1。宿主細胞のトランスフェクション<ol><li> 15 mlの増殖培地（10％を添加したヌクレオチドおよびヌクレオシドとMEMA（ギブコ、カタログ番号12571）γ線照射を特徴とするウシ胎児血清（cFBS）（HyClone、でT75コーニングの細胞培養フラスコ内のシード2 × 10 6 CHO - DXB11細胞カタログ番号SH30071.03）および45％グルコース溶液（シグマ、カタログ番号G8769））トランスフェクションの前日の10 mLの/ L。 </li><li>トランスフェクションの時点で、次のようにトランスフェクション複合体を準備します。 <ol class="lalpha"><li>滅菌マイクロ遠心チューブに血清を含まない増殖培地800μlの8μgのDNAを希釈する。穏やかに混合する。 </li><li>ポリスチレンチューブに血清を含まない増殖培地800μlに40μlのリポフェクタミン™（Invitrogen社18324012）を希釈する。 </li><li>希釈リポフェクタミン™に希釈したDNAを追加。穏やかに混合し、室温で30分間インキュベートする。 </li></ol></li><li> T75の細胞から増殖培地を削除し、血清を含まない増殖培地の6.4 mlを交換してください。フラスコにトランスフェクション複合体1.6 mlを加える。プレートを揺らして穏やかに混合。 </li><li> 6時間CO 2インキュベーターで37セル℃でインキュベートする。 </li><li> 37フラスコとインキュベートする増殖培地8mlを追加で一晩、CO 2インキュベーターでC。 </li><li>吸引によって培養液を除去し、フラスコに新鮮な増殖培地を追加してください。一晩CO 2インキュベーターで37セル℃でインキュベートする。 </li><li> （MEMA媒体ヌクレオチドまたはヌクレオシドなし（ギブコ、カタログ番号12561）10％γ線照射透析ウシ胎児血清（dFBS）（HyClone、カタログ番号SH30079.03）と10 mLの/ L 45を添加した選択培地で増殖培地を交換してください％のグルコース溶液（シグマ、カタログ番号G8769））。 </li><li> 2-3週間のためにCO 2インキュベーターで37セル℃でインキュベートする。 </li></ol> 2。フローサイトメトリー活性化細胞ソーティングによってクローニング<ol><li> 4℃で5分間800rpmでフラスコや遠沈管から​​細胞を取り除きます℃に</li><li> 2％ウシ血清アルブミンおよび1:20希釈で蛍光標識した抗ヒトIgG抗体を添加した選択培地で細胞を再懸濁します。 </li><li> 15〜30分間氷上でインキュベートし、冷PBSで2回洗浄する。ポリプロピレンのチューブに1 × PBSで細胞を再懸濁します。 </li><li> BD FACSAria™上で無菌ソートの準備。各ウェルに200μlの選択培地を含む96ウェル細胞培養プレートを準備します。 </li><li>無菌的に細胞とチューブをロードし、BD FACSAria™に分析し、それぞれ、ステンドグラスと未染色細胞の結果を記録。 </li><li> 96ウェルプレート（S）に必要な蛍光染色プロフィールの単一細胞をソートするには、ゲートと設定を行います。 <ol class="lalpha"><li>トランスフェクションされた細胞は、最初に前方散乱対側方散乱に基づいて分析されます。生細胞用のゲートは、細胞の複雑さや粒度を測定するセルのサイズ、および側方散乱を測定する前方散乱、に基づいて行われます。 </li><li>このゲート内に入る次に、細胞をPEの染色のために検査されます。 PE負のゲートは、非染色トランスフェクションされた細胞や染色した宿主細胞のために設定されています。染色したトランスフェクトした細胞をFACSで検討されているとして、&quot;ハイPE&quot;ゲートは、PE染色に陽性であるすべてのセルの上位5％を包含するように区切られます。 </li></ol></li><li>二週間、37℃のインキュベーターで培養する。 </li></ol> 3。 CloneSelect™イメージャによるコロニー形成のドキュメント 0日目、3日目、ソートFACS後7日目および13日目でCloneSelectイメージャ™上で96 - ウェルプレートでの文書のコロニー形成。画像のドキュメントは、単一細胞に由来するクローンの選択を保証します。その時点で各ウェルに1つのセルだけがあるので、このドキュメントの重要なステップは、0日目の測定のために正しく調整されて焦点面を得ています。それは、それらの単一細胞の画像がフォーカスされていることを非常に重要であり、最高の状態でその上にフォーカスを調整しようとすると、誤解を招く可能性があります。焦点面にはプレートのブランド間で大きく異なると可能性もたくさんの同じブランドの多くにできます。したがって、あらかじめ決められた焦点面には使用する必要があります。これは、テストマイクロビーズまたは使用されている同じロットからのプレート上に堆積した高密度の細胞に着目することによって行うことができます。また、同一ロットから十分に成長したプレートは、この目的のために使用されることがあります。 FACSは、ソートした後、彼らはプレート上の位置に&quot;固定&quot;となるように、細胞がイメージングの前に最低2時間のために解決できるようにすることも重要です。 4。生産性の高いクローンのスクリーニングと選択<ol><li>受信側の96ウェルアッセイプレートの文書のサンプル位置。 </li><li> TECAN自由EVO ®リキッドハンドリングシステムにより、96ウェルアッセイプレートに20μlの上清の転送アリコート（必要に応じて希釈）。この柔軟性と対応ロボットICプラットフォームは、これと他の自動化された細胞培養作業に適応されています。特別なプログラムは、最高の利用と細胞株開発のための自由EVOロボットの機能を強化するために書かれたものです。この例では、単一のコロニーをウェルの中にサンプリングするためのCloneSelect™イメージャのデータを解釈するTECANを設定しています。他のプログラムは、これらのプログラムの多くが容易にできるなど、そのような高産生クローンをスケールアップするために、、必要に応じて手動でプレートをマークカタログやサンプルを、採取されたサンプルの適切な希釈液を作るために解釈するとして、追加の細胞培養のタスクを実行する必要があった384ウェルプレートだけでなく、オリジナルの96ウェルフォーマットに適用。 </li><li>サンプル中の抗体産生は、ヒトIgGはTECAN自由EVO ®リキッドハンドリングシステム上のELISA（ピアース、ロックフォード、IL）を検出するサンドイッチによって分析されます。 <ol><li>サンプルと標準（ヒト骨髄腫はIgG1、カッパ）（シグマ、セントルイス、MO）は、プレコートバイオコート抗ヒトIgGアッセイプレート（BD Biosciences社、サンノゼ、カリフォルニア州）でロードしました。 </li><li>プレートは3つのPBSの洗浄に続いて2時間室温でインキュベートした。 </li><li> ImmunoPureヤギ抗ヒトIgG、（FC -γ）- HRPは（ピアース、ロックフォード、イリノイ州）1:2000の希釈でプレートに添加し、室温で1時間インキュベートした。 </li><li>このプレートをABTS基質を添加する前にPBSで3回洗浄した（ピアース、ロックフォード、イリノイ州）と検出用の405 nmで吸光度を用いて、プレートリーダーで読んでいた。 </li></ol></li><li>生産性の高いクローンを選択して、懸濁培養での生産性を評価する。流加培養のために、細胞を5 g / Lの大豆加水分解物（DMVインターナショナル、カタログ番号SE50MAF - UFを添加した無タンパク質培地JRH直接的なメリット65578で0.3X106細胞/ mL（SAFC Biosciences社、カンザスシティ、ミズーリ）、ロットで接種した番号）と37℃でインキュベートCO 2 7.5％Cを。文化は継続し、2g / Lのグルコース（シグマ、カタログ番号G8769、ロット番号098K2329）培養中のグルコースを加えた乳酸濃度は2g / Lの下に達し、そして供給2mMのグルタミン（Gibco社、カタログ番号25030、を添加したグルタミンのレベルが200以下に到達したロット番号568177）mg / Lであった（YSIバイオアナライザで測定された代謝物）。フェドバッチ培養物を14日と抗体産生を停止させた逆相HPLCにより測定した。 </li><li>蛍光in situハイブリダイゼーションによる候補クローンの遺伝的特性（FISH）5。 </li></ol> 5。代表的な結果： ハイスループットメソッドを使用してクローンを産生する抗体の開発の例を図1および図2に示されています。トランスフェクト細胞プールはBD FACSAria™（図1B）で解析し、ソートされた、蛍光標識した抗ヒトIgG抗体（図1A）で染色した。 96ウェルプレートでのコロニー形成はCloneSelectイメージャ™（図1C）上に結像された。細胞培養上清は、単一のコロニーを含むウェルから採取し、TECAN自由EVO ®リキッドハンドリングシステム（図1D）にELISAによりアッセイした。生産性の高いクローンを蛍光標識した抗ヒトIgGで染色することによって反射されたより高い表面抗体のレベルを示した細胞から発見された。最初のトランスフェクトされた細胞のプールの2つの集団、流加培養で生産性に大きな違いから生成されたクローンを比較するとき（図2）が観察された。高い表面抗体発現（PE高い）を持つ細胞集団から発生した上位2つのクローンの場合は、特定の生産性は50〜70 PG /細胞/日の範囲であった。抗体の生産性のに対し、低表面の抗体の発現（PE低）で細胞集団から発生した上位2つのクローンのための〜20 PG /細胞/日であった。さらに、FACSソーティングにより開発された細胞株は、マニュアル石灰散布の希釈（図3A）を介してクローン化されたものよりも抗体産生に関して、より安定しています。トップクローンの特定の生産性は、手動の石灰散布の希釈によって生成される&quot;クローン1は&quot;、〜30〜80細胞倍加のための培養後にPC​​Dを〜10にPCDを落とした。一方、、&quot;クローン2&quot;ソートFACSによって生成された最上位サブクローンは、少なくとも100細胞の倍加のPCD約20特定の生産性を維持することができた。 in situハイブリダイゼーション（FISH）の蛍光によって、我々は、表現型の混合集団（85％）として示したと表現型B（15％）クローン1を示した。細胞の99.5％が表現型（図3B）であることが証明さとは対照的に、FACSソートされたクローンは、（クローン2）、​​より均質な集団であることを示した。 <img src="/files/ftp_upload/3010/3010fig1.jpg" alt="図1" /> 図1。CHO細胞からモノクローナル抗体の産生のための生産細胞株の開発。 A）蛍光標識した抗ヒトIgG抗体との最初のトランスフェクトされた細胞のプールの表面染色が。 B）を96ウェルプレートに高い蛍光強度（PE高）と低い蛍光強度（PE低）と細胞集団のソート。 C）コロニーの文書化0日目からCloneSelectイメージャ™上では13日後の播種に形成。 D）ELISAによるスクリーニングのクローン。 <img src="/files/ftp_upload/3010/3010fig2.jpg" alt="図2" /> 図2：表面に関連する抗体のレベルは、細胞の抗体産生と相関している。ハイとローの蛍光染色を持つクローンは、細胞株へと発展し、流加培養で評価した両方。体積力価と特異的生産性は、それぞれ人口の上位2つのクローン間で比較した。 <img src="/files/ftp_upload/3010/3010fig3.jpg" alt="図3" /> 図3。高い遺伝的等質性とクローンの安定性を示すソートFACSから生成されたクローン。文化の経過時間の〜80細胞倍加用のバッチ培養でA）抗体の生産の安定性。 Δ、クローンは、細胞がよく2000個/ 1000細胞/ウェル、500細胞/ウェルで播種した限界希釈法、使用して生成されました。 <img src="/files/ftp_upload/3010/3010triangle.jpg" alt="ブラックトライアングル" /> 、クローンは、1セル/ウェルでFACSによって生成されました。 B）CHO細胞の染色体における導入遺伝子の組込み部位は、in situハイブリダイゼーション蛍光によって識別されます。

<ol>
	<li>Hung, F., Deng, L., Ravnikar, P., Condon, R., Li, B., Do, L., Saha, D., Tsao, Y. S., Merchant, A., Liu, Z., Shi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA+stability+and+antibody+production+in+CHO+cells:+improvement+through+gene+optimization.">mRNA stability and antibody production in CHO cells: improvement through gene optimization.</a> Biotechnol. J. 5, 393-401 (2010).</li><li>Brezinsky, S. C., Chiang, G. G., Szilvasi, A., Mohan, S., Shapiro, R. I., MacLean, A., Sisk, W., Thill, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+enriching+populations+of+transfected+CHO+cells+for+cells+of+higher+specific+productivity.">A simple method for enriching populations of transfected CHO cells for cells of higher specific productivity.</a> J. Immunol. Methods. 277, 141-155 (2003).</li><li>Kromenaker, S. J., Srienc, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stability+of+producer+hybridoma+cell+lines+after+cell+sorting:+a+case+study.">Stability of producer hybridoma cell lines after cell sorting: a case study.</a> Biotechnol. Prog. 10, 299-307 (1994).</li><li>Marder, P., Maciak, R. S., Fouts, R. L., Baker, R. S., Starling, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+cloning+of+hybridoma+cells+for+enhanced+immunoglobulin+production+using+flow+cytometric+cell+sorting+and+automated+laser+nephelometry.">Selective cloning of hybridoma cells for enhanced immunoglobulin production using flow cytometric cell sorting and automated laser nephelometry.</a> Cytometry. 11, 498-505 (1990).</li><li>Henegariu, O., Heerema, N., Wright, L. L., Bray-Ward, P., Ward, D. C., Vance, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improvements+in+cytogenetic+slide+preparation:+controlled+chromosome+spreading+chemical+aging+and+gradual+denaturing.">Improvements in cytogenetic slide preparation: controlled chromosome spreading chemical aging and gradual denaturing.</a> Cytomery. 43, 101-109 (2001).</li><li>Meng, Y. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Grenn+fluorescent+protein+(GFP)+as+a+second+selectable+marker+for+selection+of+high+producing+clones+from+transfected+CHO+cells.">Grenn fluorescent protein (GFP) as a second selectable marker for selection of high producing clones from transfected CHO cells.</a> Gene. 242, 201-207 (2000).</li><li>DeMaria, C. T., Cairns, V., Schwarz, C., Zhang, J., Guerin, M., Zuena, E., Estes, S., Karey, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accelerated+clone+selection+for+recombinant+CHO+cells+using+a+FACS-based+high-throughput+screen.">Accelerated clone selection for recombinant CHO cells using a FACS-based high-throughput screen.</a> Biotechnol. Prog. 23, 465-472 (2007).</li><li>Weaver, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gel+microdrop+technology+for+rapid+isolation+of+rare+an+high+producer+cells.">Gel microdrop technology for rapid isolation of rare an high producer cells.</a> Nat. Med. 3, 583-585 (1997).</li></ol>

この記事の著者は、哺乳類の細胞株からタンパク質治療薬の大規模生産のためにこの方法を使用するメルク社の社員です。

我々はクローンとクローンの安定性を確保しながら生産性の高いクローンの単離を可能にし、平均値で自動化された製造細胞株の開発プラットフォームを発表した。 FACSAria™の細胞選別に続いて表面の抗体染色の関与は、高い抗体の生産性を持つ単一クローンを得るための鍵です。我々の結果と他の報告書2-4は、一過性に細胞表面に表示される抗体のレベルは、セルの生産性とよく相関していることを示唆している。このように、フルオレセイン標識抗体は、膜関連する製品を認識し、高い生産者の分離を支援するために使用することができます。また、レポーター遺伝子およびゲルmicrodrop技術の共発現はFACS 6月8日で高産生クローンの選択を容易にするために使用されている。 FACSを介して高産生するクローンを単離することに加えて、他の技術は同じ目標を達成するために進化してきました。これらは、Genetix ClonePix FLと蛍光抗体の検出システムを用いて生産細胞株のハイスループットスクリーニングを行うStemCell Technologies社ClonaCell EasyPickプラットフォームを生産性の高いクローンを識別し、不要な細胞を排除するmicrospere抗体検出システムとレーザーのスクリーニング技術を使用してトレリスバイオサイエンスCellSpotの技術が含まれています。我々は、操作の容易性、生産性およびクローン上で選択性を組み合わせているため表面に関連付けられた抗体のレベルに基づいて、FACSクローニング法を実装することにしました。 TECAN自由EVO ®リキッドハンドリングシステムの採用が大幅にはるかに大きい細胞プールからの高収率のクローンを選択する機会を提供するスクリーニングのスループットを、増加した。このようなHTRF、BioForteオクテット、HPLC、など、など、アッセイのための他の計測機器は、高い生産者を選択し、低い生産者をスクリーニング可能なすべての手段です。 CloneSelectイメージャ™とクローン形成を追跡することにより、我々はデジタル化された細胞株の歴史を持つクローンを証明するために必要なドキュメントを生成する。クローンは、さらに遺伝的染色体上の単一の導入遺伝子の組込み部位を特徴付けることによって確認されている。通常、クローンを確保するために取られるサブクローニングのステップは、、このように排除することができる。これは、細胞株開発のための時間の4-8週間が保存されます。要約すると、高スループットの自動化されたプラットフォームで生成された高品質の細胞株は、大規模な生産と現在の規制要件への需要を満たす必要が高い生産性、生産の安定性および文書化された細胞株の履歴を示した。

<table border="1"><tbody><tr><td> の名前 </td><td> 会社 </td></tr><tr><td> BD FACSアリア™セルソーター</td><td>バイオサイエンスBD </td></tr><tr><td> CloneSelect™イメージャ</td><td> Genetix </td></tr><tr><td> TECAN自由EVO ®液体ハンドリングシステム</td><td>テカングループ</td></tr></tbody></table>

a high-throughput automated platform for the development of manufacturing cell lines for protein therapeutics

急成長を遂げているバイオ医薬品業界は、薬物の供給の増大する要件を満たすために高効率で信頼性の高い生産システムのスピーディーな開発が求められています。生産細胞株の世代は、伝統的に労働集約的、低スループットとヒューマンエラーに対して脆弱なマニュアル操作が関与しています。ここでは、タンパク質治療薬の生産のための生産細胞株の開発のための統合されたハイスループットおよび自動化されたプラットフォームを報告する。 BD FACS Ariaの組み合わせは、™セルソーター、CloneSelect™イメージャーとTECAN自由EVO ®リキッドハンドリングシステムは、高スループットとより効率的な細胞株の開発プロセスを可能にしました。この操作では、生産の宿主細胞は、最初に選択剤による治療に続い関心1の遺伝子を、発現ベクターでトランスフェクトされています。安定に導入された細胞は、その後、蛍光標識抗ヒトIgG抗体で染色し、続いてフローサイトメトリー分析2-4対象となります。生産性の高い細胞は、蛍光強度に基づいて選択されており、BD FACSAria™上で単一細胞ソーティングによって分離されています。単一細胞期からコロニー形成は微視的に検出されたとの時間周デジタル映像のシリーズは、細胞株の歴史の説明はCloneSelect™イメージャで撮影されています。単一のクローンが形成した後、これらのクローンはTECANフリーダムEVO ®リキッドハンドリングシステム上で実行ELISAによる生産性のスクリーニングを行った。約2,000 - 10,000クローンは現在のシステムのセットアップと操作のサイクルごとにスクリーニングすることができる。 この統合的なアプローチは、治療用モノクローナル抗体（mAb）だけでなく、それらの融合タンパク質の生産のための高生産チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞株を生成するために使用されています。プローブを検出する、さまざまなタイプの助けを借りて、メソッドが他のタンパク質治療薬の開発や他の生産のホストシステムに適用するために使用することができます。従来の手動の手順と比較すると、この自動化されたプラットフォームが大幅に増加した容量、確保クローン、電子マニュアルを有する細胞株の歴史の中でトレーサビリティと演算子のエラーの多くを低減機会の利点を示した。

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A High-throughput Automated Platform for the Development of Manufacturing Cell Lines for Protein Therapeutics

タンパク質治療薬を製造するための製造の細胞株開発のハイスループット、自動化されたプラットフォームが記載されている。 BD FACSアリアセルソーター、CloneSelectイメージャとTECAN自由EVOリキッドハンドリングシステムの実装では、改善された細胞株の品質と高い再現性を持つ細胞株の開発における有意に増加した処理能力を実証してきました。

タンパク質治療薬の製造細胞株の開発のためのハイスループット自動化されたプラットフォーム

The fast-growing biopharmaceutical industry demands speedy development of highly efficient and reliable production systems to meet the increasing ...

a-high-throughput-automated-platform-for-development-manufacturing

Research

JoVE Journal

Medicine

22.1K ビュー.  Merck & Co., Inc. タンパク質治療薬を製造するための製造の細胞株開発のハイスループット、自動化されたプラットフォームが記載されている。 BD FACSアリアセルソーター、CloneSelectイメージャとTECAN自由EVOリキッドハンドリングシステムの実装では、改善された細胞株の品質と高い再現性を持つ細胞株の開発における有意に増加した処理能力を実証してきました。

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Mouse Eye Enucleation for Remote High-throughput Phenotyping

The mouse eye is an important genetic model for the translational study of human ophthalmic disease. Blinding diseases in humans, such as macular degeneration, photoreceptor degeneration, cataract, glaucoma, retinoblastoma, and diabetic retinopathy have been recapitulated in transgenic mice.1-5 Most transgenic and knockout mice have been generated by laboratories to study non-ophthalmic diseases, but genetic conservation between organ systems suggests that many of the same genes may also play a role in ocular development and disease. Hence, these mice represent an important resource for discovering new genotype-phenotype correlations in the eye. Because these mice are scattered across the globe, it is difficult to acquire, maintain, and phenotype them in an efficient, cost-effective manner. Thus, most high-throughput ophthalmic phenotyping screens are restricted to a few locations that require on-site, ophthalmic expertise to examine eyes in live mice. 6-9 An alternative approach developed by our laboratory is a method for remote tissue-acquisition that can be used in large or small-scale surveys of transgenic mouse eyes. Standardized procedures for video-based surgical skill transfer, tissue fixation, and shipping allow any lab to collect whole eyes from mutant animals and send them for molecular and morphological phenotyping. In this video article, we present techniques to enucleate and transfer both unfixed and perfusion fixed mouse eyes for remote phenotyping analyses.

The dissection technique illustrates enucleation of the mouse eye for tissue fixation to perform phenotyping in high-throughput screens.

リモートハイスループット表現型解析のためのマウスの目の摘出

The mouse eye is an important genetic model for the translational study of human ophthalmic disease. Blinding diseases in humans, such as macular ...

医学

The Use of Cystometry in Small Rodents: A Study of Bladder Chemosensation

The lower urinary tract (LUT) functions as a dynamic reservoir that is able to store urine and to efficiently expel it at a convenient time. While storing urine, however, the bladder is exposed for prolonged periods to waste products. By acting as a tight barrier, the epithelial lining of the LUT, the urothelium, avoids re-absorption of harmful substances. Moreover, noxious chemicals stimulate the bladder's nociceptive innervation and initiate voiding contractions that expel the bladder's contents. Interestingly, the bladder's sensitivity to noxious chemicals has been used successfully in clinical practice, by intravesically infusing the TRPV1 agonist capsaicin to treat neurogenic bladder overactivity1. This underscores the advantage of viewing the bladder as a chemosensory organ and prompts for further clinical research. However, ethical issues severely limit the possibilities to perform, in human subjects, the invasive measurements that are necessary to unravel the molecular bases of LUT clinical pharmacology. A way to overcome this limitation is the use of several animal models2. Here we describe the implementation of cystometry in mice and rats, a technique that allows measuring the intravesical pressure in conditions of controlled bladder perfusion.
	After laparotomy, a catheter is implanted in the bladder dome and tunneled subcutaneously to the interscapular region. Then the bladder can be filled at a controlled rate, while the urethra is left free for micturition. During the repetitive cycles of filling and voiding, intravesical pressure can be measured via the implanted catheter. As such, the pressure changes can be quantified and analyzed. Moreover, simultaneous measurement of the voided volume allows distinguishing voiding contractions from non-voiding contractions3.
	Importantly, due to the differences in micturition control between rodents and humans, cystometric measurements in these animals have only limited translational value4. Nevertheless, they are quite instrumental in the study of bladder pathophysiology and pharmacology in experimental pre-clinical settings. Recent research using this technique has revealed the key role of novel molecular players in the mechano- and chemo-sensory properties of the bladder.

Cystometry is an efficient technique to measure bladder function of small animals in vivo. The bladder is continuously infused at rates controlled through an intravesical catheter, whereas the urethra is left free for micturition. This allows for repetitive filling and emptying of the bladder, while intravesical pressure and voided volume are recorded.

小型げっ歯類における膀胱内圧測定の使用：膀胱Chemosensationの研究

	The lower urinary tract (LUT) functions as a  dynamic reservoir that is able to store urine and to efficiently expel it at a  convenient time. While ...

Human Neuroendocrine Tumor Cell Lines as a Three-Dimensional Model for the Study of Human Neuroendocrine Tumor Therapy

Neuroendocrine tumors (NETs) are rare tumors, with an incidence of two per 100,&#x200A;000 individuals per year, and they account for 0.5% of all human malignancies.1 Other than surgery for the minority of patients who present with localized disease, there is little or no survival benefit of systemic therapy. Therefore, there is a great need to better understand the biology of NETs, and in particular define new therapeutic targets for patients with nonresectable or metastatic neuroendocrine tumors. 3D cell culture is becoming a popular method for drug screening due to its relevance in modeling the in vivo tumor tissue organization and microenvironment.2,3 The 3D multicellular spheroids could provide valuable information in a more timely and less expensive manner than directly proceeding from 2D cell culture experiments to animal (murine) models.
To facilitate the discovery of new therapeutics for NET patients, we have developed an in vitro 3D multicellular spheroids model using the human NET cell lines. The NET cells are plated in a non-adhesive agarose-coated 24-well plate and incubated under physiological conditions (5% CO2, 37 &deg;C) with a very slow agitation for 16-24 hr after plating. The cells form multicellular spheroids starting on the 3rd or 4th day. The spheroids become more spherical by the 6th day, at which point the drug treatments are initiated. The efficacy of the drug treatments on the NET spheroids is monitored based on the morphology, shape and size of the spheroids with a phase-contrast light microscope. The size of the spheroids is estimated automatically using a custom-developed MATLAB program based on an active contour algorithm. Further, we demonstrate a simple method to process the HistoGel embedding on these 3D spheroids, allowing the use of standard histological and immunohistochemical techniques. 
This is the first report on generating 3D spheroids using NET cell lines to examine the effect of therapeutic drugs. We have also performed histology on these 3D spheroids, and displayed an example of a single drug's effect on growth and proliferation of the NET spheroids. Our results support that the NET spheroids are valuable for further studies of NET biology and drug development.

We present a simple agarose overlay platform to grow 3D multicellular spheroids using neuroendocrine cancer cell lines. This method provides a very convenient way to examine the effect of therapeutic drugs on the neuroendocrine tumor cells. It could also help us establish human neuroendocrine tumor spheroids for cancer therapy.

人間の神経内分泌腫瘍療法の研究のための三次元モデルとしての人間の神経内分泌腫瘍細胞株

Neuroendocrine tumors (NETs) are rare tumors, with an incidence of two per 100,&#x200A;000 individuals per year, and they account for 0.5% of all human ...

Intranasal Administration of CNS Therapeutics to Awake Mice

Intranasal administration is a method of delivering therapeutic agents to the central nervous system (CNS). It is non-invasive and allows large molecules that do not cross the blood-brain barrier access to the CNS. Drugs are directly targeted to the CNS with intranasal delivery, reducing systemic exposure and thus unwanted systemic side effects1. Delivery from the nose to the CNS occurs within minutes along both the olfactory and trigeminal neural pathways via an extracellular route and does not require drug to bind to any receptor or axonal transport2. Intranasal delivery is a widely publicized method and is currently being used in human clinical trials3.
Intranasal delivery of drugs in animal models allows for initial evaluation of pharmacokinetic distribution and efficacy. With mice, it is possible to administer drugs to awake (non-anesthetized) animals on a regular basis using a specialized intranasal grip. Awake delivery is beneficial because it allows for long-term chronic dosing without anesthesia, it takes less time than with anesthesia, and can be learned and done by many people so that teams of technicians can dose large numbers of mice in short periods. Efficacy of therapeutics administered intranasally in this way to mice has been demonstrated in a number of studies including insulin in diabetic mouse models 4-6 and deferoxamine in Alzheimer's mouse models. 7,8
The intranasal grip for mice can be learned, but is not easy and requires practice, skill, and a precise grip to effectively deliver drug to the brain and avoid drainage to the lung and stomach. Mice are restrained by hand using a modified scruff in the non-dominant hand with the neck held parallel to the floor, while drug is delivered with a pipettor using the dominant hand. It usually takes 3-4 weeks of acclimating to handling before mice can be held with this grip without a stress response. We have prepared this JoVE video to make this intranasal delivery technique more accessible.

A method to intranasally administer drugs to awake mice for the purpose of targeting the brain is described. This method allows for repeat dosing over long periods using intranasal administration of drug without anesthesia, and nose-to-brain delivery with minimal systemic exposure.

アウェイクマウスに対する中枢神経系治療薬の経鼻投与

Intranasal administration is a method of delivering  therapeutic agents to the central nervous system (CNS). It is  non-invasive and allows large ...

High-throughput Flow Cytometry Cell-based Assay to Detect Antibodies to N-Methyl-D-aspartate Receptor or Dopamine-2 Receptor in Human Serum

Over the recent years, antibodies against surface and conformational proteins involved in neurotransmission have been detected in autoimmune CNS diseases in children and adults. These antibodies have been used to guide diagnosis and treatment. Cell-based assays have improved the detection of antibodies in patient serum. They are based on the surface expression of brain antigens on eukaryotic cells, which are then incubated with diluted patient sera followed by fluorochrome-conjugated secondary antibodies. After washing, secondary antibody binding is then analyzed by flow cytometry. Our group has developed a high-throughput flow cytometry live cell-based assay to reliably detect antibodies against specific neurotransmitter receptors. This flow cytometry method is straight forward, quantitative, efficient, and the use of a high-throughput sampler system allows for large patient cohorts to be easily assayed in a short space of time. Additionally, this cell-based assay can be easily adapted to detect antibodies to many different antigenic targets, both from the central nervous system and periphery. Discovering additional novel antibody biomarkers will enable prompt and accurate diagnosis and improve treatment of immune-mediated disorders.

Over the recent years, live cell-based assays have been used successfully to detect antibodies against surface and conformational antigens. Here, we describe a method using high-throughput flow cytometry enabling the analysis of large cohorts of patients. Detection of novel antibodies will improve diagnosis and treatment of immune-mediated disorders.

ハイスループットフローサイトメトリー細胞ベースのアッセイN-メチル-D-アスパラギン酸受容体またはヒト血清中のドーパ​​ミン-2受容体に対する抗体を検出する

Over the recent years, antibodies against surface and conformational proteins involved in neurotransmission have been detected in autoimmune CNS diseases ...

Ex Vivo Treatment Response of Primary Tumors and/or Associated Metastases for Preclinical and Clinical Development of Therapeutics

The molecular analysis of established cancer cell lines has been the mainstay of cancer research for the past several decades. Cell culture provides both direct and rapid analysis of therapeutic sensitivity and resistance. However, recent evidence suggests that therapeutic response is not exclusive to the inherent molecular composition of cancer cells but rather is greatly influenced by the tumor cell microenvironment, a feature that cannot be recapitulated by traditional culturing methods. Even implementation of tumor xenografts, though providing a wealth of information on drug delivery/efficacy, cannot capture the tumor cell/microenvironment crosstalk (i.e., soluble factors) that occurs within human tumors and greatly impacts tumor response. To this extent, we have developed an ex vivo (fresh tissue sectioning) technique which allows for the direct assessment of treatment response for preclinical and clinical therapeutics development. This technique maintains tissue integrity and cellular architecture within the tumor cell/microenvironment context throughout treatment response providing a more precise means to assess drug efficacy.

Ex Vivo Treatment Response of Primary Tumors and/or Associated Metastases for Preclinical and Clinical Development of Therapeutics

Established cancer cell lines and xenografts have been the mainstay of cancer research for the past several decades. However, recent evidence suggests that therapeutic response is greatly influenced by the tumor cell microenvironment. Therefore, we have developed an ex vivo analysis of primary tumor specimens for drug development purposes.

エキソビボ処理前臨床のための原発腫瘍および/ ​​または関連した転移の応答と治療薬の臨床開発

The molecular analysis of established cancer cell lines has been the mainstay of cancer research for the past several decades. Cell culture provides both ...

High Throughput Characterization of Adult Stem Cells Engineered for Delivery of Therapeutic Factors for Neuroprotective Strategies

Mesenchymal stem cells (MSCs) derived from bone marrow are a powerful cellular resource and have been used in numerous studies as potential candidates to develop strategies for treating a variety of diseases. The purpose of this study was to develop and characterize MSCs as cellular vehicles engineered for delivery of therapeutic factors as part of a neuroprotective strategy for rescuing the damaged or diseased nervous system. In this study we used mouse MSCs that were genetically modified using lentiviral vectors, which encoded brain-derived neurotrophic factor (BDNF) or glial cell-derived neurotrophic factor (GDNF), together with green fluorescent protein (GFP). 
Before proceeding with in vivo transplant studies it was important to characterize the engineered cells to determine whether or not the genetic modification altered aspects of normal cell behavior. Different culture substrates were examined for their ability to support cell adhesion, proliferation, survival, and cell migration of the four subpopulations of engineered MSCs. High content screening (HCS) was conducted and image analysis performed. 
Substrates examined included: poly-L-lysine, fibronectin, collagen type I, laminin, entactin-collagen IV-laminin (ECL). Ki67 immunolabeling was used to investigate cell proliferation and Propidium Iodide staining was used to investigate cell viability. Time-lapse imaging was conducted using a transmitted light/environmental chamber system on the high content screening system.
Our results demonstrated that the different subpopulations of the genetically modified MSCs displayed similar behaviors that were in general comparable to that of the original, non-modified MSCs. The influence of different culture substrates on cell growth and cell migration was not dramatically different between groups comparing the different MSC subtypes, as well as culture substrates. 
This study provides an experimental strategy to rapidly characterize engineered stem cells and their behaviors before their application in long-term in vivo transplant studies for nervous system rescue and repair.

This study describes an experimental platform to rapidly characterize engineered stem cells and their behaviors before their application in long-term in vivo transplant studies for nervous system rescue and repair.

神経保護戦略のための治療因子の送達のために設計成体幹細胞の高スループット特性評価

Mesenchymal stem cells (MSCs) derived from bone marrow are a powerful cellular resource and have been used in numerous studies as potential candidates to ...

Isolation and Immortalization of Patient-derived Cell Lines from Muscle Biopsy for Disease Modeling

The generation of patient-specific cell lines represents an invaluable tool for diagnostic or translational research, and these cells can be collected from skin or muscle biopsy tissue available during the patient&#8217;s diagnostic workup. In this protocol, we describe a technique for live cell isolation from small amounts of muscle or skin tissue for primary cell culture. Additionally, we provide a technique for the immortalization of myogenic cell lines and fibroblast cell lines from primary cells. Once cell lines are immortalized, substantial expansion of patient-derived cells can be achieved. Immortalized cells are amenable to many downstream applications, including drug screening and in vitro correction of the genetic mutation. Altogether, these protocols provide a reliable tool to generate and preserve patient-derived cells for downstream applications.

This protocol describes techniques for live cell isolation and primary culture of myogenic and fibroblast cell lines from muscle or skin tissue. A technique for the immortalization of these cell lines is also described. Altogether, these protocols provide a reliable tool to generate and preserve patient-derived cells for downstream applications.

病気のモデリングのための筋生検からの患者由来の細胞株の単離と不死

The generation of patient-specific cell lines represents an invaluable tool for diagnostic or translational research, and these cells can be collected ...

A High Throughput, Multiplexed and Targeted Proteomic CSF Assay to Quantify Neurodegenerative Biomarkers and Apolipoprotein E Isoforms Status

Many neurodegenerative diseases are&#160;still lacking effective treatments. Reliable biomarkers for identifying and classifying these diseases will be important in the development of future novel therapies. Often&#160;potential new biomarkers do not make it&#160;into the clinic&#160;due to limitations&#160;in their development and&#160;high costs.&#160;However,&#160;targeted proteomics using Multiple Reaction Monitoring Liquid Chromatography-tandem/Mass Spectrometry (MRM LC-MS/MS), specifically using triple quadrupole mass spectrometers, is one method that can be used to rapidly evaluate and validate biomarkers&#160;for clinical translation into diagnostic laboratories. Traditionally, this platform has been used extensively for measurement of small molecules&#160;in clinical laboratories, but it is the potential to analyze proteins, that makes it an attractive alternative to ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)-based methods. We describe here how targeted proteomics can be used to measure multiplexed markers of dementia, including the detection and quantitation of the known risk factor apolipoprotein E isoform 4 (ApoE4).
In order to make the assay suitable for translation, it is designed to be rapid, simple, highly specific and cost effective. To achieve this, every step in the development of the assay must be optimized for the individual proteins and tissues they are analyzed in. This method describes a typical workflow including various tips and tricks to developing a targeted proteomics MRM LC-MS/MS for translation.
The method development is optimized using custom synthesized versions of tryptic quantotypic peptides, which calibrate&#160;the MS for detection and then spiked into CSF to determine correct identification of the endogenous peptide in the chromatographic separation prior to analysis in the MS. To achieve absolute quantitation, stable isotope-labeled internal standard versions of the peptides with short amino acid sequence tags and containing a trypsin cleavage site, are included in the assay.

We describe a high-throughput, multiplex, and targeted proteomic cerebrospinal fluid (CSF) assay developed with potential for clinical translation. The test can quantitate potential markers and risk factors for neurodegeneration, such as the apolipoprotein E variants (E2, E3 and E4), and measure their allelic expression.

神経変性のバイオマーカーおよびアポリポタンパク質Eアイソフォームの状態を定量化するために高スループット、多重化およびターゲットプロテオームCSFアッセイ

Many neurodegenerative diseases are&#160;still lacking effective treatments. Reliable biomarkers for identifying and classifying these diseases will be ...

High-Throughput Analysis of Optical Mapping Data Using ElectroMap

Optical mapping is an established technique for high spatio-temporal resolution study of cardiac electrophysiology in multi-cellular preparations. Here we present, in a step-by-step guide, the use of ElectroMap for analysis, quantification, and mapping of high-resolution voltage and calcium datasets acquired by optical mapping. ElectroMap analysis options cover a wide variety of key electrophysiological parameters, and the graphical user interface allows straightforward modification of pre-processing and parameter definitions, making ElectroMap applicable to a wide range of experimental models. We show how built-in pacing frequency detection and signal segmentation allows high-throughput analysis of entire experimental recordings, acute responses, and single beat-to-beat variability. Additionally, ElectroMap incorporates automated multi-beat averaging to improve signal quality of noisy datasets, and here we demonstrate how this feature can help elucidate electrophysiological changes that might otherwise go undetected when using single beat analysis. Custom modules are included within the software for detailed investigation of conduction, single file analysis, and alternans, as demonstrated here. This software platform can be used to enable and accelerate the processing, analysis, and mapping of complex cardiac electrophysiology.

This protocol describes the setup and use of ElectroMap, a MATLAB-based open-source software platform for analysis of cardiac optical mapping data. ElectroMap provides a versatile high-throughput tool for analysis of optical mapping voltage and calcium datasets across a wide range of cardiac experimental models.

エレクトロマップを用いた光マッピングデータのハイスループット解析

Optical mapping is an established technique for high spatio-temporal resolution study of cardiac electrophysiology in multi-cellular preparations. Here we ...