1. התא המארח transfection <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Seed 2 x 10 6 CHO-DXB11 תאים T75 בקבוק תא קורנינג תרבות במדיום הגידול 15 מ&quot;ל (MEMa עם נוקלאוטידים ו נוקלאוזידים (Gibco, מספר קטלוג 12,571) בתוספת 10% γ-מוקרן מאופיין בסרום שור העובר (cFBS) (HyClone, מספר קטלוג SH30071.03) ו 10 mL / L של תמיסת גלוקוז 45% (Sigma, מספר קטלוג G8769)) יום אחד לפני transfection. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזמן transfection, להכין מתחמי transfection כדלקמן: <ol class="lalpha" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדולל 8 DNA מיקרוגרם ב 800 μl של מדיום הגידול ללא נסיוב בצינור microcentrifuge סטרילית. מערבבים בעדינות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדולל 40 Lipofectamine μl ™ ​​(Invitrogen 18324012) בשנת 800 μl של מדיום הגידול ללא נסיוב בצינור קלקר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים את ה-DNA מדולל ל ™ Lipofectamine בדילול מלא. מערבבים בעדינות דגירה במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את מדיום הגידול של התאים T75 ולהחליף עם 6.4 מ&quot;ל של מדיום גידול ללא נסיוב. מוסיפים 1.6 מ&quot;ל של קומפלקסים transfection אל הבקבוק. מערבבים בעדינות על ידי נדנדה את הצלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס CO 2 באינקובטור במשך 6 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 8 מ&quot;ל של מדיום הגידול כדי הבקבוק ואת לדגור על 37 מעלות צלזיוס CO 2 באינקובטור במשך הלילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר בינוני על ידי שאיפה ולהוסיף בינוני צמיחה טריים הבקבוק. דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס CO 2 באינקובטור במשך הלילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף את מדיום הגידול עם מבחר בינוני (מדיום MEMa ללא נוקלאוטידים או נוקלאוזידים (Gibco, מספר קטלוג 12,561) בתוספת 10% γ-מוקרן dialyzed בסרום שור העובר (dFBS) (HyClone, מספר קטלוג SH30079.03) ו - 10 mL / L 45 פתרון% גלוקוז (Sigma, מספר קטלוג G8769)). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס CO 2 באינקובטור במשך 2-3 שבועות. </li></ol> 2. שיבוט על ידי cytometry מיון תזרים תא פעיל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לסלק תאים מהבקבוק ו צנטריפוגות בסל&quot;ד 800 במשך 5 דקות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend התאים בינוני מבחר בתוספת 2% שור נוגדנים בסרום אלבומין ו שכותרתו fluorescently IgG נגד אדם בדילול 01:20. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדגור על הקרח במשך 15-30 דקות ולאחר מכן לשטוף פעמיים עם PBS קר. Resuspend תאים 1x PBS בתוך צינור פוליפרופילן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> היכונו סוג aseptic על FACSAria BD ™. הכן 96-היטב בתא תרבות צלחת המכילה 200 בינוני מבחר μl היטב כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בסביבה נקייה מחיידקים, לטעון את הצינור עם תאים ולנתח על BD FACSAria ™, לרשום את התוצאות עבור תאים מוכתמת בלא כתם, בהתאמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את השערים והגדרות כדי למיין תאים בודדים של הפרופיל הרצוי מכתים הקרינה לתוך צלחת-96 טוב (ים). <ol class="lalpha" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים transfected מנותחים הראשון המבוסס על פיזור קדימה לעומת פיזור לוואי. השער של תאים חיים עשויה מבוסס על פיזור קדימה, אשר מודד גודל של התא, ולפזר הצד, אשר מודד את המורכבות של התא או גרעיניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאים שנמצאים בתוך השער הזה נבחנים אז על מכתים PE. שער PE שלילי מוגדר עבור תאים transfected בלא כתם או תאים לארח מוכתם. כמו תאים transfected מוכתם נבדקות על ידי FACS, &quot;High PE&quot; שער מותווה אז להקיף את 5% העליונים של כל התאים חיובית מכתים PE. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה צלחות 37 ° C בחממה במשך שבועיים. </li></ol> 3. תיעוד של היווצרות המושבה ידי CloneSelect ™ Imager המושבה מסמך היווצרות ב 96-היטב הצלחות על CloneSelect Imager ™ ב 0 יום, יום 3, יום 7 ויום 13 FACS לאחר מיון. התיעוד תמונה יבטיח מבחר של שיבוטים שמקורם בתא יחיד. שלב קריטי בתיעוד זה הוא מקבל את מישור המוקד מותאם כראוי למדידת היום 0, שכן יש רק תא אחד טוב כל בנקודה הזאת. חשוב מאוד כי התמונות של אלו תאים בודדים נמצאים להתמקד בניסיון להתאים את להתמקד בהם יכול להיות מטעה במקרה הטוב. המטוס המוקד יכול להשתנות משמעותית בין המותגים של צלחות, ואולי אפילו הרבה הרבה המותג אותו. לפיכך מטוס מראש מוקד צריך להיות בשימוש. ניתן להשיג זאת על ידי התמקדות מבחן מיקרו חרוזים או תאים צפיפות גבוהה שהופקדו על צלחות ממגרש אותו בשימוש. לחלופין, צלחות בוגרת ממגרש אותו עשוי לשמש למטרה זו. לאחר FACS מיון, חשוב גם לתת התאים להתפשר על מינימום של 2 שעות לפני הדמיה, כך שהם יהיו &quot;קבועים&quot; בעמדה על הצלחת. 4. הקרנת הסרט ואת הבחירה של שיבוטים פרודוקטיבי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדגם מסמך עמדה על 96-היטב צלחות קבלת assay. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת aliquots של supernatant 20 μl (לדלל במידת הצורך) תוך 96-assay גם צלחות של חופש נץקאן EVO ® מערכת טיפול נוזלי. רובוט זה גמיש המסוגלפלטפורמה IC הותאם זו תרבות אחרת אוטומטיות לעבוד התא. תוכניות מיוחדות נכתבו הטובה ביותר לנצל ולשפר את יכולות EVO חופש רובוטית לפיתוח קו התא. דוגמה לכך היא הגדרת נץקאן לפרש CloneSelect ™ נתונים Imager הדגימה בארות עם מושבות אחת. תוכניות אחרות נדרשו לבצע משימות נוספות תרבית תאים כגון להפוך את דילולים המתאימה של דגימות שנלקחו, לפרש, קטלוג וצלחות מדגם מסומן באופן ידני אם נדרש, בהיקף של עד שיבוטים ייצור גבוהה, וכו &#39;רבים של תוכניות אלה ניתן בקלות מוחל על 384 צלחות היטב, כמו גם את הפורמט המקורי 96 היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ייצור נוגדנים בדגימות מנותח על ידי כריך לנוגדנים אנושיים גילוי ELISA (פירס, Rockford, IL) על חופש נץקאן EVO ® מערכת טיפול נוזלי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דוגמאות סטנדרטיות (האדם מיאלומה IgG1, קאפה) (Sigma, סנט לואיס, מיזורי) הועמסו על טרום מצופה ביו Anti-Human מעיל צלחות Assay IgG (BD Biosciences, בסן חוזה, קליפורניה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הצלחות הודגרו בטמפרטורת החדר למשך שעתיים ואחריו שלושה שוטף PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עיזים ImmunoPure Anti-Human IgG, (FC-gamma)-HRP (פירס, Rockford, IL) נוספה צלחת בדילול 1:2000 וטופחו במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחות נשטפו שלוש פעמים עם PBS לפני הוספת ABTS המצע (פירס, Rockford, IL) ו הוקראו על הקורא צלחת באמצעות ספיגת ב 405 ננומטר לצורך זיהוי. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר שיבוטים פרודוקטיבי ולהעריך את הפרודוקטיביות בתרבות ההשעיה. במשך תרבות האכילה אצווה, התאים היו מחוסן ב 0.3X106 תאים / מ&quot;ל ​​חלבון חינם יתרונות המדיום JRH מיידי 65,578 (SAFC Biosciences, Lenexa, KS) בתוספת 5 g / L סויה hydrolyzate (משרד הרישוי הבינלאומי, מספר קטלוג SE50MAF-UF, הרבה מספר) ו מודגרות ב 37 ° C עם 7.5% CO 2. תרבות נמשך נוספו עם 2 g / L גלוקוז (Sigma, מספר קטלוג G8769, מספר הרבה 098K2329) כאשר גלוקוז בתוספת ריכוז חומצת החלב בתרבות הגיע למטה 2 g / L, והאכילה 2 מ&quot;מ גלוטמין (Gibco, מספר קטלוג 25030, מספר רב 568177) כאשר רמות הגלוטמין הגיע מתחת 200 מ&quot;ג / ליטר (מטבוליטים נמדד על ידי YSI Bioanalyzer). הפד אצווה תרבויות הופסקה ביום 14 ייצור נוגדנים נמדדה על ידי הפוכה שלב HPLC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפיון גנטי של שיבוטים מועמד על ידי הקרינה הכלאה באתרו (FISH) 5. </li></ol> 5. נציג תוצאות: דוגמה לפתח נוגדנים לייצר שיבוטים עם שיטת תפוקה גבוהה מוצג באיור 1 ואיור 2. בריכת תא transfected היה מוכתם נוגדן שכותרתו fluorescently IgG נגד אדם (איור 1 א), נותחו מיון על BD FACSAria ™ (איור 1B). הקמת המושבה בצלחת 96-גם היה צילמו על CloneSelect Imager ™ (תרשים 1C). תרבות supernatant Cell נדגמה מבארות המכילים מושבת יחיד assayed ידי ELISA על מערכת החירות נץקאן ® EVO טיפול נוזלי (1D איור). שיבוטים פרודוקטיבי נמצאו מתאי כי הפגינו רמה גבוהה יותר נוגדנים השטח לידי ביטוי מכתים עם פלורסנט התווית נגד לנוגדנים אנושיים. כאשר משווים שיבוטים שנוצרו שתי אוכלוסיות של הבריכה התא הראשוני transfected, הבדל עצום בפריון ב-נמאס אצווה תרבות נצפתה (איור 2). במשך שני שיבוטים העליון שנוצר מן האוכלוסייה תא עם הביטוי נוגדנים גבוהה פני השטח (PE גבוהה), את הפרודוקטיביות ספציפי נע בין 50-70 pg / תא / יום. בעוד התפוקה נוגדן היה ~ 20 pg / תא / יום שני שיבוטים העליון שנוצר מן האוכלוסייה תא עם הביטוי נוגדנים נמוך משטח (PE נמוך). יתר על כן, שורות תאים שפותחו על ידי מיון FACS יציבים יותר לגבי ייצור נוגדנים מאשר אלו שהיו משובט באמצעות דילול צביעה ידנית (איור 3A). פריון ספציפיים של שיבוט העליונה, ירדו &quot;Clone 1&quot;, שנוצר על ידי דילול צביעה ידנית מ ~ 30 ל ~ 10 PCD PCD לאחר culturing עבור 80 הכפלות התא. מצד שני, את subclone העליון שנוצר על ידי FACS מיון, &quot;שיבוט 2&quot;, הצליח לשמור על פרודוקטיביות ספציפי סביב PCD 20 לפחות 100 הכפלות התא. על ידי ניאון הכלאה באתרו (FISH), הפגנו Clone 1 הראה כאוכלוסייה מעורבת של הפנוטיפ (85%) לבין פנוטיפ B (15%). לעומת זאת, FACS מיון שיבוט (שיבוט 2) הראתה להיות אוכלוסייה הומוגנית יותר, עם 99.5% של התאים התבררה הפנוטיפ (איור 3B). <img src="/files/ftp_upload/3010/3010fig1.jpg" alt="איור 1" /> באיור 1. ופיתוח של תא קווי ייצור לייצור נוגדנים חד שבטיים מתאי CHO. א) משטח מכתים הבריכה הראשונית תא transfected עם נוגדן שכותרתו fluorescently IgG נגד האדם. ב) מיון של האוכלוסייה תא עם עוצמת הקרינה גבוהה (PE גבוה) ואת עוצמת הקרינה נמוכה (PE נמוך) לתוך צלחת 96-היטב. ג) תיעוד המושבהמיום היווצרות 0 עד 13 יום שלאחר זריעת על CloneSelect Imager ™. ד) על ידי הקרנת שיבוטים ELISA. <img src="/files/ftp_upload/3010/3010fig2.jpg" alt="איור 2" /> איור 2. הקשורים Surface רמת נוגדנים בקורלציה עם פריון הנוגדן של התא. המשובטים עם מכתים פלורסנט גבוהים ונמוכים היו שניהם התפתח שורות תאים ומוערכת בתרבות האכילה אצווה. נפחית titer ופריון ספציפי הושוו בין 2 שיבוטים העליון של כל האוכלוסייה. <img src="/files/ftp_upload/3010/3010fig3.jpg" alt="איור 3" /> איור 3. המשובטים שנוצר FACS מיון התערוכה הומוגניות גנטית גבוהה ויציבות לשבט. א) ייצור נוגדנים יציבות בתרבות אצווה ~ 80 הכפלות התא הזמן לחלוף תרבות. Δ, לשבט נוצר באמצעות דילול מגבילים, שבו התאים היו זורעים ב 2000 תאים / היטב, 1000 תאים / היטב 500 תאים / היטב. <img src="/files/ftp_upload/3010/3010triangle.jpg" alt="שחור משולש" /> , לשבט נוצר באמצעות FACS בתא 1 / היטב. ב) אתר transgene אינטגרציה בכרומוזום התא CHO מזוהה על ידי ניאון הכלאה באתרה.

<ol>
	<li>Hung, F., Deng, L., Ravnikar, P., Condon, R., Li, B., Do, L., Saha, D., Tsao, Y. S., Merchant, A., Liu, Z., Shi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA+stability+and+antibody+production+in+CHO+cells:+improvement+through+gene+optimization.">mRNA stability and antibody production in CHO cells: improvement through gene optimization.</a> Biotechnol. J. 5, 393-401 (2010).</li><li>Brezinsky, S. C., Chiang, G. G., Szilvasi, A., Mohan, S., Shapiro, R. I., MacLean, A., Sisk, W., Thill, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+enriching+populations+of+transfected+CHO+cells+for+cells+of+higher+specific+productivity.">A simple method for enriching populations of transfected CHO cells for cells of higher specific productivity.</a> J. Immunol. Methods. 277, 141-155 (2003).</li><li>Kromenaker, S. J., Srienc, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stability+of+producer+hybridoma+cell+lines+after+cell+sorting:+a+case+study.">Stability of producer hybridoma cell lines after cell sorting: a case study.</a> Biotechnol. Prog. 10, 299-307 (1994).</li><li>Marder, P., Maciak, R. S., Fouts, R. L., Baker, R. S., Starling, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+cloning+of+hybridoma+cells+for+enhanced+immunoglobulin+production+using+flow+cytometric+cell+sorting+and+automated+laser+nephelometry.">Selective cloning of hybridoma cells for enhanced immunoglobulin production using flow cytometric cell sorting and automated laser nephelometry.</a> Cytometry. 11, 498-505 (1990).</li><li>Henegariu, O., Heerema, N., Wright, L. L., Bray-Ward, P., Ward, D. C., Vance, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improvements+in+cytogenetic+slide+preparation:+controlled+chromosome+spreading+chemical+aging+and+gradual+denaturing.">Improvements in cytogenetic slide preparation: controlled chromosome spreading chemical aging and gradual denaturing.</a> Cytomery. 43, 101-109 (2001).</li><li>Meng, Y. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Grenn+fluorescent+protein+(GFP)+as+a+second+selectable+marker+for+selection+of+high+producing+clones+from+transfected+CHO+cells.">Grenn fluorescent protein (GFP) as a second selectable marker for selection of high producing clones from transfected CHO cells.</a> Gene. 242, 201-207 (2000).</li><li>DeMaria, C. T., Cairns, V., Schwarz, C., Zhang, J., Guerin, M., Zuena, E., Estes, S., Karey, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accelerated+clone+selection+for+recombinant+CHO+cells+using+a+FACS-based+high-throughput+screen.">Accelerated clone selection for recombinant CHO cells using a FACS-based high-throughput screen.</a> Biotechnol. Prog. 23, 465-472 (2007).</li><li>Weaver, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gel+microdrop+technology+for+rapid+isolation+of+rare+an+high+producer+cells.">Gel microdrop technology for rapid isolation of rare an high producer cells.</a> Nat. Med. 3, 583-585 (1997).</li></ol>

המחברים של מאמר זה הינם עובדים של Merck &amp; Co, Inc, אשר משתמש בשיטה זו עבור ייצור בקנה מידה גדול של הרפוי חלבון מן שורות תאים של יונקים.

הצגנו קו ייצור אוטומטי לתא פיתוח פלטפורמה המאפשרת בידוד של שיבוטים פרודוקטיבי, וב מתכוון בעוד מבטיח clonality ויציבות לשבט. מעורבות של נוגדנים מכתים משטח ואחריו מיון התא ™ FACSAria היא המפתח להשגת שיבוטים אחד עם פריון נוגדנים גבוהה. התוצאות שלנו ודוחות אחרים 2-4 מראים כי רמת הנוגדנים transiently המוצג על פני התא מתואמים היטב עם תפוקה של התא. לפיכך, נוגדנים והעמסת-מצומדות ניתן להשתמש כדי לזהות את המוצר קרום הקשורים וסיוע הבידוד של יצרנים גבוהה. לחלופין, coexpression של גנים הכתב microdrop טכנולוגיית הג&#39;ל נעשה שימוש כדי להקל את הבחירה גבוהה לייצר שיבוטים על ידי FACS 6-8. בנוסף בידוד שיבוטים ייצור גבוהה באמצעות FACS, טכנולוגיות אחרות התפתחו כדי להשיג את אותה מטרה. אלו כוללים סבכה טכנולוגיה CellSpot Bioscience המשתמשת microspere זיהוי הנוגדן מערכות הקרנה בטכנולוגיית לייזר כדי לזהות שיבוטים פרודוקטיבי ולחסל תאים לא רצויים, Genetix ClonePix FL ו StemCell טכנולוגיות פלטפורמה ClonaCell EasyPick המבצעות ההקרנה תפוקה גבוהה של תא קווי הייצור באמצעות מערכת זיהוי נוגדן פלואורסצנטי . בחרנו ליישם את שיטת השיבוט FACS בהתבסס על רמת נוגדנים הקשורים פני השטח משום שהוא משלב את קלות תפעול, סלקטיביות על הפרודוקטיביות clonality. העסקתו של מערכת נץקאן חופש ® EVO טיפול הנוזל הגדילה משמעותית את התפוקה ההקרנה, אשר מספקים את ההזדמנות כדי לבחור עבור שיבוטים תשואה גבוהה מתוך מאגר התא הרבה יותר גדול. מכשור אחרים עבור assay כגון HTRF, BioForte שמינייה, HPLC, וכו &#39;, הם בכל האמצעים האפשריים של בחירת המפיקים גבוהה ההקרנה החוצה המפיקים נמוך. על ידי מעקב אחר היווצרות שיבוט עם CloneSelect Imager ™, אנו התיעוד שנוצר צורך להוכיח clonality עם היסטוריה תא דיגיטציה קו. Clonality עוד אישור גנטית לאפיין אתר יחיד אינטגרציה transgene בכרומוזום. צעד subcloning, אשר נלקח בדרך כלל כדי להבטיח clonality, ובכך עלול להתבטל. זה יחסוך 4-8 שבועות של זמן פיתוח קו התא. לסיכום, איכות תא קווי שנוצר על ידי פלטפורמת תפוקה גבוהה האוטומטית הראה יעילות גבוהה, יציבות בייצור תאים מתועדים בהיסטוריה קו זה אמור לענות על הביקוש לייצור בקנה מידה גדול דרישות רגולטוריות הנוכחי.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם </td><td> חברה </td></tr><tr><td> BD FACS Aria ™ סדרן Cell </td><td> Bioscience BD </td></tr><tr><td> CloneSelect ™ Imager </td><td> Genetix </td></tr><tr><td> נץקאן חופש EVO ® מערכת טיפול נוזלי </td><td> טקאן קבוצה </td></tr></tbody></table>

a high-throughput automated platform for the development of manufacturing cell lines for protein therapeutics

ענף בצמיחה מהירה ביולוגיות דרישות פיתוח מהיר של מערכות ייצור היעילה ביותר ואמינה כדי לענות על הדרישה הגוברת לאספקת סמים. הדור של שורות תאים הייצור מעורבים באופן מסורתי פעולות ידניות כי הם עתירי עבודה, תפוקה נמוכה ולכן חשוף לטעויות אנוש. אנו מדווחים כאן פלטפורמה תפוקה גבוהה אוטומטיות משולב לפיתוח של תא קווי ייצור לייצור חלבון הרפוי. השילוב של BD FACS Aria ™ סדרן Cell, CloneSelect ™ Imager וטקאן חופש EVO ® מערכת הטיפול נוזל אפשרה קו תפוקה גבוהה ויעילה יותר התא תהליך הפיתוח. במבצע זה, המארח תאים הייצור transfected הראשון עם וקטור ביטוי נושאת את הגן של עניין 1, ואחריו טיפול עם סוכן הבחירה. ביציבות-transfected התאים מוכתמות ואז עם נוגדן פלואורסצנטי שכותרתו IgG נגד אדם, כפופים לאחר מכן ניתוח תזרים cytometry 2-4. תאים פרודוקטיבי נבחרו בהתבסס על עוצמת הקרינה והם מבודדים ידי מיון תא בודד על FACSAria BD ™. הקמת המושבה משלב תא בודד זוהה מיקרוסקופית סדרה של זמן הקפות תמונות דיגיטליות נלקחים על ידי CloneSelect ™ Imager לתיעוד ההיסטוריה קו התא. לאחר שיבוטים אחד יצרו, שיבוטים אלו הוקרנו על הפרודוקטיביות על ידי ELISA המבוצעות על חופש נץקאן EVO ® מערכת טיפול נוזלי. כ 2,000 - 10,000 שיבוטים יכול להיות מוקרן לכל מחזור פעולה עם הגדרת המערכת הנוכחית. גישה זו משולבת נעשה שימוש כדי ליצור גבוהה בייצור הסיני השחלה אוגר (CHO) שורות תאים לייצור נוגדנים חד שבטיים טיפולית (מב), כמו גם חלבונים היתוך שלהם. בעזרת סוגים שונים של בדיקות לגילוי, השיטה יכולה לשמש לפיתוח הרפוי חלבון אחרים או להיות מיושם על מערכות אחרות לארח הייצור. השוואת הליך ידני מסורתי, זו פלטפורמה אוטומטית הפגינו היתרונות של קיבולת גדל באופן משמעותי, clonality הבטיחו, עקיבות בהיסטוריה תא בקנה אחד עם התיעוד אלקטרוניים הזדמנות לצמצם הרבה שגיאות המפעיל.

Watch this Scientific Journal Video about A High-throughput Automated Platform for the Development of Manufacturing Cell Lines for Protein Therapeutics at JoVE.com

A High-throughput Automated Platform for the Development of Manufacturing Cell Lines for Protein Therapeutics

תפוקה גבוהה, פלטפורמה אוטומטית של פיתוח וייצור קו התא לייצור חלבונים ותרופות מתואר. יישום סדרן BD Cell Aria FACS, CloneSelect Imager וטקאן חופש מערכת EVO טיפול הנוזל הוכיחה יכולת עיבוד גדל באופן משמעותי בפיתוח קו התא עם איכות הקו השתפרה התא reproducibility גבוהה.

פלטפורמה תפוקה גבוהה אוטומטיות לפיתוח קווי ייצור עבור Cell Therapeutics חלבון

The fast-growing biopharmaceutical industry demands speedy development of highly efficient and reliable production systems to meet the increasing ...

a-high-throughput-automated-platform-for-development-manufacturing

Research

JoVE Journal

Medicine

22.1K Views.  Merck & Co., Inc. תפוקה גבוהה, פלטפורמה אוטומטית של פיתוח וייצור קו התא לייצור חלבונים ותרופות מתואר. יישום סדרן BD Cell Aria FACS, CloneSelect Imager וטקאן חופש מערכת EVO טיפול הנוזל הוכיחה יכולת עיבוד גדל באופן משמעותי בפיתוח קו התא עם איכות הקו השתפרה התא reproducibility גבוהה.

Video: A High-throughput Automated Platform for the Development of Manufacturing Cell Lines for Protein Therapeutics

Mouse Eye Enucleation for Remote High-throughput Phenotyping

The mouse eye is an important genetic model for the translational study of human ophthalmic disease. Blinding diseases in humans, such as macular degeneration, photoreceptor degeneration, cataract, glaucoma, retinoblastoma, and diabetic retinopathy have been recapitulated in transgenic mice.1-5 Most transgenic and knockout mice have been generated by laboratories to study non-ophthalmic diseases, but genetic conservation between organ systems suggests that many of the same genes may also play a role in ocular development and disease. Hence, these mice represent an important resource for discovering new genotype-phenotype correlations in the eye. Because these mice are scattered across the globe, it is difficult to acquire, maintain, and phenotype them in an efficient, cost-effective manner. Thus, most high-throughput ophthalmic phenotyping screens are restricted to a few locations that require on-site, ophthalmic expertise to examine eyes in live mice. 6-9 An alternative approach developed by our laboratory is a method for remote tissue-acquisition that can be used in large or small-scale surveys of transgenic mouse eyes. Standardized procedures for video-based surgical skill transfer, tissue fixation, and shipping allow any lab to collect whole eyes from mutant animals and send them for molecular and morphological phenotyping. In this video article, we present techniques to enucleate and transfer both unfixed and perfusion fixed mouse eyes for remote phenotyping analyses.

The dissection technique illustrates enucleation of the mouse eye for tissue fixation to perform phenotyping in high-throughput screens.

Enucleation עיני העכבר לphenotyping מרחוק תפוקה גבוהה

The mouse eye is an important genetic model for the translational study of human ophthalmic disease. Blinding diseases in humans, such as macular ...

The Use of Cystometry in Small Rodents: A Study of Bladder Chemosensation

The lower urinary tract (LUT) functions as a dynamic reservoir that is able to store urine and to efficiently expel it at a convenient time. While storing urine, however, the bladder is exposed for prolonged periods to waste products. By acting as a tight barrier, the epithelial lining of the LUT, the urothelium, avoids re-absorption of harmful substances. Moreover, noxious chemicals stimulate the bladder's nociceptive innervation and initiate voiding contractions that expel the bladder's contents. Interestingly, the bladder's sensitivity to noxious chemicals has been used successfully in clinical practice, by intravesically infusing the TRPV1 agonist capsaicin to treat neurogenic bladder overactivity1. This underscores the advantage of viewing the bladder as a chemosensory organ and prompts for further clinical research. However, ethical issues severely limit the possibilities to perform, in human subjects, the invasive measurements that are necessary to unravel the molecular bases of LUT clinical pharmacology. A way to overcome this limitation is the use of several animal models2. Here we describe the implementation of cystometry in mice and rats, a technique that allows measuring the intravesical pressure in conditions of controlled bladder perfusion.
	After laparotomy, a catheter is implanted in the bladder dome and tunneled subcutaneously to the interscapular region. Then the bladder can be filled at a controlled rate, while the urethra is left free for micturition. During the repetitive cycles of filling and voiding, intravesical pressure can be measured via the implanted catheter. As such, the pressure changes can be quantified and analyzed. Moreover, simultaneous measurement of the voided volume allows distinguishing voiding contractions from non-voiding contractions3.
	Importantly, due to the differences in micturition control between rodents and humans, cystometric measurements in these animals have only limited translational value4. Nevertheless, they are quite instrumental in the study of bladder pathophysiology and pharmacology in experimental pre-clinical settings. Recent research using this technique has revealed the key role of novel molecular players in the mechano- and chemo-sensory properties of the bladder.

Cystometry is an efficient technique to measure bladder function of small animals in vivo. The bladder is continuously infused at rates controlled through an intravesical catheter, whereas the urethra is left free for micturition. This allows for repetitive filling and emptying of the bladder, while intravesical pressure and voided volume are recorded.

השימוש בCystometry במכרסמים קטנים: חקר Chemosensation שלפוחית ​​השתן

	The lower urinary tract (LUT) functions as a  dynamic reservoir that is able to store urine and to efficiently expel it at a  convenient time. While ...

Human Neuroendocrine Tumor Cell Lines as a Three-Dimensional Model for the Study of Human Neuroendocrine Tumor Therapy

Neuroendocrine tumors (NETs) are rare tumors, with an incidence of two per 100,&#x200A;000 individuals per year, and they account for 0.5% of all human malignancies.1 Other than surgery for the minority of patients who present with localized disease, there is little or no survival benefit of systemic therapy. Therefore, there is a great need to better understand the biology of NETs, and in particular define new therapeutic targets for patients with nonresectable or metastatic neuroendocrine tumors. 3D cell culture is becoming a popular method for drug screening due to its relevance in modeling the in vivo tumor tissue organization and microenvironment.2,3 The 3D multicellular spheroids could provide valuable information in a more timely and less expensive manner than directly proceeding from 2D cell culture experiments to animal (murine) models.
To facilitate the discovery of new therapeutics for NET patients, we have developed an in vitro 3D multicellular spheroids model using the human NET cell lines. The NET cells are plated in a non-adhesive agarose-coated 24-well plate and incubated under physiological conditions (5% CO2, 37 &deg;C) with a very slow agitation for 16-24 hr after plating. The cells form multicellular spheroids starting on the 3rd or 4th day. The spheroids become more spherical by the 6th day, at which point the drug treatments are initiated. The efficacy of the drug treatments on the NET spheroids is monitored based on the morphology, shape and size of the spheroids with a phase-contrast light microscope. The size of the spheroids is estimated automatically using a custom-developed MATLAB program based on an active contour algorithm. Further, we demonstrate a simple method to process the HistoGel embedding on these 3D spheroids, allowing the use of standard histological and immunohistochemical techniques. 
This is the first report on generating 3D spheroids using NET cell lines to examine the effect of therapeutic drugs. We have also performed histology on these 3D spheroids, and displayed an example of a single drug's effect on growth and proliferation of the NET spheroids. Our results support that the NET spheroids are valuable for further studies of NET biology and drug development.

We present a simple agarose overlay platform to grow 3D multicellular spheroids using neuroendocrine cancer cell lines. This method provides a very convenient way to examine the effect of therapeutic drugs on the neuroendocrine tumor cells. It could also help us establish human neuroendocrine tumor spheroids for cancer therapy.

האדם תאים סרטניים נוירואנדוקריניים קווים כמו מודל תלת ממדי לחקר הטיפול האנושי גידול נוירואנדוקריניים

Neuroendocrine tumors (NETs) are rare tumors, with an incidence of two per 100,&#x200A;000 individuals per year, and they account for 0.5% of all human ...

Intranasal Administration of CNS Therapeutics to Awake Mice

Intranasal administration is a method of delivering therapeutic agents to the central nervous system (CNS). It is non-invasive and allows large molecules that do not cross the blood-brain barrier access to the CNS. Drugs are directly targeted to the CNS with intranasal delivery, reducing systemic exposure and thus unwanted systemic side effects1. Delivery from the nose to the CNS occurs within minutes along both the olfactory and trigeminal neural pathways via an extracellular route and does not require drug to bind to any receptor or axonal transport2. Intranasal delivery is a widely publicized method and is currently being used in human clinical trials3.
Intranasal delivery of drugs in animal models allows for initial evaluation of pharmacokinetic distribution and efficacy. With mice, it is possible to administer drugs to awake (non-anesthetized) animals on a regular basis using a specialized intranasal grip. Awake delivery is beneficial because it allows for long-term chronic dosing without anesthesia, it takes less time than with anesthesia, and can be learned and done by many people so that teams of technicians can dose large numbers of mice in short periods. Efficacy of therapeutics administered intranasally in this way to mice has been demonstrated in a number of studies including insulin in diabetic mouse models 4-6 and deferoxamine in Alzheimer's mouse models. 7,8
The intranasal grip for mice can be learned, but is not easy and requires practice, skill, and a precise grip to effectively deliver drug to the brain and avoid drainage to the lung and stomach. Mice are restrained by hand using a modified scruff in the non-dominant hand with the neck held parallel to the floor, while drug is delivered with a pipettor using the dominant hand. It usually takes 3-4 weeks of acclimating to handling before mice can be held with this grip without a stress response. We have prepared this JoVE video to make this intranasal delivery technique more accessible.

A method to intranasally administer drugs to awake mice for the purpose of targeting the brain is described. This method allows for repeat dosing over long periods using intranasal administration of drug without anesthesia, and nose-to-brain delivery with minimal systemic exposure.

מנהל אפי של Therapeutics CNS לעכברי Awake

Intranasal administration is a method of delivering  therapeutic agents to the central nervous system (CNS). It is  non-invasive and allows large ...

High-throughput Flow Cytometry Cell-based Assay to Detect Antibodies to N-Methyl-D-aspartate Receptor or Dopamine-2 Receptor in Human Serum

Over the recent years, antibodies against surface and conformational proteins involved in neurotransmission have been detected in autoimmune CNS diseases in children and adults. These antibodies have been used to guide diagnosis and treatment. Cell-based assays have improved the detection of antibodies in patient serum. They are based on the surface expression of brain antigens on eukaryotic cells, which are then incubated with diluted patient sera followed by fluorochrome-conjugated secondary antibodies. After washing, secondary antibody binding is then analyzed by flow cytometry. Our group has developed a high-throughput flow cytometry live cell-based assay to reliably detect antibodies against specific neurotransmitter receptors. This flow cytometry method is straight forward, quantitative, efficient, and the use of a high-throughput sampler system allows for large patient cohorts to be easily assayed in a short space of time. Additionally, this cell-based assay can be easily adapted to detect antibodies to many different antigenic targets, both from the central nervous system and periphery. Discovering additional novel antibody biomarkers will enable prompt and accurate diagnosis and improve treatment of immune-mediated disorders.

Over the recent years, live cell-based assays have been used successfully to detect antibodies against surface and conformational antigens. Here, we describe a method using high-throughput flow cytometry enabling the analysis of large cohorts of patients. Detection of novel antibodies will improve diagnosis and treatment of immune-mediated disorders.

Assay המבוסס תא זרימת cytometry תפוקה גבוהה לזיהוי נוגדנים לN-מתיל-D-aspartate קולטן דופמין או-2 קולטן בסרום אדם

Over the recent years, antibodies against surface and conformational proteins involved in neurotransmission have been detected in autoimmune CNS diseases ...

Ex Vivo Treatment Response of Primary Tumors and/or Associated Metastases for Preclinical and Clinical Development of Therapeutics

The molecular analysis of established cancer cell lines has been the mainstay of cancer research for the past several decades. Cell culture provides both direct and rapid analysis of therapeutic sensitivity and resistance. However, recent evidence suggests that therapeutic response is not exclusive to the inherent molecular composition of cancer cells but rather is greatly influenced by the tumor cell microenvironment, a feature that cannot be recapitulated by traditional culturing methods. Even implementation of tumor xenografts, though providing a wealth of information on drug delivery/efficacy, cannot capture the tumor cell/microenvironment crosstalk (i.e., soluble factors) that occurs within human tumors and greatly impacts tumor response. To this extent, we have developed an ex vivo (fresh tissue sectioning) technique which allows for the direct assessment of treatment response for preclinical and clinical therapeutics development. This technique maintains tissue integrity and cellular architecture within the tumor cell/microenvironment context throughout treatment response providing a more precise means to assess drug efficacy.

Ex Vivo Treatment Response of Primary Tumors and/or Associated Metastases for Preclinical and Clinical Development of Therapeutics

Established cancer cell lines and xenografts have been the mainstay of cancer research for the past several decades. However, recent evidence suggests that therapeutic response is greatly influenced by the tumor cell microenvironment. Therefore, we have developed an ex vivo analysis of primary tumor specimens for drug development purposes.

Ex Vivo טיפול תגובה של גידולים ראשוניים ו / או הקשורים גרורות לפרה קלינית וקליני של Therapeutics

The molecular analysis of established cancer cell lines has been the mainstay of cancer research for the past several decades. Cell culture provides both ...

High Throughput Characterization of Adult Stem Cells Engineered for Delivery of Therapeutic Factors for Neuroprotective Strategies

Mesenchymal stem cells (MSCs) derived from bone marrow are a powerful cellular resource and have been used in numerous studies as potential candidates to develop strategies for treating a variety of diseases. The purpose of this study was to develop and characterize MSCs as cellular vehicles engineered for delivery of therapeutic factors as part of a neuroprotective strategy for rescuing the damaged or diseased nervous system. In this study we used mouse MSCs that were genetically modified using lentiviral vectors, which encoded brain-derived neurotrophic factor (BDNF) or glial cell-derived neurotrophic factor (GDNF), together with green fluorescent protein (GFP). 
Before proceeding with in vivo transplant studies it was important to characterize the engineered cells to determine whether or not the genetic modification altered aspects of normal cell behavior. Different culture substrates were examined for their ability to support cell adhesion, proliferation, survival, and cell migration of the four subpopulations of engineered MSCs. High content screening (HCS) was conducted and image analysis performed. 
Substrates examined included: poly-L-lysine, fibronectin, collagen type I, laminin, entactin-collagen IV-laminin (ECL). Ki67 immunolabeling was used to investigate cell proliferation and Propidium Iodide staining was used to investigate cell viability. Time-lapse imaging was conducted using a transmitted light/environmental chamber system on the high content screening system.
Our results demonstrated that the different subpopulations of the genetically modified MSCs displayed similar behaviors that were in general comparable to that of the original, non-modified MSCs. The influence of different culture substrates on cell growth and cell migration was not dramatically different between groups comparing the different MSC subtypes, as well as culture substrates. 
This study provides an experimental strategy to rapidly characterize engineered stem cells and their behaviors before their application in long-term in vivo transplant studies for nervous system rescue and repair.

This study describes an experimental platform to rapidly characterize engineered stem cells and their behaviors before their application in long-term in vivo transplant studies for nervous system rescue and repair.

תפוקה אפיון גבוה של תאי גזע בוגרי תכנון הנדסי למשלוח גורמים טיפוליים לאסטרטגיה הגנה עצבית

Mesenchymal stem cells (MSCs) derived from bone marrow are a powerful cellular resource and have been used in numerous studies as potential candidates to ...

Isolation and Immortalization of Patient-derived Cell Lines from Muscle Biopsy for Disease Modeling

The generation of patient-specific cell lines represents an invaluable tool for diagnostic or translational research, and these cells can be collected from skin or muscle biopsy tissue available during the patient&#8217;s diagnostic workup. In this protocol, we describe a technique for live cell isolation from small amounts of muscle or skin tissue for primary cell culture. Additionally, we provide a technique for the immortalization of myogenic cell lines and fibroblast cell lines from primary cells. Once cell lines are immortalized, substantial expansion of patient-derived cells can be achieved. Immortalized cells are amenable to many downstream applications, including drug screening and in vitro correction of the genetic mutation. Altogether, these protocols provide a reliable tool to generate and preserve patient-derived cells for downstream applications.

This protocol describes techniques for live cell isolation and primary culture of myogenic and fibroblast cell lines from muscle or skin tissue. A technique for the immortalization of these cell lines is also described. Altogether, these protocols provide a reliable tool to generate and preserve patient-derived cells for downstream applications.

בידוד והנצחה של שורות תאים שמקורם בחולה מביופסיה של שריר למחל דוגמנות

The generation of patient-specific cell lines represents an invaluable tool for diagnostic or translational research, and these cells can be collected ...

A High Throughput, Multiplexed and Targeted Proteomic CSF Assay to Quantify Neurodegenerative Biomarkers and Apolipoprotein E Isoforms Status

Many neurodegenerative diseases are&#160;still lacking effective treatments. Reliable biomarkers for identifying and classifying these diseases will be important in the development of future novel therapies. Often&#160;potential new biomarkers do not make it&#160;into the clinic&#160;due to limitations&#160;in their development and&#160;high costs.&#160;However,&#160;targeted proteomics using Multiple Reaction Monitoring Liquid Chromatography-tandem/Mass Spectrometry (MRM LC-MS/MS), specifically using triple quadrupole mass spectrometers, is one method that can be used to rapidly evaluate and validate biomarkers&#160;for clinical translation into diagnostic laboratories. Traditionally, this platform has been used extensively for measurement of small molecules&#160;in clinical laboratories, but it is the potential to analyze proteins, that makes it an attractive alternative to ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)-based methods. We describe here how targeted proteomics can be used to measure multiplexed markers of dementia, including the detection and quantitation of the known risk factor apolipoprotein E isoform 4 (ApoE4).
In order to make the assay suitable for translation, it is designed to be rapid, simple, highly specific and cost effective. To achieve this, every step in the development of the assay must be optimized for the individual proteins and tissues they are analyzed in. This method describes a typical workflow including various tips and tricks to developing a targeted proteomics MRM LC-MS/MS for translation.
The method development is optimized using custom synthesized versions of tryptic quantotypic peptides, which calibrate&#160;the MS for detection and then spiked into CSF to determine correct identification of the endogenous peptide in the chromatographic separation prior to analysis in the MS. To achieve absolute quantitation, stable isotope-labeled internal standard versions of the peptides with short amino acid sequence tags and containing a trypsin cleavage site, are included in the assay.

We describe a high-throughput, multiplex, and targeted proteomic cerebrospinal fluid (CSF) assay developed with potential for clinical translation. The test can quantitate potential markers and risk factors for neurodegeneration, such as the apolipoprotein E variants (E2, E3 and E4), and measure their allelic expression.

תפוקה גבוהה, Multiplexed וממוקדת proteomic CSF Assay לכמת Biomarkers ניווניות ו אפוליפופרוטאין E isoforms סטטוס

Many neurodegenerative diseases are&#160;still lacking effective treatments. Reliable biomarkers for identifying and classifying these diseases will be ...

High-Throughput Analysis of Optical Mapping Data Using ElectroMap

Optical mapping is an established technique for high spatio-temporal resolution study of cardiac electrophysiology in multi-cellular preparations. Here we present, in a step-by-step guide, the use of ElectroMap for analysis, quantification, and mapping of high-resolution voltage and calcium datasets acquired by optical mapping. ElectroMap analysis options cover a wide variety of key electrophysiological parameters, and the graphical user interface allows straightforward modification of pre-processing and parameter definitions, making ElectroMap applicable to a wide range of experimental models. We show how built-in pacing frequency detection and signal segmentation allows high-throughput analysis of entire experimental recordings, acute responses, and single beat-to-beat variability. Additionally, ElectroMap incorporates automated multi-beat averaging to improve signal quality of noisy datasets, and here we demonstrate how this feature can help elucidate electrophysiological changes that might otherwise go undetected when using single beat analysis. Custom modules are included within the software for detailed investigation of conduction, single file analysis, and alternans, as demonstrated here. This software platform can be used to enable and accelerate the processing, analysis, and mapping of complex cardiac electrophysiology.

This protocol describes the setup and use of ElectroMap, a MATLAB-based open-source software platform for analysis of cardiac optical mapping data. ElectroMap provides a versatile high-throughput tool for analysis of optical mapping voltage and calcium datasets across a wide range of cardiac experimental models.

ניתוח תפוקה גבוהה של נתוני מיפוי אופטי באמצעות מידע אלקטרומגנט

Optical mapping is an established technique for high spatio-temporal resolution study of cardiac electrophysiology in multi-cellular preparations. Here we ...