שיטה מעשית זו לשחזור ניתן להשתמש כדי לדמיין את האינטראקציות אנדותל לויקוציט שמובילים לגיוס לויקוציט בתוך עכבר שלם. טכניקה זו מציגה גם כלי רב עוצמה לניטור תהליכים פיזיולוגיים ופתופיזיולוגיים בתוך מפל גיוס לויקוציט ב- vivo. השיטה יכולה להיות מיושמת במודלים דלקתיים וספתיים שונים.
לדוגמה, לאחרונה הדגשנו את הרלוונטיות שלה בחקר השרירים הכרוכים חדירת לויוציט שרירים מוגזמת. ההצעה שלנו למדענים אחרים השוקלים להשתמש בטכניקה זו היא לקבל כמה שיותר ניסיון מעשי ככל השיטה רגישה מאוד לסטיות קלות. הדגימה של ההליך תהיה סיימון קרניג, קלינאי ומדען בכיר מהמעבדה שלי.
לאחר אישור חוסר תגובה לצביטת בוהן בבעל החיים הניסיוני הרדמה, לתקן את העכבר במצב שקע הגב על כרית חימום 37 מעלות צלזיוס ולהשתמש תפר סטרילי 6-0 בלתי ניתן לעצירה כדי לסובב לולאה פשוטה סביב השיניים הקדמיות. מדביקים את קצות התפר המצטרפים אל משטח החימום ולהשתמש פינצטה כדי להרים בעדינות את העור בקו האמצע. לאחר מכן, בצע חתך מעגלי בקוטר של 1 עד 2 ס"מ מעל הצוואר ובית החזה העליון ולהשתמש פינצטה כדי לנתח בזהירות את השריר שמסביב, שומן, ורקמות חיבור.
מניחים תפר מתחת קנה הנשימה. השתמש מספריים כירורגיים קטנים כדי להפוך כ 1.3 מילימטר רוחבי לחתוך לתוך קנה הנשימה ולהציג צינור פוליאתילן לתוך הקצה caudal של קנה הנשימה כדי לאבטח את דרכי הנשימה העליונות. לתקן את הצינור הממוקם עם תפר קשר עגול אחד ולאתר את העורק הראשי לאורך הצד הימני של קנה הנשימה.
לנתח את הרקמה שמסביב מקיר העורק הראשי ולהעביר שתי חתיכות תפר מתחת לעורק. לקשור את התפר הגולגולתי הראשון proximal כדי bifurcation של העורקים הראשיים ולמקם את התפר השני על חמישה עד שמונה מילימטרים דיסטלי מן התפר הראשון ללא קשירה. לאחר מכן, חבר חתיכה של צינורות פוליאתילן באורך 30 ס"מ למחט מזרק מיליליטר אחת מלאה מלוחים ולהשתמש קליפ כלי שבעה מילימטר כדי להדק את העורק הראשי distally לתפר השני.
הפוך חתך רוחבי כ 0.5 מילימטר העורק הראשי ולהציג את צינור פוליאתילן סטרילי לתוך העורק. לאבטח את הצינור עם התפר השני ולהסיר את קליפ כלי. ואז בעדינות לדכא את הבוכנה מזרק לשטוף מלוחים לתוך הכלי.
כדי להכין את שריר cremaster, להעביר את העכבר למסגרת מיקרוסקופ פלסטיק בהתאמה אישית עם שק האשכים מול שלב המיקרוסקופ בזהירות לתפוס את שק האשכים בקצה הדיסטלי ביותר שלה עם פינצטה. משיכת שק האשכים בעדינות, להסיר קטע מעגלי על חמישה מילימטר קוטר של עור האשכים שמירה על הרקמה הפתוחה hydrated היטב עם מלוחים. השתמש בשני פינצטה כדי לנתח את רקמת החיבור הרופפת ולאתר את שני האשכים.
לתפוס אשך אחד בנפרד בעדינות להתחיל לשלוף את רקמת הרבייה הסרת כל רקמות החיבור שמסביב צעד אחר צעד. לאחר האשך כבר החיצוני, להצמיד את הקצה הדיסטלי של הרקמה לטבעת הגומי המקיפה את הבמה לחות את הרקמה עם מלוחים. לאחר מכן, להסיר בזהירות את רקמת החיבור מבלי לפגוע בשריר cremaster הבסיסית.
זה קריטי כדי להסיר את כל רקמת החיבור אשר יגרום תמונות מטושטשות מבלי לפגוע בשריר cremaster הבסיסית. כאשר כל הרקמה הוסרה, לעשות חתך רוחבי מילימטר אחד כדי לפתוח את שריר cremaster לפני ביצוע חתך אורך מן דיסטלי מאוד לקצה הפרוקסימלי של הרקמה. השריר צריך להיפתח בצורה כדורית.
בזהירות להפיץ את השריר על שלב הזכוכית ולהצמיד את השריר לטבעת גומי דואג לא לגעת או לפגוע באזור המרכזי של הרקמה. ואז להצמיד את האשכים הנותרים לצד כדי לתת גישה לאזור העניין לחות את הרקמה עם PSS. לקבלת הדמיה תוך-בלתי נמנעת של כלי הדם בשריר, מניחים את שריר הקרמאסטר הרכוב במיקרוסקופ הזקוף ובחרו את המטרה 40X.
בצע את ההקלטות תחת עירוי-על מתמשך עם PSS 35 עד 37 מעלות צלזיוס באמצעות פיסת צינורות קטנים שהודבקה למטרה זקוף של המיקרוסקופ כדי לאפשר טפטוף מתמשך של PSS לצד המטרה אל השריר והרקמות. זהה את הוונולים שלאחר נימי. למדוד את המיקרו-סירקולציה על ורנולים בקוטר של 20 עד 40 מיקרומטר.
לאחר מכן להקליט תמונות ברזולוציה גבוהה של microcirculation משריר cremaster על פני תקופה של 30 שניות ברציפות התאמת המוקד עקב שינויים קלים התכווצות הרפיה של רקמת השריר. עודף רקמת חיבור יכול להוביל לתמונות מיקרוסקופיות מטושטשות. בתמונה מיקרוסקופית מייצגת זו, ניתן לזהות את הוונוסלים הפוסט-נימיים שאמורים להיות בקוטר של בין 20 ל-40 מיקרומטרים על ידי התכנסות של שני כלי שיט קטנים יותר.
ניתן לדמיין לויציטים חסידים ומתגלגלים תוך כדי הפצת לויציטים רק בהילוך איטי של קטעי וידאו מוקלטים. מספר רב של פרמטרים עשויים להשפיע על גיוס לויקוציטים ב- vivo כולל תפוקת הלב, קוטר כלי השיט, מהירות קו המרכז, קצב נטישת הקיר ומספר לויקוציטים במחזור. שים לב כי המהירות המרכזית מושפעת מתפוקת לב, עמידות היקפית בכלי הדם ונפח תוך-וסאלי.
לדוגמה, נפח גדול של רודמין או חומר ניסיוני אחר שניתן באמצעות קטטר התרדמה מגביר את מהירות הקו המרכזי שלאחר נימי ומעכב לויוציט ללכוד ולגלגל. להיפך, אי ספיקת לב, הרדמה עמוקה או השערה עשויה להקטין את הזרימה שלאחר נימי. כדי לקבוע את המהירות המרכזית, ניתן להשתמש בלוקוציטים פלואורסצנטיים במחזור חופשי או לצבוע את הלוקוציטים עם רייגנטים פלואורסצנטיים כמו רודמין.
שים לב כי זנים מסוג פראי עשויים להראות שונות פיזיולוגית. לדוגמה, עכברי C57BL/6 מדגימים גלגול לויוציט, הידבקות והתגלות משופרים בבירור בהשוואה לבעלי חיים C57BL/10ScSn. שלבי התכנון והתקנון חשובים לשליטה בטכניקה במיוחד במהלך הכנת שריר הקרמאסטר למיקרוסקופיה.
שיטות אחרות להדמיית גיוס לויקוציטים יכולות להתבצע כדי להניב מידע נוסף ולעזור לנתח את התרומה האישית של לויקוציטים ותאי אנדותל למפל הגיוס. טכניקה זו מספקת פלטפורמה להערכה פרה-קלינית של מדיטטורים פרמקולוגיים וחומרים אפנוניים חיסוניים חדשניים.
