עבודה זו מומנה על ידי מענקים DMH ו TDM (NHMRC מענקים הפרוייקט). DMH הוא עמית Grimwade, שמומן על ידי הקרן Miegunyah.

1. הכנת תאים עם תיוג ReAsH / פלאש <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת שיטות סטנדרטיות תרבות התא לקו הנייד של עניין, להכין התרבות של תאים חסיד ישירות שקופיות הדמיה לחיות התא מוכן transfection. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Transfect פלסמיד המכיל שלך TC-tagged הגן של עניין על פי שיטת transfection בחירתך. </li></ol> הערה חשוב להשתמש בפקדי חיוביים ושליליים כדי להעריך את מידת מחייב ספציפית את התגיות TC ולהעריך עבור bleedthrough של הקרינה בין הערוצים בעת איסוף micrographs confocal. לפיכך, עבור שני צבעים (לדוגמה Flash / או שרי ReAsH / או CFP ReAsH / GFP שילובים), להבטיח דגימות מוכנים צבעים בודד (חלבון פלואורסצנטי למשל לבד או אם אפשר חלבון TC-tagged חייב Flash / ReAsH אך ללא פלורסנט חלבון) <ol start="3" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום או יומיים לאחר transfection, לשטוף בעדינות את התאים עם 300 μL מראש התחמם (ב 37 ° C) HBSS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות לטבול את התאים עם פלאש 1 מיקרומטר (או ReAsH) ב 300 μL של HBSS prewarmed ו -10 מיקרומטר 1,2-ethanedithiol (EDT). </li></ol> חשוב להוסיף EDT הראשון לפני הוספת Flash / ReAsH ולהפוך את המאגר רק לפני הוספתו התאים. דגירה של 30 דקות בדיוק בשעה 37 ° C ברקמות תרבות חממה. כבר בשנת הניסיון שלנו פעמים הדגירה מגביר באופן משמעותי את הקרינה רקע. בונה חדש צריך להיות גם מותאם תיוג זמן Flash / ReAsH ריכוז (0.5-2 מיקרומטר). <ol start="5" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב בעדינות תיוג פתרון מתאי ולאחר מכן להחליף עם 300 HBSS prewarmed μL + 250 מיקרומטר 2,3-dimercaptopropanol (BAL) במשך 15 דקות על 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר לשטוף פתרון על ידי שאיפה עדינה להחליף עם 300 HBSS prewarmed μL. </li></ol> אחרי זה לשטוף, התאים עשויים להיות קבועים עם paraformaldehyde (15 דקות עם פתרון 3.2%), אם כי מצאנו כי זה מגביר את הלא ספציפית צבע פלואורסצנטי biarsenical. לכן אנחנו בדרך כלל תמונה תאים חיים בטמפרטורת החדר. (שים לב קיבעון של תאים לפני תיוג מונע מחייב לצבוע biarsenical). 2. דימות את התאים במיקרוסקופ confocal <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על מיקרוסקופ confocal, להגדיר פרמטרים עבור הדמיה fluorophores הפרט (ראה לוח 1), ולהבטיח שיש bleedthrough זניח בין הערוצים. זו יכולה להיות מושגת על ידי בדיקת fluorophores הפרט (בדגימות שליטה) נגד הגדרת הרכישה שונה בכל ניאון עבור פלואורסצנטי. התאמת טווח אורך גל הפליטה יכולים לעזור להקטין את bleedthrough (אם כי זה יכול גם להפחית את אות / רעש). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גם להתאים את הגדרות מכפיל כך הקרינה המרבית במדגם לא להרוות את גלאי. (זה יכול להיות מזוהה באמצעות הגדרת Q-LUT על לייקה SP2 confocal). לאחר הגדרות הדמיה הטובים ביותר הם נחושים, לא לשנות כל אחד מהם בין דגימות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרות אחרות אנחנו משתמשים בדרך כלל (אם כי אלה יכול להיות מותאם) הם קצב סריקה של 200 הרץ ולאסוף 4 ממוצעים קו בקוטר חריר של יחידה 1 אוורירי. קוטר חריר ניתן להרחיב אם האות / הרעש הוא בעיה, לעומת זאת, זה עלול לגרום לאובדן חלק הדמיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף התמונות confocal בפורמט (או יותר) 12-bit אם אפשר. 12-bit בפורמט לוכדת טווח דינמי גדול יותר של ערכים (0-4095) עבור עוצמת כל פיקסל מ 8 סיביות (0-255). זה חשוב כדי להבטיח את מערכת הנתונים העשיר ביותר נרשם, אשר ממקסם את האיכות של ניתוח נתונים כמותיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף התמונות של הערוץ חלבון פלואורסצנטי (שרי, GFP או CFP) וגם לערוץ צבע biarsenical (Flash או ReAsH) עבור כל המדגמים. </li></ol> 3. ניתוח הנתונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התקן את ImageJ התוכנה במחשב 8. <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/">http://rsbweb.nih.gov/ij/</a> </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא כי גירסת ImageJ יש את התוספים הבאים: <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/file-opener.html">http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/file-opener.html</a> </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/image_correlator.html">http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/image_correlator.html</a> </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/lut-editor.html">http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/lut-editor.html</a> </li></ul></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח ImageJ, ואם באמצעות גרסה ישנה יותר מ v1.32c, לחץ על האפשרויות הבאות על מנת לאפשר מספר רב של תמונות להיפתח בבת אחת (אשר יכול להיעשות על ידי החזקת לחצן בקרת בעת לחיצה על קבצים שונים): <img src="/files/ftp_upload/2857/2857step1.jpg" alt="איור 1" /></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את התמונות עניין ImageJ. ImageJ באופן אוטומטי מגדירים את עוצמות פיקסל מינימום ומקסימום המוצגות על המסך עבור כל תמונה בנפרד. בהתחשב בעובדה תמונות שונות יהיה דעוצמות פיקסל ifferent, זה אומר התמונות המוצגות לא ניתן להשוות כפי שנצפו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להבטיח את התמונות נפתח כולם באותו קנה מידה, אתה יכול להגדיר פיזית העליון פיקסל בעוצמות נמוכות כדי לראות (זה לא ישנה את תוכן הנתונים בפועל של התמונות כפי שניתן היה במקרה של תוכנה אחרת). ערכים אלה ניתן להגדיר תחת תפריט הפעולות הבאות: <img src="/files/ftp_upload/2857/2857step2.jpg" alt="איור 2" /></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גישה חלופית היא לעבוד עם ערימות, אשר מעמידה את כל התמונות יחד לתוך קובץ אחד וגם באופן אוטומטי בקנה מידה (לצפייה) כל התמונות בערימה בהיקף זהה. הדרך הקלה ביותר לעבוד עם הנתונים היא להמיר כל ערוץ בערימה. כך, ערוץ חלבון פלואורסצנטי להמיר את כל מחסנית כמוצג. באפשרותך לבחור בקלות ערוץ אחד על ידי הערמה המכיל את כל התמונות שם משותף (למשל, &quot;ch00&quot;) בכותרת. <img src="/files/ftp_upload/2857/2857step3.jpg" alt="איור 3" /></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עכשיו להמיר את כל התמונות פתוחה של 8 סיביות לצורך ניתוח. זה יהיה ממש rescale טווח שנצפו לתוך טווח 0-255 (המגדירה 8 סיביות). חשוב: אל תשמור על 12-bit בפורמט המקורי (או יותר) או תאבד את תוכן המידע. שים לב כמה חבילות התוכנה ניתן להציג רק 8-bit תמונות בפורמט זה כל כך שימושי לביצוע דמויות וכו &#39; <img src="/files/ftp_upload/2857/2857step4.jpg" alt="איור 4" /></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור עותק בתיקייה חדשה בשם &quot;8-bit המרה&quot; באמצעות &quot;שמירה בשם ...&quot; אפשרות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחת השיטות לבחון את מידת מחייב לצבוע biarsenical בתמונה כולה לבצע החלקה פיקסל מתאם אינטנסיביות. מגרשים זה כל ערך פיקסל בערוץ אחד ביחס לערך פיקסל המקבילה בערוץ השני. לפיכך עמדה פיקסל גבוה CFP הקרינה יהיה גם גבוה הקרינה ReAsH אם יש גבוה מחייב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לנתח את פיקסל שיתוף המתאם, ודא 8-bit ReAsH Cerulean ו / GFP תמונות פתוחים ImageJ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את &quot;קורלטור תמונה&quot; תוסף כמפורט להלן. בחר &quot;Image1&quot; כמו ערימה ReAsH או Flash ו &quot;Image2&quot; כמו ערימת חלבון פלואורסצנטי. <img src="/files/ftp_upload/2857/2857step5.jpg" alt="איור 5" /></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחסנית וכתוצאה מכך אין להציג מידע מפורט - זה נורמלי. שמור את מחסנית בתיקייה חדשה בשם &quot;Scatterplots&quot; ולתת לו את שם הקובץ בדיוק כמו המדגם הוא מתייחס (לדוגמה: &quot;פלאש דובדבן העלילה מתאם&quot;) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להציג את הנתונים בצורה משמעותית אתה יכול לעשות אחת משתי אפשרויות. ראשית לשנות את הנתונים כך שיהיה בפורמט יומן. ואז חזותית rescale את הנתונים כדלקמן: <img src="/files/ftp_upload/2857/2857step6.jpg" alt="איור 6" /></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלופין, ניתן rescale את הנתונים ויזואלית להציג רק ערכים נמוכים (למשל 1-255) ולהציג את הנתונים בעזרת LUT מיוחד. LUT (חפש טבלה) מייצג את טבלת הצבעים המוקצים ערך כל פיקסל בתמונה . זה יכול לשמש כדי להגדיר ערכת pseudocolor לתמונה והיא שימושית להגדרת תכונות מסוימות בתמונה. כדי ליצור LUT מותאם אישית לחץ על &quot;עורך LUT&quot; ולעשות אחד חדש כמו זה שמוצג (זה ניתן לשמור ולהשתמש בהם מאוחר יותר). <img src="/files/ftp_upload/2857/2857step7.jpg" alt="איור 7" /></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את טווח בהירות / ניגודיות 0-255 (כמתואר בשלב 13 לעיל). כדי &quot;לנעול&quot; את התמונה כפי לזה המוצג על המסך, התמונה יכולה להיות המרה לפורמט RGB אשר חוסך ערך 8 סיביות עבור כל צבע, אדום, ירוק וכחול של כל פיקסל. <img src="/files/ftp_upload/2857/2857step8.jpg" alt="איור 8" /> כדי להעתיק ולהדביק תמונות לתוכניות אחרות פותח לראשונה את התמונות 8-bit או 16-bit. כמתואר בשלב 14 לעיל, להקצות צבע LUT תכנית לתמונה. עבור CFP, להקצות את &quot;כחול&quot; LUT כמתואר להלן ... <img src="/files/ftp_upload/2857/2857step9.jpg" alt="איור 9" /></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את התמונה כדי להעתיק אותו ללוח, בחר ... <img src="/files/ftp_upload/2857/2857step10.jpg" /></li></ol> 4. נציג התוצאות: ההצלחה של תאים תיוג עם צבעים biarsenical תלוי כמה פרמטרים מרכזיים. ראשית, העיתוי של תיוג עם צבעים היא קריטית. מצאנו כי תקופות ממושכות של תיוג (יותר מ 30 דקות) תוצאות ברמה גבוהה של מכתים הלא ספציפית רקע. איור 1 מציג תוצאה אופיינית טופס wild-type של שבר huntingtin (25Q) התמזגו Cerulean נגזרת CFP המכיל תג TC כפי שתואר לעיל 7. מדגם זה היה מוכתם למשך 30 דקות עם ReAsH ויש רקע מינימלי במדגם חסרים את תג TC. מצאנו כי קיבוע תאים עם רקע עליות paraformaldehyde תוך קיבוע עם מתנול מבטלת את הקרינה של תג חלבון פלואורסצנטי. לפיכך במידת האפשר אנו התמונה תאים חיים. חשוב גם לציין כי הקיבעון מוקדמתעל תיוג עם צבעים biarsenical מונע, מחייב שלהם כנראה בשל שינויים של מוטיב TC. גורם קריטי עבור תוצאות עקביות היא צפיפות של תאים. מצאנו זה קריטי תאים התמונה מופצים באופן רופף וגם כי clumping נרחב יכול להוביל מכתים אחידה של צבעי biarsenical בתאים שונים. <img src="/files/ftp_upload/2857/2857fig1.jpg" alt="איור 1" /> באיור 1. התגיות Tetracysteine ​​והכתים ReAsH בתאים חיים transfected עם huntingtin (exon1-25Q)-Cerulean fusions. תג TC ממוקם בצומת של היתוך huntingtin-Cerulean (כפי שמתואר 7). העלילה פיקסל מתאם עוצמת מאפשר הערכה להבדלים ReAsH מחייב ברחבי התא והוא יכול לשמש כדי למפות שינויים ReAsH מחייב עקב שינוי קונפורמציה או אינטראקציות ליגנד.

<ol>
	<li>Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+green+fluorescent+protein.">The green fluorescent protein.</a> Ann. Rev. Biochem. 67, 509-544 (1998).</li><li>Griffin, B. A., Adams, S. R., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+covalent+labeling+of+recombinant+protein+molecules+inside+live+cells.">Specific covalent labeling of recombinant protein molecules inside live cells.</a> Science. 281, 269-2672 (1998).</li><li>Uttamapinant, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fluorophore+ligase+for+site-specific+protein+labeling+inside+living+cells.">A fluorophore ligase for site-specific protein labeling inside living cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107, 10914-10919 (2010).</li><li>Ignatova, Z., Gierasch, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+protein+stability+and+aggregation+in+vivo+by+real-time+fluorescent+labeling.">Monitoring protein stability and aggregation in vivo by real-time fluorescent labeling.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 101, 523-528 (2004).</li><li>Coleman, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+detection+of+prion+protein+with+biarsenical+labeling+and+FlAsH+fluorescence.">Conformational detection of prion protein with biarsenical labeling and FlAsH fluorescence.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 380, 564-568 (2009).</li><li>Luedtke, N. W., Dexter, R. J., Fried, D. B., Schepartz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surveying+polypeptide+and+protein+domain+conformation+and+association+with+FlASH+and+ReAsH.">Surveying polypeptide and protein domain conformation and association with FlASH and ReAsH.</a> Nat. Chem. Biol. 3, 779-784 (2007).</li><li>Ramdzan, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformation+sensors+that+distinguish+monomeric+proteins+from+oligomers+in+live+cells.">Conformation sensors that distinguish monomeric proteins from oligomers in live cells.</a> Chem. Biol. 17, 371-379 (2010).</li><li>Abramoff, M. a. g. e. l. h. a. e. s., PJ, S. J. R. a. m. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image+processing+with+ImageJ.">Image processing with ImageJ.</a> Biophotonics International. 11, 36-42 (2004).</li><li>Hearps, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biarsenical+dye+Lumio+exhibits+a+reduced+ability+to+specifically+detect+tetracysteine-containing+proteins+within+live+cells.">The biarsenical dye Lumio exhibits a reduced ability to specifically detect tetracysteine-containing proteins within live cells.</a> J. Fluor. 17, 593-597 (2007).</li><li>Adams, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+biarsenical+ligands+and+tetracysteine+motifs+for+protein+labeling+in+vitro+and+in+vivo:+Synthesis+and+biological+applications.">New biarsenical ligands and tetracysteine motifs for protein labeling in vitro and in vivo: Synthesis and biological applications.</a> J. Am. Chem. Soc. 124, 6063-6076 (2002).</li><li>Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+choosing+fluorescent+proteins.">A guide to choosing fluorescent proteins.</a> Nat. Meth. 2, 905-909 (2005).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

הגישה לוקליזציה חלבון תווית עם חלבון פלואורסצנטי ומאפיינים קונפורמציה עם צבע שנייה מציע הרבה פוטנציאל למיפוי בו תצורות שונות של חלבונים בתאים לצבור ואירועים לשנות את הדינמיקה של קונפורמציה בחלבון. ReAsH / פלאש שימש לראשונה כחיישן ב-cell עבור קיפול חלבונים של חלבון יונק?...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם מגיב </th><th> חברה </th><th> מספר קטלוגי </th><th> תגובות </th></tr><tr><td> 8-μ היטב-שקופיות </td><td> Ibidi </td><td> 80826 </td><td> אנו מוצאים קאמרית אלה שקופיות להיות שימושי במיוחד עבור תאים culturing הדמיה. </td></tr><tr><td> TC-Flash השנייה בתוך תא איתור Tetracysteine ​​תג קיט * * * פלואורסצנטי ירוק עבור לגור תאים הדמיה </td><td> Invitrogen </td><td> T34561 (Flash) או T34562 (ReAsH) </td><td></td></tr><tr><td> הנקס &quot;פתרון מאוזן מלח </td><td> Invitrogen </td><td> 14175-103 </td><td></td></tr><tr><td> 2,3-Dimercapto-1-propanol </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> D1129-5 מ&quot;ל </td><td></td></tr><tr><td> 1,2-Ethanedithiol </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> 02390-25ML </td><td></td></tr></tbody></table>

reash/flash labeling and image analysis of tetracysteine sensor proteins in cells

חלבונים פלורסנט וצבעים הם כלים חיוניים לחקר לוקליזציה סחר, חלבונים לתפקד בתאים. בעוד חלבוני ניאון כגון חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) נעשה שימוש נרחב כשותפים היתוך חלבונים כדי לעקוב אחר תכונות של חלבון של עניין 1, ההתפתחויות האחרונות עם תגיות קטנות מאפשרות פונקציות חדשות של חלבונים להיבחן בתאים כגון שינוי קונפורמציה וחלבון אסוציאציה 2, 3. אחת מערכת תג קטן כרוך מוטיב tetracysteine ​​(CCXXCC) מוכנס לתוך גנטית חלבון מטרה, אשר נקשר צבעים biarsenical, ReAsH (אדום ניאון) ו-Flash (ירוק זרחני), עם סגוליות גבוהה אפילו בתאים חיים 2. מערכת TC / biarsenical לצבוע מציעה אילוצים סטרית הרבה פחות חלבון מאשר לארח חלבוני ניאון אשר אפשרה מספר גישות חדשות כדי למדוד שינוי קונפורמציה ו חלבונים אינטראקציות 4-7. אנחנו לאחרונה פיתחה יישום הרומן של תגיות TC כמו חיישנים של oligomerization בתאים לבטא huntingtin מוטנטים, אשר כאשר מוטציה אגרגטים נוירונים מחלת הנטינגטון 7. Huntingtin היה מתויג עם שני צבעי ניאון, אחד חלבון פלואורסצנטי לעקוב אחר המיקום חלבון, ואת תג שנייה TC שרק נקשר צבעים biarsenical ב מונומרים. לפיכך, שינויים colocalization בין חלבון תגובתיות לצבוע biarsenical מופעלת תוכן oligomer submicroscopic להיות ממופה מרחבית בתוך התאים. כאן אנו מתארים כיצד תווית TC-tagged חלבונים התמזגו חלבון פלואורסצנטי (שרי, GFP או CFP) עם פלאש או ReAsH בתאי יונקים לחיות וכיצד לכמת את הקרינה two צבע (שרי / Flash, CFP / Flash או ה-GFP / ReAsH שילובים).

Watch this Scientific Journal Video about ReAsH/FlAsH Labeling and Image Analysis of Tetracysteine Sensor Proteins in Cells at JoVE.com

ReAsH/FlAsH Labeling and Image Analysis of Tetracysteine Sensor Proteins in Cells

צבעים biarsenical פלאש ReAsH להיקשר באופן ספציפי מוטיבים tetracysteine ​​בחלבונים והוא יכול סלקטיבי תווית חלבונים בתאים חיים. לאחרונה באסטרטגיה זו תיוג נעשה שימוש כדי לפתח חיישנים עבור תצורות חלבונים שונים או מדינות oligomeric. אנו מתארים את גישת התיוג ושיטות כמותית לנתח מחייב.

ReAsH / פלאש סימון ניתוח מקדימה של חלבונים בתאים חיישן Tetracysteine

Fluorescent proteins and dyes are essential tools for the study of protein trafficking, localization and function in cells.  While fluorescent 
proteins ...

reashflash-labeling-image-analysis-tetracysteine-sensor-proteins

Research

JoVE Journal

Biology

16.9K Views.  Bio21 Molecular Science and Biotechnology Institute. צבעים biarsenical פלאש ReAsH להיקשר באופן ספציפי מוטיבים tetracysteine ​​בחלבונים והוא יכול סלקטיבי תווית חלבונים בתאים חיים. לאחרונה באסטרטגיה זו תיוג נעשה שימוש כדי לפתח חיישנים עבור תצורות חלבונים שונים או מדינות oligomeric. אנו מתארים את גישת התיוג ושיטות כמותית לנתח מחייב.

Video: ReAsH/FlAsH Labeling and Image Analysis of Tetracysteine Sensor Proteins in Cells

Robotics and Dynamic Image Analysis for Studies of Gene Expression in Plant Tissues

Gene expression in plant tissues is typically studied by destructive extraction of compounds from plant tissues for in vitro analyses. The methods presented here utilize the green fluorescent protein (gfp) gene for continual monitoring of gene expression in the same pieces of tissues, over time. The gfp gene was placed under regulatory control of different promoters and introduced into lima bean cotyledonary tissues via particle bombardment. Cotyledons were then placed on a robotic image collection system, which consisted of a fluorescence dissecting microscope with a digital camera and a 2-dimensional robotics platform custom-designed to allow secure attachment of culture dishes. Images were collected from cotyledonary tissues every hour for 100 hours to generate expression profiles for each promoter. Each collected series of 100 images was first subjected to manual image alignment using ImageReady to make certain that GFP-expressing foci were consistently retained within selected fields of analysis. Specific regions of the series measuring 300 x 400 pixels, were then selected for further analysis to provide GFP Intensity measurements using ImageJ software. Batch images were separated into the red, green and blue channels and GFP-expressing areas were identified using the threshold feature of ImageJ. After subtracting the background fluorescence (subtraction of gray values of non-expressing pixels from every pixel) in the respective red and green channels, GFP intensity was calculated by multiplying the mean grayscale value per pixel by the total number of GFP-expressing pixels in each channel, and then adding those values for both the red and green channels. GFP Intensity values were collected for all 100 time points to yield expression profiles. Variations in GFP expression profiles resulted from differences in factors such as promoter strength, presence of a silencing suppressor, or nature of the promoter. In addition to quantification of GFP intensity, the image series were also used to generate time-lapse animations using ImageReady. Time-lapse animations revealed that the clear majority of cells displayed a relatively rapid increase in GFP expression, followed by a slow decline. Some cells occasionally displayed a sudden loss of fluorescence, which may be associated with rapid cell death. Apparent transport of GFP across the membrane and cell wall to adjacent cells was also observed. Time lapse animations provided additional information that could not otherwise be obtained using GFP Intensity profiles or single time point image collections.

We report a method for introduction, tracking and quantitative analysis of GFP expression in plant cells. This method utilizes a custom-designed robotics system for semi-continuous image collection from large numbers of samples, over time. We also demonstrate the use of ImageJ and ImageReady for analysis of image series.

רובוטיקה ניתוח תמונה דינאמית ללימודים של ביטוי גנים ברקמות הצמח

Gene expression in plant tissues is typically studied by destructive extraction of compounds from plant tissues for in vitro analyses. The methods ...

Examining the Conformational Dynamics of Membrane Proteins in situ with Site-directed Fluorescence Labeling

Two electrode voltage clamp electrophysiology (TEVC) is a powerful tool to investigate the mechanism of ion transport1 for a wide variety of membrane proteins including ion channels2, ion pumps3, and transporters4. Recent developments have combined site-specific fluorophore labeling alongside TEVC to 
concurrently examine the conformational dynamics at specific residues and function of these proteins on the surface of single cells.
We will describe a method to study the conformational dynamics of membrane proteins by simultaneously monitoring fluorescence and current changes using voltage-clamp fluorometry. This approach can be used to examine the molecular motion of membrane proteins site-specifically following cysteine replacement and site-directed fluorophore labeling5,6. Furthermore, this method provides an approach to determine distance constraints between specific residues7,8. 
This is achieved by selectively attaching donor and acceptor fluorophores to two mutated cysteine residues of interest.
In brief, these experiments are performed following functional expression of the desired protein on the surface of Xenopus leavis oocytes. The large surface area of these oocytes enables facile functional measurements and a robust fluorescence signal5. It is also possible to readily change the extracellular conditions such as pH, ligand or cations/anions, which can provide further information on the mechanism of membrane proteins4. Finally, recent developments 
have also enabled the manipulation of select internal ions following co-expression with a second protein9.
Our protocol is described in multiple parts. First, cysteine scanning mutagenesis proceeded by fluorophore labeling is completed at residues located at the interface of the transmembrane and extracellular domains. Subsequent experiments are designed to identify residues which demonstrate large changes in fluorescence intensity (&lt;5%)3 upon a conformational change of the protein. Second, these changes in fluorescence intensity are compared to the kinetic parameters of 
the membrane protein in order to correlate the conformational dynamics to the function of the protein10. This enables a rigorous biophysical analysis of the molecular motion of the target protein. Lastly, two residues of the holoenzyme can be labeled with a donor and acceptor fluorophore in order to determine distance constraints using donor photodestruction methods. It is also possible to monitor the relative movement of protein subunits following labeling with a donor and acceptor fluorophore.

Examining the Conformational Dynamics of Membrane Proteins in situ with Site-directed Fluorescence Labeling

We will describe a method which measures the kinetics of ion transport of membrane proteins alongside site-specific analysis of conformational changes using fluorescence on single cells. This technique is adaptable to ion channels, transporters and ion pumps and can be utilized to determine distance constraints between protein subunits.

בחינת Dynamics קונפורמציה של חלבונים בממברנה באתרו עם תיוג, האתר מכוון פלואורסצנטי

Two electrode voltage clamp electrophysiology (TEVC) is a powerful tool to investigate the mechanism of ion transport1 for a wide variety of membrane ...

Phenotypic Analysis and Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells and Lineage-committed Progenitors

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs constitute a minute cell population of pluripotent cells capable of generating all blood cell lineages for a life-time1. The molecular dissection of HSCs homeostasis in the bone marrow has important implications in hematopoiesis, oncology and regenerative medicine. We describe the labeling protocol with fluorescent antibodies and the electronic gating procedure in flow cytometry to score hematopoietic progenitor subsets and HSCs distribution in individual mice (Fig. 1). In addition, we describe a method to extensively enrich hematopoietic progenitors as well as long-term (LT) and short term (ST) reconstituting HSCs from pooled bone marrow cell suspensions by magnetic enrichment of cells expressing c-Kit. The resulting cell preparation can be used to sort selected subsets for in vitro and in vivo functional studies (Fig. 2).
Both trabecular osteoblasts2,3 and sinusoidal endothelium4 constitute functional niches supporting HSCs in the bone marrow. Several mechanisms in the osteoblastic niche, including a subset of N-cadherin+ osteoblasts3 and interaction of the receptor tyrosine kinase Tie2 expressed in HSCs with its ligand angiopoietin-15 concur in determining HSCs quiescence. "Hibernation" in the bone marrow is crucial to protect HSCs from replication and eventual exhaustion upon excessive cycling activity6. Exogenous stimuli acting on cells of the innate immune system such as Toll-like receptor ligands7 and interferon-&alpha;6 can also induce proliferation and differentiation of HSCs into lineage committed progenitors. Recently, a population of dormant mouse HSCs within the lin- c-Kit+ Sca-1+ CD150+ CD48- CD34- population has been described8. Sorting of cells based on CD34 expression from the hematopoietic progenitors-enriched cell suspension as described here allows the isolation of both quiescent self-renewing LT-HSCs and ST-HSCs9. A similar procedure based on depletion of lineage positive cells and sorting of LT-HSC with CD48 and Flk2 antibodies has been previously described10. In the present report we provide a protocol for the phenotypic characterization and ex vivo cell cycle analysis of hematopoietic progenitors, which can be useful for monitoring hematopoiesis in different physiological and pathological conditions. Moreover, we describe a FACS sorting procedure for HSCs, which can be used to define factors and mechanisms regulating their self-renewal, expansion and differentiation in cell biology and signal transduction assays as well as for transplantation.

A method to analyse the distribution of bone marrow hematopoietic progenitors in flow cytometry as well as to efficiently isolate highly purified hematopoietic stem cells (HSCs) is described. The isolation procedure is essentially based on magnetic enrichment of c-Kit+ cells and cell sorting to purify HSCs for cellular and molecular studies.

ניתוח בידוד פנוטיפי של Murine בתאי גזע hematopoietic ו-Lineage מחויבים אבות

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during development. Misregulation of this process has been implicated as a key event in fibrosis and the progression of carcinomas to a metastatic state. Understanding the processes that underlie EMT is imperative for the early diagnosis and clinical control of these disease states. Reliable induction of EMT in vitro is a useful tool for drug discovery as well as to identify common gene expression signatures for diagnostic purposes. Here we demonstrate a straightforward method for the induction of EMT in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells pre- and post-EMT induction by immunocytochemistry are also included. Additionally, we demonstrate the effectiveness of this method through antibody-based array analysis and migration/invasion assays.

A straightforward method is described for the induction of epithelial to mesenchymal transition (EMT) in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells in EMT states by immunocytochemistry are included.

אינדוקציה וניתוח של אפיתל לmesenchymal מעבר

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Automated Analysis of Dynamic Ca2+ Signals in Image Sequences

Intracellular Ca2+ signals are commonly studied with fluorescent Ca2+ indicator dyes and microscopy techniques. However, quantitative analysis of Ca2+ imaging data is time consuming and subject to bias. Automated signal analysis algorithms based on region of interest (ROI) detection have been implemented for one-dimensional line scan measurements, but there is no current algorithm which integrates optimized identification and analysis of ROIs in two-dimensional image sequences. Here an algorithm for rapid acquisition and analysis of ROIs in image sequences is described. It utilizes ellipses fit to noise filtered signals in order to determine optimal ROI placement, and computes Ca2+ signal parameters of amplitude, duration and spatial spread. This algorithm was implemented as a freely available plugin for ImageJ (NIH) software. Together with analysis scripts written for the open source statistical processing software R, this approach provides a high-capacity pipeline for performing quick statistical analysis of experimental output. The authors suggest that use of this analysis protocol will lead to a more complete and unbiased characterization of physiologic Ca2+ signaling.

Automated Analysis of Dynamic Ca2+ Signals in Image Sequences

Here a novel region of interest analysis protocol based on sorting best-fit ellipses assigned to regions of positive signal within two-dimensional time lapse image sequences is demonstrated. This algorithm may enable investigators to comprehensively analyze physiological Ca2+ signals with minimal user input and bias.

ניתוח האוטומטי של דינמי Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; אותות ברצפי תמונות

Intracellular Ca2+ signals are commonly studied with fluorescent Ca2+ indicator dyes and microscopy techniques. However, quantitative analysis of Ca2+ ...

Sequence-specific Labeling of Nucleic Acids and Proteins with Methyltransferases and Cofactor Analogues

S-Adenosyl-l-methionine (AdoMet or SAM)-dependent methyltransferases (MTase) catalyze the transfer of the activated methyl group from AdoMet to specific positions in DNA, RNA, proteins and small biomolecules. This natural methylation reaction can be expanded to a wide variety of alkylation reactions using synthetic cofactor analogues. Replacement of the reactive sulfonium center of AdoMet with an aziridine ring leads to cofactors which can be coupled with DNA by various DNA MTases. These aziridine cofactors can be equipped with reporter groups at different positions of the adenine moiety and used for Sequence-specific Methyltransferase-Induced Labeling of DNA (SMILing DNA). As a typical example we give a protocol for biotinylation of pBR322 plasmid DNA at the 5&#8217;-ATCGAT-3&#8217; sequence with the DNA MTase M.BseCI and the aziridine cofactor 6BAz in one step. Extension of the activated methyl group with unsaturated alkyl groups results in another class of AdoMet analogues which are used for methyltransferase-directed Transfer of Activated Groups (mTAG). Since the extended side chains are activated by the sulfonium center and the unsaturated bond, these cofactors are called double-activated AdoMet analogues. These analogues not only function as cofactors for DNA MTases, like the aziridine cofactors, but also for RNA, protein and small molecule MTases. They are typically used for enzymatic modification of MTase substrates with unique functional groups which are labeled with reporter groups in a second chemical step. This is exemplified in a protocol for fluorescence labeling of histone H3 protein. A small propargyl group is transferred from the cofactor analogue SeAdoYn to the protein by the histone H3 lysine 4 (H3K4) MTase Set7/9 followed by click labeling of the alkynylated histone H3 with TAMRA azide. MTase-mediated labeling with cofactor analogues is an enabling technology for many exciting applications including identification and functional study of MTase substrates as well as DNA genotyping and methylation detection.

DNA and proteins are sequence-specifically labeled with affinity or fluorescent reporter groups using DNA or protein methyltransferases and synthetic cofactor analogues. Depending on the cofactor specificity of the enzymes, aziridine or double activated cofactor analogues are employed for one- or two-step labeling.

תיוג רצף ספציפי של חומצות גרעין וחלבונים עם Methyltransferases ואנלוגים כקו-פקטורים

S-Adenosyl-l-methionine (AdoMet or SAM)-dependent methyltransferases (MTase) catalyze the transfer of the activated methyl group from AdoMet to specific ...

Immunofluorescence Analysis of Endogenous and Exogenous Centromere-kinetochore Proteins

"Centromeres" and "kinetochores" refer to the site where chromosomes associate with the spindle during cell division. Direct visualization of centromere-kinetochore proteins during the cell cycle remains a fundamental tool in investigating the mechanism(s) of these proteins. Advanced imaging methods in fluorescence microscopy provide remarkable resolution of centromere-kinetochore components and allow direct observation of specific molecular components of the centromeres and kinetochores. In addition, methods of indirect immunofluorescent (IIF) staining using specific antibodies are crucial to these observations. However, despite numerous reports about IIF protocols, few discussed in detail problems of specific centromere-kinetochore proteins.1-4 Here we report optimized protocols to stain endogenous centromere-kinetochore proteins in human cells by using paraformaldehyde fixation and IIF staining. Furthermore, we report protocols to detect Flag-tagged exogenous CENP-A proteins in human cells subjected to acetone or methanol fixation. These methods are useful in detecting and quantifying endogenous centromere-kinetochore proteins and Flag-tagged CENP-A proteins, including those in human cells.

Here we report protocols to detect endogenous and exogenous centromere-kinetochore proteins in human cells and quantify these protein levels at centromeres-kinetochores by indirect immunofluorescent staining through the use of fixation (paraformaldehyde, acetone, or methanol fixation).

חלבונים Immunofluorescence ניתוח של אנדוגני אקסוגניים centromere-קינטוכור

"Centromeres" and "kinetochores" refer to the site where chromosomes associate with the spindle during cell division. Direct visualization of ...

Assays for the Degradation of Misfolded Proteins in Cells

Protein misfolding and aggregation are associated with various neurodegenerative diseases. Cellular mechanisms that recognize and degrade misfolded proteins may serve as potential therapeutic targets. To distinguish degradation of misfolding-prone proteins from other mechanisms that regulate their levels, one important method is to measure protein half-life in cells. However, this can be challenging because misfolding-prone proteins may exist in different forms, including the native form and misfolded forms of distinct characteristics. Here we describe assays to examine the half-life of misfolded proteins in mammalian cells using a highly aggregation-prone protein, Ataxin-1 with an extended polyglutamine (polyQ) stretch, and a conformationally unstable luciferase mutant as models. Cycloheximide chase is combined with cell fractionation to examine the turnover rate of misfolding-prone proteins in various cellular fractions. We further depict a fluorescence-based assay using an enhanced green fluorescence protein (EGFP)-fusion of the luciferase mutant, which can be adapted for high throughput screening on a microplate-reader.

This report describes protocols for measuring degradation rates of misfolded proteins by either western blot or fluorescence-based assays. The methods can be applied to analysis of other misfolded proteins and for high throughput screening.

מבחנים עבור הפירוק של חלבונים בתאים Misfolded

Protein misfolding and aggregation are associated with various neurodegenerative diseases. Cellular mechanisms that recognize and degrade misfolded ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex signaling mechanisms underlying filopodial initiation, elongation and subsequent stabilization or retraction, it is crucial to determine the spatio-temporal protein activity in these dynamic structures. To analyze protein function in filopodia, we recently developed a semi-automated tracking algorithm that adapts to filopodial shape-changes, thus allowing parallel analysis of protrusion dynamics and relative protein concentration along the whole filopodial length. Here, we present a detailed step-by-step protocol for optimized cell handling, image acquisition and software analysis. We further provide instructions for the use of optional features during image analysis and data representation, as well as troubleshooting guidelines for all critical steps along the way. Finally, we also include a comparison of the described image analysis software with other programs available for filopodia quantification. Together, the presented protocol provides a framework for accurate analysis of protein dynamics in filopodial protrusions using image analysis software.

We present a software solution for semi-automated tracking of relative protein concentration along the length of dynamic cellular protrusions.

ממשק משתמש גרפי למעקב בסיוע תוכנה של ריכוז חלבון בהפרעות ניידות דינמיות

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...

Immunofluorescent Labeling of Plant Virus and Insect Vector Proteins in Hemipteran Guts

Most plant viruses in nature are transmitted from one plant to another by hemipteran insects. A high population density of the vector insects that are highly efficient at virus transmission plays a key role in virus epidemics in fields. Studying virus-insect vector interactions can advance our understanding of virus transmission and epidemics with the aim of designing novel strategies to control plant viruses and their vector insects. Immunofluorescence labeling has been widely used to analyze interactions between pathogens and hosts and is used here in the white-backed planthopper (WBPH, Sogatella furcifera), which efficiently transmits the southern rice black streaked dwarf virus (SRBSDV, genus Fijivirus, family Reoviridae), to locate the virions and insect proteins in the midgut epithelial cells. Using laser scanning confocal microscopy, we studied the morphological characteristics of midgut epithelial cells, cellular localization of insect proteins, and the colocalization of virions and an insect protein. This protocol can be used to study virus activities in insects, functions of insect proteins, and interactions between virus and vector insect.

This protocol for immunofluorescent labeling of both plant virus proteins and vector insect proteins in excised insect guts can be used to study interactions among virus and vector insects, insect protein functions and molecular mechanisms underlying virus transmission.

תיוג אימונופלואורסצנטי של חלבונים וקטוריים של וירוסים צמחיים וחרקים במעיים המיפטרניים

Most plant viruses in nature are transmitted from one plant to another by hemipteran insects. A high population density of the vector insects that are ...