Este trabajo fue financiado por becas de DMH y TDM (NHMRC subvenciones para proyectos). DMH es un compañero Grimwade, financiado por la Fundación Miegunyah.

1. Preparación de las células para el etiquetado con ReAsH / Flash <ol><li> Utilizando los métodos estándar de cultivo celular para la línea celular de interés, preparar un cultivo de células adheridas directamente en una diapositiva de células imágenes en vivo listo para la transfección. </li><li> Transfectar el plásmido que contenía TC-etiquetado de genes de interés en función de su método de transfección de la elección. </li></ol> Tenga en cuenta que es importante la utilización de controles positivos y negativos para evaluar el grado de unión específica a las etiquetas de TC y evaluar de forma bleedthrough de fluorescencia entre los canales en la recogida de micrografías confocal. Por lo tanto, de dos colores (por ejemplo, Flash / cereza o ReAsH / PPC o combinaciones ReAsH / GFP), asegúrese de muestras se preparan para un solo color (por ejemplo, proteínas fluorescentes solo o si es posible una proteína TC-etiquetado vinculados a Flash / ReAsH pero sin fluorescentes proteína) <ol start="3"><li> Uno o dos días después de la transfección, aclare suavemente las células con 300 L precalentado (a 37 ° C) HBSS. </li><li> Sumergir suavemente las células con Flash M 1 (o ReAsH) en 300 l de HBSS precalentado y 10 M de 1,2-etanoditiol (EDT). </li></ol> Es importante agregar EDT primero antes de añadir Flash / ReAsH y hacer que el buffer justo antes de añadir a las células. Incubar durante exactamente 30 minutos a 37 ° C en la incubadora de cultivo de tejidos. En nuestra experiencia los tiempos de incubación más largo aumenta significativamente la fluorescencia de fondo. Nuevas construcciones también deben ser optimizados para el etiquetado de tiempo y Flash / ReAsH concentración (0.5-2 M). <ol start="5"><li> Aspire con cuidado el etiquetado solución de las células y luego vuelva a colocar con 300 l HBSS precalentado + 250 M 2,3-dimercaptopropanol (BAL) por 15 min a 37 ° C. </li><li> Retire la solución de lavado por aspiración suave y reemplazar con 300 l HBSS precalentado. </li></ol> Después de este lavado, las células se pueden fijar con paraformaldehído (15 min con 3,2% de solución), aunque hemos encontrado que este aumento no específico de fluorescencia tinte biarsenical. De ahí que por lo general la imagen de la células vivas a temperatura ambiente. (Tenga en cuenta que la fijación de las células antes de su etiquetado impide la unión colorante biarsenical.) 2. Imágenes de las células en un microscopio confocal <ol><li> En el microscopio confocal, configurar los parámetros para obtener imágenes de los fluoróforos individual (ver Tabla 1) y asegurarse de que no es bleedthrough insignificante entre los canales. Esto se puede lograr mediante la comprobación fluoróforos individuales (en las muestras de control) en contra de cada opción de adquisición de diferentes fluorescente para la fluorescencia. Ajuste de la longitud de onda de emisión puede ayudar a minimizar bleedthrough (aunque esto también puede reducir la relación señal / ruido). </li><li> También puede ajustar la configuración del fotomultiplicador para que el máximo de fluorescencia en la muestra no saturar el detector. (Esto puede ser detectado mediante el ajuste de Q-LUT en el confocal Leica SP2). Una vez que la mejor configuración de imagen se determinan, no cambie ninguna de ellas entre las muestras. </li><li> Otros ajustes se suelen utilizar (aunque estos pueden ser optimizados) son una velocidad de barrido de 200 Hz y recoger 4 promedios de línea y un diámetro de orificio de 1 unidad Airy. El diámetro del agujero de alfiler puede ser ampliado si la señal / ruido es un problema, sin embargo, esto puede resultar en una pérdida de imagen. </li><li> Recoger las imágenes de confocal de 12-bit (o superior) formato, si es posible. 12-bit formato capta un mayor rango dinámico de los valores (0-4095) para cada intensidad de los píxeles de 8 bits (0-255). Esto es importante para asegurar el más rico conjunto de datos se registra, lo que maximiza la calidad de los análisis de datos cuantitativos. </li><li> Recoge imágenes del canal de la proteína fluorescente (Cherry, las buenas prácticas agrarias o PPC) y también para el canal biarsenical tinte (flash o ReAsH) para todas las muestras. </li></ol> 3. Análisis de los datos <ol><li> Instale el software ImageJ en su ordenador 8. <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/">http://rsbweb.nih.gov/ij/</a> </li><li> Asegúrese de que su versión de ImageJ tiene los siguientes plugins: <ul><li> <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/file-opener.html">http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/file-opener.html</a> </li><li> <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/image_correlator.html">http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/image_correlator.html</a> </li><li> <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/lut-editor.html">http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/lut-editor.html</a> </li></ul></li><li> Abrir ImageJ, y si se utiliza una versión anterior a la v1.32c, haga clic en las opciones siguientes para permitir que múltiples imágenes que se abrirá a la vez (que se puede hacer manteniendo pulsado el botón de control mientras hace clic en diferentes archivos): <img src="/files/ftp_upload/2857/2857step1.jpg" alt="Figura 1" /></li><li> Abra las imágenes de interés en ImageJ. ImageJ definirá automáticamente las intensidades de los píxeles máximos y mínimos que se muestran en la pantalla para cada imagen por separado. Teniendo en cuenta que las diferentes imágenes se han dintensidades ifferent píxeles, esto significa que las imágenes mostradas no son comparables como se ven. </li><li> Para asegurarse de que las imágenes se abren todas en la misma escala, que físicamente puede definir los límites superior e inferior intensidades de los píxeles para ser visto (esto no va a cambiar el contenido de los datos reales de las imágenes, como sería el caso en algunos otros programas). Estos valores se puede establecer en el siguiente menú: <img src="/files/ftp_upload/2857/2857step2.jpg" alt="Figura 2" /></li><li> Un enfoque alternativo es trabajar con las pilas, lo que pone todas las imágenes juntas en un solo archivo y se escalará de forma automática (para ver) todas las imágenes de la pila a la misma escala. La forma más fácil de trabajar con los datos es convertir cada canal a una pila. Por lo tanto, para el canal de la proteína fluorescente convertir a todos a la pila como se muestra. Usted puede seleccionar un canal por el apilamiento de todas las imágenes que contiene un nombre común (por ejemplo, &quot;ch00&quot;) en el título. <img src="/files/ftp_upload/2857/2857step3.jpg" alt="Figura 3" /></li><li> Ahora convertir todas las imágenes abiertas a 8 bits para su análisis. Esto va a cambiar la escala del rango considerado en un rango de 0 a 255 (que define de 8 bits). IMPORTANTE: No guarde el original de 12-bit (o superior) de formato o se pierde el contenido de la información. Tenga en cuenta que algunos paquetes de software sólo puede mostrar imágenes de 8 bits por lo que este formato es útil para la toma de datos, etc <img src="/files/ftp_upload/2857/2857step4.jpg" alt="Figura 4" /></li><li> Guardar una copia en una carpeta llamada &quot;8-bit convertido&quot; utilizando la opción &quot;Guardar como ...&quot; opción. </li><li> Un método para examinar el grado de fijación del colorante biarsenical en una imagen de conjunto es para llevar a cabo un complot intensidad de la correlación de píxeles. Esto dibuja cada píxel de valor en un canal de relación con el correspondiente valor de píxel en un segundo canal. Por lo tanto, una posición de píxeles de alta en el PPC fluorescencia también será alto en la fluorescencia ReAsH si disponen de un enlace. </li><li> Para analizar el píxel co-correlación, asegúrese de que el ReAsH de 8-bits y las imágenes de Cerulean / GFP están abiertas en ImageJ. </li><li> Abra el &quot;Correlador imagen&quot; plug-in, como se indica a continuación. Seleccione &quot;Image1&quot;, como la pila de ReAsH o Flash y &quot;Image2&quot;, como la pila de la proteína fluorescente. <img src="/files/ftp_upload/2857/2857step5.jpg" alt="Figura 5" /></li><li> La pila resultante no puede mostrar información detallada - esto es normal. Guarde la pila en una nueva carpeta llamada &quot;Diagramas de dispersión&quot; y darle el mismo nombre que la muestra se refiere a (por ejemplo, &quot;flash-cereza gráfica de correlación&quot;) </li><li> Para ver la información significativa que puede hacer una de dos opciones. En primer lugar transformar los datos para que sea en el formato de registro. Luego visualmente reescalar los datos de la siguiente manera: <img src="/files/ftp_upload/2857/2857step6.jpg" alt="Figura 6" /></li><li> Como alternativa, puede cambiar la escala de los datos visuales para mostrar sólo los valores bajos (por ejemplo, 1-255) y mostrar los datos utilizando una LUT especial. Una LUT (Look Up Table) representa una tabla de colores que se asignan a cada valor de píxel en una imagen . Esto puede ser usado para definir un plan de pseudocolor de una imagen y es útil para la definición de ciertas características de una imagen. Para crear una, haga clic LUT personalizada en &quot;editor LUT&quot; y hacer uno nuevo, como el que se muestra (esto puede ser guardado y utilizado más adelante). <img src="/files/ftp_upload/2857/2857step7.jpg" alt="Figura 7" /></li><li> Establecer el rango de brillo / contraste 0-255 (como se describe en el paso 13). Para &quot;congelar&quot; la imagen que la mostrada en la pantalla, la imagen se puede convertir a formato RGB, que guarda un valor de 8 bits para cada uno de los colores rojo, verde y azul de cada píxel. <img src="/files/ftp_upload/2857/2857step8.jpg" alt="Figura 8" /> Para copiar y pegar imágenes a otros programas de abrir por primera vez las imágenes de 8-bit o 16-bit. Como se describe en el paso 14, asignar una combinación de colores LUT de la imagen. De la PPC, asigne el &quot;Cyan&quot; LUT como se describe a continuación ... <img src="/files/ftp_upload/2857/2857step9.jpg" alt="Figura 9" /></li><li> Seleccione la imagen y copiarla en el portapapeles de selección, ... <img src="/files/ftp_upload/2857/2857step10.jpg" /></li></ol> 4. Los resultados representativos: El éxito de las células de etiquetado con los tintes biarsenical depende de los parámetros clave. En primer lugar, el momento en el etiquetado con los tintes es crucial. Hemos encontrado que durante largos períodos de etiquetado (más de 30 minutos) se traduce en un alto grado de tinción de fondo inespecífica. La figura 1 muestra un resultado típico de una forma de tipo salvaje de un fragmento de la huntingtina (25Q) fusionado con el Cerulean PPC derivado que contenga una etiqueta de TC como se describió anteriormente 7. Esta muestra se tiñó durante 30 minutos con ReAsH y no hay experiencia mínima en la muestra que carecen de la etiqueta de TC. Hemos encontrado que la fijación de las células con paraformaldehído plano aumenta mientras que la fijación con metanol abroga la fluorescencia de la etiqueta de la proteína fluorescente. De ahí que sea posible que la imagen de la células vivas. Es importante señalar también que la fijación previaal etiquetado con los tintes biarsenical impide su unión, presumiblemente debido a las modificaciones del motivo de TC. Otro factor fundamental para obtener resultados consistentes es la densidad de las células. Hemos encontrado que es esencial para las células de la imagen que están más o menos distribuidos y también que agrupar extensa puede dar lugar a manchas irregulares de los tintes biarsenical en diferentes células. <img src="/files/ftp_upload/2857/2857fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Tetracysteine ​​etiquetas y tinción ReAsH en células vivas transfectadas con la huntingtina (exon1-25Q)-Cerulean fusiones. La etiqueta de TC se encuentra en el cruce de la fusión de la huntingtina, Celeste (como se describe en 7). La trama de intensidad de correlación de píxeles permite una evaluación a las diferencias en ReAsH vinculante en toda la célula y puede ser utilizado para trazar los cambios en ReAsH vinculante debido al cambio conformacional o ligando.

<ol>
	<li>Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+green+fluorescent+protein.">The green fluorescent protein.</a> Ann. Rev. Biochem. 67, 509-544 (1998).</li><li>Griffin, B. A., Adams, S. R., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+covalent+labeling+of+recombinant+protein+molecules+inside+live+cells.">Specific covalent labeling of recombinant protein molecules inside live cells.</a> Science. 281, 269-2672 (1998).</li><li>Uttamapinant, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fluorophore+ligase+for+site-specific+protein+labeling+inside+living+cells.">A fluorophore ligase for site-specific protein labeling inside living cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107, 10914-10919 (2010).</li><li>Ignatova, Z., Gierasch, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+protein+stability+and+aggregation+in+vivo+by+real-time+fluorescent+labeling.">Monitoring protein stability and aggregation in vivo by real-time fluorescent labeling.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 101, 523-528 (2004).</li><li>Coleman, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+detection+of+prion+protein+with+biarsenical+labeling+and+FlAsH+fluorescence.">Conformational detection of prion protein with biarsenical labeling and FlAsH fluorescence.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 380, 564-568 (2009).</li><li>Luedtke, N. W., Dexter, R. J., Fried, D. B., Schepartz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surveying+polypeptide+and+protein+domain+conformation+and+association+with+FlASH+and+ReAsH.">Surveying polypeptide and protein domain conformation and association with FlASH and ReAsH.</a> Nat. Chem. Biol. 3, 779-784 (2007).</li><li>Ramdzan, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformation+sensors+that+distinguish+monomeric+proteins+from+oligomers+in+live+cells.">Conformation sensors that distinguish monomeric proteins from oligomers in live cells.</a> Chem. Biol. 17, 371-379 (2010).</li><li>Abramoff, M. a. g. e. l. h. a. e. s., PJ, S. J. R. a. m. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image+processing+with+ImageJ.">Image processing with ImageJ.</a> Biophotonics International. 11, 36-42 (2004).</li><li>Hearps, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biarsenical+dye+Lumio+exhibits+a+reduced+ability+to+specifically+detect+tetracysteine-containing+proteins+within+live+cells.">The biarsenical dye Lumio exhibits a reduced ability to specifically detect tetracysteine-containing proteins within live cells.</a> J. Fluor. 17, 593-597 (2007).</li><li>Adams, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+biarsenical+ligands+and+tetracysteine+motifs+for+protein+labeling+in+vitro+and+in+vivo:+Synthesis+and+biological+applications.">New biarsenical ligands and tetracysteine motifs for protein labeling in vitro and in vivo: Synthesis and biological applications.</a> J. Am. Chem. Soc. 124, 6063-6076 (2002).</li><li>Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+choosing+fluorescent+proteins.">A guide to choosing fluorescent proteins.</a> Nat. Meth. 2, 905-909 (2005).</li></ol>

No hay conflictos de interés declarado.

El enfoque de la localización de la etiqueta de proteínas con una proteína fluorescente y propiedades conformacionales con un tinte segunda ofrece un gran potencial para el mapeo en diferentes conformaciones de las proteínas se acumulan en las células y los eventos que cambian la dinámica de la conformación de la proteína. ReAsH / Flash se utilizó por primera vez como un sensor en el celular de plegamiento de las proteínas celulares de los mamíferos del ácido retinoico-proteína de unión I 4. En ...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nombre del reactivo </th><th> Empresa </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentarios </th></tr><tr><td> 8 y μ-diapositivas </td><td> Ibidi </td><td> 80826 </td><td> Consideramos que estos cámara de diapositivas para ser especialmente útil para el cultivo de células para la imagen. </td></tr><tr><td> TC-Flash II en las células de detección de etiqueta Tetracysteine ​​Kit * * * fluorescencia verde de células vivas imágenes </td><td> Invitrogen </td><td> T34561 (flash) o T34562 (ReAsH) </td><td></td></tr><tr><td> Solución salina equilibrada de Hanks </td><td> Invitrogen </td><td> 14175-103 </td><td></td></tr><tr><td> 2,3-dimercapto-1-propanol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D1129-5ML </td><td></td></tr><tr><td> 1,2-etanoditiol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 02390-25ML </td><td></td></tr></tbody></table>

reash/flash labeling and image analysis of tetracysteine sensor proteins in cells

Las proteínas fluorescentes y tintes son herramientas esenciales para el estudio de proteínas tráfico, localización y función en las células. Mientras que las proteínas fluorescentes como la proteína verde fluorescente (GFP) han sido ampliamente utilizados como socios de la fusión de las proteínas para hacer un seguimiento de las propiedades de una proteína de interés 1, los acontecimientos recientes más pequeñas etiquetas permiten nuevas funcionalidades de las proteínas que se examinarán en las células, como el cambio conformacional y proteínas de asociación 2, 3. Un sistema de etiqueta pequeña implica un motivo tetracysteine ​​(CCXXCC) genéticamente insertado en una proteína diana, que se une a colorantes biarsenical, ReAsH (fluorescente de color rojo) y Flash (de color verde fluorescente), con una alta especificidad, incluso en las células vivas 2. El sistema de TC / biarsenical tinte ofrece mucho menos restricciones estéricas de la proteína de acogida de proteínas fluorescentes que ha permitido a varios nuevos métodos para medir el cambio en la conformación y las interacciones proteína-7.4. Recientemente hemos desarrollado una nueva aplicación de etiquetas de TC como sensores de oligomerización en células que expresan huntingtina mutante, que cuando mutan agregados en las neuronas en la enfermedad de Huntington 7. Huntingtina fue etiquetado con dos tintes fluorescentes, una una proteína fluorescente para seguir la localización de proteínas, y la segunda, una etiqueta de TC, que sólo vincula a los tintes biarsenical en monómeros. Por lo tanto, los cambios en la colocalización entre la proteína y la reactividad tinte biarsenical contenido habilitado oligómero submicroscópicas que se asigna espacio dentro de las células. Aquí se describe cómo etiquetar TC-etiquetados proteínas fusionadas a una proteína fluorescente (Cherry, las buenas prácticas agrarias o PPC) con flash o ReAsH en vivo las células de mamíferos y la forma de cuantificar la fluorescencia de dos colores (cereza / Flash, PPC / Flash o GFP / ReAsH combinaciones).

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ReAsH/FlAsH Labeling and Image Analysis of Tetracysteine Sensor Proteins in Cells

El biarsenical FlAsH tintes y ReAsH se unen específicamente a los motivos tetracysteine ​​en proteínas y selectiva puede etiquetar las proteínas en células vivas. Recientemente, esta estrategia de etiquetado se ha utilizado para desarrollar sensores para diferentes conformaciones de las proteínas o los estados oligoméricos. Se describe el mecanismo de etiquetado y métodos para analizar cuantitativamente vinculante.

ReAsH / Flash etiquetado y análisis de imágenes de las proteínas en las células del sensor Tetracysteine

Fluorescent proteins and dyes are essential tools for the study of protein trafficking, localization and function in cells.  While fluorescent 
proteins ...

reashflash-labeling-image-analysis-tetracysteine-sensor-proteins

Research

JoVE Journal

Biology

16.9K vistas.  Bio21 Molecular Science and Biotechnology Institute. El biarsenical FlAsH tintes y ReAsH se unen específicamente a los motivos tetracysteine ​​en proteínas y selectiva puede etiquetar las proteínas en células vivas. Recientemente, esta estrategia de etiquetado se ha utilizado para desarrollar sensores para diferentes conformaciones de las proteínas o los estados oligoméricos. Se describe el mecanismo de etiquetado y métodos para analizar cuantitativamente vinculante.

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Robotics and Dynamic Image Analysis for Studies of Gene Expression in Plant Tissues

Gene expression in plant tissues is typically studied by destructive extraction of compounds from plant tissues for in vitro analyses. The methods presented here utilize the green fluorescent protein (gfp) gene for continual monitoring of gene expression in the same pieces of tissues, over time. The gfp gene was placed under regulatory control of different promoters and introduced into lima bean cotyledonary tissues via particle bombardment. Cotyledons were then placed on a robotic image collection system, which consisted of a fluorescence dissecting microscope with a digital camera and a 2-dimensional robotics platform custom-designed to allow secure attachment of culture dishes. Images were collected from cotyledonary tissues every hour for 100 hours to generate expression profiles for each promoter. Each collected series of 100 images was first subjected to manual image alignment using ImageReady to make certain that GFP-expressing foci were consistently retained within selected fields of analysis. Specific regions of the series measuring 300 x 400 pixels, were then selected for further analysis to provide GFP Intensity measurements using ImageJ software. Batch images were separated into the red, green and blue channels and GFP-expressing areas were identified using the threshold feature of ImageJ. After subtracting the background fluorescence (subtraction of gray values of non-expressing pixels from every pixel) in the respective red and green channels, GFP intensity was calculated by multiplying the mean grayscale value per pixel by the total number of GFP-expressing pixels in each channel, and then adding those values for both the red and green channels. GFP Intensity values were collected for all 100 time points to yield expression profiles. Variations in GFP expression profiles resulted from differences in factors such as promoter strength, presence of a silencing suppressor, or nature of the promoter. In addition to quantification of GFP intensity, the image series were also used to generate time-lapse animations using ImageReady. Time-lapse animations revealed that the clear majority of cells displayed a relatively rapid increase in GFP expression, followed by a slow decline. Some cells occasionally displayed a sudden loss of fluorescence, which may be associated with rapid cell death. Apparent transport of GFP across the membrane and cell wall to adjacent cells was also observed. Time lapse animations provided additional information that could not otherwise be obtained using GFP Intensity profiles or single time point image collections.

We report a method for introduction, tracking and quantitative analysis of GFP expression in plant cells. This method utilizes a custom-designed robotics system for semi-continuous image collection from large numbers of samples, over time. We also demonstrate the use of ImageJ and ImageReady for analysis of image series.

Robótica y Análisis de Imagen Dinámica de Estudios de la expresión génica en los tejidos vegetales

Gene expression in plant tissues is typically studied by destructive extraction of compounds from plant tissues for in vitro analyses. The methods ...

Investigación

Biología

Examining the Conformational Dynamics of Membrane Proteins in situ with Site-directed Fluorescence Labeling

Two electrode voltage clamp electrophysiology (TEVC) is a powerful tool to investigate the mechanism of ion transport1 for a wide variety of membrane proteins including ion channels2, ion pumps3, and transporters4. Recent developments have combined site-specific fluorophore labeling alongside TEVC to 
concurrently examine the conformational dynamics at specific residues and function of these proteins on the surface of single cells.
We will describe a method to study the conformational dynamics of membrane proteins by simultaneously monitoring fluorescence and current changes using voltage-clamp fluorometry. This approach can be used to examine the molecular motion of membrane proteins site-specifically following cysteine replacement and site-directed fluorophore labeling5,6. Furthermore, this method provides an approach to determine distance constraints between specific residues7,8. 
This is achieved by selectively attaching donor and acceptor fluorophores to two mutated cysteine residues of interest.
In brief, these experiments are performed following functional expression of the desired protein on the surface of Xenopus leavis oocytes. The large surface area of these oocytes enables facile functional measurements and a robust fluorescence signal5. It is also possible to readily change the extracellular conditions such as pH, ligand or cations/anions, which can provide further information on the mechanism of membrane proteins4. Finally, recent developments 
have also enabled the manipulation of select internal ions following co-expression with a second protein9.
Our protocol is described in multiple parts. First, cysteine scanning mutagenesis proceeded by fluorophore labeling is completed at residues located at the interface of the transmembrane and extracellular domains. Subsequent experiments are designed to identify residues which demonstrate large changes in fluorescence intensity (&lt;5%)3 upon a conformational change of the protein. Second, these changes in fluorescence intensity are compared to the kinetic parameters of 
the membrane protein in order to correlate the conformational dynamics to the function of the protein10. This enables a rigorous biophysical analysis of the molecular motion of the target protein. Lastly, two residues of the holoenzyme can be labeled with a donor and acceptor fluorophore in order to determine distance constraints using donor photodestruction methods. It is also possible to monitor the relative movement of protein subunits following labeling with a donor and acceptor fluorophore.

Examining the Conformational Dynamics of Membrane Proteins in situ with Site-directed Fluorescence Labeling

We will describe a method which measures the kinetics of ion transport of membrane proteins alongside site-specific analysis of conformational changes using fluorescence on single cells. This technique is adaptable to ion channels, transporters and ion pumps and can be utilized to determine distance constraints between protein subunits.

Examinar la dinámica conformacional de las proteínas de membrana In situ Sitio-dirigida con fluorescencia de etiquetado

Two electrode voltage clamp electrophysiology (TEVC) is a powerful tool to investigate the mechanism of ion transport1 for a wide variety of membrane ...

Phenotypic Analysis and Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells and Lineage-committed Progenitors

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs constitute a minute cell population of pluripotent cells capable of generating all blood cell lineages for a life-time1. The molecular dissection of HSCs homeostasis in the bone marrow has important implications in hematopoiesis, oncology and regenerative medicine. We describe the labeling protocol with fluorescent antibodies and the electronic gating procedure in flow cytometry to score hematopoietic progenitor subsets and HSCs distribution in individual mice (Fig. 1). In addition, we describe a method to extensively enrich hematopoietic progenitors as well as long-term (LT) and short term (ST) reconstituting HSCs from pooled bone marrow cell suspensions by magnetic enrichment of cells expressing c-Kit. The resulting cell preparation can be used to sort selected subsets for in vitro and in vivo functional studies (Fig. 2).
Both trabecular osteoblasts2,3 and sinusoidal endothelium4 constitute functional niches supporting HSCs in the bone marrow. Several mechanisms in the osteoblastic niche, including a subset of N-cadherin+ osteoblasts3 and interaction of the receptor tyrosine kinase Tie2 expressed in HSCs with its ligand angiopoietin-15 concur in determining HSCs quiescence. "Hibernation" in the bone marrow is crucial to protect HSCs from replication and eventual exhaustion upon excessive cycling activity6. Exogenous stimuli acting on cells of the innate immune system such as Toll-like receptor ligands7 and interferon-&alpha;6 can also induce proliferation and differentiation of HSCs into lineage committed progenitors. Recently, a population of dormant mouse HSCs within the lin- c-Kit+ Sca-1+ CD150+ CD48- CD34- population has been described8. Sorting of cells based on CD34 expression from the hematopoietic progenitors-enriched cell suspension as described here allows the isolation of both quiescent self-renewing LT-HSCs and ST-HSCs9. A similar procedure based on depletion of lineage positive cells and sorting of LT-HSC with CD48 and Flk2 antibodies has been previously described10. In the present report we provide a protocol for the phenotypic characterization and ex vivo cell cycle analysis of hematopoietic progenitors, which can be useful for monitoring hematopoiesis in different physiological and pathological conditions. Moreover, we describe a FACS sorting procedure for HSCs, which can be used to define factors and mechanisms regulating their self-renewal, expansion and differentiation in cell biology and signal transduction assays as well as for transplantation.

A method to analyse the distribution of bone marrow hematopoietic progenitors in flow cytometry as well as to efficiently isolate highly purified hematopoietic stem cells (HSCs) is described. The isolation procedure is essentially based on magnetic enrichment of c-Kit+ cells and cell sorting to purify HSCs for cellular and molecular studies.

El análisis fenotípico y aislamiento de células madre hematopoyéticas murinas y progenitores comprometidos Lineage

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during development. Misregulation of this process has been implicated as a key event in fibrosis and the progression of carcinomas to a metastatic state. Understanding the processes that underlie EMT is imperative for the early diagnosis and clinical control of these disease states. Reliable induction of EMT in vitro is a useful tool for drug discovery as well as to identify common gene expression signatures for diagnostic purposes. Here we demonstrate a straightforward method for the induction of EMT in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells pre- and post-EMT induction by immunocytochemistry are also included. Additionally, we demonstrate the effectiveness of this method through antibody-based array analysis and migration/invasion assays.

A straightforward method is described for the induction of epithelial to mesenchymal transition (EMT) in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells in EMT states by immunocytochemistry are included.

Inducción y Análisis de epitelial a mesenquimal de transición

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Automated Analysis of Dynamic Ca2+ Signals in Image Sequences

Intracellular Ca2+ signals are commonly studied with fluorescent Ca2+ indicator dyes and microscopy techniques. However, quantitative analysis of Ca2+ imaging data is time consuming and subject to bias. Automated signal analysis algorithms based on region of interest (ROI) detection have been implemented for one-dimensional line scan measurements, but there is no current algorithm which integrates optimized identification and analysis of ROIs in two-dimensional image sequences. Here an algorithm for rapid acquisition and analysis of ROIs in image sequences is described. It utilizes ellipses fit to noise filtered signals in order to determine optimal ROI placement, and computes Ca2+ signal parameters of amplitude, duration and spatial spread. This algorithm was implemented as a freely available plugin for ImageJ (NIH) software. Together with analysis scripts written for the open source statistical processing software R, this approach provides a high-capacity pipeline for performing quick statistical analysis of experimental output. The authors suggest that use of this analysis protocol will lead to a more complete and unbiased characterization of physiologic Ca2+ signaling.

Automated Analysis of Dynamic Ca2+ Signals in Image Sequences

Here a novel region of interest analysis protocol based on sorting best-fit ellipses assigned to regions of positive signal within two-dimensional time lapse image sequences is demonstrated. This algorithm may enable investigators to comprehensively analyze physiological Ca2+ signals with minimal user input and bias.

Análisis automatizado de Dinámica Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Las señales en secuencias de imágenes

Intracellular Ca2+ signals are commonly studied with fluorescent Ca2+ indicator dyes and microscopy techniques. However, quantitative analysis of Ca2+ ...

Sequence-specific Labeling of Nucleic Acids and Proteins with Methyltransferases and Cofactor Analogues

S-Adenosyl-l-methionine (AdoMet or SAM)-dependent methyltransferases (MTase) catalyze the transfer of the activated methyl group from AdoMet to specific positions in DNA, RNA, proteins and small biomolecules. This natural methylation reaction can be expanded to a wide variety of alkylation reactions using synthetic cofactor analogues. Replacement of the reactive sulfonium center of AdoMet with an aziridine ring leads to cofactors which can be coupled with DNA by various DNA MTases. These aziridine cofactors can be equipped with reporter groups at different positions of the adenine moiety and used for Sequence-specific Methyltransferase-Induced Labeling of DNA (SMILing DNA). As a typical example we give a protocol for biotinylation of pBR322 plasmid DNA at the 5&#8217;-ATCGAT-3&#8217; sequence with the DNA MTase M.BseCI and the aziridine cofactor 6BAz in one step. Extension of the activated methyl group with unsaturated alkyl groups results in another class of AdoMet analogues which are used for methyltransferase-directed Transfer of Activated Groups (mTAG). Since the extended side chains are activated by the sulfonium center and the unsaturated bond, these cofactors are called double-activated AdoMet analogues. These analogues not only function as cofactors for DNA MTases, like the aziridine cofactors, but also for RNA, protein and small molecule MTases. They are typically used for enzymatic modification of MTase substrates with unique functional groups which are labeled with reporter groups in a second chemical step. This is exemplified in a protocol for fluorescence labeling of histone H3 protein. A small propargyl group is transferred from the cofactor analogue SeAdoYn to the protein by the histone H3 lysine 4 (H3K4) MTase Set7/9 followed by click labeling of the alkynylated histone H3 with TAMRA azide. MTase-mediated labeling with cofactor analogues is an enabling technology for many exciting applications including identification and functional study of MTase substrates as well as DNA genotyping and methylation detection.

DNA and proteins are sequence-specifically labeled with affinity or fluorescent reporter groups using DNA or protein methyltransferases and synthetic cofactor analogues. Depending on the cofactor specificity of the enzymes, aziridine or double activated cofactor analogues are employed for one- or two-step labeling.

Etiquetado específico de secuencia de ácidos nucleicos y proteínas con metiltransferasas y el cofactor Análogos

S-Adenosyl-l-methionine (AdoMet or SAM)-dependent methyltransferases (MTase) catalyze the transfer of the activated methyl group from AdoMet to specific ...

Immunofluorescence Analysis of Endogenous and Exogenous Centromere-kinetochore Proteins

"Centromeres" and "kinetochores" refer to the site where chromosomes associate with the spindle during cell division. Direct visualization of centromere-kinetochore proteins during the cell cycle remains a fundamental tool in investigating the mechanism(s) of these proteins. Advanced imaging methods in fluorescence microscopy provide remarkable resolution of centromere-kinetochore components and allow direct observation of specific molecular components of the centromeres and kinetochores. In addition, methods of indirect immunofluorescent (IIF) staining using specific antibodies are crucial to these observations. However, despite numerous reports about IIF protocols, few discussed in detail problems of specific centromere-kinetochore proteins.1-4 Here we report optimized protocols to stain endogenous centromere-kinetochore proteins in human cells by using paraformaldehyde fixation and IIF staining. Furthermore, we report protocols to detect Flag-tagged exogenous CENP-A proteins in human cells subjected to acetone or methanol fixation. These methods are useful in detecting and quantifying endogenous centromere-kinetochore proteins and Flag-tagged CENP-A proteins, including those in human cells.

Here we report protocols to detect endogenous and exogenous centromere-kinetochore proteins in human cells and quantify these protein levels at centromeres-kinetochores by indirect immunofluorescent staining through the use of fixation (paraformaldehyde, acetone, or methanol fixation).

Las proteínas Análisis de inmunofluorescencia de endógenos y exógenos Centrómero-cinetocoro

"Centromeres" and "kinetochores" refer to the site where chromosomes associate with the spindle during cell division. Direct visualization of ...

Assays for the Degradation of Misfolded Proteins in Cells

Protein misfolding and aggregation are associated with various neurodegenerative diseases. Cellular mechanisms that recognize and degrade misfolded proteins may serve as potential therapeutic targets. To distinguish degradation of misfolding-prone proteins from other mechanisms that regulate their levels, one important method is to measure protein half-life in cells. However, this can be challenging because misfolding-prone proteins may exist in different forms, including the native form and misfolded forms of distinct characteristics. Here we describe assays to examine the half-life of misfolded proteins in mammalian cells using a highly aggregation-prone protein, Ataxin-1 with an extended polyglutamine (polyQ) stretch, and a conformationally unstable luciferase mutant as models. Cycloheximide chase is combined with cell fractionation to examine the turnover rate of misfolding-prone proteins in various cellular fractions. We further depict a fluorescence-based assay using an enhanced green fluorescence protein (EGFP)-fusion of the luciferase mutant, which can be adapted for high throughput screening on a microplate-reader.

This report describes protocols for measuring degradation rates of misfolded proteins by either western blot or fluorescence-based assays. The methods can be applied to analysis of other misfolded proteins and for high throughput screening.

Los ensayos para la degradación de proteínas en células de mal plegadas

Protein misfolding and aggregation are associated with various neurodegenerative diseases. Cellular mechanisms that recognize and degrade misfolded ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex signaling mechanisms underlying filopodial initiation, elongation and subsequent stabilization or retraction, it is crucial to determine the spatio-temporal protein activity in these dynamic structures. To analyze protein function in filopodia, we recently developed a semi-automated tracking algorithm that adapts to filopodial shape-changes, thus allowing parallel analysis of protrusion dynamics and relative protein concentration along the whole filopodial length. Here, we present a detailed step-by-step protocol for optimized cell handling, image acquisition and software analysis. We further provide instructions for the use of optional features during image analysis and data representation, as well as troubleshooting guidelines for all critical steps along the way. Finally, we also include a comparison of the described image analysis software with other programs available for filopodia quantification. Together, the presented protocol provides a framework for accurate analysis of protein dynamics in filopodial protrusions using image analysis software.

We present a software solution for semi-automated tracking of relative protein concentration along the length of dynamic cellular protrusions.

Una interfaz gráfica de usuario para el seguimiento asistido por software de la concentración de proteínas en protones dinámicos celulares

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...

Immunofluorescent Labeling of Plant Virus and Insect Vector Proteins in Hemipteran Guts

Most plant viruses in nature are transmitted from one plant to another by hemipteran insects. A high population density of the vector insects that are highly efficient at virus transmission plays a key role in virus epidemics in fields. Studying virus-insect vector interactions can advance our understanding of virus transmission and epidemics with the aim of designing novel strategies to control plant viruses and their vector insects. Immunofluorescence labeling has been widely used to analyze interactions between pathogens and hosts and is used here in the white-backed planthopper (WBPH, Sogatella furcifera), which efficiently transmits the southern rice black streaked dwarf virus (SRBSDV, genus Fijivirus, family Reoviridae), to locate the virions and insect proteins in the midgut epithelial cells. Using laser scanning confocal microscopy, we studied the morphological characteristics of midgut epithelial cells, cellular localization of insect proteins, and the colocalization of virions and an insect protein. This protocol can be used to study virus activities in insects, functions of insect proteins, and interactions between virus and vector insect.

This protocol for immunofluorescent labeling of both plant virus proteins and vector insect proteins in excised insect guts can be used to study interactions among virus and vector insects, insect protein functions and molecular mechanisms underlying virus transmission.

Etiquetado inmunofluorescente de virus vegetales y proteínas vectoras de insectos en intestinos hemípteros

Most plant viruses in nature are transmitted from one plant to another by hemipteran insects. A high population density of the vector insects that are ...