כל הפרוטוקול לאחר בידוד התא לוקח כ 2 שעות. 1. Microsurgical הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע בידוד בתאי גזע ממח עצם מתורם וסימון ניאון של subpopulation המבודד על פי פרוטוקולים סטנדרטיים 9,12 אפשר תאים לנוח בזמן המבצע בבעלי החיים מתבצע. לניאון תיוג אנו ממליצים CFDA (succinimidyl אסתר diacetate Carboxyfluorescein). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרדימי במשקל גרם 20-25 עם קטמין (75 מ&quot;ג / קילוגרם) ו xylazine (2.5 מ&quot;ג / קילוגרם) עכבר זכר. לאורך כל ההליכים כירורגיים ופרוטוקולים ניסיוניים, הרדמה צריכה להיות מתוחזק על ידי תוספים (10% מהזרקה ראשונית, ip) לפי צורך (בדרך כלל כל 30-60 דק &#39;). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגלח בעדינות את ההיבט הקדמי של כיס האשכים תקין, כמו גם את הירך ומפשעה הימנית. לאסוף את כל לאבד את השיער עם מקלון צמר גפן טבולה. הנח את צד הגחון העכבר על שלב צפייה פרספקס ולתקן את התשלוםלא באמצעות וילון אלסטי. הבמה מחוייט, בהיקף של צלחת בסיס וצלחת שנייה בקצה הזנב של צלחת הבסיס לגובה של שני רגליים וצק האשכים. מניחים את הבמה על כרית חימום כדי לשמור על טמפרטורת גוף על 37 ° C. לאחר קיבוע על הבמה, המקום חי תחת מיקרוסקופ פעולה ולבצע את שלבי הפעולה הבאים באמצעות 10 - להגדלת 16 פי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך את החתך הראשוני באמצעות מספריים עור בשוק הימין, רק הקדמי של כלי הירך מהברך ועד למפשעה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זהה את עורק הירך ובצע אותה proximally, וגייס את העורק מרקמות רכות. לזהות ולחתוך סניף גדול לאשך השמאלי באמצעות thermocautery. לאחר מכן למקם את תפר שהות באופן שטחי באשך השמאלי. מתיחה עדינה תאפשר גיוס הפרוקסימלי נוסף של עורק הירך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר השלמת הגיוס הפרוקסימלי, לזהות ולחתוך mediall סניף פועל גדולy בירך על ידי thermocautery. לאחר מכן לקשור את עורק הירך בחלקו האחורי של ירך ימין. מתיחה עדינה על המייתר תסייע הכנה נוספת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפנות את תשומת לב החברה לעורק הירך הפרוקסימלי שוב ולמקם את תפר סביב העורק כproximally ככל האפשר. הכן את קשר אבל לא לקשור את זה עדיין. החל מתיחה עדינה לתפר וליצור מסתלסלים בעורקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הקמת מסתלסלת, לחתוך את העורק באמצעות microscissor בזהירות. קח טיפול מיוחד שלא לפגוע בעורק הירך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס microcatheter מוכן (קוטר פנימי 0.28 מ&quot;מ) דרך החתך. קטטר יש deaired (כלוריד 0.9% נתרן, NaCl) ומחובר לכניסה לפני מזרק 1 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר כניסה מוצלחת של קטטר, לשחרר בזהירות מסתלסלת על מנת להקל על המעבר של קטטר. זרימת דם בעורקים צריכה להיות גלויה באופן מיידי בתוך קטטר. בעדינות לקדם את הקטטר כמה מילימטרשל מעבר למסתלסל הקודם. לאחר מכן, לקשור את המייתר מוכן לקיבעון של הקטטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות לשטוף את הצנתר (0.9% NaCl) ולשאוב כדי לאשר את המיקום נכון. השתמש בנייר דבק כדי להבטיח עוד יותר את הצנתר לשלב הפעולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר קיבוע נאות, לשים את הקטטר בצד לשלבי ההכנה הבאה של שריר Cremaster. החל שטיפה ושאיפה של קטטר כל דקות 5-10 קבועות על מנת למנוע היווצרות קריש דם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפנות את תשומת לב החברה לצק האשכים תקין ועושה חתך על ידי חיתוך העור וfascia מעל היבט הגחון של שק האשכים תקין. יש להיזהר שלא לגעת ברקמה הבסיסית עם כל מכשירים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להאריך את החתך עד לקפל מפשעתי וcaudally לקצה הדיסטלי של שק האשכים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רקמה נפרדת זהירות בסיסית רכה וחיבור מעל שק Cremaster, מבלי לגעת בו. זהה את הקצה הדיסטלי של Cremaster, ולמקם את תפר שהות כאן כדי SLightly להאריך את השרירים. לכרות עם החברה רקמות רכות שנותרו מתחת לשק השריר על ידי משייכתו בעדינות את שריר caudally ו anteriorly. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הפרדה מוחלטת מרקמות חיבור, פתח את שק Cremaster בנקודה אחת על קצה הגולגולת באמצעות מספריים. להאריך את החתך מפתיחה למטה זה לקצה הדיסטלי של השריר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאטום את כלי השיט הקטן המחבר את האשך וCremaster באמצעות thermocautery, לאחר מכן לחתוך את הקשרים שנותרו בין השרירים והאשך באמצעות מספריים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להניח בצד האשך, מתוך השדה במיקרוסקופ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Cremaster נפתח כעת מניח שטוח על הבמה. הנח ארבעה 6-0 תפרי שהות Prolene בקצוות של הרקמה ולתקן אותן עם וילון אלסטי כדי להפיץ את רקמת שריר Cremaster. מעתה והלאה ברציפות ללחלח את הרקמות שבנאגר מלוח פוספט (PBS) באמצעות מזרק 1 מיליליטר (איור 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר לחברת ההכנה למנוחה ל15 דקות. לאחר מכן להזריק0.05-0.1 מיליליטר של 1% Rhodamine-Dextran דרך עורק הירך השמאלי להגברת הניגודיות של נימי הדם. אם כל כמוקינים או סוכנים דלקתיים מתוכננים ליישום, אתה צריך עכשיו למריחה ללחלח את השריר עם מגיב בהתאמה באמצעות מזרק 1 מיליליטר. במקרה של ניסוי בקרה, ימשיך הרטבה עם PBS. </li></ol> 2. מיקרוסקופית Intravital <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור על העכבר קבוע בשלב הפעולה ולהעביר תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי הותאם לעלית תאורה ומחובר לCCD (מכשיר תשלום מצמידים) מצלמת וידאו. קח טיפול מיוחד שלא לנקוע את הקטטר עורק הירך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע ניסויים באמצעות מטרת טבילה במים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר ההתאמה האובייקטיבית להדמיה מספקת של זרימת דם Cremaster ולפני הזרקת תאים, stochastically להגדיר שש venules postcapillary לניתוח מאוחר יותר של דבקות תאי גזע איתנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנהל בתאי גזע שכותרתו ניאון,מומס ב200 μl PBS, ב0.4 x 10 6 תאים לכל הזרקה, עם סך של חמש זריקות רצופות ניצול צנתר עורק הירך ומזרק 1 מיליליטר. לנער בזהירות את מדגם התא לפני הזריקה הראשונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי גזע שיא מתגלגלים מייד לאחר הזרקת תאים, ובכך מגדירים את &quot;גלגול&quot; כהפחתה של יותר מ -50% מתא מהירות לאורך אנדותל הציפוי הפנימי בשילוב עם טיפוסי סלולארי &quot;מקל ולשחרר את&quot; תנועות. לבצע ספירה של תאי גזע מתגלגלים וכל תאי הגזע עוברים מרחק venular מוגדר מראש במהלך 1 דקות של ההתבוננות הבאה כל זריקה. כמות מתגלגל בתאי הגזע באה לידי ביטוי כאחוז מכל התאים שעוברים. אל תסמכו תאים מציגים תופעות קשירה קצרות אקראיות כמו תאים מתגלגלים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות הזרקת התא האחרונה לקבוע את מספר תאי גזע חסיד בחוזקה על ידי ספירה ולהביע את הסכום ביחס למשטח אנדותל המחושב של הדואר שש venules המוגדרת מראש (π x אורך x קוטר) כתאים חסיד / 2 מ&quot;מ. הידבקות משרד נחשבת כאשר אין תנועת תא היא לגילוי ל30 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר השלמת מיקרוסקופיה intravital להסיר בזהירות את שריר Cremaster ולאחסן אותו בהתכתבות לצורך הניתוח מאוחר יותר (אימונוהיסטוכימיה או ביולוגיה מולקולרית). להקריב את בעלי החיים על ידי נקע בצוואר הרחם. הניתוח של הקלטות מיקרוסקופיה intravital לכימות של מתגלגל תאי גזע והידבקות אנדותל משרד, כמו גם פרמטרים המודינמיים כלי הדם, כגון מהירות דם אדום תא (מ&quot;מ / השני), אונייה שאורכה (מיקרומטר), קוטר כלי (מיקרומטר), שער מניית קיר (שניות -1); יש לבצעו במצב לא מקוון על ידי חוקר העיוור כדי טיפול רקמות ניסיוני בהתאמה ניצול תוכנת עיבוד תמונה. </li></ol>

<ol>
	<li>Madlambayan, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=marrow+stem+and+progenitor+cell+contribution+to+neovasculogenesis+is+dependent+on+model+system+with+SDF-1+as+a+permissive+trigger.">marrow stem and progenitor cell contribution to neovasculogenesis is dependent on model system with SDF-1 as a permissive trigger.</a> Blood. 114, 4310-4319 (2009).</li><li>Lapidot, T., Dar, A., Kollet, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+do+stem+cells+find+their+way+home?.">How do stem cells find their way home?.</a> Blood. 106, 1901-1910 (2005).</li><li>Lehr, H. A., Vollmar, B., Vajkoczy, P., Menger, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+fluorescence+microscopy+for+the+study+of+leukocyte+interaction+with+platelets+and+endothelial+cells.">Intravital fluorescence microscopy for the study of leukocyte interaction with platelets and endothelial cells.</a> Methods Enzymol. 300, 462-481 (1999).</li><li>Gavins, F. N., Chatterjee, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy+for+the+study+of+mouse+microcirculation+in+anti-inflammatory+drug+research:+focus+on+the+mesentery+and+cremaster+preparations.">Intravital microscopy for the study of mouse microcirculation in anti-inflammatory drug research: focus on the mesentery and cremaster preparations.</a> J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 49, 1-14 (2004).</li><li>Leister, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+peritoneal+cavity+chamber+for+intravital+microscopy+of+the+liver+under+conditions+of+pneumoperitoneum.">A peritoneal cavity chamber for intravital microscopy of the liver under conditions of pneumoperitoneum.</a> Surg. Endosc. 17, 939-942 (2003).</li><li>Sriramarao, P., Anderson, W., Wolitzky, B. A., Broide, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+bone+marrow-derived+mast+cells+roll+on+P-selectin+under+conditions+of+flow+in+vivo.">Mouse bone marrow-derived mast cells roll on P-selectin under conditions of flow in vivo.</a> Lab Invest. 74, 634-643 (1996).</li><li>Baez, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+open+cremaster+muscle+preparation+for+the+study+of+blood+vessels+by+in+vivo+microscopy.">An open cremaster muscle preparation for the study of blood vessels by in vivo microscopy.</a> Microvasc. Res. 5, 384-394 (1973).</li><li>Bagher, P., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mouse+cremaster+muscle+preparation+for+intravital+imaging+of+the+microcirculation.">The mouse cremaster muscle preparation for intravital imaging of the microcirculation.</a> J. Vis. Exp. , e2874 (2011).</li><li>Kaminski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+NOS+is+required+for+SDF-1alpha/CXCR4-mediated+peripheral+endothelial+adhesion+of+c-kit++bone+marrow+stem+cells.">Endothelial NOS is required for SDF-1alpha/CXCR4-mediated peripheral endothelial adhesion of c-kit+ bone marrow stem cells.</a> Lab Invest. 88, 58-69 (2008).</li><li>Furlani, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HMGB-1+induces+c-kit++cell+microvascular+rolling+and+adhesion+via+both+toll-like+receptor-2+and+toll-like+receptor-4+of+endothelial+cells.">HMGB-1 induces c-kit+ cell microvascular rolling and adhesion via both toll-like receptor-2 and toll-like receptor-4 of endothelial cells.</a> J. Cell Mol. Med. 16, 1094-1105 (2012).</li><li>Furlani, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+the+intravascular+administration+of+mesenchymal+stem+cells+safe?+Mesenchymal+stem+cells+and+intravital+microscopy.">Is the intravascular administration of mesenchymal stem cells safe? Mesenchymal stem cells and intravital microscopy.</a> Microvasc. Res. 77, 370-376 (2009).</li><li>Donndorf, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysing+migratory+properties+of+human+CD+133(+)+stem+cells+in+vivo+after+intraoperative+sternal+bone+marrow+isolation.">Analysing migratory properties of human CD 133(+) stem cells in vivo after intraoperative sternal bone marrow isolation.</a> Cell Transplant. , (2012).</li></ol>

כל הניסויים בבעלי החיים, שנערכו לכתב היד הזה אושרו על ידי ועדת טיפול בבעלי החיים ושימוש המקומית. החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

<html> מיקרוסקופ פלואורסצנטי intravital מאפשר הדמיה ישירה וניתוח כמותי של אינטראקציות תא האנדותל גזע. מודל שריר Cremaster הוא שימושי במיוחד, שכן חשיפת microsurgical והדמית intravital טכניקות כבר מבוססת היטב במהלך המחקר על אינטראקציות יקוציט-האנדותל ורכיבים כימיים שונים יכולים להיות מיושמ...

מטרתו של המאמר הנוכחי היא לתאר את הטכניקה של מיקרוסקופיה intravital (IVM) להחיל על זרימת דם Cremaster עכבר להתבוננות וניתוח ישירים של נדידת תאי גזע של מח עצם היקפי. התחדשות רקמות ואיברים המבוסס הקונספט הנוכחי של תאי גזע כרוך הביות של תאי גזע שמקורם במח עצם לרקמות נפצעו 1. צעד חיוני לנדידת תאי גזע מוצלחת כולל גזע אינטראקציה עם תא האנדותל המקומי בתוך האיבר הפצוע ואחרי הגירת transendothelial וסופו של דבר האיבר engraftment 2. ניתוח Intravital של תאי גזע אלה - אינטראקציות תא האנדותל מהווה פרמטר אידיאלי לכימות של תגובת משובי תאי גזע מבוססת בהגדרות pathophysiological שונות in vivo. יתר על כן, זה נראה מתקבל על הדעת, כי, בעתיד, ניתוח intravital של יכולת הנדידה של תאי גזע הספציפי populations בתוך סביבות microcirculatory סטנדרטיות, עשוי להיות מיושם לפני קידום אוכלוסיות אלה לבדיקה קלינית נוספת. מיקרוסקופיה Intravital פותחה בתחילה עבור התצפית וכימות של אינטראקציה תא יקוציט-אנדותל in vivo בתחום המחקר דלקתי 3. הקלטות מוצלחות הראשונות של מחקרי מיקרוסקופיה intravital דווחו על ידי Cohnheim כבר במאה ה -19, לומדות לשון וmesenteries צפרדעים תחת מיקרוסקופ אור 4. מאז השימוש הראשון שלה IVM עבר פיתוח טכני אדיר והיום רכיבים חיוניים מסוימים יוצרים תנאים מוקדמים על מנת לבצע IVM כמותיים: הכנות (i) רקמה המאפשרות גישה אופטית, (ii) בדיקות מולקולריות שיכול להיות מזוהה על ידי מיקרוסקופ, (iii ) מיקרוסקופ המחובר למערכת גילוי וכן (iv) ניתוח מערכות מחשב מבוסס שיכול לחלץ פרמטרים של עניין מנתוני התמונהלהגדיר 4. מגוון רחב של הכנות רקמות כבר הציג ללימודי IVM כולל mesenteries והכבד של העכבר והחולדה 5, תאי skinfold הגב של עכבר ו6 אוגר, אוזן הארנב וכיס הלחי אוגר עד כמה שם. עם זאת, בחלק הבא אנו נתמקד בשריר Cremaster העכבר, המייצג את הרקמה אידיאלית לתצפיות intravital, כהכנה להדמיה הן אפשריות על ידי הליך כירורגי סטנדרטי היטב, ובאופן כללי אין בעיות של חפצי תנועה להתרחש. הכנת השרירים Cremaster הפתוחה בוצעה בפעם הראשונה ב1970s ידי אאז ועמיתיו 7. תאר במקור עבור חולדות, זה כבר אימץ בהצלחה גם לעכבר 8. לאחר המחקרים קודמים התמקדו בעיקר באינטראקציות יקוציט עם קיר הכלי, הקבוצה שלנו הציגה לאחרונה את הכנת השרירים Cremaster העכבר כvaluaכלי ble להדמיה ישירה וניתוח כמותי של אינטראקציות תא האנדותל גזע בתוך microenvironment מוגדר 9. אוכלוסיות תאי גזע שונות נחקרו ניצול מודל זה, כולל c-kit עכברי + בתאי גזע במח עצם ותאי גזע mesenchymal, כמו גם תקליטורי אדם תאי גזע במח עצם 133 + 10-12. בעקבות בידוד תא ממח עצם מתורם וניאון תיוג להדמיה, תאי הגזע מיושמים באופן סלקטיבי לזרימת דם Cremaster ניצול הזרקת עורקים דרך עורק הירך, ובכך להימנע מכל מלכודת תא בתוך איברים מרוחקים. יתר על כן, מודל שריר Cremaster שימושי במיוחד מאז כמוקינים שונים שעלולים להיות מתווכים נדידת תאי גזע מקומית בתוך ההגדרות המתאימות, ניתן למריחה על עור לרקמות המטרה על ידי טכניקת superfusion פשוטה.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carboxy-fluorescein diacetate succinimidylester (CFDA)</td>
			<td>Invitrogen, Carlsbad, CA, USA</td>
			<td>C1157</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine 6 G (1%)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Munich, Germany</td>
			<td>83697</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamin (Ketanest)</td>
			<td>Pfizer, Berlin, Germany</td>
			<td>not available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylacin (Rompun)</td>
			<td>Bayer, Leverkusen, Germany</td>
			<td>not available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate - buffered saline (PBS)</td>
			<td>PAN Biotech, Aidenbach, Germany</td>
			<td>P04-36500</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

intravital microscopy of the microcirculation in the mouse cremaster muscle for the analysis of peripheral stem cell migration

בעידן של פרוטוקולי יישום תא intravascular בהקשר של טיפול בתאי משובי, המנגנונים של נדידת תאי גזע לרקמות nonmarrow לא הובהרו לחלוטין. אנו מתארים כאן את הטכניקה של מיקרוסקופיה intravital להחיל את זרימת דם Cremaster עכבר לניתוח של נדידת תאי גזע היקפית מח עצם בגוף חי. מיקרוסקופיה Intravital של Cremaster מ &#39;כבר הציגה בעבר בתחום של מחקר דלקתי לתצפית ישירה של האינטראקציה יקוציט עם האנדותל של כלי הדם. מאז גזע היקפי מספיק ונדידת תאי אב כוללים שלבים ראשוניים דומים של מתגלגל לאורך והידבקות משרד בהאנדותל המצפה את זה מתקבל על הדעת להחיל את מודל Cremaster מ &#39;לתצפית וכימות של האינטראקציה של תאי גזע מנוהלים intravasculary עם האנדותל. כרכיבים כימיים שונים יכולים להיות מיושמים באופן סלקטיבי כדי לא היעדנושא על ידי טכניקות superfusion פשוט, זה אפשרי להקים תנאים מוקדמים microenvironmental חיוניים, לגיוס תאי גזע ראשוני להתקיים באורגניזם חי מחוץ למח העצם.

באופן כללי, אינטראקציה של תאי גזע הוזרקה ישירות או אב עם האנדותל של כלי הדם בתוך זרימת דם השרירים Cremaster הוא אירוע נדיר ומתרחש באופן בלעדי בvenules postcapillary (קוטר: 30-80 מיקרומטר). בשל מתגלגל תיוג הקרינה ותאי גזע חסיד בחוזקה ניתן לכמת באופן ברור בהפרדה ממחזור leucocytes אנדוגני בvenul...

Watch this Scientific Journal Video about Intravital Microscopy of the Microcirculation in the Mouse Cremaster Muscle for the Analysis of Peripheral Stem Cell Migration at JoVE.com

Intravital Microscopy of the Microcirculation in the Mouse Cremaster Muscle for the Analysis of Peripheral Stem Cell Migration

מיקרוסקופיה Intravital של זרימת דם Cremaster העכבר מ &#39;מציעה ייחודית וסטנדרטיזציה גם במודל vivo לניתוח נדידת תאי גזע של מח עצם היקפי.

מיקרוסקופית Intravital של זרימת הדם בשריר העכבר Cremaster לניתוח של נדידת תאי גזע היקפי

In the era of intravascular cell application protocols in the context of regenerative cell therapy, the underlying mechanisms of stem cell migration to ...

intravital-microscopy-microcirculation-mouse-cremaster-muscle-for

Research

JoVE Journal

Biology

15.1K Views.  University Rostock.  מיקרוסקופיה Intravital של זרימת דם Cremaster העכבר מ 'מציעה ייחודית וסטנדרטיזציה גם במודל vivo לניתוח נדידת תאי גזע של מח עצם היקפי. 

Video: Intravital Microscopy of the Microcirculation in the Mouse Cremaster Muscle for the Analysis of Peripheral Stem Cell Migration

The Mouse Cremaster Muscle Preparation for Intravital Imaging of the Microcirculation

Throughout the body, the maintenance of homeostasis requires the constant supply of oxygen and nutrients concomitant with removal of metabolic by-products. This balance is achieved by the movement of blood through the microcirculation, which encompasses the smallest branches of the vascular supply throughout all tissues and organs. Arterioles branch from arteries to form networks that control the distribution and magnitude of oxygenated blood flowing into the multitude of capillaries intimately associated with parenchymal cells. Capillaries provide a large surface area for diffusional exchange between tissue cells and the blood supply. Venules collect capillary effluent and converge as they return deoxygenated blood towards the heart. To observe these processes in real time requires an experimental approach for visualizing and manipulating the living microcirculation.
The cremaster muscle of rats was first used as a model for studying inflammation using histology and electron microscopy post mortem1,2. 
The first in vivo report of the exposed intact rat cremaster muscle investigated microvascular responses to vasoactive drugs using reflected light3. However 
curvature of the muscle and lack of focused illumination limited the usefulness of this preparation. The major breakthrough entailed opening the muscle, 
detaching it from the testicle and spreading it radially as a flat sheet for transillumination under a compound microscope4. While shown to be a valuable 
preparation to study the physiology of the microcirculation in rats5 and hamsters6, the cremaster muscle in mice7 has proven particularly useful in dissecting 
cellular pathways involved in regulating microvascular function8-11 and real-time imaging of intercellular signaling12. 
The cremaster muscle is derived from the internal oblique and transverse abdominus muscles as the testes descend through the inguinal canal13. 
It serves to support (Greek: cremaster = suspender) and maintain temperature of the testes. As described here, the cremaster muscle is prepared as a thin flat sheet 
for outstanding optical resolution. With the mouse maintained at a stable body temperature and plane of anesthesia, surgical preparation involves freeing the muscle 
from surrounding tissue and the testes, spreading it onto transparent pedestal of silastic rubber and securing the edges with insect pins while irrigating it 
continuously with physiological salt solution. The present protocol utilizes transgenic mice expressing GCaMP2 in arteriolar endothelial cells. GCaMP2 is a 
genetically encoded fluorescent calcium indicator molecule12. Widefield imaging and an intensified charge-coupled device camera enable in vivo study of 
calcium signaling in the arteriolar endothelium.

A tissue preparation is described for visualization and experimental manipulation of the living microcirculation. In anesthetized male mice, the thin, highly vascularized cremaster muscle is prepared for intravital microscopy to study microvascular networks including arterioles, capillaries and venules. This preparation is readily adapted for rats and hamsters.

Cremaster עכבר הכנה שריר עבור הדמיה של Intravital microcirculation

Throughout the body, the maintenance of homeostasis requires the constant supply of oxygen and nutrients concomitant with removal of metabolic ...

Microiontophoresis and Micromanipulation for Intravital Fluorescence Imaging of the Microcirculation

Microiontophoresis entails passage of current through a micropipette tip to deliver a solute at a designated site within an experimental preparation. Microiontophoresis can simulate synaptic transmission1 by delivering neurotransmitters and neuropeptides onto neurons reproducibly2. Negligible volume (fluid) displacement avoids mechanical disturbance to the experimental preparation. Adapting these techniques to the microcirculation3 has enabled mechanisms of vasodilation and vasoconstriction to be studied at the microscopic level in vivo4,5. A key advantage of such localized delivery is enabling vasomotor responses to be studied at defined sites within a microvascular network without evoking systemic or reflexive changes in blood pressure and tissue blood flow, thereby revealing intrinsic properties of microvessels.
A limitation of microiontophoresis is that the precise concentration of agent delivered to the site of interest is difficult to ascertain6. Nevertheless, its release from the micropipette tip is proportional to the intensity and duration of the ejection current2,7, such that reproducible stimulus-response relationships can be readily determined under defined experimental conditions (described below). Additional factors affecting microiontophoretic delivery include solute concentration and its ionization in solution. The internal diameter of the micropipette tip should be &tilde; 1 &mu;m or less to minimize diffusional 'leak', which can be counteracted with a retaining current. Thus an outward (positive) current is used to eject a cation and a negative current used to retain it within the micropipette.
Fabrication of micropipettes is facilitated with sophisticated electronic pullers8. Micropipettes are pulled from glass capillary tubes containing a filament that 'wicks' solution into the tip of the micropipette when filled from the back end ("backfilled"). This is done by inserting a microcapillary tube connected to a syringe containing the solution of interest and ejecting the solution into the lumen of the micropipette. Micromanipulators enable desired placement of micropipettes within the experimental preparation. Micromanipulators mounted on a movable base can be positioned around the preparation according to the topography of microvascular networks (developed below). 
The present protocol demonstrates microiontophoresis of acetylcholine (ACh+ Cl-) onto an arteriole of the mouse cremaster muscle preparation (See associated protocol: JoVE ID#2874) to produce endothelium-dependent vasodilation. Stimulus delivery is synchronized with digitized image acquisition using an electronic trigger. The use of Cx40BAC-GCaMP2 transgenic mice9 enables visualization of intracellular calcium responses underlying vasodilation in arteriolar endothelial cells in the living microcirculation.

Microiontophoresis entails movement of ions from a micropipette in response to a difference in electrical potential between the inside and outside of the micropipette. Biologically active molecules are thereby delivered in proportion to electrical current. We illustrate acetylcholine microiontophoresis in conjunction with micromanipulation to study endothelium-dependent vasodilation in the microcirculation.

Microiontophoresis ו המיקרומניפולציה עבור דימות פלואורסצנטי Intravital של microcirculation

Microiontophoresis entails passage of current through a micropipette tip to deliver a solute at a designated site within an experimental  preparation. ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also produce a source of patient-matched cells for regenerative therapies. iPSCs may be generated using multiple protocols and derived from multiple cell sources. Once generated, iPSCs are tested using a variety of assays including immunostaining for pluripotency markers, generation of three germ layers in embryoid bodies and teratomas, comparisons of gene expression with embryonic stem cells (ESCs) and production of chimeric mice with or without germline contribution2. Importantly, iPSC lines that pass these tests still vary in their capacity to produce different differentiated cell types2. This has made it difficult to establish which iPSC derivation protocols, donor cell sources or selection methods are most useful for different applications.
The most stringent test of whether a stem cell line has sufficient developmental potential to generate all tissues required for survival of an organism (termed full pluripotency) is tetraploid embryo complementation (TEC)3-5. Technically, TEC involves electrofusion of two-cell embryos to generate tetraploid (4n) one-cell embryos that can be cultured in vitro to the blastocyst stage6. Diploid (2n) pluripotent stem cells (e.g. ESCs or iPSCs) are then injected into the blastocoel cavity of the tetraploid blastocyst and transferred to a recipient female for gestation (see Figure 1). The tetraploid component of the complemented embryo contributes almost exclusively to the extraembryonic tissues (placenta, yolk sac), whereas the diploid cells constitute the embryo proper, resulting in a fetus derived entirely from the injected stem cell line.
Recently, we reported the derivation of iPSC lines that reproducibly generate adult mice via TEC1. These iPSC lines give rise to viable pups with efficiencies of 5-13%, which is comparable to ESCs3,4,7 and higher than that reported for most other iPSC lines8-12. These reports show that direct reprogramming can produce fully pluripotent iPSCs that match ESCs in their developmental potential and efficiency of generating pups in TEC tests. At present, it is not clear what distinguishes between fully pluripotent iPSCs and less potent lines13-15. Nor is it clear which reprogramming methods will produce these lines with the highest efficiency. Here we describe one method that produces fully pluripotent iPSCs and "all- iPSC" mice, which may be helpful for investigators wishing to compare the pluripotency of iPSC lines or establish the equivalence of different reprogramming methods.

Generating induced pluripotent stem cell (iPSC) lines produces lines of differing developmental potential even when they pass standard tests for pluripotency. Here we describe a protocol to produce mice derived entirely from iPSCs, which defines the iPSC lines as possessing full pluripotency1.

דור של עכברים שמקורם בתאי גזע pluripotent מושרים

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Isolation of Blood-vessel-derived Multipotent Precursors from Human Skeletal Muscle

Since the discovery of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs), the native identity and localization&#160;of MSCs have been obscured by their retrospective isolation in culture. Recently, using fluorescence-activated cell sorting (FACS), we and other researchers prospectively identified and purified three subpopulations of multipotent precursor cells associated with the vasculature of human skeletal muscle. These three cell populations: myogenic endothelial cells (MECs), pericytes (PCs), and adventitial cells (ACs), are localized respectively to the three structural layers of blood vessels: intima, media, and adventitia. All of these human blood-vessel-derived stem cell (hBVSC) populations not only express classic MSC markers but also possess mesodermal developmental potentials similar to typical MSCs. Previously, MECs, PCs, and ACs have been isolated through distinct protocols and subsequently characterized in separate studies. The current isolation protocol, through modifications to the isolation process and adjustments in the selective cell surface markers, allows us to simultaneously purify all three hBVSC subpopulations by FACS from a single human muscle biopsy. This new method will not only streamline the isolation of multiple BVSC subpopulations but also facilitate future clinical applications of hBVSCs for distinct therapeutic purposes.

Blood vessels within human skeletal muscle harbor several multi-lineage precursor populations that are ideal for regenerative applications. This isolation method allows simultaneous purification of three multipotent precursor cell populations respectively from three structural layers of blood vessels: myogenic endothelial cells from intima, pericytes from media, and adventitial cells from adventitia.

בידוד של דם המופק מכולים multipotent מבשרים משרירי שלד אדם

Since the discovery of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs), the native identity and localization&#160;of MSCs have been obscured by their retrospective ...

Identification of Key Factors Regulating Self-renewal and Differentiation in EML Hematopoietic Precursor Cells by RNA-sequencing Analysis

Hematopoietic stem cells (HSCs) are used clinically for transplantation treatment to rebuild a patient&#39;s hematopoietic system in many diseases such as leukemia and lymphoma. Elucidating the mechanisms controlling HSCs self-renewal and differentiation is important for application of HSCs for research and clinical uses. However, it is not possible to obtain large quantity of HSCs due to their inability to proliferate in vitro. To overcome this hurdle, we used a mouse bone marrow derived cell line, the EML (Erythroid, Myeloid, and Lymphocytic) cell line, as a model system for this study.
RNA-sequencing (RNA-Seq) has been increasingly used to replace microarray for gene expression studies. We report here a detailed method of using RNA-Seq technology to investigate the potential key factors in regulation of EML cell self-renewal and differentiation. The protocol provided in this paper is divided into three parts. The first part explains how to culture EML cells and separate Lin-CD34+ and Lin-CD34- cells. The second part of the protocol offers detailed procedures for total RNA preparation and the subsequent library construction for high-throughput sequencing. The last part describes the method for RNA-Seq data analysis and explains how to use the data to identify differentially expressed transcription factors between Lin-CD34+ and Lin-CD34- cells. The most significantly differentially expressed transcription factors were identified to be the potential key regulators controlling EML cell self-renewal and differentiation. In the discussion section of this paper, we highlight the key steps for successful performance of this experiment.
In summary, this paper offers a method of using RNA-Seq technology to identify potential regulators of self-renewal and differentiation in EML cells. The key factors identified are subjected to downstream functional analysis in vitro and in vivo.

RNA-sequencing and bioinformatics analyses were used to identify significantly and differentially expressed transcription factors in Lin-CD34+ and Lin-CD34- subpopulations of mouse EMLcells. These transcription factors might play important roles in determining the switch between self-renewing Lin-CD34+ and partially differentiated Lin-CD34- cells.

זיהוי של גורמי מפתח עם הרגולציה עצמית התחדשות והתמיינות בתאי EML המטופואטיות מבשר על ידי ניתוח RNA-רצף

Hematopoietic stem cells (HSCs) are used clinically for transplantation treatment to rebuild a patient&#39;s hematopoietic system in many diseases such as ...

Visualization and Quantification of the Cell-free Layer in Arterioles of the Rat Cremaster Muscle

The cell-free layer is defined as the parietal plasma layer in the microvessel flow, which is devoid of red blood cells. The measurement of the in vivo cell-free layer width and its spatiotemporal variations can provide a comprehensive understanding of hemodynamics in microcirculation. In this study, we used an intravital microscopic system coupled with a high-speed video camera to quantify the cell-free layer widths in arterioles in vivo. The cremaster muscle of Sprague-Dawley rats was surgically exteriorized to visualize the blood flow. A custom-built imaging script was also developed to automate the image processing and analysis of the cell-free layer width. This approach enables the quantification of spatiotemporal variations more consistently than previous manual measurements. The accuracy of the measurement, however, partly depends on the use of a blue filter and the selection of an appropriate thresholding algorithm. Specifically, we evaluated the contrast and quality of images acquired with and without the use of a blue filter. In addition, we compared five different image histogram-based thresholding algorithms (Otsu, minimum, intermode, iterative selection, and fuzzy entropic thresholding) and illustrated the differences in their determination of the cell-free layer width.

This study demonstrates the surgical preparation of the rat cremaster muscle for the visualization of the in vivo cell-free layer. Considerable factors affecting the accuracy of the cell-free layer width measurement are discussed in this study.

ויזואליזציה וכימות של שכבה חסרת התא ב arterioles של השריר עכברוש Cremaster

The cell-free layer is defined as the parietal plasma layer in the microvessel flow, which is devoid of red blood cells. The measurement of the in vivo ...

Analysis of the Gap Junction-dependent Transfer of miRNA with 3D-FRAP Microscopy

Small antisense RNAs, like miRNA and siRNA, play an important role in cellular physiology and pathology and, moreover, can be used as therapeutic agents in the treatment of several diseases. The development of new, innovative strategies for miRNA/siRNA therapy is based on an extensive knowledge of the underlying mechanisms. Recent data suggest that small RNAs are exchanged between cells in a gap junction-dependent manner, thereby inducing gene regulatory effects in the recipient cell. Molecular biological techniques and flow cytometric analysis are commonly used to study the intercellular exchange of miRNA. However, these methods do not provide high temporal resolution, which is necessary when studying the gap junctional flux of molecules. Therefore, to investigate the impact of miRNA/siRNA as intercellular signaling molecules, novel tools are needed that will allow for the analysis of these small RNAs at the cellular level. The present protocol describes the application of three-dimensional fluorescence recovery after photobleaching (3D-FRAP) microscopy to elucidating the gap junction-dependent exchange of miRNA molecules between cardiac cells. Importantly, this straightforward and non-invasive live-cell imaging approach allows for the visualization and quantification of the gap junctional shuttling of fluorescently labeled small RNAs in real time, with high spatio-temporal resolution. The data obtained by 3D-FRAP confirm a novel pathway of intercellular gene regulation, where small RNAs act as signaling molecules within the intercellular network.

Here, we describe the application of three-dimensional fluorescence recovery after photobleaching (3D-FRAP) for the analysis of the gap junction-dependent shuttling of miRNA. In contrast to commonly applied methods, 3D-FRAP allows for the quantification of the intercellular transfer of small RNAs in real time, with high spatio-temporal resolution.

ניתוח של המעבר צומת הפער תלוי מירנה עם מיקרוסקופיה 3D-FRAP

Small antisense RNAs, like miRNA and siRNA, play an important role in cellular physiology and pathology and, moreover, can be used as therapeutic agents ...

Intravital Subcellular Microscopy of the Mammary Gland

The mammary gland constitutes a model par excellence for investigating epithelial functions, including tissue remodeling, cell polarity, and secretory mechanisms. During pregnancy, the gland expands from a primitive ductal tree embedded in a fat pad to a highly branched alveolar network primed for the formation and secretion of colostrum and milk. Post-partum, the gland supplies all the nutrients required for neonatal survival, including membrane-coated lipid droplets (LDs), proteins, carbohydrates, ions, and water. Various milk components, including lactose, casein micelles, and skim-milk proteins, are synthesized within the alveolar cells and secreted from vesicles by exocytosis at the apical surface. LDs are transported from sites of synthesis in the rough endoplasmic reticulum to the cell apex, coated with cellular membranes, and secreted by a unique apocrine mechanism. Other preformed constituents, including antibodies and hormones, are transported from the serosal side of the epithelium into milk by transcytosis. These processes are amenable to intravital microscopy because the mammary gland is a skin gland and, therefore, directly accessible to experimental manipulation. In this paper, a facile procedure is described to investigate the kinetics of LD secretion in situ, in real-time, in live anesthetized mice. Boron-dipyrromethene (BODIPY)665/676&#160;or monodansylpentane are used to label the neutral lipid fraction of transgenic mice, which either express soluble EGFP (enhanced green fluorescent protein) in the cytoplasm, or a membrane-targeted peptide fused to either EGFP or tdTomato. The membrane-tagged fusion proteins serve as markers of cell surfaces, and the lipid dyes resolve LDs &#8805; 0.7 &#181;m. Time-lapse images can be recorded by standard laser scanning confocal microscopy down to a depth of 15-25 &#181;m or by multiphoton microscopy for imaging deeper in the tissue. The mammary gland may be bathed with pharmacological agents or fluorescent dyes throughout the surgery, providing a platform for acute experimental manipulations as required.

<meta charset="utf8"></head><body>מיקרוסקופיה תת-תאית תוך חיונית של בלוטת החלב

The present protocol describes a facile technique for the intravital imaging of the lactating mouse mammary gland by laser scanning confocal and multiphoton microscopy.

מיקרוסקופיה תת-תאית תוך חיונית של בלוטת החלב

The mammary gland constitutes a model par excellence for investigating epithelial functions, including tissue remodeling, cell polarity, and secretory ...

Live Imaging of Microtubule Dynamics in Glioblastoma Cells Invading the Zebrafish Brain

With a dismal median survival time in real populations-between 6 to 15 months-glioblastoma (GBM) is the most devastating malignant brain tumor. Treatment failure is mainly due to the invasiveness of GBM cells, which speaks for the need for a better understanding of GBM motile properties. To investigate the molecular mechanism supporting GBM invasion, new physiological models enabling in-depth characterization of protein dynamics during invasion are required. These observations would pave the way to the discovery of novel targets to block tumor infiltration and improve patient outcomes. This paper reports how an orthotopic xenograft of GBM cells in the zebrafish brain permits subcellular intravital live imaging. Focusing on microtubules (MTs), we describe a procedure for MT labeling in GBM cells, microinjecting GBM cells in the transparent brain of 3 days post fertilization (dpf) zebrafish larvae, intravital imaging of MTs in the disseminating xenografts, altering MT dynamics to assess their role during GBM invasion, and analyzing the acquired data.

We report a technique permitting live imaging of microtubule dynamics in glioblastoma (GBM) cells invading a vertebrate brain tissue. Coupling the orthotopic injection of fluorescently tagged GBM cells into a transparent zebrafish brain with high-resolution intravital imaging allows the measurement of cytoskeleton dynamics during in situ cancer invasion.

הדמיה חיה של דינמיקת מיקרוטובולים בתאי גליובלסטומה הפולשים למוח דג הזברה

With a dismal median survival time in real populations-between 6 to 15 months-glioblastoma (GBM) is the most devastating malignant brain tumor. Treatment ...