פרוטוקול זה מתאר שיטה המאפשרת זיהוי ספציפי לאתר של שאריות ציסטין מחומצנות של חלבונים. השיטה מאפשרת להפיק נתונים כמותיים וספציפיים לאתר של שאריות ציסטין מחומצנות מסוגי דגימות שונים. כדי להתחיל בהליך הלכידה בסיוע, יש לשטוף את כדורי החלבון המזורזים פעמיים באצטון על ידי צנטריפוגה בעוצמה של 20, 500 גרם, בארבע מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
לאחר מכן decant את האצטון ולהסיר את האצטון הנותר עם מיקרו פיפטה. באמצעות פיפטה סרולוגית זכוכית להוסיף שלושה מיליליטר של אצטון קר כקרח טרי לצינור ומערבבים היטב על ידי היפוך הצינור מספר פעמים. לאחר השטיפה השנייה, אפשרו לכופתיות להתייבש באוויר במשך דקה עד שתי דקות מבלי לתת להן להתייבש.
מוסיפים מיליליטר אחד של חיץ B לכדור החלבון המיובש. כדי לבודד את החלבון, סוניקו את הכדור שוב ושוב בסוניק אמבטיה עם תפוקה של 250 וואט למשך 15 עד 30 שניות בכל פעם, יחד עם מערבולת קצרה. בצעו את בדיקת החומצה הביצ'ינצ'ונית או BCA כדי למדוד את ריכוז החלבון.
כדי לתקנן את ריכוזי החלבון, העבירו 500 מיקרוגרם של דגימת חלבון למסנן צנטריפוגלי של 0.5 מיליליטר, 10 קילודלטון, והגדילו את הדגימה ל-500 מיקרוליטר עם חיץ מחדש. צנטריפוגה תערובת מאגר חלבון ב 14, 000 גרם בטמפרטורת החדר, עד נפח במסנן צנטריפוגלי הוא פחות מ 100 microliters. אסוף את הדגימה על ידי היפוך המסנן בצינור איסוף.
צנטריפוגה הדגימה ב 1000 G במשך שתי דקות ולהוסיף חיץ C כדי לקבל נפח סופי של 500 מיקרוליטר. כדי להפחית את תיול החלבון, להוסיף 20 microliters של 500 מילימולר dithiothreitol או DTT, לדגימה כדי לקבל ריכוז סופי של 20 מילימולר, ולדגור את הדגימות במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס עם רעידות ב 850 סל"ד. לאחר הפחתה, צנטריפוגה לדגימות לתוך 0.5 מיליליטר 10 קילודלטון מסננים צנטריפוגליים ב 14, 000 G בטמפרטורת החדר, עד נפח במסנן צנטריפוגלי הוא פחות מ 100 microliters.
הוסף חיץ D כדי להשלים את הנפח ל-500 מיקרוליטר וחזור על הצנטריפוגה. לאחר הצנטריפוגה הרביעית, אסוף את הדגימות על ידי היפוך המסנן בצינור איסוף לצנטריפוגה ב 1000 G במשך שתי דקות. לאחר מכן מדדו את ריכוז החלבון באמצעות בדיקת BCA.
לאחר מכן, מניחים את עמודי הספין על סעפת ואקום, ובעזרת מיקרו פיפטה מעבירים 500 מיקרוליטרים של שרף זיקה תיול טרי לכל עמודה. החל ואקום להסרת מים. חזור על ההליך פעם אחת כדי לקבל 30 מיליגרם של שרף לכל עמודה.
לשטוף את השרף חמש פעמים עם 500 microliters של מים ultrapurure, על ידי החלת ואקום כדי להסיר את המים ולאחר מכן חמש פעמים עם 500 microliters של חיץ E.In צינור חדש, להוסיף חיץ C ל 150 מיקרוגרם של דגימת חלבון מופחת עד נפח הסופי הוא 120 microliters. מעבירים את תמיסת החלבון לעמודת ספין סתומה המכילה את השרף. מניחים את הכובע על העמוד ודוגרים במשך שעתיים בטמפרטורת החדר עם רעידות ב-850 סל"ד.
לשטוף את השרף כפי שמתואר בכתב היד. החלף את התקע. כדי לבצע עיכול טריפטי על שרף, הוסיפו 120 מיקרוליטרים של תמיסת טריפסין טרייה לדגימות, ודגרו את העמודה למשך הלילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, עם רעידות במהירות של 850 סל"ד.
למחרת, יש לשטוף את השרף מספר פעמים כמתואר בכתב היד ולהחליף את התקע. באמצעות מיקרו פיפטה, להוסיף 40 microliters של 100 מילימולר Triethylammonium ביקרבונט חיץ שרף שטף. לאחר מכן הוסיפו 70 מיקרוליטרים של תג מסת טנדם מומס או מגיב תיוג TMT, ודגרו במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר עם ניעור ב-850 סל"ד.
אחסן את כל מגיב TMT שנותר במינוס 80 מעלות צלזיוס. שטפו את השרף והחליפו את התקע. שדרגו את הפפטידים המסומנים ב-TMT על ידי הוספת 100 מיקרוליטרים של חיץ אמוניום ביקרבונט של 100 מילימולאר ב-pH 8.0, המכיל DTT של 20 מילימולר, לעמודה, והדגרת העמודה על מערבל תרמי בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות ב-850 סל"ד.
לאחר הדגירה, בצע אלוציה על ידי הנחת העמודה על סעפת ואקום, החלת הוואקום והפיכת הדגימות לצינור מיקרו צנטריפוגה של חמישה מיליליטר. חזור על השלב פעם אחת, ולאחר מכן להוסיף 100 microliters של 80% acetonitrile עם 0.1% חומצה trifluoroacetic לעמודה. לאחר דגירה של העמודה במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר, יש לחמוק מהדגימה באותו צינור צנטריפוגה של חמישה מיליליטר.
מניחים את הדגימות המלוטשות ברכז ואקום עד לייבוש. לאחר מכן יש לאחסן את הפפטידים היבשים בטמפרטורה של מינוס 80 מעלות צלזיוס עד לשימוש נוסף. הניתוח האיכותי של דגימות פפטידים מתאי RAW 264.7 בוצע באמצעות SDS-PAGE, שבו הדגימות הושוו על ידי קביעת רמות שונות של חמצון עקב טיפולים.
החלבונים שהופרדו נחקרו לאחר מכן על ידי כתם מערבי כדי לחקור עוד יותר את רמות החמצון של חלבונים בודדים. עוצמות יונים מדווחות של ציסטין המכילות פפטידים נותחו על ידי ספקטרומטריית מסה טנדם כרומטוגרפיה נוזלית. הסטויכיומטריה של חמצון תיול של iTRAQ, המסומנת כפפטידים מועשרים ומחומצנים ברמות של אתרי ציסטין בודדים, כומתה.
בזהירות להסיר אצטון מבלי להפריע גלולה חלבון. ודאו כי גלולת החלבון מסיסה לחלוטין וכמותית במדויק, וכי שרף מוקצה במדויק לעמודות ספין. הקפידו להשהות את השרף במהלך שלבי הכביסה.
הערכה נוספת של חלבונים ופפטידים מועשרים עשויה להתבצע על ידי SDS-PAGE וכתמים, כתם מערבי וספקטרומטריית מסה.
