the iPSC-Tregs express CD4, CD8, CD3, CD25, FoxP3, and Ag-specific TCR and are able to respond to Ag stimulation. This method has been successfully applied to cell-based therapy of autoimmune arthritis in a murine model. Adoptive transfer of these Ag-specific iPSC-Tregs into Ag-induced arthritis (AIA)-bearing mice has the ability to reduce joint inflammation and swelling and to prevent bone loss.

We present here a method to develop functional antigen (Ag)-specific regulatory T cells (Tregs) from induced pluripotent stem cells (iPSCs) for immunotherapy of autoimmune arthritis in a murine model.

פיתוח תאי גזע שמקורם אנטיגן ספציפי תקינים בתאי T נגד אוטואימוניות

Autoimmune diseases arise due to the loss of immunological self-tolerance. Regulatory T cells (Tregs) are important mediators of immunologic ...

Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood

Monoclonal antibodies (mAbs) are powerful tools useful for both fundamental research and in biomedicine. Their high specificity is indispensable when the antibody needs to distinguish between highly related structures (e.g., a normal protein and a mutated version thereof). The current way of generating such discriminative mAbs involves extensive screening of multiple Ab-producing B cells, which is both costly and time consuming. We propose here a rapid and cost-effective method for the generation of discriminative, fully human mAbs starting from human blood circulating B lymphocytes. The originality of this strategy is due to the selection of specific antigen binding B cells combined with the counter-selection of all other cells, using readily available Peripheral Blood Mononuclear Cells (PBMC). Once specific B cells are isolated, cDNA (complementary deoxyribonucleic acid) sequences coding for the corresponding mAb are obtained using single cell Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) technology and subsequently expressed in human cells. Within as little as 1 month, it is possible to produce milligrams of highly discriminative human mAbs directed against virtually any desired antigen naturally detected by the B cell repertoire.

We describe a method for the production of human antibodies specific for an antigen of interest, starting from rare B cells circulating in human blood. Generation of these natural antibodies is efficient and rapid, and the antibodies obtained can discriminate between highly related antigens.

דור שמסווגת נוגדנים חד-שבטיים אנושי מתאי B אנטיגן ספציפי נדיר במחזור הדם

Monoclonal antibodies (mAbs) are powerful tools useful for both fundamental research and in biomedicine. Their high specificity is indispensable when the ...

Quantification of Proliferating Human Antigen-specific CD4+ T Cells using Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester

Described is a simple, in vitro, dye dilution-based method for measuring antigen-specific CD4+ T cell proliferation in human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs). The development of stable, non-toxic, fluorescent dyes such as carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) allows for rare, antigen-specific T cells to be distinguished from bystanders by diminution in fluorescent staining, as detected by flow cytometry. This method has the following advantages over alternative approaches: (i) it is very sensitive to low-frequency T cells, (ii) no knowledge of the antigen or epitope is required, (iii) the phenotype of the responding cells can be analyzed, and (iv) viable, responding cells can be sorted and used for further analysis, such as T cell cloning.

Quantification of Proliferating Human Antigen-specific CD4+ T Cells using Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester

Presented here is a protocol for measuring proliferating CD4+ T cells in response to antigenic proteins or peptides using dye dilution. This assay is particularly sensitive to rare antigen-specific T cells and can be modified to facilitate cloning of antigen-specific cells.

קוונפיקציה של מתרבים אנטיגן אנושי-ספציפי CD4+ T תאים באמצעות Carboxyפלואורומיתאת הדיקן אסתר

Described is a simple, in vitro, dye dilution-based method for measuring antigen-specific CD4+ T cell proliferation in human peripheral blood mononuclear ...

High-Efficiency Generation of Antigen-Specific Primary Mouse Cytotoxic T Cells for Functional Testing in an Autoimmune Diabetes Model

Type 1 Diabetes (T1D) is characterized by islet-specific autoimmunity leading to beta cell destruction and absolute loss of insulin production. In the spontaneous non-obese diabetes (NOD) mouse model, insulin is the primary target, and genetic manipulation of these animals to remove a single key insulin epitope prevents disease. Thus, selective elimination of professional antigen presenting cells (APCs) bearing this pathogenic epitope is an approach to inhibit the unwanted insulin-specific autoimmune responses, and likely has greater translational potential.
Chimeric antigen receptors (CARs) can redirect T cells to selectively target disease-causing antigens. This technique is fundamental to recent attempts to use cellular engineering for adoptive cell therapy to treat multiple cancers. In this protocol, we describe an optimized T-cell retrovirus (RV) transduction and in vitro expansion protocol that generates high numbers of functional antigen-specific CD8 CAR-T cells starting from a low number of naive cells. Previously multiple CAR-T cell protocols have been described, but typically with relatively low transduction efficiency and cell viability following transduction. In contrast, our protocol provides up to 90% transduction efficiency, and the cells generated can survive more than two weeks in vivo and significantly delay disease onset following a single infusion. We provide a detailed description of the cell maintenance and transduction protocol, so that the critical steps can be easily followed. The whole procedure from primary cell isolation to CAR expression can be performed within 14 days. The general method may be applied to any mouse disease model in which the target is known. Similarly, the specific application (targeting a pathogenic peptide/MHC class II complex) is applicable to any other autoimmune disease model for which a key complex has been identified.

This article describes a protocol for the generation of antigen-specific CD8 T cells, and their expansion in vitro, with the aim of yielding high numbers of functional T cells for use in vitro and in vivo.

יעילות גבוהה הדור של העכבר העיקרי של אנטיגן בתאי T ציטוטוקסיים לבדיקות פונקציונליות במודל סוכרת אוטואימוניות

Type 1 Diabetes (T1D) is characterized by islet-specific autoimmunity leading to beta cell destruction and absolute loss of insulin production. In the ...