Diese Arbeit wurde durch Stipendien an DMH und TDM (NHMRC Projekt Zuschüsse) finanziert. DMH ist ein Grimwade Fellow, durch die Miegunyah Trust finanziert.

1. Vorbereitung der Zellen für die Kennzeichnung mit ReAsH / Flash <ol><li> Mit Standard-Zellkultur-Methoden für Ihre Zelllinie von Interesse, bereiten eine Kultur von adhärenten Zellen direkt in einem Live Cell Imaging Rutsche bereit für die Transfektion. </li><li> Transfizieren Ihre Plasmid TC-markierten Gen von Interesse nach Ihren Transfektion Methode der Wahl. </li></ol> Hinweis Es ist wichtig, um positive und negative Kontrollen nutzen, um das Ausmaß der spezifischen Bindung an den TC tags zu bewerten und für Übersprechen der Fluoreszenz zwischen den Kanälen zu beurteilen, wenn das Sammeln konfokalen Aufnahmen. Daher ist für zwei Farben (zB Flash / Cherry oder ReAsH / CFP oder ReAsH / GFP-Kombinationen), sicherzustellen, Proben für die einzelnen Farben (z. B. fluoreszierende Protein allein oder wenn möglich ein TC-markierte Protein gebunden Flash / ReAsH aber ohne fluoreszierende bereit sind, Protein) <ol start="3"><li> Ein bis zwei Tage nach der Transfektion, sanft waschen Sie die Zellen mit 300 ul vorgewärmte (bei 37 ° C) HBSS. </li><li> Sanft tauchen die Zellen mit 1 uM Flash (oder ReAsH) in 300 ul vorgewärmtes HBSS und 10 uM 1,2-Ethandithiol (EDT). </li></ol> Es ist wichtig, EDT hinzufügen, bevor Hinzufügen von Flash / ReAsH und machen den Puffer kurz vor Zugabe zu den Zellen. Inkubieren genau 30 min bei 37 ° C in Gewebekultur-Inkubator. Nach unseren Erfahrungen längere Inkubationszeiten erhöht die Hintergrundfluoreszenz. New Konstrukte sollte auch für die Kennzeichnung Zeit und Flash / ReAsH Konzentration (0.5-2 nM) optimiert werden. <ol start="5"><li> Vorsichtig absaugen Kennzeichnung Lösung von Zellen und ersetzen Sie dann mit 300 ul vorgewärmtes HBSS + 250 uM 2,3-Dimercaptopropanol (BAL) für 15 min bei 37 ° C. </li><li> Entfernen Sie Waschlösung durch leichtes Ansaugen und ersetzen mit 300 ul vorgewärmtes HBSS. </li></ol> Nach diesem Waschen, können die Zellen mit Paraformaldehyd (15 min mit 3,2% ige Lösung) fixiert werden, obwohl wir festgestellt, dass diese unspezifischen biarsenical Farbstofffluoreszenz erhöht haben. Daher haben wir in der Regel Bild der Zellen leben bei Raumtemperatur. (Beachten Sie, dass die Fixierung der Zellen vor der Markierung verhindert biarsenical Farbstoff verbindlich.) 2. Imaging die Zellen auf einem konfokalen Mikroskop <ol><li> Auf dem konfokalen Mikroskop eingestellten Parameter für die Abbildung der einzelnen Fluorophore (siehe Tabelle 1) und stellen Sie sicher, dass es unerheblich ist Übersprechen zwischen den Kanälen. Dies kann durch Überprüfung einzelner Fluorophore (in Kontrollproben) gegeneinander verschiedenen fluoreszierenden Erwerb Einstellung für die Fluoreszenz erreicht werden. Einstellen der Emission Wellenlängenbereich kann helfen, Übersprechen zu minimieren (obwohl dies auch zu einer Verminderung des Signal / Rausch). </li><li> Auch passen die Photomultiplier so, dass die maximale Fluoreszenz in der Probe nicht in die Sättigung des Detektors. (Dies kann unter Verwendung des Q-LUT-Einstellung auf dem SP2 Leica konfokalen werden). Nachdem die besten Bildeinstellungen sind entschlossen, nicht ändern, jeder von ihnen zwischen den Proben. </li><li> Andere Einstellungen, die wir verwenden in der Regel (obwohl diese optimiert werden können) werden mit einer Abtastrate von 200 Hz und sammeln 4 Zeilen Durchschnittswerte und einer Lochkamera Durchmesser von 1 Airy Einheit. Der Durchmesser der Blende kann erweitert werden, wenn das Signal / Rausch ist ein Thema, jedoch kann dies in einem gewissen Verlust von bildgebenden Folge sein. </li><li> Sammeln Sie die konfokalen Bilder in 12-bit (oder höher)-Format, wenn möglich. 12-Bit-Format erfasst einen größeren Dynamikbereich von Werten (0-4095) für jedes Pixel die Intensität als 8-Bit-(0-255). Dies ist für die Gewährleistung der reichsten Datensatz aufgezeichnet wird, die maximale Qualität der quantitativen Datenanalyse wichtig. </li><li> Sammeln Sie Bilder für das fluoreszierende Protein-Kanal (Cherry, GFP oder GFP) und auch für die biarsenical Farbstoff-Kanal (Flash oder ReAsH) für alle Proben. </li></ol> 3. Die Analyse der Daten <ol><li> Installieren Sie die Software ImageJ auf Ihrem Computer 8. <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/">http://rsbweb.nih.gov/ij/</a> </li><li> Stellen Sie sicher, dass Ihre Version von ImageJ die folgenden Plugins hat: <ul><li> <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/file-opener.html">http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/file-opener.html</a> </li><li> <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/image_correlator.html">http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/image_correlator.html</a> </li><li> <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/lut-editor.html">http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/lut-editor.html</a> </li></ul></li><li> Öffnen ImageJ, und wenn Sie eine ältere Version als v1.32c, auf der folgenden Optionen klicken, damit mehrere Bilder auf einmal (das kann bei gedrückter Control-Taste erfolgen, während Sie auf anderen Dateien) geöffnet werden: <img src="/files/ftp_upload/2857/2857step1.jpg" alt="Abbildung 1" /></li><li> Öffnen Sie die Bilder von Interesse in ImageJ. ImageJ wird automatisch die maximale und minimale Pixelintensitäten die auf dem Bildschirm für jedes Bild einzeln angezeigt werden. Da die verschiedenen Bilder werden d habenUNTERSCHIEDLICHE Pixelintensitäten bedeutet dies, die angezeigten Bilder sind nicht vergleichbar, wie angesehen. </li><li> Um sicherzustellen, dass die geöffneten Bilder sind alle im gleichen Maßstab, können Sie physisch definieren die obere und untere Pixelintensitäten zur Ansicht (dies ändert nichts an der eigentlichen Dateninhalt der Bilder als wäre der Fall in eine andere Software sein). Diese Werte können unter folgenden Menü eingestellt werden: <img src="/files/ftp_upload/2857/2857step2.jpg" alt="Abbildung 2" /></li><li> Ein alternativer Ansatz ist es, mit Stapeln, die alle Bilder stellt zusammen in einer Datei und wird automatisch skaliert (zum Anschauen) alle Bilder im Stapel auf die gleiche Ebene zu arbeiten. Der einfachste Weg, mit den Daten arbeiten ist für jeden Kanal, um einen Stapel zu konvertieren. So für das fluoreszierende Protein-Kanal alle konvertieren zu stapeln, wie dargestellt. Sie können wählen Sie einen Kanal durch das Stapeln alle Bilder mit einem gemeinsamen Namen (zB &quot;CH00&quot;) in den Titel. <img src="/files/ftp_upload/2857/2857step3.jpg" alt="Abbildung 3" /></li><li> Nun wandeln Sie alle geöffneten Bilder in 8-Bit für die Analyse. Dies wird tatsächlich skalieren die angesehen Bereich in einen Bereich 0-255 (die definiert 8-bit). WICHTIG: Speichern Sie keine über den ursprünglichen 12-Bit (oder höher)-Format oder finden Sie Informationen zu verlieren. Beachten Sie, dass einige Software-Pakete kann nur 8-Bit-Bildern ist dieses Format ist nützlich, um Zahlen etc. <img src="/files/ftp_upload/2857/2857step4.jpg" alt="Abbildung 4" /></li><li> Speichern Sie eine Kopie in einen neuen Ordner namens &quot;8-Bit umgewandelt&quot; mit der Option &quot;Speichern unter ...&quot;. </li><li> Eine Methode, um das Ausmaß der biarsenical Farbstoffbindung in ein ganzes Bild zu untersuchen ist, eine Pixelintensität Korrelationskurve durchzuführen. Diese Grundstücke jeder Pixelwert in einem Kanal gegenüber dem entsprechenden Pixelwert in einem zweiten Kanal. Daher ist eine Pixel-Position hoch in GFP-Fluoreszenz wird auch hoch in ReAsH Fluoreszenz, wenn es hoch bindend. </li><li> Zur Analyse der Pixel-co-Korrelation, sicherzustellen, dass die 8-Bit-ReAsH und Cerulean / GFP Bilder in ImageJ öffnen. </li><li> Öffnen Sie die &quot;Bild Correlator&quot; plugin wie unten angegeben. Wählen Sie &quot;Image1&quot;, wie die ReAsH oder Flash-Stack und &quot;Image2&quot;, wie das fluoreszierende Protein Stack. <img src="/files/ftp_upload/2857/2857step5.jpg" alt="Abbildung 5" /></li><li> Die daraus resultierende Stapel kann nicht angezeigt werden, alle Informationen - das ist normal. Speichern Sie die Stapel in einen neuen Ordner namens &quot;Streudiagramme&quot; und geben Sie ihm den gleichen Dateinamen wie die Probe es sich bezieht (zB &quot;Flash-Kirsche Korrelationskurve&quot;) </li><li> Um die Daten sinnvoll Sie tun können, eine der beiden Optionen. Erste Transformation der Daten, so dass es in log-Format ist. Dann visuell skalieren die Daten wie folgt: <img src="/files/ftp_upload/2857/2857step6.jpg" alt="Abbildung 6" /></li><li> Alternativ können Sie die Daten visuell neu zu skalieren, dass nur geringe Werte (zB 1-255) und die Daten mit einem speziellen LUTs. Eine LUT (Look Up Table) stellt eine Tabelle von Farben, die zu jeder Pixelwert in einem Bild zugeordnet werden . Dies kann eine Falschfarben-System um ein Bild zu definieren und ist nützlich für die Definition bestimmter Merkmale in einem Bild. Um eine benutzerdefinierte LUT klicken Sie auf &quot;LUT Editor&quot; erstellen und einen neuen, wie oben gezeigt (diese können gespeichert und genutzt werden später auf). <img src="/files/ftp_upload/2857/2857step7.jpg" alt="Abbildung 7" /></li><li> Stellen Sie die Helligkeit / Kontrast reichen von 0-255 (wie in Schritt 13 beschrieben). Um &quot;lock in&quot; das Bild, um die auf dem Bildschirm dargestellt, kann das Bild, um RGB-Format, die einen 8-Bit-Wert für jede der roten, grünen und blauen Farbe der einzelnen Pixel speichert umgewandelt werden. <img src="/files/ftp_upload/2857/2857step8.jpg" alt="Abbildung 8" /> Zum Kopieren und Einfügen von Bildern in andere Programme öffnen Sie zunächst die 8-Bit-oder 16-Bit-Bildern. Wie in Schritt 14 oben beschrieben, weisen eine LUT Farbschema, um das Bild. Für CFP, weisen Sie den &quot;Cyan&quot; LUT, wie unten beschrieben ... <img src="/files/ftp_upload/2857/2857step9.jpg" alt="Abbildung 9" /></li><li> Wählen Sie das Bild und es in die Zwischenablage zu kopieren, wählen Sie ... <img src="/files/ftp_upload/2857/2857step10.jpg" /></li></ol> 4. Repräsentative Ergebnisse: Der Erfolg der Markierung von Zellen mit biarsenical Farbstoffe ist abhängig von ein paar wichtige Parameter. Zuerst wird der Zeitpunkt der Kennzeichnung mit Farbstoffen von entscheidender Bedeutung. Wir haben festgestellt, dass längere Kennzeichnung (mehr als 30 min) ergibt sich ein hohes Maß an unspezifischer Hintergrundfärbung. Abb. 1 zeigt ein typisches Ergebnis für einen Wildtyp-Form des Huntingtin-Fragment (25Q) fusioniert mit dem GFP-Derivat Cerulean mit einer TC-Tag wie beschrieben bisher 7. Diese Probe wurde für 30 min mit ReAsH gefärbt und es ist minimal Hintergrund in der Probe nicht über die TC-Tag. Wir haben festgestellt, dass die Festsetzung Zellen mit Paraformaldehyd erhöht Hintergrund, während Fixierung mit Methanol hebt die Fluoreszenz des fluoreszierenden Protein-Tag. Wo also möglich, dass wir Bild der Zellen leben. Es ist wichtig zu beachten Sie auch, dass die Fixierung vormit biarsenical Farbstoffe Kennzeichnung verhindert ihre Bindung, vermutlich aufgrund von Änderungen des TC-Motiv. Ein weiterer entscheidender Faktor für konsistente Ergebnisse ist die Dichte der Zellen. Wir fanden es wichtig, image-Zellen, die locker verteilt sind und auch, dass umfangreiche Verklumpung kann eine ungleichmäßige Färbung der biarsenical Farbstoffe in verschiedenen Zellen führen. <img src="/files/ftp_upload/2857/2857fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Tetracysteinmotiv tags und ReAsH Färbung in lebende Zellen mit Huntingtin (exon1-25Q)-Cerulean Fusionen transfiziert. Die TC-Tag wird an der Kreuzung des Huntingtin-Cerulean Fusion (wie in 7 beschrieben) befindet. Die Pixel-Intensität Korrelationskurve ermöglicht eine Bewertung der Unterschiede in ReAsH Bindung in der Zelle und kann verwendet werden, um Veränderungen in ReAsH Bindung durch Konformationsänderung oder Ligand-Wechselwirkungen abzubilden.

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	<li>Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+green+fluorescent+protein.">The green fluorescent protein.</a> Ann. Rev. Biochem. 67, 509-544 (1998).</li><li>Griffin, B. A., Adams, S. R., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+covalent+labeling+of+recombinant+protein+molecules+inside+live+cells.">Specific covalent labeling of recombinant protein molecules inside live cells.</a> Science. 281, 269-2672 (1998).</li><li>Uttamapinant, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fluorophore+ligase+for+site-specific+protein+labeling+inside+living+cells.">A fluorophore ligase for site-specific protein labeling inside living cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107, 10914-10919 (2010).</li><li>Ignatova, Z., Gierasch, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+protein+stability+and+aggregation+in+vivo+by+real-time+fluorescent+labeling.">Monitoring protein stability and aggregation in vivo by real-time fluorescent labeling.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 101, 523-528 (2004).</li><li>Coleman, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+detection+of+prion+protein+with+biarsenical+labeling+and+FlAsH+fluorescence.">Conformational detection of prion protein with biarsenical labeling and FlAsH fluorescence.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 380, 564-568 (2009).</li><li>Luedtke, N. W., Dexter, R. J., Fried, D. B., Schepartz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surveying+polypeptide+and+protein+domain+conformation+and+association+with+FlASH+and+ReAsH.">Surveying polypeptide and protein domain conformation and association with FlASH and ReAsH.</a> Nat. Chem. Biol. 3, 779-784 (2007).</li><li>Ramdzan, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformation+sensors+that+distinguish+monomeric+proteins+from+oligomers+in+live+cells.">Conformation sensors that distinguish monomeric proteins from oligomers in live cells.</a> Chem. Biol. 17, 371-379 (2010).</li><li>Abramoff, M. a. g. e. l. h. a. e. s., PJ, S. J. R. a. m. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image+processing+with+ImageJ.">Image processing with ImageJ.</a> Biophotonics International. 11, 36-42 (2004).</li><li>Hearps, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biarsenical+dye+Lumio+exhibits+a+reduced+ability+to+specifically+detect+tetracysteine-containing+proteins+within+live+cells.">The biarsenical dye Lumio exhibits a reduced ability to specifically detect tetracysteine-containing proteins within live cells.</a> J. Fluor. 17, 593-597 (2007).</li><li>Adams, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+biarsenical+ligands+and+tetracysteine+motifs+for+protein+labeling+in+vitro+and+in+vivo:+Synthesis+and+biological+applications.">New biarsenical ligands and tetracysteine motifs for protein labeling in vitro and in vivo: Synthesis and biological applications.</a> J. Am. Chem. Soc. 124, 6063-6076 (2002).</li><li>Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+choosing+fluorescent+proteins.">A guide to choosing fluorescent proteins.</a> Nat. Meth. 2, 905-909 (2005).</li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Der Ansatz zur Kennzeichnung Proteinlokalisierung mit einem fluoreszierenden Protein und konformativen Eigenschaften mit einem zweiten Farbstoff bietet viel Potenzial für die Zuordnung, wo verschiedene Konformationen von Proteinen in Zellen und Ereignisse, die die Dynamik der Protein-Konformation ändern anfallen. ReAsH / Flash wurde zuerst als in-cell-Sensor für die Proteinfaltung von Säugetieren zelluläre Retinsäure-bindende Protein I 4 verwendet. In diesem Beispiel, das Flash gebunden an ein TC-Tag in zelluläre Retinsäure-bindende Protein I Fluoreszenzausbeute reduziert in der gefalteten Form in Bezug auf die entfaltete Form hatte entwickelt, und die Faltung konnte in E. verfolgt werden coli-Zellen. In jüngerer Zeit Proteinfaltung und Selbst-Verein wurde im Modell-Proteine ​​durch bipartite Tetracysteinmotiv Anzeige 6 gezeigt. In diesem Beispiel wurden distalen dicysteine ​​paarweise auf Modell-Peptide in der Nähe bei der Bindung von zwei Peptiden, die dicysteine ​​Paare, oder durch die Faltung ein Peptid, das eine funktionelle Tetracysteinmotiv Motiv für die Bindung biarsenical Farbstoffe wieder her gebracht. Wir haben diesen Ansatz noch einen Schritt weiter durch die Entwicklung von Sensoren, die Monomere von Oligomeren durch die TC-Tag unterscheiden immer verschlossen aus biarsenical Farbstoffbindung in allen oligomeren Klassen 7. Trotz des Potenzials der TC-Tags und biarsenical Farbstoffe als Reporter für Konformationsänderungen und Vereinigungsfreiheit, leidet die Methodik von mit einer vergleichsweise geringen Signal / Rausch-Signal im Vergleich zu fluoreszierenden Proteine ​​als Folge der Grundlinie Hintergrundfluoreszenz 9. Daher bei den Bemühungen um Konformation Sensoren entwickeln würde es sich lohnen, einige der anderen neueren Kennzeichnung Ansätze entwickelt, wie ein technisch Fluorophor-Ligase-System, das Cumarin-Derivaten Konjugate ein 13 Aminosäuren-Peptid-Sequenz-3-Test. Die hier vorgelegte Analyse kann weiter ausgebaut werden, zu prüfen, wo in den Zellen Unterschiede in der Bindung von ReAsH / Flash auftreten, um das Protein von Interesse. Dazu können die Bilder in Teilbereiche durch die Schaffung von regions of interest (ROI) und konvertiert sie in Masken, die verschiedenen Teile des Bildes (das kann alles in ImageJ durchgeführt werden) Filter aufgeteilt werden. Daher durch Vergleich der Pixel-Intensität zeichnet es sollte möglich sein, statistisch auswerten Unterschiede zwischen intrazellulären Subregionen mit den Sensoren.

<table border="1"><tbody><tr><th> Name des Reagens </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th><th> Kommentare </th></tr><tr><td> 8-Well-μ-Slides </td><td> Ibidi </td><td> 80826 </td><td> Wir finden diese Kammer-Objektträgern sich als besonders nützlich zur Kultivierung von Zellen für die Bildgebung. </td></tr><tr><td> TC-Flash II In-cell Tetracysteinmotiv Tag Detection Kit * grüne Fluoreszenz * * für Live-Cell-Imaging </td><td> Invitrogen </td><td> T34561 (Flash) oder T34562 (ReAsH) </td><td></td></tr><tr><td> Hanks &#39;Balanced Salt Solution </td><td> Invitrogen </td><td> 14175-103 </td><td></td></tr><tr><td> 2,3-Dimercapto-1-propanol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D1129-5ML </td><td></td></tr><tr><td> 1,2-Ethandithiol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 02390-25ML </td><td></td></tr></tbody></table>

reash/flash labeling and image analysis of tetracysteine sensor proteins in cells

Fluoreszierende Proteine ​​und Farbstoffe sind wesentliche Instrumente für die Untersuchung von Protein Menschenhandel, Lokalisation und Funktion in Zellen. Während fluoreszierende Proteine, wie zB grün fluoreszierendes Protein (GFP) wurden intensiv als Fusionspartner an Proteine ​​verwendet werden, um die Eigenschaften eines Proteins von Interesse 1, die jüngsten Entwicklungen bei kleineren Tags ermöglichen neue Funktionalitäten von Proteinen in Zellen wie Konformationsänderung untersucht werden track und Protein-Vereins 2, 3. Ein kleiner Tag-System beinhaltet eine Tetracysteinmotiv Motiv (CCXXCC) genetisch in ein Zielprotein, das biarsenical Farbstoffe bindet eingefügt, ReAsH (rote Fluoreszenz) und Flash (grün fluoreszierend), mit hoher Spezifität auch in lebenden Zellen 2. Die TC / biarsenical Farbstoff-System bietet weit weniger sterische Einschränkungen an den Host-Protein als fluoreszierende Proteine, die mehrere neue Ansätze ermöglicht hat, Konformationsänderung und Protein-Protein-Interaktionen 4-7 messen. Wir haben vor kurzem eine neuartige Anwendung des TC tags als Sensoren der Oligomerisierung in Zellen, die mutierte Huntingtin, die, wenn mutierte Aggregate in Neuronen in Huntington-Krankheit 7. Huntingtin wurde mit zwei Fluoreszenzfarbstoffen, einer ein fluoreszierendes Protein zu Protein Ort zu verfolgen und die zweite ein TC-Tag, das bindet nur biarsenical Farbstoffe in Monomeren getaggt. Daher aktiviert Veränderungen in Kolokalisation zwischen Protein und biarsenical Farbstoff Reaktivität submikroskopischen Oligomergehalt räumlich innerhalb von Zellen abgebildet werden. Hier beschreiben wir, wie TC-markierte Proteine ​​fusioniert an ein fluoreszierendes Protein (Cherry, GFP oder GFP) mit Flash oder ReAsH in Live Säugetierzellen und wie die beiden Farben-Fluoreszenz (Cherry / Flash, CFP / Flash oder GFP / quantifizieren Label ReAsH Kombinationen).

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ReAsH/FlAsH Labeling and Image Analysis of Tetracysteine Sensor Proteins in Cells

Die biarsenical Farbstoffe Flash und ReAsH binden spezifisch an Tetracysteinmotiv Motive in Proteinen und kann wahlweise Label Proteine ​​in lebenden Zellen. Kürzlich diese Kennzeichnung Strategie wurde verwendet, um Sensoren für verschiedene Proteinkonformationen oder oligomeren Zustände zu entwickeln. Wir beschreiben die Label-Ansatz und Methoden zur quantitativen Analyse bindend.

ReAsH / Flash Labeling und Bildanalyse von Tetracysteinmotiv Sensor Proteinen in Zellen

Fluorescent proteins and dyes are essential tools for the study of protein trafficking, localization and function in cells.  While fluorescent 
proteins ...

reashflash-labeling-image-analysis-tetracysteine-sensor-proteins

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

16.9K Aufrufe.  Bio21 Molecular Science and Biotechnology Institute. Die biarsenical Farbstoffe Flash und ReAsH binden spezifisch an Tetracysteinmotiv Motive in Proteinen und kann wahlweise Label Proteine ​​in lebenden Zellen. Kürzlich diese Kennzeichnung Strategie wurde verwendet, um Sensoren für verschiedene Proteinkonformationen oder oligomeren Zustände zu entwickeln. Wir beschreiben die Label-Ansatz und Methoden zur quantitativen Analyse bindend.

Serie: ReAsH/FlAsH Labeling and Image Analysis of Tetracysteine Sensor Proteins in Cells

Robotics and Dynamic Image Analysis for Studies of Gene Expression in Plant Tissues

Gene expression in plant tissues is typically studied by destructive extraction of compounds from plant tissues for in vitro analyses. The methods presented here utilize the green fluorescent protein (gfp) gene for continual monitoring of gene expression in the same pieces of tissues, over time. The gfp gene was placed under regulatory control of different promoters and introduced into lima bean cotyledonary tissues via particle bombardment. Cotyledons were then placed on a robotic image collection system, which consisted of a fluorescence dissecting microscope with a digital camera and a 2-dimensional robotics platform custom-designed to allow secure attachment of culture dishes. Images were collected from cotyledonary tissues every hour for 100 hours to generate expression profiles for each promoter. Each collected series of 100 images was first subjected to manual image alignment using ImageReady to make certain that GFP-expressing foci were consistently retained within selected fields of analysis. Specific regions of the series measuring 300 x 400 pixels, were then selected for further analysis to provide GFP Intensity measurements using ImageJ software. Batch images were separated into the red, green and blue channels and GFP-expressing areas were identified using the threshold feature of ImageJ. After subtracting the background fluorescence (subtraction of gray values of non-expressing pixels from every pixel) in the respective red and green channels, GFP intensity was calculated by multiplying the mean grayscale value per pixel by the total number of GFP-expressing pixels in each channel, and then adding those values for both the red and green channels. GFP Intensity values were collected for all 100 time points to yield expression profiles. Variations in GFP expression profiles resulted from differences in factors such as promoter strength, presence of a silencing suppressor, or nature of the promoter. In addition to quantification of GFP intensity, the image series were also used to generate time-lapse animations using ImageReady. Time-lapse animations revealed that the clear majority of cells displayed a relatively rapid increase in GFP expression, followed by a slow decline. Some cells occasionally displayed a sudden loss of fluorescence, which may be associated with rapid cell death. Apparent transport of GFP across the membrane and cell wall to adjacent cells was also observed. Time lapse animations provided additional information that could not otherwise be obtained using GFP Intensity profiles or single time point image collections.

We report a method for introduction, tracking and quantitative analysis of GFP expression in plant cells. This method utilizes a custom-designed robotics system for semi-continuous image collection from large numbers of samples, over time. We also demonstrate the use of ImageJ and ImageReady for analysis of image series.

Robotik und Dynamic Image Analysis für Studies of Gene Expression in pflanzlichen Geweben

Gene expression in plant tissues is typically studied by destructive extraction of compounds from plant tissues for in vitro analyses. The methods ...

Forschung

Biologie

Examining the Conformational Dynamics of Membrane Proteins in situ with Site-directed Fluorescence Labeling

Two electrode voltage clamp electrophysiology (TEVC) is a powerful tool to investigate the mechanism of ion transport1 for a wide variety of membrane proteins including ion channels2, ion pumps3, and transporters4. Recent developments have combined site-specific fluorophore labeling alongside TEVC to 
concurrently examine the conformational dynamics at specific residues and function of these proteins on the surface of single cells.
We will describe a method to study the conformational dynamics of membrane proteins by simultaneously monitoring fluorescence and current changes using voltage-clamp fluorometry. This approach can be used to examine the molecular motion of membrane proteins site-specifically following cysteine replacement and site-directed fluorophore labeling5,6. Furthermore, this method provides an approach to determine distance constraints between specific residues7,8. 
This is achieved by selectively attaching donor and acceptor fluorophores to two mutated cysteine residues of interest.
In brief, these experiments are performed following functional expression of the desired protein on the surface of Xenopus leavis oocytes. The large surface area of these oocytes enables facile functional measurements and a robust fluorescence signal5. It is also possible to readily change the extracellular conditions such as pH, ligand or cations/anions, which can provide further information on the mechanism of membrane proteins4. Finally, recent developments 
have also enabled the manipulation of select internal ions following co-expression with a second protein9.
Our protocol is described in multiple parts. First, cysteine scanning mutagenesis proceeded by fluorophore labeling is completed at residues located at the interface of the transmembrane and extracellular domains. Subsequent experiments are designed to identify residues which demonstrate large changes in fluorescence intensity (&lt;5%)3 upon a conformational change of the protein. Second, these changes in fluorescence intensity are compared to the kinetic parameters of 
the membrane protein in order to correlate the conformational dynamics to the function of the protein10. This enables a rigorous biophysical analysis of the molecular motion of the target protein. Lastly, two residues of the holoenzyme can be labeled with a donor and acceptor fluorophore in order to determine distance constraints using donor photodestruction methods. It is also possible to monitor the relative movement of protein subunits following labeling with a donor and acceptor fluorophore.

Examining the Conformational Dynamics of Membrane Proteins in situ with Site-directed Fluorescence Labeling

We will describe a method which measures the kinetics of ion transport of membrane proteins alongside site-specific analysis of conformational changes using fluorescence on single cells. This technique is adaptable to ion channels, transporters and ion pumps and can be utilized to determine distance constraints between protein subunits.

Die Untersuchung der Konformationsänderungen Dynamics von Membranproteinen In situ Mit Site-directed Fluoreszenzmarkierung

Two electrode voltage clamp electrophysiology (TEVC) is a powerful tool to investigate the mechanism of ion transport1 for a wide variety of membrane ...

Phenotypic Analysis and Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells and Lineage-committed Progenitors

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs constitute a minute cell population of pluripotent cells capable of generating all blood cell lineages for a life-time1. The molecular dissection of HSCs homeostasis in the bone marrow has important implications in hematopoiesis, oncology and regenerative medicine. We describe the labeling protocol with fluorescent antibodies and the electronic gating procedure in flow cytometry to score hematopoietic progenitor subsets and HSCs distribution in individual mice (Fig. 1). In addition, we describe a method to extensively enrich hematopoietic progenitors as well as long-term (LT) and short term (ST) reconstituting HSCs from pooled bone marrow cell suspensions by magnetic enrichment of cells expressing c-Kit. The resulting cell preparation can be used to sort selected subsets for in vitro and in vivo functional studies (Fig. 2).
Both trabecular osteoblasts2,3 and sinusoidal endothelium4 constitute functional niches supporting HSCs in the bone marrow. Several mechanisms in the osteoblastic niche, including a subset of N-cadherin+ osteoblasts3 and interaction of the receptor tyrosine kinase Tie2 expressed in HSCs with its ligand angiopoietin-15 concur in determining HSCs quiescence. "Hibernation" in the bone marrow is crucial to protect HSCs from replication and eventual exhaustion upon excessive cycling activity6. Exogenous stimuli acting on cells of the innate immune system such as Toll-like receptor ligands7 and interferon-&alpha;6 can also induce proliferation and differentiation of HSCs into lineage committed progenitors. Recently, a population of dormant mouse HSCs within the lin- c-Kit+ Sca-1+ CD150+ CD48- CD34- population has been described8. Sorting of cells based on CD34 expression from the hematopoietic progenitors-enriched cell suspension as described here allows the isolation of both quiescent self-renewing LT-HSCs and ST-HSCs9. A similar procedure based on depletion of lineage positive cells and sorting of LT-HSC with CD48 and Flk2 antibodies has been previously described10. In the present report we provide a protocol for the phenotypic characterization and ex vivo cell cycle analysis of hematopoietic progenitors, which can be useful for monitoring hematopoiesis in different physiological and pathological conditions. Moreover, we describe a FACS sorting procedure for HSCs, which can be used to define factors and mechanisms regulating their self-renewal, expansion and differentiation in cell biology and signal transduction assays as well as for transplantation.

A method to analyse the distribution of bone marrow hematopoietic progenitors in flow cytometry as well as to efficiently isolate highly purified hematopoietic stem cells (HSCs) is described. The isolation procedure is essentially based on magnetic enrichment of c-Kit+ cells and cell sorting to purify HSCs for cellular and molecular studies.

Phänotypische Analyse und Isolierung von murinen hämatopoetischen Stammzellen und Lineage-festgelegte Vorläuferzellen

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during development. Misregulation of this process has been implicated as a key event in fibrosis and the progression of carcinomas to a metastatic state. Understanding the processes that underlie EMT is imperative for the early diagnosis and clinical control of these disease states. Reliable induction of EMT in vitro is a useful tool for drug discovery as well as to identify common gene expression signatures for diagnostic purposes. Here we demonstrate a straightforward method for the induction of EMT in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells pre- and post-EMT induction by immunocytochemistry are also included. Additionally, we demonstrate the effectiveness of this method through antibody-based array analysis and migration/invasion assays.

A straightforward method is described for the induction of epithelial to mesenchymal transition (EMT) in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells in EMT states by immunocytochemistry are included.

Induktion und Analyse von epithelialen zu mesenchymalen Transition

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Automated Analysis of Dynamic Ca2+ Signals in Image Sequences

Intracellular Ca2+ signals are commonly studied with fluorescent Ca2+ indicator dyes and microscopy techniques. However, quantitative analysis of Ca2+ imaging data is time consuming and subject to bias. Automated signal analysis algorithms based on region of interest (ROI) detection have been implemented for one-dimensional line scan measurements, but there is no current algorithm which integrates optimized identification and analysis of ROIs in two-dimensional image sequences. Here an algorithm for rapid acquisition and analysis of ROIs in image sequences is described. It utilizes ellipses fit to noise filtered signals in order to determine optimal ROI placement, and computes Ca2+ signal parameters of amplitude, duration and spatial spread. This algorithm was implemented as a freely available plugin for ImageJ (NIH) software. Together with analysis scripts written for the open source statistical processing software R, this approach provides a high-capacity pipeline for performing quick statistical analysis of experimental output. The authors suggest that use of this analysis protocol will lead to a more complete and unbiased characterization of physiologic Ca2+ signaling.

Automated Analysis of Dynamic Ca2+ Signals in Image Sequences

Here a novel region of interest analysis protocol based on sorting best-fit ellipses assigned to regions of positive signal within two-dimensional time lapse image sequences is demonstrated. This algorithm may enable investigators to comprehensively analyze physiological Ca2+ signals with minimal user input and bias.

Automatisierte Analyse von dynamischen Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Signale in Bildsequenzen

Intracellular Ca2+ signals are commonly studied with fluorescent Ca2+ indicator dyes and microscopy techniques. However, quantitative analysis of Ca2+ ...

Sequence-specific Labeling of Nucleic Acids and Proteins with Methyltransferases and Cofactor Analogues

S-Adenosyl-l-methionine (AdoMet or SAM)-dependent methyltransferases (MTase) catalyze the transfer of the activated methyl group from AdoMet to specific positions in DNA, RNA, proteins and small biomolecules. This natural methylation reaction can be expanded to a wide variety of alkylation reactions using synthetic cofactor analogues. Replacement of the reactive sulfonium center of AdoMet with an aziridine ring leads to cofactors which can be coupled with DNA by various DNA MTases. These aziridine cofactors can be equipped with reporter groups at different positions of the adenine moiety and used for Sequence-specific Methyltransferase-Induced Labeling of DNA (SMILing DNA). As a typical example we give a protocol for biotinylation of pBR322 plasmid DNA at the 5&#8217;-ATCGAT-3&#8217; sequence with the DNA MTase M.BseCI and the aziridine cofactor 6BAz in one step. Extension of the activated methyl group with unsaturated alkyl groups results in another class of AdoMet analogues which are used for methyltransferase-directed Transfer of Activated Groups (mTAG). Since the extended side chains are activated by the sulfonium center and the unsaturated bond, these cofactors are called double-activated AdoMet analogues. These analogues not only function as cofactors for DNA MTases, like the aziridine cofactors, but also for RNA, protein and small molecule MTases. They are typically used for enzymatic modification of MTase substrates with unique functional groups which are labeled with reporter groups in a second chemical step. This is exemplified in a protocol for fluorescence labeling of histone H3 protein. A small propargyl group is transferred from the cofactor analogue SeAdoYn to the protein by the histone H3 lysine 4 (H3K4) MTase Set7/9 followed by click labeling of the alkynylated histone H3 with TAMRA azide. MTase-mediated labeling with cofactor analogues is an enabling technology for many exciting applications including identification and functional study of MTase substrates as well as DNA genotyping and methylation detection.

DNA and proteins are sequence-specifically labeled with affinity or fluorescent reporter groups using DNA or protein methyltransferases and synthetic cofactor analogues. Depending on the cofactor specificity of the enzymes, aziridine or double activated cofactor analogues are employed for one- or two-step labeling.

Sequenzspezifische Markierung von Nukleinsäuren und Proteinen mit Methyltransferasen und Cofaktor-Analoga

S-Adenosyl-l-methionine (AdoMet or SAM)-dependent methyltransferases (MTase) catalyze the transfer of the activated methyl group from AdoMet to specific ...

Immunofluorescence Analysis of Endogenous and Exogenous Centromere-kinetochore Proteins

"Centromeres" and "kinetochores" refer to the site where chromosomes associate with the spindle during cell division. Direct visualization of centromere-kinetochore proteins during the cell cycle remains a fundamental tool in investigating the mechanism(s) of these proteins. Advanced imaging methods in fluorescence microscopy provide remarkable resolution of centromere-kinetochore components and allow direct observation of specific molecular components of the centromeres and kinetochores. In addition, methods of indirect immunofluorescent (IIF) staining using specific antibodies are crucial to these observations. However, despite numerous reports about IIF protocols, few discussed in detail problems of specific centromere-kinetochore proteins.1-4 Here we report optimized protocols to stain endogenous centromere-kinetochore proteins in human cells by using paraformaldehyde fixation and IIF staining. Furthermore, we report protocols to detect Flag-tagged exogenous CENP-A proteins in human cells subjected to acetone or methanol fixation. These methods are useful in detecting and quantifying endogenous centromere-kinetochore proteins and Flag-tagged CENP-A proteins, including those in human cells.

Here we report protocols to detect endogenous and exogenous centromere-kinetochore proteins in human cells and quantify these protein levels at centromeres-kinetochores by indirect immunofluorescent staining through the use of fixation (paraformaldehyde, acetone, or methanol fixation).

Immunofluoreszenz-Analyse von endogener und exogener Zentromer-Proteine ​​kinetochore

"Centromeres" and "kinetochores" refer to the site where chromosomes associate with the spindle during cell division. Direct visualization of ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes within individual endothelial cells (ECs). These processes are critical for homeostatic maintenance such as wound healing, and are also crucial in promoting tumor growth and metastasis. EC morphology is defined by the organization of the cytoskeleton, a tightly regulated system of actin and microtubule (MT) dynamics that is known to control EC branching, polarity and directional migration, essential components of angiogenesis. To study MT dynamics, we used high-resolution fluorescence microscopy coupled with computational image analysis of fluorescently-labeled MT plus-ends to investigate MT growth dynamics and the regulation of EC branching morphology and directional migration. Time-lapse imaging of living Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) was performed following transfection with fluorescently-labeled MT End Binding protein 3 (EB3) and Mitotic Centromere Associated Kinesin (MCAK)-specific cDNA constructs to evaluate effects on MT dynamics. PlusTipTracker software was used to track EB3-labeled MT plus ends in order to measure MT growth speeds and MT growth lifetimes in time-lapse images. This methodology allows for the study of MT dynamics and the identification of how localized regulation of MT dynamics within sub-cellular regions contributes to the angiogenic processes of EC branching and migration.

Protocols for Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC) culture, transient transfection of fluorescently-labeled markers of microtubule growth, live-cell imaging and automated analysis of interphase microtubule growth dynamics are detailed.

Hochauflösende Zeitraffer-Imaging und automatische Analyse von Dynamik der Mikrotubuli in lebenden menschlichen Endothelzellen aus der Nabelvene

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

Assays for the Degradation of Misfolded Proteins in Cells

Protein misfolding and aggregation are associated with various neurodegenerative diseases. Cellular mechanisms that recognize and degrade misfolded proteins may serve as potential therapeutic targets. To distinguish degradation of misfolding-prone proteins from other mechanisms that regulate their levels, one important method is to measure protein half-life in cells. However, this can be challenging because misfolding-prone proteins may exist in different forms, including the native form and misfolded forms of distinct characteristics. Here we describe assays to examine the half-life of misfolded proteins in mammalian cells using a highly aggregation-prone protein, Ataxin-1 with an extended polyglutamine (polyQ) stretch, and a conformationally unstable luciferase mutant as models. Cycloheximide chase is combined with cell fractionation to examine the turnover rate of misfolding-prone proteins in various cellular fractions. We further depict a fluorescence-based assay using an enhanced green fluorescence protein (EGFP)-fusion of the luciferase mutant, which can be adapted for high throughput screening on a microplate-reader.

This report describes protocols for measuring degradation rates of misfolded proteins by either western blot or fluorescence-based assays. The methods can be applied to analysis of other misfolded proteins and for high throughput screening.

Assays für den Abbau fehlgefalteter Proteine ​​in Zellen

Protein misfolding and aggregation are associated with various neurodegenerative diseases. Cellular mechanisms that recognize and degrade misfolded ...

Analysis of Cell Suspensions Isolated from Solid Tissues by Spectral Flow Cytometry

Flow cytometry has been used for the past 40 years to define and analyze the phenotype of lymphoid and other hematopoietic cells. Initially restricted to the analysis of a few fluorochromes, currently there are dozens of different fluorescent dyes, and up to 14-18 different dyes can be combined at a time. However, several limitations still impair the analytical capabilities. Because of the multiplicity of fluorescent probes, data analysis has become increasingly complex due to the need of large, multi-parametric compensation matrices. Moreover, mutant mouse models carrying fluorescent proteins to detect and trace specific cell types in different tissues have become available, so the analysis (by flow cytometry) of auto-fluorescent cell suspensions obtained from solid organs is required. Spectral flow cytometry, which distinguishes the shapes of emission spectra along a wide range of continuous wavelengths, addresses some of these problems. The data is analyzed with an algorithm that replaces compensation matrices and treats auto-fluorescence as an independent parameter. Thus, spectral flow cytometry should be capable of discriminating fluorochromes with similar emission peaks and can provide a multi-parametric analysis without compensation requirements.
This protocol describes the spectral flow cytometry analysis, allowing for a 21-parameter (19 fluorescent probes) characterization and the management of an auto-fluorescent signal, providing high resolution in minor population detection. The results presented here show that spectral flow cytometry presents advantages in the analysis of cell populations from tissues difficult to characterize in conventional flow cytometry, such as the heart and the intestine. Spectral flow cytometry thus demonstrates the multi-parametric analytical capacity of high-performing conventional flow cytometry without the requirement for compensation and enables auto-fluorescence management.

This article describes spectral cytometry, a new approach in flow cytometry that uses the shapes of emission spectra to distinguish fluorochromes. An algorithm replaces compensations and can treat auto-fluorescence as an independent parameter. This new approach allows for the proper analysis of cells isolated from solid organs.

Analyse von Zellsuspensionen isoliert von festen Geweben von Spectral Flow Cytometry

Flow cytometry has been used for the past 40 years to define and analyze the phenotype of lymphoid and other hematopoietic cells. Initially restricted to ...