Bu çalışma DMH ve TDM (NHMRC proje hibe) bağışları ile finanse edilmiştir. DMH Miegunyah Trust tarafından finanse edilen bir Grimwade Üyesi.

1. ReAsH / Flash ile etiketlenmesi için hücrelerin hazırlanması <ol><li> Ilgi hücre hattı için standart hücre kültürü yöntemleri kullanarak, doğrudan transfeksiyon için hazır bir canlı hücre görüntüleme slayt yapışık hücreler bir kültür hazırlayın. </li><li> Seçtiğiniz transfeksiyon yöntemine göre faiz plazmid içeren TC etiketli gen Transfect. </li></ol> TC etiketleri belirli bağlayıcı ölçüde değerlendirmek ve odaklı mikrograflar toplama kanalları arasında floresan bleedthrough değerlendirmek için pozitif ve negatif kontrollerin kullanılması önemlidir Not. Bu nedenle, iki renk (örneğin Flash / Cherry veya ReAsH / CFP veya ReAsH / GFP kombinasyonları), örnekler, tek renk (örneğin Floresan protein tek başına ya da mümkünse hiçbir floresan ile Flash / ReAsH ama bağlı TC-etiketli bir protein için hazırlanan sağlamak protein) <ol start="3"><li> Transfeksiyon Bir iki gün sonra, HBSS (37 ° C) 300 mcL önceden ısıtılmış hücreleri nazikçe yıkayın. </li><li> Prewarmed HBSS ve 10 mcM 1,2-ethanedithiol (EDT) 300 mcL 1 mcM Flash (ya da ReAsH) hücreler yavaşça bırakın. </li></ol> Hücreler ekleyerek Flash / ReAsH eklemeden önce EDT ekleyebilir ve hemen önce tampon yapmak önemlidir. 37 ° C dokusunda kültür inkübatör tam 30 dakika boyunca inkübe. Eşiğe deneyimimiz uzun inkübasyon süreleri önemli ölçüde artırır. Yeni yapıları da, zaman ve Flash / ReAsH konsantrasyonu (0.5-2 mcM) etiketlenmesi için optimize edilmelidir. <ol start="5"><li> Yavaşça 300 mcL prewarmed HBSS + 250 mcM 37 az 15 dakika boyunca 2,3-dimercaptopropanol (BAL) ° C ile değiştirin sonra hücrelerin çözüm etiketleme aspirat </li><li> Çözüm nazik aspirasyonu ile yıkayın ve 300 mcL prewarmed HBSS ile değiştirin çıkarın. </li></ol> Bu yıkamadan sonra, hücreler, bu non-spesifik biarsenical boya floresan artırdığını bulduk rağmen paraformaldehid (% 3.2 solüsyonu ile 15 dakika) ile sabit olabilir. Bu nedenle genellikle görüntü hücreleri oda sıcaklığında yaşıyor. (Etiketleme biarsenical boya bağlanmasını engelleyen önce bu hücre fiksasyonu unutmayın.) 2. Görüntüleme konfokal mikroskop hücreleri <ol><li> Konfokal mikroskop, görüntüleme bireysel fluorophores (bkz. Tablo 1) parametrelerini ayarlamak ve kanallar arasında ihmal edilebilir bleedthrough olduğundan emin olunuz. Bu floresan için her biri farklı floresan bir satın alma ayarı karşı bireysel fluorophores (kontrol numuneleri) kontrol ederek elde edilebilir. Emisyon dalga boyu aralığında ayarlanması bleedthrough (bu da sinyal / gürültü azaltabilir rağmen) en aza indirmek için yardımcı olabilir. </li><li> Ayrıca numune maksimum floresans dedektör doyurabilecek kalmaması photomultiplier ayarlarını. (SP2 Leica konfokal Q-LUT ayarını kullanarak tespit edilebilir). Bir kez iyi görüntüleme ayarları belirlenir, bunların örnekleri arasında herhangi bir değişiklik yok. </li><li> Diğer ayarlar (bu optimize edilmiş olmasına rağmen) biz genellikle 200 Hz tarama hızı ve 4 hat ortalamalar ve bir iğne deliği çapı 1 Airy birim toplamak. Iğne deliği çapı sinyal / noise bir sorun olup olmadığını, ancak, bu görüntüleme bazı kaybına neden olabilir genişletilebilir. </li><li> Mümkünse, 12-bit (veya üstü) formatında konfokal görüntüleri toplayın. 12-bit formatında, 8-bit (0-255) göre, her bir piksel yoğunluğu için değerleri (0-4095) daha yüksek dinamik aralık yakalar. Bu zengin veri seti nicel verilerin analiz kalitesini en üst düzeye kaydedilir sağlamak için önemlidir. </li><li> Floresan protein kanal (Kiraz, GFP veya CFP) ve aynı zamanda tüm örnekler için biarsenical boya kanal (Flash veya ReAsH) görüntüleri toplayın. </li></ol> 3. Verilerin analizi <ol><li> Yazılım bilgisayarınıza 8 ImageJ yükleyin. <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/">http://rsbweb.nih.gov/ij/</a> </li><li> ImageJ sürümüne aşağıdaki eklentileri olduğundan emin olun: <ul><li> <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/file-opener.html">http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/file-opener.html</a> </li><li> <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/image_correlator.html">http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/image_correlator.html</a> </li><li> <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/lut-editor.html">http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/lut-editor.html</a> </li></ul></li><li> Açık ImageJ ve v1.32c daha eski bir sürümü kullanıyorsanız, bir kez (farklı dosyalar üzerinde tıklarken kontrol düğmesi basılı tutarak yapılabilir) açılacak birden fazla görüntü sağlamak için aşağıdaki seçenekleri tıklayın: <img src="/files/ftp_upload/2857/2857step1.jpg" alt="Şekil 1" /></li><li> ImageJ ilgi görüntüleri açın. ImageJ, her resim için ayrı ayrı ekranda görüntülenen maksimum ve minimum piksel yoğunlukları otomatik olarak tanımlayacaktır. Farklı görüntüler d olacağı verilenifferent piksel yoğunlukları bakıldığında görüntülenen görüntüleri karşılaştırılabilir DEĞİLDİR anlamına gelir. </li><li> Açılan görüntülerin hepsi aynı ölçekte sağlamak için, fiziksel üst tanımlayabilirsiniz ve daha düşük piksel yoğunluklarda (bu başka bir yazılım olacak gibi görüntülerin gerçek veri içeriği değişmeyecek) görülebilir. Bu değerler aşağıdaki menü altında ayarlanabilir: <img src="/files/ftp_upload/2857/2857step2.jpg" alt="Şekil 2" /></li><li> Alternatif bir yaklaşım, aynı ölçekte yığın (görüntülemek için) tüm görüntüleri bir dosya içine tüm görüntüleri bir araya koyar ve otomatik olarak ölçekli yığınları ile çalışmak için. Verilerle çalışmak için en kolay yolu, her kanal bir yığın dönüştürmek için. Böylece, floresan protein kanal için gösterildiği gibi yığını tüm dönüştürmek. Başlığında bir ortak adı (örneğin, &quot;ch00&quot;) içeren tüm görüntüleri istifleme tarafından kolayca bir kanal seçebilirsiniz. <img src="/files/ftp_upload/2857/2857step3.jpg" alt="Şekil 3" /></li><li> Şimdi analiz için 8-bit için tüm açık görüntüleri dönüştürmek. Bu aslında bir 0-255 aralığı (8-bit tanımlayan) içine görüntülenen aralık rescale. ÖNEMLİ NOT: orijinal 12-bit (veya üstü) biçiminde tasarruf ya da bilgi içeriğini kaybedersiniz . Not, bu biçimi, rakamlar vb yapmak için yararlıdır bu nedenle bazı yazılım paketleri sadece 8-bit görüntüleri görüntüleyebilirsiniz <img src="/files/ftp_upload/2857/2857step4.jpg" alt="Şekil 4" /></li><li> &quot;Seçenek&quot; olarak ... Kaydet &quot;seçeneğini kullanarak 8-bit dönüştürülür&quot; olarak adlandırılan yeni bir klasörde bir kopyasını kaydedin. </li><li> Biarsenical boya bağlayıcı bir bütün görüntü ölçüde incelemek için bir yöntem, bir piksel yoğunluğu korelasyon arsa gerçekleştirmek için. Bu araziler bir kanal ikinci bir kanala karşılık gelen piksel değerine göre her piksel değeri. Bağlayıcı yüksek olup olmadığını Dolayısıyla CFP floresan yüksek bir piksel konumunu da ReAsH floresan yüksek olacak. </li><li> Co-korelasyon piksel analiz etmek, 8-bit ReAsH ve Cerulean / GFP görüntüleri ImageJ açık olduğundan emin olun. </li><li> &quot;Görüntü korelatör&quot; eklentisi aşağıda gösterildiği gibi açın. ReAsH veya flash yığını ve floresan protein yığını olarak &quot;Image2&quot; gibi &quot;image1&quot; i seçin. <img src="/files/ftp_upload/2857/2857step5.jpg" alt="Şekil 5" /></li><li> Yığını herhangi bir ayrıntılı bilgi görüntülemek olmayabilir, bu normaldir. &quot;SCATTERPLOTS&quot; olarak adlandırılan yeni bir klasöre yığını kaydedin ve bunu atıfta örnek olarak aynı dosya adını vermek (örneğin, &quot;flash-kiraz korelasyon komplo&quot;) </li><li> Verileri görüntülemek için anlamlı iki seçenekten birini yapabilirsiniz. Öncelikle günlük biçiminde böylece veri dönüşümü. Sonra aşağıdaki gibi görsel veri rescale: <img src="/files/ftp_upload/2857/2857step6.jpg" alt="Şekil 6" /></li><li> Alternatif olarak, sadece düşük değerler (örneğin 1-255) ve özel bir LUT kullanarak veri görüntülemek için görsel veri rescale. LUT (Yukarı Bak), bir görüntüdeki her bir piksel değeri atanır renk bir masa temsil eder Bu bir görüntü için bir Pseudocolor düzenini tanımlamak için kullanılan ve bir görüntüdeki bazı özellikleri tanımlamak için yararlı olabilir. &quot;LUT editörü&quot; özel bir LUT tıklama oluşturmak ve yeni bir biri olarak gösterilir (bu kaydedilir ve daha sonra kullanılabilir) yapmak için. <img src="/files/ftp_upload/2857/2857step7.jpg" alt="Şekil 7" /></li><li> 0-255 parlaklık / kontrast aralığı (yukarıdaki 13. adımda açıklandığı gibi) ayarlayın. &quot;Kilidi&quot; olarak ekranda gösterilen görüntü, görüntüdeki her bir pikselin kırmızı, yeşil ve mavi renk, her bir 8-bit değeri kaydeder RGB formatına dönüştürülecek için. <img src="/files/ftp_upload/2857/2857step8.jpg" alt="Şekil 8" /> 8-bit veya 16-bit görüntüleri ilk görüntüleri diğer programlara kopyalama ve yapıştırma için açın. Yukarıda adım 14 olarak açıklandığı gibi, resmin bir LUT renk düzeni atayın. CFP için, aşağıda açıklandığı gibi &quot;Cyan&quot; LUT atamak ... <img src="/files/ftp_upload/2857/2857step9.jpg" alt="Şekil 9" /></li><li> Görüntüyü seçin ve panoya kopyalamak için seçmek ... <img src="/files/ftp_upload/2857/2857step10.jpg" /></li></ol> 4. Temsilcisi sonuçları: Biarsenical boya ile etiketleme hücrelerin başarı, birkaç anahtar parametreleri bağlıdır. Öncelikle, boya ile etiketleme zamanlaması çok önemlidir. Biz bulduk, etiketleme uzun süre (30 dakika daha fazla) yüksek düzeyde bir non-spesifik bir arka plan boyama sonuç. Şekil 1, daha önce 7 açıklandığı gibi TC etiketi içeren CFP türev Cerulean erimiş huntingtin parçası yabani tip formu (25Q) için tipik bir sonucu gösterir . Bu örnek ReAsH ile 30 dakika boyanmış ve TC etiketi eksik örnek minimal arka plan var. Biz paraformaldehid artar arka plan ile hücre sabitleme metanol ile tespit floresan protein etiketi floresan lağvetti ederken bulduk. Bu nedenle hücreler mümkünse biz görüntü canlı. Ayrıca bu fiksasyon önce dikkat etmek önemlidir.biarsenical boya ile etiketleme için TC motifi değişiklikler nedeniyle, muhtemelen onların bağlayıcı önler. Tutarlı sonuçlar elde etmek için bir başka kritik faktör, hücre yoğunluğu. Biz, gevşek bir şekilde dağıtılmış ve aynı zamanda geniş bir topaklanma farklı hücreler biarsenical boyaların düzensiz boyanma yol açabilir görüntü hücreleri kritik bulduk. <img src="/files/ftp_upload/2857/2857fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1 Tetracysteine ​​etiketleri ve huntingtin (exon1-25Q) Cerulean füzyonlar ile transfekte canlı hücrelerde ReAsH boyanma. TC etiketi huntingtin Cerulean füzyon (7 açıklandığı gibi) kavşak noktasında yer almaktadır. Piksel yoğunluğu korelasyon arsa hücre boyunca bağlayıcı ReAsH farklılıkları bir değerlendirme sağlar ve konformasyonel değişikliği veya ligand etkileşimleri nedeniyle bağlayıcı ReAsH değişiklikler harita için kullanılabilir.

<ol>
	<li>Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+green+fluorescent+protein.">The green fluorescent protein.</a> Ann. Rev. Biochem. 67, 509-544 (1998).</li><li>Griffin, B. A., Adams, S. R., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+covalent+labeling+of+recombinant+protein+molecules+inside+live+cells.">Specific covalent labeling of recombinant protein molecules inside live cells.</a> Science. 281, 269-2672 (1998).</li><li>Uttamapinant, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fluorophore+ligase+for+site-specific+protein+labeling+inside+living+cells.">A fluorophore ligase for site-specific protein labeling inside living cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107, 10914-10919 (2010).</li><li>Ignatova, Z., Gierasch, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+protein+stability+and+aggregation+in+vivo+by+real-time+fluorescent+labeling.">Monitoring protein stability and aggregation in vivo by real-time fluorescent labeling.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 101, 523-528 (2004).</li><li>Coleman, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+detection+of+prion+protein+with+biarsenical+labeling+and+FlAsH+fluorescence.">Conformational detection of prion protein with biarsenical labeling and FlAsH fluorescence.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 380, 564-568 (2009).</li><li>Luedtke, N. W., Dexter, R. J., Fried, D. B., Schepartz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surveying+polypeptide+and+protein+domain+conformation+and+association+with+FlASH+and+ReAsH.">Surveying polypeptide and protein domain conformation and association with FlASH and ReAsH.</a> Nat. Chem. Biol. 3, 779-784 (2007).</li><li>Ramdzan, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformation+sensors+that+distinguish+monomeric+proteins+from+oligomers+in+live+cells.">Conformation sensors that distinguish monomeric proteins from oligomers in live cells.</a> Chem. Biol. 17, 371-379 (2010).</li><li>Abramoff, M. a. g. e. l. h. a. e. s., PJ, S. J. R. a. m. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image+processing+with+ImageJ.">Image processing with ImageJ.</a> Biophotonics International. 11, 36-42 (2004).</li><li>Hearps, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biarsenical+dye+Lumio+exhibits+a+reduced+ability+to+specifically+detect+tetracysteine-containing+proteins+within+live+cells.">The biarsenical dye Lumio exhibits a reduced ability to specifically detect tetracysteine-containing proteins within live cells.</a> J. Fluor. 17, 593-597 (2007).</li><li>Adams, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+biarsenical+ligands+and+tetracysteine+motifs+for+protein+labeling+in+vitro+and+in+vivo:+Synthesis+and+biological+applications.">New biarsenical ligands and tetracysteine motifs for protein labeling in vitro and in vivo: Synthesis and biological applications.</a> J. Am. Chem. Soc. 124, 6063-6076 (2002).</li><li>Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+choosing+fluorescent+proteins.">A guide to choosing fluorescent proteins.</a> Nat. Meth. 2, 905-909 (2005).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Ikinci bir boya ile floresan protein ve konformasyonel özellikleri ile etiket protein lokalizasyon yaklaşımı farklı proteinlerin konformasyonlar hücreleri ve protein konformasyonu dinamiklerini değiştiren olaylar tahakkuk haritalama için çok potansiyel sunmaktadır. ReAsH / Flash ilk memeli hücresel retinoik asit bağlayıcı protein 4 protein katlanması için bir hücre sensörü olarak kullanılmıştır. Bu örnekte, bir TC etiketi bağlı Flash gelişeceğini formuna göre katlanmış şeklind...

<table border="1"><tbody><tr><th> Reaktif Adı </th><th> Şirket </th><th> Katalog Numarası </th><th> Yorumlar </th></tr><tr><td> Μ-slaytları 8-iyi </td><td> Ibidi </td><td> 80826 </td><td> Biz bu odasına görüntüleme için kültür hücreleri için özellikle yararlı olabilmesi için slaytlar bulabilirsiniz. </td></tr><tr><td> TC-Flash II Tetracysteine ​​Etiket algılama hücresinde Kiti * yeşil floresan * * canlı hücre görüntüleme </td><td> Invitrogen </td><td> T34561 (Flash) veya T34562 (ReAsH) </td><td></td></tr><tr><td> Hanks &#39;Dengeli Tuz Çözeltisi </td><td> Invitrogen </td><td> 14175-103 </td><td></td></tr><tr><td> 2,3-Dimercapto-1-propanol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D1129-5ML </td><td></td></tr><tr><td> 1,2-Ethanedithiol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 02.390-25ml </td><td></td></tr></tbody></table>

reash/flash labeling and image analysis of tetracysteine sensor proteins in cells

Floresan proteinleri ve boyalar, hücrelerin protein kaçakçılığı, yerelleştirme ve fonksiyon çalışması için gerekli araçları vardır. Yeşil floresan proteininin (GFP) gibi floresan proteinleri yoğun proteinlere füzyon ortağı olarak küçük etiketleri konformasyonel değişikliği gibi hücrelerin incelenmesi gereken proteinlerin yeni işlevler sağlayan bir protein ilgi 1 özellikleri, son gelişmeleri takip etmek için kullanılmış olsa da ve protein dernek 2, 3. Bir küçük etiket sistemi genetik biarsenical boyalar bağlayan bir hedef protein, içine yerleştirilen bir tetracysteine ​​motifi (CCXXCC) içerir ReAsH (kırmızı floresan) ve Flash (yeşil floresan), 2 canlı hücrelerinde bile yüksek özgüllüğü. TC / biarsenical boya sistemi, konformasyonel değişikliği ve protein-protein etkileşimleri 4-7 ölçmek için birçok yeni yaklaşımlar sağladı floresan proteinleri daha ana proteine ​​daha az sterik kısıtlamalar sunmaktadır . Yakın zamanda hücrelerde mutant huntingtin ifade oligomerization, sensörler, bir roman gibi TC etiketleri uygulama geliştirdi Huntington hastalığı 7 nöronların agrega mutasyona uğramış. Huntingtin iki floresan boyalar, bir protein konumunu izlemek için floresan protein ve sadece monomerlerin biarsenical boyalar bağlayan ikinci bir TC etiketi ile etiketlenmiş. Bu nedenle, protein ve biarsenical boya reaktivitesi arasında ko değişiklikler hücre içinde mekansal eşlenebilir mikroskopik oligomer içerikler sağladı. Burada, Flash veya ReAsH canlı memeli hücrelerinde ve nasıl iki renkli floresan (Kiraz / Flash CFP / / Flash veya GFP ölçmek için bir floresan proteini (Kiraz, GFP veya CFP) erimiş TC etiketli proteinlerin nasıl etiketlemek için tarif ReAsH kombinasyonları).

Watch this Scientific Journal Video about ReAsH/FlAsH Labeling and Image Analysis of Tetracysteine Sensor Proteins in Cells at JoVE.com

ReAsH/FlAsH Labeling and Image Analysis of Tetracysteine Sensor Proteins in Cells

Flash ve ReAsH biarsenical boyalar özellikle proteinlerin tetracysteine ​​motiflerine bağlanır ve seçici canlı hücrelerde protein etiketleyebilirsiniz. Son zamanlarda bu etiketleme stratejisi, farklı protein konformasyonlar veya oligomerik devletler için sensörler geliştirmek için kullanılır olmuştur. Biz etiketleme yaklaşımı tanımlar ve yöntemleri kantitatif bağlayıcı analiz etmek.

ReAsH / Flash Etiketleme ve Hücreler Tetracysteine ​​Sensör Proteinlerin Görüntü Analizi

Fluorescent proteins and dyes are essential tools for the study of protein trafficking, localization and function in cells.  While fluorescent 
proteins ...

reashflash-labeling-image-analysis-tetracysteine-sensor-proteins

Research

JoVE Journal

Biology

16.9K Görüntüleme.  Bio21 Molecular Science and Biotechnology Institute. Flash ve ReAsH biarsenical boyalar özellikle proteinlerin tetracysteine ​​motiflerine bağlanır ve seçici canlı hücrelerde protein etiketleyebilirsiniz. Son zamanlarda bu etiketleme stratejisi, farklı protein konformasyonlar veya oligomerik devletler için sensörler geliştirmek için kullanılır olmuştur. Biz etiketleme yaklaşımı tanımlar ve yöntemleri kantitatif bağlayıcı analiz etmek.

Video: ReAsH/FlAsH Labeling and Image Analysis of Tetracysteine Sensor Proteins in Cells

Robotics and Dynamic Image Analysis for Studies of Gene Expression in Plant Tissues

Gene expression in plant tissues is typically studied by destructive extraction of compounds from plant tissues for in vitro analyses. The methods presented here utilize the green fluorescent protein (gfp) gene for continual monitoring of gene expression in the same pieces of tissues, over time. The gfp gene was placed under regulatory control of different promoters and introduced into lima bean cotyledonary tissues via particle bombardment. Cotyledons were then placed on a robotic image collection system, which consisted of a fluorescence dissecting microscope with a digital camera and a 2-dimensional robotics platform custom-designed to allow secure attachment of culture dishes. Images were collected from cotyledonary tissues every hour for 100 hours to generate expression profiles for each promoter. Each collected series of 100 images was first subjected to manual image alignment using ImageReady to make certain that GFP-expressing foci were consistently retained within selected fields of analysis. Specific regions of the series measuring 300 x 400 pixels, were then selected for further analysis to provide GFP Intensity measurements using ImageJ software. Batch images were separated into the red, green and blue channels and GFP-expressing areas were identified using the threshold feature of ImageJ. After subtracting the background fluorescence (subtraction of gray values of non-expressing pixels from every pixel) in the respective red and green channels, GFP intensity was calculated by multiplying the mean grayscale value per pixel by the total number of GFP-expressing pixels in each channel, and then adding those values for both the red and green channels. GFP Intensity values were collected for all 100 time points to yield expression profiles. Variations in GFP expression profiles resulted from differences in factors such as promoter strength, presence of a silencing suppressor, or nature of the promoter. In addition to quantification of GFP intensity, the image series were also used to generate time-lapse animations using ImageReady. Time-lapse animations revealed that the clear majority of cells displayed a relatively rapid increase in GFP expression, followed by a slow decline. Some cells occasionally displayed a sudden loss of fluorescence, which may be associated with rapid cell death. Apparent transport of GFP across the membrane and cell wall to adjacent cells was also observed. Time lapse animations provided additional information that could not otherwise be obtained using GFP Intensity profiles or single time point image collections.

We report a method for introduction, tracking and quantitative analysis of GFP expression in plant cells. This method utilizes a custom-designed robotics system for semi-continuous image collection from large numbers of samples, over time. We also demonstrate the use of ImageJ and ImageReady for analysis of image series.

Bitkisel Dokular Gen İfade Araştırmalar Robotik ve Dinamik Görüntü Analizi

Gene expression in plant tissues is typically studied by destructive extraction of compounds from plant tissues for in vitro analyses. The methods ...

Biyoloji

Examining the Conformational Dynamics of Membrane Proteins in situ with Site-directed Fluorescence Labeling

Two electrode voltage clamp electrophysiology (TEVC) is a powerful tool to investigate the mechanism of ion transport1 for a wide variety of membrane proteins including ion channels2, ion pumps3, and transporters4. Recent developments have combined site-specific fluorophore labeling alongside TEVC to 
concurrently examine the conformational dynamics at specific residues and function of these proteins on the surface of single cells.
We will describe a method to study the conformational dynamics of membrane proteins by simultaneously monitoring fluorescence and current changes using voltage-clamp fluorometry. This approach can be used to examine the molecular motion of membrane proteins site-specifically following cysteine replacement and site-directed fluorophore labeling5,6. Furthermore, this method provides an approach to determine distance constraints between specific residues7,8. 
This is achieved by selectively attaching donor and acceptor fluorophores to two mutated cysteine residues of interest.
In brief, these experiments are performed following functional expression of the desired protein on the surface of Xenopus leavis oocytes. The large surface area of these oocytes enables facile functional measurements and a robust fluorescence signal5. It is also possible to readily change the extracellular conditions such as pH, ligand or cations/anions, which can provide further information on the mechanism of membrane proteins4. Finally, recent developments 
have also enabled the manipulation of select internal ions following co-expression with a second protein9.
Our protocol is described in multiple parts. First, cysteine scanning mutagenesis proceeded by fluorophore labeling is completed at residues located at the interface of the transmembrane and extracellular domains. Subsequent experiments are designed to identify residues which demonstrate large changes in fluorescence intensity (&lt;5%)3 upon a conformational change of the protein. Second, these changes in fluorescence intensity are compared to the kinetic parameters of 
the membrane protein in order to correlate the conformational dynamics to the function of the protein10. This enables a rigorous biophysical analysis of the molecular motion of the target protein. Lastly, two residues of the holoenzyme can be labeled with a donor and acceptor fluorophore in order to determine distance constraints using donor photodestruction methods. It is also possible to monitor the relative movement of protein subunits following labeling with a donor and acceptor fluorophore.

Examining the Conformational Dynamics of Membrane Proteins in situ with Site-directed Fluorescence Labeling

We will describe a method which measures the kinetics of ion transport of membrane proteins alongside site-specific analysis of conformational changes using fluorescence on single cells. This technique is adaptable to ion channels, transporters and ion pumps and can be utilized to determine distance constraints between protein subunits.

Membran Proteinleri Konformasyonel Dynamics incelenmesi In situ Site Floresan Etiketleme

Two electrode voltage clamp electrophysiology (TEVC) is a powerful tool to investigate the mechanism of ion transport1 for a wide variety of membrane ...

Phenotypic Analysis and Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells and Lineage-committed Progenitors

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs constitute a minute cell population of pluripotent cells capable of generating all blood cell lineages for a life-time1. The molecular dissection of HSCs homeostasis in the bone marrow has important implications in hematopoiesis, oncology and regenerative medicine. We describe the labeling protocol with fluorescent antibodies and the electronic gating procedure in flow cytometry to score hematopoietic progenitor subsets and HSCs distribution in individual mice (Fig. 1). In addition, we describe a method to extensively enrich hematopoietic progenitors as well as long-term (LT) and short term (ST) reconstituting HSCs from pooled bone marrow cell suspensions by magnetic enrichment of cells expressing c-Kit. The resulting cell preparation can be used to sort selected subsets for in vitro and in vivo functional studies (Fig. 2).
Both trabecular osteoblasts2,3 and sinusoidal endothelium4 constitute functional niches supporting HSCs in the bone marrow. Several mechanisms in the osteoblastic niche, including a subset of N-cadherin+ osteoblasts3 and interaction of the receptor tyrosine kinase Tie2 expressed in HSCs with its ligand angiopoietin-15 concur in determining HSCs quiescence. "Hibernation" in the bone marrow is crucial to protect HSCs from replication and eventual exhaustion upon excessive cycling activity6. Exogenous stimuli acting on cells of the innate immune system such as Toll-like receptor ligands7 and interferon-&alpha;6 can also induce proliferation and differentiation of HSCs into lineage committed progenitors. Recently, a population of dormant mouse HSCs within the lin- c-Kit+ Sca-1+ CD150+ CD48- CD34- population has been described8. Sorting of cells based on CD34 expression from the hematopoietic progenitors-enriched cell suspension as described here allows the isolation of both quiescent self-renewing LT-HSCs and ST-HSCs9. A similar procedure based on depletion of lineage positive cells and sorting of LT-HSC with CD48 and Flk2 antibodies has been previously described10. In the present report we provide a protocol for the phenotypic characterization and ex vivo cell cycle analysis of hematopoietic progenitors, which can be useful for monitoring hematopoiesis in different physiological and pathological conditions. Moreover, we describe a FACS sorting procedure for HSCs, which can be used to define factors and mechanisms regulating their self-renewal, expansion and differentiation in cell biology and signal transduction assays as well as for transplantation.

A method to analyse the distribution of bone marrow hematopoietic progenitors in flow cytometry as well as to efficiently isolate highly purified hematopoietic stem cells (HSCs) is described. The isolation procedure is essentially based on magnetic enrichment of c-Kit+ cells and cell sorting to purify HSCs for cellular and molecular studies.

Mürin Hematopoetik Kök Hücreler ve Lineage-kararlı progenitörlerin Fenotipik Analizi ve İzolasyon

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during development. Misregulation of this process has been implicated as a key event in fibrosis and the progression of carcinomas to a metastatic state. Understanding the processes that underlie EMT is imperative for the early diagnosis and clinical control of these disease states. Reliable induction of EMT in vitro is a useful tool for drug discovery as well as to identify common gene expression signatures for diagnostic purposes. Here we demonstrate a straightforward method for the induction of EMT in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells pre- and post-EMT induction by immunocytochemistry are also included. Additionally, we demonstrate the effectiveness of this method through antibody-based array analysis and migration/invasion assays.

A straightforward method is described for the induction of epithelial to mesenchymal transition (EMT) in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells in EMT states by immunocytochemistry are included.

Mezenkimal Geçiş indüksiyon ve Epitel Analizi

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Automated Analysis of Dynamic Ca2+ Signals in Image Sequences

Intracellular Ca2+ signals are commonly studied with fluorescent Ca2+ indicator dyes and microscopy techniques. However, quantitative analysis of Ca2+ imaging data is time consuming and subject to bias. Automated signal analysis algorithms based on region of interest (ROI) detection have been implemented for one-dimensional line scan measurements, but there is no current algorithm which integrates optimized identification and analysis of ROIs in two-dimensional image sequences. Here an algorithm for rapid acquisition and analysis of ROIs in image sequences is described. It utilizes ellipses fit to noise filtered signals in order to determine optimal ROI placement, and computes Ca2+ signal parameters of amplitude, duration and spatial spread. This algorithm was implemented as a freely available plugin for ImageJ (NIH) software. Together with analysis scripts written for the open source statistical processing software R, this approach provides a high-capacity pipeline for performing quick statistical analysis of experimental output. The authors suggest that use of this analysis protocol will lead to a more complete and unbiased characterization of physiologic Ca2+ signaling.

Automated Analysis of Dynamic Ca2+ Signals in Image Sequences

Here a novel region of interest analysis protocol based on sorting best-fit ellipses assigned to regions of positive signal within two-dimensional time lapse image sequences is demonstrated. This algorithm may enable investigators to comprehensively analyze physiological Ca2+ signals with minimal user input and bias.

Dinamik Ca Otomatik Analizi<sup&gt; 2 +</supGörüntü Dizilerinde&gt; Sinyaller

Intracellular Ca2+ signals are commonly studied with fluorescent Ca2+ indicator dyes and microscopy techniques. However, quantitative analysis of Ca2+ ...

Sequence-specific Labeling of Nucleic Acids and Proteins with Methyltransferases and Cofactor Analogues

S-Adenosyl-l-methionine (AdoMet or SAM)-dependent methyltransferases (MTase) catalyze the transfer of the activated methyl group from AdoMet to specific positions in DNA, RNA, proteins and small biomolecules. This natural methylation reaction can be expanded to a wide variety of alkylation reactions using synthetic cofactor analogues. Replacement of the reactive sulfonium center of AdoMet with an aziridine ring leads to cofactors which can be coupled with DNA by various DNA MTases. These aziridine cofactors can be equipped with reporter groups at different positions of the adenine moiety and used for Sequence-specific Methyltransferase-Induced Labeling of DNA (SMILing DNA). As a typical example we give a protocol for biotinylation of pBR322 plasmid DNA at the 5&#8217;-ATCGAT-3&#8217; sequence with the DNA MTase M.BseCI and the aziridine cofactor 6BAz in one step. Extension of the activated methyl group with unsaturated alkyl groups results in another class of AdoMet analogues which are used for methyltransferase-directed Transfer of Activated Groups (mTAG). Since the extended side chains are activated by the sulfonium center and the unsaturated bond, these cofactors are called double-activated AdoMet analogues. These analogues not only function as cofactors for DNA MTases, like the aziridine cofactors, but also for RNA, protein and small molecule MTases. They are typically used for enzymatic modification of MTase substrates with unique functional groups which are labeled with reporter groups in a second chemical step. This is exemplified in a protocol for fluorescence labeling of histone H3 protein. A small propargyl group is transferred from the cofactor analogue SeAdoYn to the protein by the histone H3 lysine 4 (H3K4) MTase Set7/9 followed by click labeling of the alkynylated histone H3 with TAMRA azide. MTase-mediated labeling with cofactor analogues is an enabling technology for many exciting applications including identification and functional study of MTase substrates as well as DNA genotyping and methylation detection.

DNA and proteins are sequence-specifically labeled with affinity or fluorescent reporter groups using DNA or protein methyltransferases and synthetic cofactor analogues. Depending on the cofactor specificity of the enzymes, aziridine or double activated cofactor analogues are employed for one- or two-step labeling.

Methyltransferases ve Kofaktör Analoglarının ile Nükleik Asitler ve Proteinler Dizi-spesifik Etiketleme

S-Adenosyl-l-methionine (AdoMet or SAM)-dependent methyltransferases (MTase) catalyze the transfer of the activated methyl group from AdoMet to specific ...

Immunofluorescence Analysis of Endogenous and Exogenous Centromere-kinetochore Proteins

"Centromeres" and "kinetochores" refer to the site where chromosomes associate with the spindle during cell division. Direct visualization of centromere-kinetochore proteins during the cell cycle remains a fundamental tool in investigating the mechanism(s) of these proteins. Advanced imaging methods in fluorescence microscopy provide remarkable resolution of centromere-kinetochore components and allow direct observation of specific molecular components of the centromeres and kinetochores. In addition, methods of indirect immunofluorescent (IIF) staining using specific antibodies are crucial to these observations. However, despite numerous reports about IIF protocols, few discussed in detail problems of specific centromere-kinetochore proteins.1-4 Here we report optimized protocols to stain endogenous centromere-kinetochore proteins in human cells by using paraformaldehyde fixation and IIF staining. Furthermore, we report protocols to detect Flag-tagged exogenous CENP-A proteins in human cells subjected to acetone or methanol fixation. These methods are useful in detecting and quantifying endogenous centromere-kinetochore proteins and Flag-tagged CENP-A proteins, including those in human cells.

Here we report protocols to detect endogenous and exogenous centromere-kinetochore proteins in human cells and quantify these protein levels at centromeres-kinetochores by indirect immunofluorescent staining through the use of fixation (paraformaldehyde, acetone, or methanol fixation).

Endojen ve İmmünofloresan Analizi ve Eksojen Sentromer-kinetochore Proteinler

"Centromeres" and "kinetochores" refer to the site where chromosomes associate with the spindle during cell division. Direct visualization of ...

Assays for the Degradation of Misfolded Proteins in Cells

Protein misfolding and aggregation are associated with various neurodegenerative diseases. Cellular mechanisms that recognize and degrade misfolded proteins may serve as potential therapeutic targets. To distinguish degradation of misfolding-prone proteins from other mechanisms that regulate their levels, one important method is to measure protein half-life in cells. However, this can be challenging because misfolding-prone proteins may exist in different forms, including the native form and misfolded forms of distinct characteristics. Here we describe assays to examine the half-life of misfolded proteins in mammalian cells using a highly aggregation-prone protein, Ataxin-1 with an extended polyglutamine (polyQ) stretch, and a conformationally unstable luciferase mutant as models. Cycloheximide chase is combined with cell fractionation to examine the turnover rate of misfolding-prone proteins in various cellular fractions. We further depict a fluorescence-based assay using an enhanced green fluorescence protein (EGFP)-fusion of the luciferase mutant, which can be adapted for high throughput screening on a microplate-reader.

This report describes protocols for measuring degradation rates of misfolded proteins by either western blot or fluorescence-based assays. The methods can be applied to analysis of other misfolded proteins and for high throughput screening.

Hücreler yanlış katlanmış proteinlerle degradasyonundan Tahliller

Protein misfolding and aggregation are associated with various neurodegenerative diseases. Cellular mechanisms that recognize and degrade misfolded ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex signaling mechanisms underlying filopodial initiation, elongation and subsequent stabilization or retraction, it is crucial to determine the spatio-temporal protein activity in these dynamic structures. To analyze protein function in filopodia, we recently developed a semi-automated tracking algorithm that adapts to filopodial shape-changes, thus allowing parallel analysis of protrusion dynamics and relative protein concentration along the whole filopodial length. Here, we present a detailed step-by-step protocol for optimized cell handling, image acquisition and software analysis. We further provide instructions for the use of optional features during image analysis and data representation, as well as troubleshooting guidelines for all critical steps along the way. Finally, we also include a comparison of the described image analysis software with other programs available for filopodia quantification. Together, the presented protocol provides a framework for accurate analysis of protein dynamics in filopodial protrusions using image analysis software.

We present a software solution for semi-automated tracking of relative protein concentration along the length of dynamic cellular protrusions.

Dinamik Hücresel Protrüzyonlarda Protein Konsantrasyonunun Yazılım Destekli Takibi için Grafiksel Bir Kullanıcı Arayüzü

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...

Immunofluorescent Labeling of Plant Virus and Insect Vector Proteins in Hemipteran Guts

Most plant viruses in nature are transmitted from one plant to another by hemipteran insects. A high population density of the vector insects that are highly efficient at virus transmission plays a key role in virus epidemics in fields. Studying virus-insect vector interactions can advance our understanding of virus transmission and epidemics with the aim of designing novel strategies to control plant viruses and their vector insects. Immunofluorescence labeling has been widely used to analyze interactions between pathogens and hosts and is used here in the white-backed planthopper (WBPH, Sogatella furcifera), which efficiently transmits the southern rice black streaked dwarf virus (SRBSDV, genus Fijivirus, family Reoviridae), to locate the virions and insect proteins in the midgut epithelial cells. Using laser scanning confocal microscopy, we studied the morphological characteristics of midgut epithelial cells, cellular localization of insect proteins, and the colocalization of virions and an insect protein. This protocol can be used to study virus activities in insects, functions of insect proteins, and interactions between virus and vector insect.

This protocol for immunofluorescent labeling of both plant virus proteins and vector insect proteins in excised insect guts can be used to study interactions among virus and vector insects, insect protein functions and molecular mechanisms underlying virus transmission.

Hemipteran Bağırsaklarda Bitki Virüsü ve Böcek Vektör Proteinlerinin İmmünofloresan Etiketlenmesi

Most plant viruses in nature are transmitted from one plant to another by hemipteran insects. A high population density of the vector insects that are ...

ReAsH / Flash Etiketleme ve Hücreler Tetracysteine ​​Sensör Proteinlerin Görüntü Analizi

ReAsH / Flash Etiketleme ve Hücreler Tetracysteine Sensör Proteinlerin Görüntü Analizi