מחקר במעבדה של המחברים הוא נתמך על ידי המכון הלאומי לבריאות מענקים R37-HL041026, R01-R01 HL086483 ו-HL056786 (SSS) ועל ידי F32-HL097463 ו-T32 AR048523 (PB) משירות ארצות הברית לבריאות הציבור.

1. Animal Care ושימוש בעקבות סקירה ואישור של טיפוח בעלי חיים מוסדיים ועדת שימוש, עכברים זכרים לפחות 12 שבועות משמשים. העכבר הוא הרדים עם נתרן pentobarbital (60 מ&quot;ג / ק&quot;ג) באמצעות הזרקה (IP) intraperitoneal. במהלך ניתוחים ופרוטוקולים ניסיוני, הרדמה מתוחזק על ידי תוספי מזון (10-20% של הזרקת הראשוני, ip) לפי הצורך (כל 30-60 דקות, שמסומן על ידי תגובת נסיגה הבוהן או קמצוץ הזנב). לאחר השלמת הליך הניסוי העכבר הוא מנת יתר עם pentobarbital (IP) מורדמים על ידי נקע בצוואר הרחם. 2. Micropipettes ו Microiontophoresis <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Micropipettes Microiontophoresis (קוטר קצה פנימי, ~ 1 מיקרומטר) מוכנים מן צינורות זכוכית בורוסיליקט נימי בעזרת פיפטה חולץ אופקי. שלנו יש ~ 5 להתחדד מ&quot;מ עבור נוקשות; נרות יותר גמישים יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Micropipettes הם backfilled עם 1M ACH (Figure1A-C) מומס 18.2 MΩ מים. בשביל למלא את משבצות, צינור microcapillary מחובר לסנן 0.2 מיקרומטר מצמידים את מזרק המכיל את אגוניסט של עניין (איור 1). אלה יכולים להיות מפוברק בקלות (להלן) או נרכשו מיצרנים מסחריים. צינור microcapillary מוכנס לתוך האחורי של הפתרון micropipette ו ACH מועבר לתוך לומן תוך הוצאת צינור microcapillary כמו micropipette ממלא. החזקת micropipette עם קצהו כלפי מטה, בועות אוויר יוסרו על ידי מצליף בעדינות micropipette. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Micropipette מובטחת בפומית רכוב micromanipulator (איור 2). לבעל יש חוט כסף חיבור פתרון אח בתוך micropipette להצמיד חיצוני, אשר בתורו מחובר להדק החיובי של מתכנת microiontophoresis. חוט כסף second מאובטח בקצה הכנת הרקמה מחובר למסוף השלילית כדי להשלים את המעגל כמו קצה micropipette הוא התקדם לתוך הפתרון מלח פיזיולוגיים על ההכנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנוכחי תמך מוחל על מנת למנוע התרחבות (או בתגובה ניאון) כאשר קצה micropipette ממוקמת צמוד לקיר arteriolar. שימור הנוכחית תשתנה בהתאם לגודל של קצה micropipette (קוטר פנימי = 1 מיקרומטר) וריכוז אגוניסט אך ניתנת לשחזור מאוד פרמטרים מוגדרים (אנו משתמשים ~ 200 NA עבור 1M אח, טיפ 1 מיקרומטר). הנוכחי שמירה חדל ביחד עם משלוח של פליטה הנוכחי באמצעות ההדק אלקטרוניים (איור משלים 1) מסונכרן עם תחילת הרכישה של התמונה. </li></ol> 3. המיקרומניפולציה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלטפורמה אישית לשלב מיקרוסקופ XY היה מפוברק מתוך נירוסטה פרומגנטי. ממדים פלטפורמה (1 / 8 &quot;X 12&quot; X 13 &quot;) לאפשר מרחב מספיק כדי micromanipulators עמדה סביב הכנת הניסוי כפי Micromanipulators הרצוי (איור 2 א). מאובטחת לבסיסי מגנטי (תרשים 2B) לאפשר מיצוב כפי שמחייבת הכנה. אלה ממוקם ישירות סביב ההכנות micropipettes מיצוב באתרים בעלי עניין (איור 2C) על פלטפורמה מפוברק. </li></ol> 4. נציג תוצאות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם קצה micropipette ממוקם בסמוך עורקיק, יש תגובה פלואורסצנטי ACH (שמירה הנוכחי מאשר מותאם כדי למנוע דליפה ACH). מתחת לסף גירוי היתה שום השפעה. עם זאת, כמו גירוי בעוצמה מוגברת, פלואורסצנטי תא האנדותל סידן מוגברת על פני מרחקים בהדרגה יותר לאורך עורקיק, כמו גם את עוצמת הקרינה באתר של גירוי (איור 3). </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2900/2900fig1.jpg" alt="איור 1" /> באיור 1. שיטה למלא את משבצות pipettes Microiontophoresis. א) צינור microcapillary (חץ ירוק) הוא מאובטח ב הולם דחיסה (חץ כחול) המצורפים 0.2 מיקרומטר מסנן (חץ סגול), אשר מחוברת אז מזרק מלא 1M אח. B) צינור microcapillary מוזן לתוך פיפטה microiontophoresis עד סוף פתרון לאחור הוא העקורים כדי למלא את לומן של micropipette. C) לאחר פיפטה מלא, החזק את קצה מטה בעדינות קפיצי להתחדד לעיל כדי להסיר בועות (חץ שחור). <img src="/files/ftp_upload/2900/2900fig2.jpg" alt="איור 2" /> איור 2. פלטפורמה אישית עבור מיקום Micromanipulator. ..) פלטפורמה פרומגנטי נירוסטה הושם על בסיס MVX10 אישית מיקרוסקופ המכיל הבמה XY translational B) בסיסים מגנטי חוזר מודבקת בתחתית 3-ציר micromanipulators קומפקטי C) Micromanipulators ממוקם סביב הכנת הניסוי (ראה פרוטוקול קשורים: מזהה יופיטר # 2874) ללמוד לאתרים ספציפיים של עניין.גודל ir צדדיות קומפקטי לאפשר micropipettes מרובים כדי לשמש בעת ובעונה אחת. <img src="/files/ftp_upload/2900/2900fig3.jpg" alt="איור 3" /> איור 3. Fluorescence סידן Arterioles. הקרינה של סידן לתאי אנדותל המצפים את הקיר arteriolar מוגברת בעוצמה גירוי. הראשון 3 פאנלים הראו תמונות של תגובות פלואורסצנטי) 250 NA, B) 500 NA ו-C) 1000 פליטה NA הנוכחי (כל 500 מילישניות משך הדופק). המרחק שעליו פלואורסצנטי תא האנדותל סידן מוגברת מסומן על ידי סוגריים ב AC (~ 130, 270 ו - 400 מיקרומטר, בהתאמה). קו התייחסות על פני עורקיק בחלונית מציין היכן כל התגובות פלואורסצנטי (F / FO) כדי ACH נרשמו באתר של גירוי. ד) הקלטות של זמן לעומת F / FO להגדלת גירויים אח. כמו פליטה הנוכחי גדל, גדל F / FO ב משרעת ומשך. שים לב, 100 גירוי NA היה מתחת לסף ולא היה לו שום השפעה. <img src="/files/ftp_upload/2900/2900sup1.jpg" alt="משלים איור 1" /> משלים באיור 1. תרשים מעגל עבור ההדק אלקטרוניים. במעגל זה interfaced עם יציאה מקבילית ממחשב אישי. כאשר מופעל הוא מספק קבוע TTL הדופק של 5V. השבב 7805 הוא מתח 5V הרגולטור המחובר לספק DC 9-12V צריכת חשמל (סוללה של מתח מתאים זה בסדר). פלט של 7805 מספקת חשמל למתג בילטראליים Quad ו הפלט של המעגל. קלט פני הנגד 1K הוא מהמחשב.

<ol>
	<li>Majno, G., Palade, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+inflammation.+1.+The+effect+of+histamine+and+serotonin+on+vascular+permeability:+an+electron+microscopic+study.">Studies on inflammation. 1. The effect of histamine and serotonin on vascular permeability: an electron microscopic study.</a> J. Biophys. Biochem. Cytol. 11, 571-605 (1961).</li><li>Majno, G., Palade, G. E., Schoefl, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+inflammation.+II.+The+site+of+action+of+histamine+and+serotonin+along+the+vascular+tree:+a+topographic+study.">Studies on inflammation. II. The site of action of histamine and serotonin along the vascular tree: a topographic study.</a> J. Biophys. Biochem. Cytol. 11, 607-626 (1961).</li><li>Grant, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+Observation+of+Skeletal+Muscle+Blood+Vessels+(Rat+Cremaster).">Direct Observation of Skeletal Muscle Blood Vessels (Rat Cremaster).</a> J. Physiol. 172, 123-137 (1964).</li><li>Baez, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+open+cremaster+muscle+preparation+for+the+study+of+blood+vessels+by+in+vivo+microscopy.">An open cremaster muscle preparation for the study of blood vessels by in vivo microscopy.</a> Microvasc. Res. 5, 384-394 (1973).</li><li>Bohlen, H. G., Gore, R. W., Hutchins, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+microvascular+pressures+in+normal+and+spontaneously+hypertensive+rats.">Comparison of microvascular pressures in normal and spontaneously hypertensive rats.</a> Microvasc. Res. 13, 125-130 (1977).</li><li>Klitzman, B., Duling, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microvascular+hematocrit+and+red+cell+flow+in+resting+and+contracting+striated+muscle.">Microvascular hematocrit and red cell flow in resting and contracting striated muscle.</a> Am. J. Physiol. 237, 481-490 (1979).</li><li>Hungerford, J. E., Sessa, W. C., &amp;amp, S. e. g. a. l., S, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vasomotor+control+in+arterioles+of+the+mouse+cremaster+muscle.">Vasomotor control in arterioles of the mouse cremaster muscle.</a> FASEB J. 14, 197-207 (2000).</li><li>Figueroa, X. F., Paul, D. L., Simon, A. M., Goodenough, D. A., Day, K. H., Damon, D. N., Duling, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+role+of+connexin40+in+the+propagation+of+electrically+activated+vasodilation+in+mouse+cremasteric+arterioles+in+vivo.">Central role of connexin40 in the propagation of electrically activated vasodilation in mouse cremasteric arterioles in vivo.</a> Circ. Res. 92, 793-800 (2003).</li><li>Wolfle, S. E., Schmidt, V. J., Hoepfl, B., Gebert, A., Alcolea, S., Gros, D., de Wit, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connexin45+cannot+replace+the+function+of+connexin40+in+conducting+endothelium-dependent+dilations+along+arterioles.">Connexin45 cannot replace the function of connexin40 in conducting endothelium-dependent dilations along arterioles.</a> Circ. Res. 101, 292-1299 (2007).</li><li>Milkau, M., Kohler, R., de Wit, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crucial+importance+of+the+endothelial+K++channel+SK3+and+connexin40+in+arteriolar+dilations+during+skeletal+muscle+contraction.">Crucial importance of the endothelial K+ channel SK3 and connexin40 in arteriolar dilations during skeletal muscle contraction.</a> FASEB J. 24, 3572-3579 (2010).</li><li>Bagher, P., Duan, D., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+impaired+neurovascular+transmission+in+a+murine+model+of+Duchenne+Muscular+Dystrophy.">Evidence for impaired neurovascular transmission in a murine model of Duchenne Muscular Dystrophy.</a> J. Appl. Physiol. 110, 601-610 (2011).</li><li>Tallini, Y. N., Brekke, J. F., Shui, B., Doran, R., Hwang, S. M., Nakai, J., Salama, G., Segal, S. S., Kotlikoff, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Propagated+endothelial+Ca2++waves+and+arteriolar+dilation+in+vivo:+measurements+in+Cx40BAC-GCaMP2+transgenic+mice.">Propagated endothelial Ca2+ waves and arteriolar dilation in vivo: measurements in Cx40BAC-GCaMP2 transgenic mice.</a> Circ. Res. 101, 1300-1309 (2007).</li><li>Grant, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+denervation+on+skeletal+muscle+blood+vessels+(rat+cremaster).">The effects of denervation on skeletal muscle blood vessels (rat cremaster).</a> J. Anat. 100, 305-316 (1966).</li><li>Proctor, K. G., Busija, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationships+among+arteriolar,+regional,+and+whole+organ+blood+flow+in+cremaster+muscle.">Relationships among arteriolar, regional, and whole organ blood flow in cremaster muscle.</a> Am. J. Physiol. 249, H34-H41 (1985).</li><li>Bagher, P., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+blood+flow+in+the+microcirculation:+Role+of+conducted+vasodilation.">Regulation of blood flow in the microcirculation: Role of conducted vasodilation.</a> Acta Physiol. , (2011).</li><li>Hill, M. A., Simpson, B. E., Meininger, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+cremaster+muscle+hemodynamics+due+to+disruption+of+the+deferential+feed+vessels.">Altered cremaster muscle hemodynamics due to disruption of the deferential feed vessels.</a> Microvasc. Res. 39, 349-363 (1990).</li></ol>

נהלים ופרוטוקולים מעורבים כל בעלי החיים אושרו על ידי טיפול בבעלי חיים ועדת שימוש מאוניברסיטת מיזורי והופיעה בקנה אחד עם מדריך National Institutes of Health לטיפול ושימוש בחיות מעבדה. הפקה של מאמר זה מומן על ידי אוניברסיטת סטנפורד Photonics.

פרוטוקול המתואר כאן מדגים שיטות להכנת ויישום micropipettes עבור microiontophoresis. מסירה של אצטילכולין משמש כדי להמחיש איתות סידן התרחבות הבסיסית האנדותל תלויי ב arterioles של העכבר בהרדמה. התוצאות שלנו להמחיש כי המרחק שעליו אח מגבירה תא האנדותל סידן מגביר את הקרינה עם עוצמת פליטה הנוכחית מ micropipette microiontophoresis (איור 3). חוסר להגדיל הקרינה בתנאים מנוחה מציין זליגת זניח של אח של micropipette. חוסר תגובה לגירוי בעוצמה NA 100 (איור 3, אגדה) ממחישה כי עוצמת סף גירוי נדרש סידן תא האנדותל כדי להגדיל. טכניקות אלו ניתן להתאים בקלות סוכני vasoactive אחרים ההכנות רקמות. שיקולים מעשיים: בעבודה עם microiontophoresis ללמוד תגובתיות arteriolar, כמה דברים צריך להיות מוכר. אמנם הוכיחה קשה לקבוע את ריכוז בפועל של אגוניסט נמסר, בתגובה לגירוי עקומות ולייצר בתוך ובין ההכנות. אלה ניתן לבצע על ידי לחיצה משך דופק קבוע (למשל, 500 ms) לבין משתנים פליטה הנוכחי (למשל, 250, 500 ו - 1000 NA; איור 3). לחלופין, פליטה הנוכחי ניתן לקיים קבוע (למשל, 500 NA) והדופק משך מגוונים (למשל, 250, 500 ו 1000 ms). לקבלת התייחסות לפעולות של ריכוז אגוניסט מוגדר, הכנת ניתן superfused עם הפתרון המתאים 5. בגלל הכוח המניע פליטה המומס תנועה מטען חשמלי, הסוכן יועברו לשאת מטען נטו להיות שעזבו micropipette. על מנת להבטיח כי הסוכן של עניין היא נושאת מטען ראשוני, הוא מומס בריכוז גבוה (למשל, 1 M עבור ACH) כדי למזער אלקטרו אוסמוזה. כאשר זה דורש מניפולציה של ה-pH של התמיסה מילוי micropipette, פקדי הרכב נדרשים לוודא תופעות ספציפי. בקרות מתאימות צריך גם להתבצע למעבר הנוכחי בלבד (למשל, באמצעות micropipettes מלא מלוחים איזוטוני). המרחק יעיל דיפוזיה של הסוכן שלה מהאתר של שחרור יש לוודא והוא נקבע על ידי רוב בקלות אמפירית היעלמותו של תגובה פיזיולוגית (למשל, התרחבות או עלייה סידן תאיים על פליטה של ​​ACH) כמו micropipette ממוקמת מוגדרים מרחקים מאתר היעד. בפועל, המרחק דיפוזיה יעילה מושפעת במידה רבה על ידי האופן שבו קצה micropipette ממוקם בתוך הרקמה, למשל, אם קצה לחוץ לתוך הרקמה ואת קצהו הוא occluded, מאשר פליטה נפגעת. רקמת חיבור מופרז הוא בעייתי במיוחד, יש להסיר מפני השטח רקמות במהלך הכנת כירורגית. שימו לב צריך גם לתת אפשרות של depleting קצה סוכן המיועד. זה ממוזער באמצעות פולסים קצרים יחסית (למשל, ≤ 1 ים). עם זרמים ממושך (למשל, מספר שניות), אגוניסט עשוי להיות מגורש מקצה במהירות רבה יותר מאשר הוא יכול להיות מוחלף על ידי דיפוזיה מפתרון מילוי בתפזורת ב micropipette. בגלל נפח זניח מוחלפת עם microiontophoresis, אם הוא מנסה לשנות את הסביבה יוניים המקומית (למשל, כדי לספק K depolarizing גירוי +), זה לא יכול להתבצע ביעילות עם microiontophoresis אבל מושגת בקלות עם פליטה לחץ של נוזלים בצובר לאחר הרצוי הרכב. לגירוי מקומי של עורקיק, טיפים micropipette עם קוטר פנימי של 2-3 מיקרומטר לעבוד היטב עם הלחץ פליטה 4-5 psi (28-35 kPa) ואת הדופק משך (למשל, 1 שנייה) שבשליטת עם שסתום סולנואיד 10. איפה אספקה ​​מתמשכת של סוכן מן micropipette על microvessel נדרש, פליטה הלחץ הוא העדיף להשתמש micropipettes בקוטר המתאים קצה פנימית (למשל, ~ 10 מיקרומטר) 11,12. טור ההידרוסטטי של גובה ידוע עם שסתום שסתום מספק זול, מוגדרים היטב on / off ראש לחץ מתמיד. שיעורי זרימה נקבעים על ידי בקוטר הפנימי של קצה פיפטה והלחץ נהיגה. כמו תמיד, פקדי הרכב חיוניים כדי למנוע פעולות ספציפי של פליטה הלחץ.

<table style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> חומר המשמש </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> בורוסיליקט צינורות זכוכית נימי </td><td> וורנר מכשירים </td><td> GC120F-10 </td><td></td></tr><tr><td> אופקי פיפטה פולר </td><td> סאטר מכשירים </td><td> דגם P-97 </td><td></td></tr><tr><td> אצטילכולין כלוריד </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> A6625 </td><td></td></tr><tr><td> מתאם Luer הרכזת </td><td> Martech </td><td> AC1343 </td><td> כדי לאבטח את צינורות microcapillary </td></tr><tr><td> ניילון 0.2 מיקרומטר טיטאן מסנן </td><td> יום ראשון סרי </td><td> 42204-NN </td><td> שימור נפח נמוך כדי להקטין את איבוד </td></tr><tr><td> 5 מ&quot;ל במזרק </td><td> בקטון דיקינסון-ושות </td><td> 309603 </td><td></td></tr><tr><td> פיפטה מחזיק </td><td> וורנר מכשירים </td><td> E45W-M12VH </td><td></td></tr><tr><td> כסף Wire </td><td> וורנר מכשירים </td><td> AG10W </td><td> 0.25mm בקוטר </td></tr><tr><td> 3 ציר micromanipulator </td><td> Siskiyou עיצוב מכשירים </td><td> DT3-100, MXB, MXC, מג&quot;ב / 8 </td><td> רכיבים עבור מניפולטור כפי שמוצג </td></tr><tr><td> microiontophoresis הנוכחית מתכנת </td><td> העולם מכשירי דיוק </td><td> דגם 260 </td><td></td></tr><tr><td> המכשיר הדק </td><td> מנהג </td><td> מנהג </td><td> מעגל הניתנים Suppl. איור 1 </td></tr><tr><td> חלד פלדה </td><td> מקמאסטר-קאר </td><td> 1 / 8 &quot;X 12&quot; X 12 &quot; </td><td> על פי התכנון </td></tr><tr><td> מוגברת מצלמה דיגיטלית </td><td> סטנפורד Photonics Inc </td><td> XR/Mega-10 </td><td> משולב עם פייפר בקרת תוכנה </td></tr></tbody></table>

microiontophoresis and micromanipulation for intravital fluorescence imaging of the microcirculation

Microiontophoresis כרוך במעבר של זרם דרך טיפ micropipette לספק המומס באתר ייעודי בתוך הכנה ניסיונית. Microiontophoresis יכול לדמות הילוכים הסינפטי 1 על ידי אספקת נוירוטרנסמיטורים נוירופפטידים על נוירונים reproducibly 2. נפח זניח (נוזל) עקירה נמנעת הפרעה מכנית הכנה הניסוי. התאמת בטכניקות אלה כדי microcirculation 3 אפשרה מנגנוני התרחבות ו vasoconstriction להיחקר ברמה המיקרוסקופית in vivo 4,5. יתרון המפתח של משלוח מקומי כזה המאפשר תגובות וזומוטורים להיחקר באתרים מוגדרים בתוך רשת כלי הדם מבלי לעורר שינויים מערכתיים או רפלקסיבי בלחץ הדם זרימת הדם לרקמות, ובכך חושפים מאפיינים מהותיים של microvessels. הגבלה של microiontophoresis היא כי הריכוז המדויק של סוכן נמסר לאתר של עניין קשה לברר 6. עם זאת, השקתו מקצה micropipette הוא יחסי עוצמת ומשך פליטה הנוכחית 2,7, כגון לשחזור כי הגירוי תגובה קשרים ניתן לקבוע בקלות תחת תנאים ניסויים מוגדר (המתואר להלן). גורמים נוספים המשפיעים על משלוח microiontophoretic כוללים ריכוז המומס ואת יינון שלה בתמיסה. הקוטר הפנימי של קצה micropipette יש ~ 1 מיקרומטר או פחות כדי למזער את &quot;דליפה&quot; diffusional, אשר ניתן לסתור עם זרם שמירה. לכן זרם החוצה (חיובי) משמש כדי להוציא קטיון ואת זרם שלילי בשימוש לשמור אותו בתוך micropipette. המצאה של micropipettes הוא הקל עם מושכי אלקטרוניים מתוחכמים 8. Micropipettes המגיעים צינורות זכוכית נימי המכיל נימה כי &quot;פתילות&quot; פתרון אל קצה micropipette כאשר מלא מקצה האחורי (&quot;backfilled&quot;). הדבר נעשה על ידי החדרת צינור microcapillary מחובר מזרק המכיל את הפתרון לעניין פתרון ולהוציא לתוך לומן של micropipette. Micromanipulators לאפשר המיקום הרצוי של micropipettes תוך הכנת הניסוי. Micromanipulators רכוב על בסיס מטלטלין ניתן למקם סביב הכנת בהתאם לטופוגרפיה של רשתות כלי הדם (שפותחה בהמשך). הפרוטוקול הנוכחי מדגים microiontophoresis של אצטילכולין (ACH + Cl -) על עורקיק הכנה השריר עכבר cremaster (ראה פרוטוקול קשורים: מזהה יופיטר # 2874) כדי לייצר האנדותל תלויי התרחבות. משלוח Stimulus מסונכרן עם רכישת תמונה דיגיטלית באמצעות ההדק אלקטרוניים. השימוש Cx40 BAC-GCaMP2 העכברים הטרנסגניים 9 תגובות מאפשר הדמיה של סידן תוך תאי הבסיס התרחבות בתאי האנדותל arteriolar ב microcirculation האורחים.

Watch this Scientific Journal Video about Microiontophoresis and Micromanipulation for Intravital Fluorescence Imaging of the Microcirculation at JoVE.com

Microiontophoresis and Micromanipulation for Intravital Fluorescence Imaging of the Microcirculation

Microiontophoresis כרוכה בתנועה של יונים מן micropipette בתגובה הבדל בפוטנציאל חשמלי בין בתוך ומחוץ micropipette. מולקולות פעילות ביולוגית מועברות ובכך ביחס זרם חשמלי. אנו מדגימים microiontophoresis אצטילכולין בשיתוף עם המיקרומניפולציה ללמוד האנדותל תלויי התרחבות ב microcirculation.

Microiontophoresis ו המיקרומניפולציה עבור דימות פלואורסצנטי Intravital של microcirculation

Microiontophoresis entails passage of current through a micropipette tip to deliver a solute at a designated site within an experimental  preparation. ...

microiontophoresis-micromanipulation-for-intravital-fluorescence

Research

JoVE Journal

Biology

14.4K Views.  University of Missouri. Microiontophoresis כרוכה בתנועה של יונים מן micropipette בתגובה הבדל בפוטנציאל חשמלי בין בתוך ומחוץ micropipette. מולקולות פעילות ביולוגית מועברות ובכך ביחס זרם חשמלי. אנו מדגימים microiontophoresis אצטילכולין בשיתוף עם המיקרומניפולציה ללמוד האנדותל תלויי התרחבות ב microcirculation.

Video: Microiontophoresis and Micromanipulation for Intravital Fluorescence Imaging of the Microcirculation

Born Normalization for Fluorescence Optical Projection Tomography for Whole Heart Imaging

Optical projection tomography is a three-dimensional imaging technique that has been recently introduced as an imaging tool primarily in developmental biology and gene expression studies. The technique renders biological sample optically transparent by first dehydrating them and then placing in a mixture of benzyl alcohol and benzyl benzoate in a 2:1 ratio (BABB or Murray s Clear solution). The technique renders biological samples optically transparent by first dehydrating them in graded ethanol solutions then placing them in a mixture of benzyl alcohol and benzyl benzoate in a 2:1 ratio (BABB or Murray s Clear solution) to clear. After the clearing process the scattering contribution in the sample can be greatly reduced and made almost negligible while the absorption contribution cannot be eliminated completely. When trying to reconstruct the fluorescence distribution within the sample under investigation, this contribution affects the reconstructions and leads, inevitably, to image artifacts and quantification errors.. While absorption could be reduced further with a permanence of weeks or months in the clearing media, this will lead to progressive loss of fluorescence and to an unrealistically long sample processing time. This is true when reconstructing both exogenous contrast agents (molecular contrast agents) as well as endogenous contrast (e.g. reconstructions of genetically expressed fluorescent proteins).

We suggest a Born normalized approach for Optical Projection Tomography (BnOPT) that accounts for the absorption properties of imaged samples to obtain accurate and quantitative fluorescence tomographic reconstructions. We use the proposed algorithm to reconstruct the fluorescence molecular probe distribution within small animal organs.

נורמליזציה נולד עבור טומוגרפיה Fluorescence הקרנה אופטית עבור הדמיה בלב שלם

Optical projection tomography is a three-dimensional imaging technique that has been recently introduced as an imaging tool primarily in developmental ...

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

Visualizing developing organ formation as well as progession and treatment of disease often heavily relies on the ability to optically interrogate molecular and functional changes in intact living organisms. Most existing optical imaging methods are inadequate for imaging at dimensions that lie between the penetration limits of modern optical microscopy (0.5-1mm) and the diffusion-imposed limits of optical macroscopy (&gt;1cm) [1]. Thus, many important model organisms, e.g. insects, animal embryos or small animal extremities, remain inaccessible for in-vivo optical imaging. 
Although there is increasing interest towards the development of nanometer-resolution optical imaging methods, there have not been many successful efforts in improving the imaging penetration depth. The ability to perform in-vivo imaging beyond microscopy limits is in fact met with the difficulties associated with photon scattering present in tissues. Recent efforts to image entire embryos for example [2,3] require special chemical treatment of the specimen, to clear them from scattering, a procedure that makes them suitable only for post-mortem imaging. These methods however evidence the need for imaging larger specimens than the ones usually allowed by two-photon or confocal microscopy, especially in developmental biology and in drug discovery.
We have developed a new optical imaging technique named Mesoscopic Fluorescence Tomography [4], which appropriate for non-invasive in-vivo imaging at dimensions of 1mm-5mm. The method exchanges resolution for penetration depth, but offers unprecedented tomographic imaging performance and it has been developed to add time as a new dimension in developmental biology observations (and possibly other areas of biological research) by imparting the ability to image the evolution of fluorescence-tagged responses over time. As such it can accelerate studies of morphological or functional dependencies on gene mutations or external stimuli, and can importantly, capture the complete picture of development or tissue function by allowing longitudinal time-lapse visualization of the same, developing organism.
The technique utilizes a modified laboratory microscope and multi-projection illumination to collect data at 360-degree projections. It applies the Fermi simplification to Fokker-Plank solution of the photon transport equation, combined with geometrical optics principles in order to build a realistic inversion scheme suitable for mesoscopic range. This allows in-vivo whole-body visualization of non-transparent three-dimensional structures in samples up to several millimeters in size.
We have demonstrated the in-vivo performance of the technique by imaging three-dimensional structures of developing Drosophila tissues in-vivo and by following the morphogenesis of the wings in the opaque Drosophila pupae in real time over six consecutive hours.

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

Mesoscopic fluorescence tomography operates beyond the penetration limits of tissue-sectioning fluorescence microscopy. The technique is based on multi-projection illumination and a photon transport description. We demonstrate in-vivo whole-body 3D visualization of the morphogenesis of GFP-expressing wing imaginal discs in Drosophila melanogaster.

Mesoscopic Fluorescence טומוגרפיה עבור In-vivo הדמיה של פיתוח תסיסנית</em

Visualizing  developing organ formation as well as progession and treatment of disease often  heavily relies on the ability to optically interrogate ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and cellular content. Hallmark events of mitosis, such as chromosome movement, can be readily tracked on an individual cell basis using time-lapse fluorescence microscopy of mammalian cell lines expressing specific GFP-tagged proteins. In combination with RNAi-based depletion, this can be a powerful method for pinpointing the stage(s) of mitosis where defects occur after levels of a particular protein have been lowered. In this protocol, we present a basic method for assessing the effect of depleting a potential mitotic regulatory protein on the timing of mitosis. Cells are transfected with siRNA, placed in a stage-top incubation chamber, and imaged using an automated fluorescence microscope. We describe how to use software to set up a time-lapse experiment, how to process the image sequences to make either still-image montages or movies, and how to quantify and analyze the timing of mitotic stages using a cell-line expressing mCherry-tagged histone H2B. Finally, we discuss important considerations for designing a time-lapse experiment. This strategy is complementary to other approaches and offers the advantages of 1) sensitivity to changes in kinetics that might not be observed when looking at cells as a population and 2) analysis of mitosis without the need to synchronize the cell cycle using drug treatments. The visual information from such imaging experiments not only allows the sub-stages of mitosis to be assessed, but can also provide unexpected insight that would not be apparent from cell cycle analysis by FACS.

Here we describe a basic protocol to image and quantify the mitotic timing of live mammalian tissue culture cells after siRNA transfection.

זמן לשגות הדמיה של מיטוזה לאחר transfection siRNA

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

The Mouse Cremaster Muscle Preparation for Intravital Imaging of the Microcirculation

Throughout the body, the maintenance of homeostasis requires the constant supply of oxygen and nutrients concomitant with removal of metabolic by-products. This balance is achieved by the movement of blood through the microcirculation, which encompasses the smallest branches of the vascular supply throughout all tissues and organs. Arterioles branch from arteries to form networks that control the distribution and magnitude of oxygenated blood flowing into the multitude of capillaries intimately associated with parenchymal cells. Capillaries provide a large surface area for diffusional exchange between tissue cells and the blood supply. Venules collect capillary effluent and converge as they return deoxygenated blood towards the heart. To observe these processes in real time requires an experimental approach for visualizing and manipulating the living microcirculation.
The cremaster muscle of rats was first used as a model for studying inflammation using histology and electron microscopy post mortem1,2. 
The first in vivo report of the exposed intact rat cremaster muscle investigated microvascular responses to vasoactive drugs using reflected light3. However 
curvature of the muscle and lack of focused illumination limited the usefulness of this preparation. The major breakthrough entailed opening the muscle, 
detaching it from the testicle and spreading it radially as a flat sheet for transillumination under a compound microscope4. While shown to be a valuable 
preparation to study the physiology of the microcirculation in rats5 and hamsters6, the cremaster muscle in mice7 has proven particularly useful in dissecting 
cellular pathways involved in regulating microvascular function8-11 and real-time imaging of intercellular signaling12. 
The cremaster muscle is derived from the internal oblique and transverse abdominus muscles as the testes descend through the inguinal canal13. 
It serves to support (Greek: cremaster = suspender) and maintain temperature of the testes. As described here, the cremaster muscle is prepared as a thin flat sheet 
for outstanding optical resolution. With the mouse maintained at a stable body temperature and plane of anesthesia, surgical preparation involves freeing the muscle 
from surrounding tissue and the testes, spreading it onto transparent pedestal of silastic rubber and securing the edges with insect pins while irrigating it 
continuously with physiological salt solution. The present protocol utilizes transgenic mice expressing GCaMP2 in arteriolar endothelial cells. GCaMP2 is a 
genetically encoded fluorescent calcium indicator molecule12. Widefield imaging and an intensified charge-coupled device camera enable in vivo study of 
calcium signaling in the arteriolar endothelium.

A tissue preparation is described for visualization and experimental manipulation of the living microcirculation. In anesthetized male mice, the thin, highly vascularized cremaster muscle is prepared for intravital microscopy to study microvascular networks including arterioles, capillaries and venules. This preparation is readily adapted for rats and hamsters.

Cremaster עכבר הכנה שריר עבור הדמיה של Intravital microcirculation

Throughout the body, the maintenance of homeostasis requires the constant supply of oxygen and nutrients concomitant with removal of metabolic ...

Intravital Microscopy of the Microcirculation in the Mouse Cremaster Muscle for the Analysis of Peripheral Stem Cell Migration

In the era of intravascular cell application protocols in the context of regenerative cell therapy, the underlying mechanisms of stem cell migration to nonmarrow tissue have not been completely clarified. We describe here the technique of intravital microscopy applied to the mouse cremaster microcirculation for analysis of peripheral bone marrow stem cell migration in vivo. Intravital microscopy of the M. cremaster has been previously introduced in the field of inflammatory research for direct observation of leucocyte interaction with the vascular endothelium. Since sufficient peripheral stem and progenitor cell migration includes similar initial steps of rolling along and firm adhesion at the endothelial lining it is conceivable to apply the M. cremaster model for the observation and quantification of the interaction of intravasculary administered stem cells with the endothelium. As various chemical components can be selectively applied to the target tissue by simple superfusion techniques, it is possible to establish essential microenvironmental preconditions, for initial stem cell recruitment to take place in a living organism outside the bone marrow.

Intravital microscopy of the mouse M. cremaster microcirculation offers a unique and well-standardized in vivo model for the analysis of peripheral bone marrow stem cell migration.

מיקרוסקופית Intravital של זרימת הדם בשריר העכבר Cremaster לניתוח של נדידת תאי גזע היקפי

In the era of intravascular cell application protocols in the context of regenerative cell therapy, the underlying mechanisms of stem cell migration to ...

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, we use the salivary glands of live mice since they provide several advantages. First, they can be easily exposed to enable access to the optics, and stabilized to facilitate the reduction of the motion artifacts due to heartbeat and respiration. This significantly facilitates imaging and tracking small subcellular structures. Second, most of the cell populations of the salivary glands are accessible from the surface of the organ. This permits the use of confocal microscopy that has a higher spatial resolution than other techniques that have been used for in vivo imaging, such as two-photon microscopy. Finally, salivary glands can be easily manipulated pharmacologically and genetically, thus providing a robust system to investigate biological processes at a molecular level.
In this study we focus on a protocol designed to follow the kinetics of the exocytosis of secretory granules in acinar cells and the dynamics of the apical plasma membrane where the secretory granules fuse upon stimulation of the beta-adrenergic receptors. Specifically, we used a transgenic mouse that co-expresses cytosolic GFP and a membrane-targeted peptide fused with the fluorescent protein tandem-Tomato. However, the procedures that we used to stabilize and image the salivary glands can be extended to other mouse models and coupled to other approaches to label in vivo cellular components, enabling the visualization of various subcellular structures, such as endosomes, lysosomes, mitochondria, and the actin cytoskeleton.

Intravital microscopy is a powerful tool that enables imaging various biological processes in live animals. In this article, we present a detailed method for imaging the dynamics of subcellular structures, such as the secretory granules, in the salivary glands of live mice.

מיקרוסקופית Intravital למבני ההדמיה subcellular בעכברים חיים לבטא חלבוני פלורסנט

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

Rapid Analysis and Exploration of Fluorescence Microscopy Images

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized image analysis tools are available, most traditional image-analysis-based workflows have steep learning curves (for fine tuning of analysis parameters) and result in long turnaround times between imaging and analysis. In particular, cell segmentation, the process of identifying individual cells in an image, is a major bottleneck in this regard.
Here we present an alternate, cell-segmentation-free workflow based on PhenoRipper, an open-source software platform designed for the rapid analysis and exploration of microscopy images. The pipeline presented here is optimized for immunofluorescence microscopy images of cell cultures and requires minimal user intervention. Within half an hour, PhenoRipper can analyze data from a typical 96-well experiment and generate image profiles. Users can then visually explore their data, perform quality control on their experiment, ensure response to perturbations and check reproducibility of replicates. This facilitates a rapid feedback cycle between analysis and experiment, which is crucial during assay optimization. This protocol is useful not just as a first pass analysis for quality control, but also may be used as an end-to-end solution, especially for screening. The workflow described here scales to large data sets such as those generated by high-throughput screens, and has been shown to group experimental conditions by phenotype accurately over a wide range of biological systems. The PhenoBrowser interface provides an intuitive framework to explore the phenotypic space and relate image properties to biological annotations. Taken together, the protocol described here will lower the barriers to adopting quantitative analysis of image based screens.

Here we describe a workflow for rapidly analyzing and exploring collections of fluorescence microscopy images using PhenoRipper, a recently developed image-analysis platform.

ראפיד ניתוח וחקירה של תמונות מיקרוסקופ פלואורסצנטי

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized ...

Fluorescence Imaging with One-nanometer Accuracy (FIONA)

Fluorescence imaging with one-nanometer accuracy (FIONA) is a simple but useful technique for localizing single fluorophores with nanometer precision in the x-y plane. Here a summary of the FIONA technique is reported and examples of research that have been performed using FIONA are briefly described. First, how to set up the required equipment for FIONA experiments, i.e., a total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM), with details on aligning the optics, is described. Then how to carry out a simple FIONA experiment on localizing immobilized Cy3-DNA single molecules using appropriate protocols, followed by the use of FIONA to measure the 36 nm step size of a single truncated myosin Va motor labeled with a quantum dot, is illustrated. Lastly, recent effort to extend the application of FIONA to thick samples is reported. It is shown that, using a water immersion objective and quantum dots soaked deep in sol-gels and rabbit eye corneas (&#62;200 &#181;m), localization precision of 2-3 nm can be achieved.

Fluorescence Imaging with One-nanometer Accuracy FIONA

Single fluorophores can be localized with nanometer precision using FIONA. Here a summary of the FIONA technique is reported, and how to carry out FIONA experiments is described.

דימות פלואורסצנטי עם דיוק אחת ננומטר (FIONA)

Fluorescence imaging with one-nanometer accuracy (FIONA) is a simple but useful technique for localizing single fluorophores with nanometer precision in ...

Micromanipulation Techniques Allowing Analysis of Morphogenetic Dynamics and Turnover of Cytoskeletal Regulators

Examining the spatiotemporal dynamics of proteins can reveal their functional importance in various contexts. In this article, it is discussed how fluorescent recovery after photobleaching (FRAP) and photoactivation techniques can be used to study the spatiotemporal dynamics of proteins in subcellular locations. We also show how these techniques enable straightforward determination of various parameters linked to actin cytoskeletal regulation and cell motility. Moreover, the microinjection of cells is additionally described as an alternative treatment (potentially preceding or complementing the aforementioned photomanipulation techniques) to trigger instantaneous effects of translocated proteins on cell morphology and function. Micromanipulation such as protein injection or local application of plasma membrane-permeable drugs or cytoskeletal inhibitors can serve as powerful tool to record immediate consequences of a given treatment on cell behavior at the single cell and subcellular level. This is exemplified here by immediate induction of lamellipodial cell edge protrusion by the injection of recombinant Rac1 protein, as established a quarter-century ago. In addition, we provide a protocol for determining the turnover of enhanced green fluorescent protein (EGFP)-VASP, an actin filament polymerase prominently accumulating at lamellipodial tips of B16-F1 cells, employing FRAP and including associated data analysis and curve fitting. We also present guidelines for estimating the rates of lamellipodial actin network polymerization, as exemplified by cells expressing EGFP-tagged &#946;-actin. Finally, instructions are given for how to investigate the rates of actin monomer mobility within the cell cytoplasm, followed by actin incorporation at sites of rapid filament assembly, such as the tips of protruding lamellipodia, using photoactivation approaches. None of these protocols is&#160;restricted to components or regulators of the actin cytoskeleton, but can easily be extended to explore in analogous fashion the spatiotemporal dynamics and function of proteins in various different subcellular structures or functional contexts.

We describe how micro- and photomanipulation techniques such as FRAP and photoactivation enable the determination of motility parameters and the spatiotemporal dynamics of proteins within migrating cells. Experimental readouts include subcellular dynamics and turnover of motility regulators or of the underlying actin cytoskeleton.

בטכניקות המיקרומניפולציה המאפשר ניתוח של דינמיקה Morphogenetic מחזור של הרגולטורים Cytoskeletal

Examining the spatiotemporal dynamics of proteins can reveal their functional importance in various contexts. In this article, it is discussed how ...

Isolation and Fluorescence Imaging for Single-particle Reconstruction of Chlamydomonas Centrioles

Centrioles are large macromolecular assemblies important for the proper execution of fundamental cell biological processes such as cell division, cell motility, or cell signaling. The green algae Chlamydomonas reinhardtii has proven to be an insightful model in the study of centriole architecture, function, and protein composition. Despite great advances toward understanding centriolar architecture, one of the current challenges is to determine the precise localization of centriolar components within structural regions of the centriole in order to better understand their role in centriole biogenesis. A major limitation lies in the resolution of fluorescence microscopy, which complicates the interpretation of protein localization in this organelle with dimensions close to the diffraction limit. To tackle this question, we are providing a method to purify and image a large number of C. reinhardtii centrioles with different orientations using super-resolution microscopy. This technique allows further processing of data through fluorescent single-particle averaging (Fluo-SPA) owing to the large number of centrioles acquired. Fluo-SPA generates averages of stained C. reinhardtii centrioles in different orientations, thus facilitating the localization of distinct proteins in centriolar sub-regions. Importantly, this method can be applied to image centrioles from other species or other large macromolecular assemblies.

Isolation and Fluorescence Imaging for Single-particle Reconstruction of Chlamydomonas Centrioles

We have developed a strategy to purify and image a large number of centrioles in different orientations amenable for super-resolution microscopy and single-particle averaging.

בידוד והדמיה פלורסצנטיות עבור שחזור יחיד-חלקיקים של Chlamydomonas Centrioles

Centrioles are large macromolecular assemblies important for the proper execution of fundamental cell biological processes such as cell division, cell ...