1. Della cellula ospite trasfezione <ol><li> Semi di 2 x 10 6 CHO-DXB11 cellule in coltura cellulare T75 fiasco Corning in 15 ml di mezzo di crescita (MEMA con nucleotidi e nucleosidi (Gibco, numero di catalogo 12571) integrata con 10% di γ-irradiati caratterizzato siero fetale bovino (cFBS) (Hyclone, numero di catalogo SH30071.03) e 10 mL / L di una soluzione di glucosio al 45% (Sigma, numero di catalogo G8769)) un giorno prima della trasfezione. </li><li> Al momento della transfezione, preparare complessi trasfezione come segue: <ol class="lalpha"><li> Diluire il DNA 8 mg in 800 ml di terreno di coltura senza siero in una provetta sterile. Mescolare delicatamente. </li><li> Diluire 40 microlitri Lipofectamine ™ (Invitrogen 18.324.012) in 800 ml di terreno di coltura senza siero in una provetta di polistirolo. </li><li> Aggiungere il DNA diluito al ™ Lipofectamine diluito. Mescolare delicatamente e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente. </li></ol></li><li> Rimuovere il terreno di crescita da parte delle cellule T75 e sostituire con 6,4 ml di terreno di coltura senza siero. Aggiungere il 1,6 ml di complessi trasfezione al pallone. Mescolare delicatamente la piastra a dondolo. </li><li> Incubare le cellule a 37 ° C in un incubatore CO 2 per 6 ore. </li><li> Aggiungere 8 ml di terreno di crescita per il pallone e incubare a 37 ° C in un incubatore CO 2 durante la notte. </li><li> Rimuovere media tramite aspirazione e aggiungere mezzo fresco di crescita al pallone. Incubare le cellule a 37 ° C in un incubatore CO 2 durante la notte. </li><li> Sostituire il terreno di crescita di medio selezione (media MEMA senza nucleotidi o nucleosidi (Gibco, numero di catalogo 12561) integrata con 10% di γ-irradiati dializzati siero fetale bovino (DFB) (Hyclone, numero di catalogo SH30079.03) e 10 mL / L 45 % soluzione di glucosio (Sigma, numero di catalogo G8769)). </li><li> Incubare le cellule a 37 ° C in un incubatore CO 2 per 2-3 settimane. </li></ol> 2. Clonazione ordinando Citometria a cella di flusso attivo <ol><li> Staccare le cellule dal pallone e centrifugare a 800 rpm per 5 minuti a 4 ° C. </li><li> Risospendere le cellule in terreno selezione integrato con il 2% di albumina sierica bovina e fluorescente anti-IgG umane a 1:20 diluizione. </li><li> Incubare in ghiaccio per 15-30 minuti e poi lavare due volte con PBS freddo. Risospendere le cellule in PBS 1x in un tubo di polipropilene. </li><li> Preparati per una sorta asettico FACSAria BD ™. Preparare 96-pozzetti di coltura cellulare che contiene 200 microlitri medio di selezione in ciascun pozzetto. </li><li> Asetticamente caricare il tubo con le cellule e analizzare su BD FACSAria ™, registrare i risultati di cellule colorate e senza macchia, rispettivamente. </li><li> Impostare le porte e le impostazioni per ordinare singole cellule del profilo di fluorescenza desiderato colorazione in piastra a 96 pozzetti (s). <ol class="lalpha"><li> Cellule transfettate vengono prima analizzati sulla base di dispersione in avanti rispetto a dispersione laterale. Un cancello di cellule vive è fatto sulla base di dispersione in avanti, che misura la dimensione di una cellula, e side scatter, che misura la complessità di una cellula o di granularità. </li><li> Le cellule che rientrano in questa porta vengono poi esaminati per la colorazione PE. Cancello PE negativo è impostato per macchia o cellule transfettate cellule ospiti macchiato. Come macchiato cellule transfettate vengono esaminati da FACS, la &quot;High PE&quot; cancello è poi delineato per comprendere i primi 5% di tutte le cellule che sono positivi per la colorazione PE. </li></ol></li><li> Incubare le piastre in incubatore a 37 ° C per due settimane. </li></ol> 3. Documentazione di formazione di colonie di CloneSelect ™ Imager Documento formazione di colonie in piastre da 96 pozzetti su CloneSelect Imager ™ al giorno 0, giorno 3, giorno 7 e il giorno 13 dopo FACS ordinamento. La documentazione immagine garantirà selezione dei cloni derivati ​​da una singola cellula. Un passo fondamentale in questa documentazione è sempre il piano focale regolata correttamente per la misurazione giorno 0, dato che c&#39;è una sola cellula di ogni bene in quel punto. E &#39;molto importante che le immagini di queste celle singole sono a fuoco e cercare di regolare il fuoco su di essi possono essere fuorvianti al meglio. Il piano focale può variare notevolmente tra le marche di piatti e forse anche da lotto a lotto della stessa marca. Quindi un pre-determinato piano focale deve essere utilizzato. Questo può essere realizzato puntando sulla prova di micro-perle o cellule ad alta densità depositato su lastre dello stesso lotto in uso. In alternativa, le piastre completamente cresciuto da una stessa partita possono essere utilizzati per questo scopo. FACS dopo l&#39;ordinamento, è anche importante per permettere alle cellule accontentarsi di un minimo di 2 ore prima di imaging, in modo che possano essere &#39;fisso&#39; in posizione sul piatto. 4. Lo screening e la selezione di cloni altamente produttiva <ol><li> Documento di posizione del campione nel ricevere piastre a 96 pozzetti test. </li><li> Aliquote trasferimento di 20 microlitri surnatante (diluire se necessario) in piastre da 96 pozzetti saggio dal TECAN Freedom EVO ® sistema di gestione dei liquidi. Questo robot flessibili e capacipiattaforma ic è stato adattato per questo e altri servizi telefonici automatizzati lavoro colture cellulari. Programmi speciali sono stati scritti per utilizzare al meglio e migliorare le capacità EVO Libertà robotica per lo sviluppo di linee cellulari. Un esempio di questo è l&#39;impostazione del TECAN di interpretare CloneSelect ™ dati Imager per il campionamento pozzetti con singole colonie. Altri programmi sono stati tenuti a eseguire ulteriori operazioni di coltura cellulare tali da rendere le diluizioni appropriata dei campioni prelevati, interpretare, catalogare e piastre di esempio manualmente segnato, se necessario, di scalare in alto la produzione di cloni, ecc Molti di questi programmi possono essere facilmente applicata a 384 pozzetti così come l&#39;originale formato 96 bene. </li><li> Produzione di anticorpi nei campioni viene analizzato da un sandwich di IgG umano rilevazione ELISA (Pierce, Rockford, IL) sulla libertà TECAN EVO ® sistema di gestione dei liquidi. <ol><li> Campioni e standard (umani mieloma IgG1 kappa) (Sigma, St. Louis, MO) sono stati caricati su preverniciato Bio Coat Anti-Human Piastre Assay IgG (BD Biosciences, San Jose, CA). </li><li> Le piastre sono state incubate a temperatura ambiente per due ore, seguita da tre lavaggi PBS. </li><li> ImmunoPure capra anti-IgG (Fc-gamma)-HRP (Pierce, Rockford, IL) è stato aggiunto alla piastra a una diluizione 1:2000 e incubate per un&#39;ora a temperatura ambiente. </li><li> Le piastre sono state lavate tre volte con PBS prima dell&#39;aggiunta del substrato ABTS (Pierce, Rockford, IL) e sono stati letti su un lettore di piastre con assorbanza a 405 nm per il rilevamento. </li></ol></li><li> Selezionare cloni altamente produttivi e di valutare la produttività nella cultura sospensione. Per fed-batch cultura, le cellule sono state inoculate in 0.3X106 cellule / ml in vantaggio medio libero proteina JRH IMMEDIATA 65578 (RdC Biosciences, Lenexa, KS) integrata con 5 g / L di soia idrolizzato (DMV International, numero di catalogo SE50MAF-UF, lotto numero) e incubate a 37 ° C con 7,5% di CO 2. La cultura continuato e sono stati integrati con 2 g / L di glucosio (Sigma, numero di catalogo G8769, numero di lotto 098K2329) quando il glucosio, più concentrazione di lattato nella cultura raggiunto sotto di 2 g / L, e nutriti 2 mM glutammina (Gibco, numero di catalogo 25030, numero di lotto 568177) quando i livelli di glutammina raggiunto sotto i 200 mg / L (metaboliti misurati con YSI Bioanalyzer). Fed-batch culture si conclusero il giorno 14 e la produzione di anticorpi è stata misurata mediante HPLC in fase inversa. </li><li> Caratterizzazione genetica di cloni candidato da parte ibridazione in situ fluorescente (FISH) 5. </li></ol> 5. Rappresentante dei risultati: Un esempio di sviluppo di produrre anticorpi cloni con il metodo di throughput elevato è mostrata in Figura 1 e Figura 2. Pool di cellule transfettate era macchiata di fluorescente anti-IgG umane (Figura 1A), analizzati e ordinati su BD FACSAria ™ (Figura 1B). Formazione di colonie in piastra da 96 pozzetti è stato ripreso in CloneSelect Imager ™ (Figura 1C). Supernatante di coltura cellulare è stata prelevata da pozzi che contengono singola colonia e dosati mediante test ELISA sul sistema TECAN Freedom EVO ® movimentazione liquidi (Figura 1D). Cloni altamente produttivi sono stati trovati dalle cellule che mostravano più alto livello di anticorpi di superficie riflessa con la colorazione fluorescente anticorpi anti-IgG umane. Quando si confrontano cloni generati da due popolazioni della piscina iniziale delle cellule transfettate, una grande differenza in termini di produttività in fed-batch è stata osservata la cultura (Figura 2). Per i primi due cloni generati dalla popolazione di cellule con elevata espressione di anticorpi di superficie (PE alto), la produttività specifica variava dal 50-70 pg / cellula / giorno. Mentre la produttività degli anticorpi è stata circa 20 pg / cellula / die per i primi due cloni generati dalla popolazione di cellule con bassa espressione di anticorpi di superficie (PE basso). Inoltre, le linee cellulari sviluppato da ordinamento FACS sono più stabili rispetto alla produzione di anticorpi rispetto a quelli che sono stati clonati per diluizione calcinazione manuale (Figura 3A). La produttività specifica del clone in alto, &quot;Clone 1&quot;, generato dalla diluizione calcinazione manuale è sceso da circa 30 pcd a ~ 10 pcd dopo coltura per 80 raddoppi cellulare. D&#39;altra parte, la parte superiore sottoclone generato da FACS ordinamento, &quot;Clone 2&quot;, è stato in grado di mantenere la produttività specifica circa 20 pcd per almeno 100 raddoppi cellulare. Da ibridazione in situ fluorescente (FISH), abbiamo dimostrato Clone 1 ha mostrato come una popolazione mista di fenotipo A (85%) e fenotipo B (15%). Al contrario, FACS ordinati clone (clone 2) ha dimostrato di essere una popolazione più omogenea, con il 99,5% delle cellule si è rivelato un fenotipo (Figura 3B). <img src="/files/ftp_upload/3010/3010fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Sviluppo di linee di produzione di celle per la produzione di anticorpi monoclonali di cellule CHO. A) colorazione superficiale della piscina iniziale delle cellule transfettate con fluorescente anti-IgG umane. B) Ordinamento della popolazione di cellule con elevata intensità di fluorescenza (PE alto) e bassa intensità di fluorescenza (PE bassa) in piastra da 96 pozzetti. C) Documentazione coloniaformazione dal giorno 0 al giorno 13 semina messaggi il CloneSelect Imager ™. D) cloni di screening mediante ELISA. <img src="/files/ftp_upload/3010/3010fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Livello di anticorpi di superficie associata è correlata con la produttività degli anticorpi della cellula. Cloni con alta e bassa colorazione fluorescente sono stati entrambi sviluppati in linee cellulari e valutati in fed-batch cultura. Volumetrico titolo e produttività specifica sono stati confrontati tra top 2 cloni di ogni popolazione. <img src="/files/ftp_upload/3010/3010fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Cloni generati da FACS ordinamento mostrano maggiore omogeneità genetica e stabilità clone. A) la produzione di anticorpi stabilità nella cultura batch per ~ 80 raddoppiamenti cellulari cultura trascorrere del tempo. Δ, clone è stata generata tramite diluizione limite, dove le cellule sono state seminate a 2000 cellule / pozzetto, 1000 cellule / pozzetto e 500 cellule / pozzetto. <img src="/files/ftp_upload/3010/3010triangle.jpg" alt="Triangolo nero" /> , Clone è stata generata tramite FACS a 1 cella / bene. B) l&#39;integrazione del sito Transgene nel cromosoma cellulare CHO è identificata da ibridazione in situ fluorescente.

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	<li>Hung, F., Deng, L., Ravnikar, P., Condon, R., Li, B., Do, L., Saha, D., Tsao, Y. S., Merchant, A., Liu, Z., Shi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA+stability+and+antibody+production+in+CHO+cells:+improvement+through+gene+optimization.">mRNA stability and antibody production in CHO cells: improvement through gene optimization.</a> Biotechnol. J. 5, 393-401 (2010).</li><li>Brezinsky, S. C., Chiang, G. G., Szilvasi, A., Mohan, S., Shapiro, R. I., MacLean, A., Sisk, W., Thill, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+enriching+populations+of+transfected+CHO+cells+for+cells+of+higher+specific+productivity.">A simple method for enriching populations of transfected CHO cells for cells of higher specific productivity.</a> J. Immunol. Methods. 277, 141-155 (2003).</li><li>Kromenaker, S. J., Srienc, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stability+of+producer+hybridoma+cell+lines+after+cell+sorting:+a+case+study.">Stability of producer hybridoma cell lines after cell sorting: a case study.</a> Biotechnol. Prog. 10, 299-307 (1994).</li><li>Marder, P., Maciak, R. S., Fouts, R. L., Baker, R. S., Starling, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+cloning+of+hybridoma+cells+for+enhanced+immunoglobulin+production+using+flow+cytometric+cell+sorting+and+automated+laser+nephelometry.">Selective cloning of hybridoma cells for enhanced immunoglobulin production using flow cytometric cell sorting and automated laser nephelometry.</a> Cytometry. 11, 498-505 (1990).</li><li>Henegariu, O., Heerema, N., Wright, L. L., Bray-Ward, P., Ward, D. C., Vance, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improvements+in+cytogenetic+slide+preparation:+controlled+chromosome+spreading+chemical+aging+and+gradual+denaturing.">Improvements in cytogenetic slide preparation: controlled chromosome spreading chemical aging and gradual denaturing.</a> Cytomery. 43, 101-109 (2001).</li><li>Meng, Y. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Grenn+fluorescent+protein+(GFP)+as+a+second+selectable+marker+for+selection+of+high+producing+clones+from+transfected+CHO+cells.">Grenn fluorescent protein (GFP) as a second selectable marker for selection of high producing clones from transfected CHO cells.</a> Gene. 242, 201-207 (2000).</li><li>DeMaria, C. T., Cairns, V., Schwarz, C., Zhang, J., Guerin, M., Zuena, E., Estes, S., Karey, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accelerated+clone+selection+for+recombinant+CHO+cells+using+a+FACS-based+high-throughput+screen.">Accelerated clone selection for recombinant CHO cells using a FACS-based high-throughput screen.</a> Biotechnol. Prog. 23, 465-472 (2007).</li><li>Weaver, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gel+microdrop+technology+for+rapid+isolation+of+rare+an+high+producer+cells.">Gel microdrop technology for rapid isolation of rare an high producer cells.</a> Nat. Med. 3, 583-585 (1997).</li></ol>

Gli autori di questo articolo sono dipendenti della Merck &amp; Co., Inc., che utilizzano questo metodo per la produzione su larga scala di proteine ​​terapeutiche da linee cellulari di mammiferi.

Abbiamo presentato un sistema automatizzato cella di produzione piattaforma di linea di sviluppo che consente l&#39;isolamento di cloni altamente produttivi, e nel mezzo, mentre assicura clonalità e stabilità clone. L&#39;impegno della colorazione superficiale anticorpi seguita da ordinamento FACSAria cellula ™ è la chiave per ottenere cloni singola con anticorpi ad alta produttività. I nostri risultati e le relazioni di altri 2-4 suggeriscono che il livello di anticorpi transitoriamente visualizzata sulla superficie cellulare una buona correlazione con la produttività della cellula. Così, un fluoresceina coniugato anticorpo può essere utilizzato per riconoscere il prodotto membrana associati e aiuti l&#39;isolamento dei produttori alto. In alternativa, coespressione di geni reporter e MicroDrop tecnologia gel sono stati utilizzati per facilitare la selezione di alta produzione di cloni di FACS 6-8. Oltre ad isolare cloni alta produzione tramite FACS, altre tecnologie si sono evolute per raggiungere lo stesso obiettivo. Queste includono la tecnologia CellSpot Bioscience a traliccio che utilizza microspere sistemi di rilevamento degli anticorpi e lo screening della tecnologia laser per identificare cloni altamente produttivo ed eliminare le cellule indesiderate, Genetix ClonePix FL e StemCell Tecnologie ClonaCell piattaforma EasyPick che eseguono lo screening ad alta velocità di linee cellulari di produzione mediante un sistema di rilevamento degli anticorpi fluorescenti . Abbiamo scelto di implementare il metodo FACS clonazione in base al livello di anticorpi superficiali associate perché combina la facilità di funzionamento, la selettività sulla produttività e sulla clonalità. L&#39;impiego del sistema di gestione TECAN Freedom EVO ® liquido aumentato significativamente il throughput screening, che offrono la possibilità di selezionare per i cloni ad alto rendimento da un pool di cellule molto più grande. Altra strumentazione per test, come HTRF, Bioforte Ottetto, HPLC, ecc, sono tutti i mezzi possibili di selezione dei produttori di alta e bassa screening dei produttori. Tenendo traccia formazione clone con CloneSelect Imager ™, abbiamo generato la documentazione necessaria per dimostrare clonalità con la storia digitalizzati linea cellulare. Clonalità è ulteriormente confermata da caratterizzare geneticamente singolo sito di integrazione del transgene nel cromosoma. Un passo subcloning, che di solito adottati per garantire clonalità, possono quindi essere eliminati. Questo farà risparmiare 4-8 settimane di tempo per lo sviluppo di linee cellulari. In sintesi, le linee cellulari di qualità generato dalla high-throughput piattaforma automatizzata ha dimostrato l&#39;alta produttività, stabilità di produzione e documentata storia linea cellulare che dovrebbe soddisfare la domanda per la produzione su larga scala e attuali requisiti normativi.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome </td><td> Azienda </td></tr><tr><td> BD FACS Aria ™ cell sorter </td><td> BD Bioscience </td></tr><tr><td> CloneSelect ™ Imager </td><td> Genetix </td></tr><tr><td> TECAN Freedom EVO ® sistema di gestione dei liquidi </td><td> Tecan Group </td></tr></tbody></table>

a high-throughput automated platform for the development of manufacturing cell lines for protein therapeutics

La rapida crescita dell&#39;industria biofarmaceutica esigenze rapido sviluppo di sistemi di produzione altamente efficiente e affidabile per soddisfare i requisiti crescenti per le forniture di droga. La generazione di linee cellulari di produzione ha sempre coinvolto le operazioni manuali che sono alta intensità di manodopera, bassa produttività e vulnerabili a errori umani. Riportiamo qui una piattaforma integrata high-throughput e automatizzato per lo sviluppo di linee di produzione di celle per la produzione di proteine ​​terapeutiche. La combinazione di BD FACS Aria ™ cell sorter, CloneSelect ™ Imager e TECAN Freedom EVO ® sistema di gestione dei liquidi ha permesso un alto throughput e più efficiente linea processo di sviluppo delle cellule. In questa operazione, cellule ospiti produzione sono prima transfettate con un vettore di espressione che trasportano il gene di interesse 1, seguito dal trattamento con un agente di selezione. Il stabilmente transfettate cellule vengono poi colorate con fluorescenza anticorpi anti-IgG umane, e successivamente sottoposti ad analisi in citometria a flusso 2-4. Cellule altamente produttive sono selezionati sulla base di intensità di fluorescenza e sono isolate da singole cellule ordinamento su un FACSAria BD ™. Formazione di colonie da singole cellule stadio è stato rilevato al microscopio e una serie di giri nel tempo le immagini digitali vengono prese CloneSelect ™ Imager per la documentazione della storia della linea cellulare. Dopo singoli cloni si sono formati, questi cloni sono stati sottoposti a screening per la produttività mediante test ELISA eseguito su un TECAN Freedom EVO ® sistema di gestione dei liquidi. Circa 2.000 - 10.000 cloni possono essere sottoposti a screening per ciclo di funzionamento con la configurazione del sistema attuale. Questo approccio integrato è stato usato per generare alta produzione ovarica di criceto cinese (CHO) linee cellulari per la produzione di anticorpi terapeutici monoclonali (mAb) così come le loro proteine ​​di fusione. Con l&#39;aiuto di diversi tipi di sonde di rilevazione, il metodo può essere utilizzato per lo sviluppo di terapie proteiche o essere applicata ad altri sistemi host di produzione. Confrontando la procedura manuale tradizionale, questa piattaforma automatizzata dimostrato vantaggi di significativo aumento di capacità, garantita clonalità, la tracciabilità nella storia linea cellulare con documentazione elettronica e di opportunità molto ridotta per errore dell&#39;operatore.

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A High-throughput Automated Platform for the Development of Manufacturing Cell Lines for Protein Therapeutics

Un elevato throughput, piattaforma automatizzata di sviluppo delle cellule linea di produzione per la produzione di proteine ​​terapeutiche è descritto. Implementazione di Cell BD FACS sorter Aria, CloneSelect Imager e TECAN Libertà sistema di movimentazione EVO liquido ha dimostrato capacità di elaborazione significativamente aumentata in linea con lo sviluppo delle cellule migliore qualità linea cellulare e alta riproducibilità.

A High-throughput piattaforma automatica per lo sviluppo di linee cellulari di produzione per Therapeutics Proteine

The fast-growing biopharmaceutical industry demands speedy development of highly efficient and reliable production systems to meet the increasing ...

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22.1K Views.  Merck & Co., Inc. Un elevato throughput, piattaforma automatizzata di sviluppo delle cellule linea di produzione per la produzione di proteine ​​terapeutiche è descritto. Implementazione di Cell BD FACS sorter Aria, CloneSelect Imager e TECAN Libertà sistema di movimentazione EVO liquido ha dimostrato capacità di elaborazione significativamente aumentata in linea con lo sviluppo delle cellule migliore qualità linea cellulare e alta riproducibilità.

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Mouse Eye Enucleation for Remote High-throughput Phenotyping

The mouse eye is an important genetic model for the translational study of human ophthalmic disease. Blinding diseases in humans, such as macular degeneration, photoreceptor degeneration, cataract, glaucoma, retinoblastoma, and diabetic retinopathy have been recapitulated in transgenic mice.1-5 Most transgenic and knockout mice have been generated by laboratories to study non-ophthalmic diseases, but genetic conservation between organ systems suggests that many of the same genes may also play a role in ocular development and disease. Hence, these mice represent an important resource for discovering new genotype-phenotype correlations in the eye. Because these mice are scattered across the globe, it is difficult to acquire, maintain, and phenotype them in an efficient, cost-effective manner. Thus, most high-throughput ophthalmic phenotyping screens are restricted to a few locations that require on-site, ophthalmic expertise to examine eyes in live mice. 6-9 An alternative approach developed by our laboratory is a method for remote tissue-acquisition that can be used in large or small-scale surveys of transgenic mouse eyes. Standardized procedures for video-based surgical skill transfer, tissue fixation, and shipping allow any lab to collect whole eyes from mutant animals and send them for molecular and morphological phenotyping. In this video article, we present techniques to enucleate and transfer both unfixed and perfusion fixed mouse eyes for remote phenotyping analyses.

The dissection technique illustrates enucleation of the mouse eye for tissue fixation to perform phenotyping in high-throughput screens.

Mouse enucleazione degli occhi per Remote ad alta velocità Fenotipizzazione

The mouse eye is an important genetic model for the translational study of human ophthalmic disease. Blinding diseases in humans, such as macular ...

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Medicina

The Use of Cystometry in Small Rodents: A Study of Bladder Chemosensation

The lower urinary tract (LUT) functions as a dynamic reservoir that is able to store urine and to efficiently expel it at a convenient time. While storing urine, however, the bladder is exposed for prolonged periods to waste products. By acting as a tight barrier, the epithelial lining of the LUT, the urothelium, avoids re-absorption of harmful substances. Moreover, noxious chemicals stimulate the bladder's nociceptive innervation and initiate voiding contractions that expel the bladder's contents. Interestingly, the bladder's sensitivity to noxious chemicals has been used successfully in clinical practice, by intravesically infusing the TRPV1 agonist capsaicin to treat neurogenic bladder overactivity1. This underscores the advantage of viewing the bladder as a chemosensory organ and prompts for further clinical research. However, ethical issues severely limit the possibilities to perform, in human subjects, the invasive measurements that are necessary to unravel the molecular bases of LUT clinical pharmacology. A way to overcome this limitation is the use of several animal models2. Here we describe the implementation of cystometry in mice and rats, a technique that allows measuring the intravesical pressure in conditions of controlled bladder perfusion.
	After laparotomy, a catheter is implanted in the bladder dome and tunneled subcutaneously to the interscapular region. Then the bladder can be filled at a controlled rate, while the urethra is left free for micturition. During the repetitive cycles of filling and voiding, intravesical pressure can be measured via the implanted catheter. As such, the pressure changes can be quantified and analyzed. Moreover, simultaneous measurement of the voided volume allows distinguishing voiding contractions from non-voiding contractions3.
	Importantly, due to the differences in micturition control between rodents and humans, cystometric measurements in these animals have only limited translational value4. Nevertheless, they are quite instrumental in the study of bladder pathophysiology and pharmacology in experimental pre-clinical settings. Recent research using this technique has revealed the key role of novel molecular players in the mechano- and chemo-sensory properties of the bladder.

Cystometry is an efficient technique to measure bladder function of small animals in vivo. The bladder is continuously infused at rates controlled through an intravesical catheter, whereas the urethra is left free for micturition. This allows for repetitive filling and emptying of the bladder, while intravesical pressure and voided volume are recorded.

L&#39;uso di cistometria in piccoli roditori: A Study of Chemosensation vescica

	The lower urinary tract (LUT) functions as a  dynamic reservoir that is able to store urine and to efficiently expel it at a  convenient time. While ...

Human Neuroendocrine Tumor Cell Lines as a Three-Dimensional Model for the Study of Human Neuroendocrine Tumor Therapy

Neuroendocrine tumors (NETs) are rare tumors, with an incidence of two per 100,&#x200A;000 individuals per year, and they account for 0.5% of all human malignancies.1 Other than surgery for the minority of patients who present with localized disease, there is little or no survival benefit of systemic therapy. Therefore, there is a great need to better understand the biology of NETs, and in particular define new therapeutic targets for patients with nonresectable or metastatic neuroendocrine tumors. 3D cell culture is becoming a popular method for drug screening due to its relevance in modeling the in vivo tumor tissue organization and microenvironment.2,3 The 3D multicellular spheroids could provide valuable information in a more timely and less expensive manner than directly proceeding from 2D cell culture experiments to animal (murine) models.
To facilitate the discovery of new therapeutics for NET patients, we have developed an in vitro 3D multicellular spheroids model using the human NET cell lines. The NET cells are plated in a non-adhesive agarose-coated 24-well plate and incubated under physiological conditions (5% CO2, 37 &deg;C) with a very slow agitation for 16-24 hr after plating. The cells form multicellular spheroids starting on the 3rd or 4th day. The spheroids become more spherical by the 6th day, at which point the drug treatments are initiated. The efficacy of the drug treatments on the NET spheroids is monitored based on the morphology, shape and size of the spheroids with a phase-contrast light microscope. The size of the spheroids is estimated automatically using a custom-developed MATLAB program based on an active contour algorithm. Further, we demonstrate a simple method to process the HistoGel embedding on these 3D spheroids, allowing the use of standard histological and immunohistochemical techniques. 
This is the first report on generating 3D spheroids using NET cell lines to examine the effect of therapeutic drugs. We have also performed histology on these 3D spheroids, and displayed an example of a single drug's effect on growth and proliferation of the NET spheroids. Our results support that the NET spheroids are valuable for further studies of NET biology and drug development.

We present a simple agarose overlay platform to grow 3D multicellular spheroids using neuroendocrine cancer cell lines. This method provides a very convenient way to examine the effect of therapeutic drugs on the neuroendocrine tumor cells. It could also help us establish human neuroendocrine tumor spheroids for cancer therapy.

Neuroendocrini umani cella linee tumorali come un modello tridimensionale per lo studio dei diritti dell&#39;uomo e terapia dei tumori neuroendocrini

Neuroendocrine tumors (NETs) are rare tumors, with an incidence of two per 100,&#x200A;000 individuals per year, and they account for 0.5% of all human ...

Intranasal Administration of CNS Therapeutics to Awake Mice

Intranasal administration is a method of delivering therapeutic agents to the central nervous system (CNS). It is non-invasive and allows large molecules that do not cross the blood-brain barrier access to the CNS. Drugs are directly targeted to the CNS with intranasal delivery, reducing systemic exposure and thus unwanted systemic side effects1. Delivery from the nose to the CNS occurs within minutes along both the olfactory and trigeminal neural pathways via an extracellular route and does not require drug to bind to any receptor or axonal transport2. Intranasal delivery is a widely publicized method and is currently being used in human clinical trials3.
Intranasal delivery of drugs in animal models allows for initial evaluation of pharmacokinetic distribution and efficacy. With mice, it is possible to administer drugs to awake (non-anesthetized) animals on a regular basis using a specialized intranasal grip. Awake delivery is beneficial because it allows for long-term chronic dosing without anesthesia, it takes less time than with anesthesia, and can be learned and done by many people so that teams of technicians can dose large numbers of mice in short periods. Efficacy of therapeutics administered intranasally in this way to mice has been demonstrated in a number of studies including insulin in diabetic mouse models 4-6 and deferoxamine in Alzheimer's mouse models. 7,8
The intranasal grip for mice can be learned, but is not easy and requires practice, skill, and a precise grip to effectively deliver drug to the brain and avoid drainage to the lung and stomach. Mice are restrained by hand using a modified scruff in the non-dominant hand with the neck held parallel to the floor, while drug is delivered with a pipettor using the dominant hand. It usually takes 3-4 weeks of acclimating to handling before mice can be held with this grip without a stress response. We have prepared this JoVE video to make this intranasal delivery technique more accessible.

A method to intranasally administer drugs to awake mice for the purpose of targeting the brain is described. This method allows for repeat dosing over long periods using intranasal administration of drug without anesthesia, and nose-to-brain delivery with minimal systemic exposure.

Somministrazione intranasale di terapeutica del sistema nervoso centrale di topi Awake

Intranasal administration is a method of delivering  therapeutic agents to the central nervous system (CNS). It is  non-invasive and allows large ...

High-throughput Flow Cytometry Cell-based Assay to Detect Antibodies to N-Methyl-D-aspartate Receptor or Dopamine-2 Receptor in Human Serum

Over the recent years, antibodies against surface and conformational proteins involved in neurotransmission have been detected in autoimmune CNS diseases in children and adults. These antibodies have been used to guide diagnosis and treatment. Cell-based assays have improved the detection of antibodies in patient serum. They are based on the surface expression of brain antigens on eukaryotic cells, which are then incubated with diluted patient sera followed by fluorochrome-conjugated secondary antibodies. After washing, secondary antibody binding is then analyzed by flow cytometry. Our group has developed a high-throughput flow cytometry live cell-based assay to reliably detect antibodies against specific neurotransmitter receptors. This flow cytometry method is straight forward, quantitative, efficient, and the use of a high-throughput sampler system allows for large patient cohorts to be easily assayed in a short space of time. Additionally, this cell-based assay can be easily adapted to detect antibodies to many different antigenic targets, both from the central nervous system and periphery. Discovering additional novel antibody biomarkers will enable prompt and accurate diagnosis and improve treatment of immune-mediated disorders.

Over the recent years, live cell-based assays have been used successfully to detect antibodies against surface and conformational antigens. Here, we describe a method using high-throughput flow cytometry enabling the analysis of large cohorts of patients. Detection of novel antibodies will improve diagnosis and treatment of immune-mediated disorders.

High-throughput Citometria a Flusso test cellulare per individuare gli anticorpi per N-metil-D-aspartato Receptor o dopamina-2 recettore nel siero umano

Over the recent years, antibodies against surface and conformational proteins involved in neurotransmission have been detected in autoimmune CNS diseases ...

Ex Vivo Treatment Response of Primary Tumors and/or Associated Metastases for Preclinical and Clinical Development of Therapeutics

The molecular analysis of established cancer cell lines has been the mainstay of cancer research for the past several decades. Cell culture provides both direct and rapid analysis of therapeutic sensitivity and resistance. However, recent evidence suggests that therapeutic response is not exclusive to the inherent molecular composition of cancer cells but rather is greatly influenced by the tumor cell microenvironment, a feature that cannot be recapitulated by traditional culturing methods. Even implementation of tumor xenografts, though providing a wealth of information on drug delivery/efficacy, cannot capture the tumor cell/microenvironment crosstalk (i.e., soluble factors) that occurs within human tumors and greatly impacts tumor response. To this extent, we have developed an ex vivo (fresh tissue sectioning) technique which allows for the direct assessment of treatment response for preclinical and clinical therapeutics development. This technique maintains tissue integrity and cellular architecture within the tumor cell/microenvironment context throughout treatment response providing a more precise means to assess drug efficacy.

Ex Vivo Treatment Response of Primary Tumors and/or Associated Metastases for Preclinical and Clinical Development of Therapeutics

Established cancer cell lines and xenografts have been the mainstay of cancer research for the past several decades. However, recent evidence suggests that therapeutic response is greatly influenced by the tumor cell microenvironment. Therefore, we have developed an ex vivo analysis of primary tumor specimens for drug development purposes.

Ex Vivo risposta al trattamento di tumori primari e / o associati per metastasi preclinici e sviluppo clinico di Therapeutics

The molecular analysis of established cancer cell lines has been the mainstay of cancer research for the past several decades. Cell culture provides both ...

High Throughput Characterization of Adult Stem Cells Engineered for Delivery of Therapeutic Factors for Neuroprotective Strategies

Mesenchymal stem cells (MSCs) derived from bone marrow are a powerful cellular resource and have been used in numerous studies as potential candidates to develop strategies for treating a variety of diseases. The purpose of this study was to develop and characterize MSCs as cellular vehicles engineered for delivery of therapeutic factors as part of a neuroprotective strategy for rescuing the damaged or diseased nervous system. In this study we used mouse MSCs that were genetically modified using lentiviral vectors, which encoded brain-derived neurotrophic factor (BDNF) or glial cell-derived neurotrophic factor (GDNF), together with green fluorescent protein (GFP). 
Before proceeding with in vivo transplant studies it was important to characterize the engineered cells to determine whether or not the genetic modification altered aspects of normal cell behavior. Different culture substrates were examined for their ability to support cell adhesion, proliferation, survival, and cell migration of the four subpopulations of engineered MSCs. High content screening (HCS) was conducted and image analysis performed. 
Substrates examined included: poly-L-lysine, fibronectin, collagen type I, laminin, entactin-collagen IV-laminin (ECL). Ki67 immunolabeling was used to investigate cell proliferation and Propidium Iodide staining was used to investigate cell viability. Time-lapse imaging was conducted using a transmitted light/environmental chamber system on the high content screening system.
Our results demonstrated that the different subpopulations of the genetically modified MSCs displayed similar behaviors that were in general comparable to that of the original, non-modified MSCs. The influence of different culture substrates on cell growth and cell migration was not dramatically different between groups comparing the different MSC subtypes, as well as culture substrates. 
This study provides an experimental strategy to rapidly characterize engineered stem cells and their behaviors before their application in long-term in vivo transplant studies for nervous system rescue and repair.

This study describes an experimental platform to rapidly characterize engineered stem cells and their behaviors before their application in long-term in vivo transplant studies for nervous system rescue and repair.

High Throughput Caratterizzazione di cellule staminali adulte Engineered per consegna di fattori terapeutici per le strategie neuroprotettive

Mesenchymal stem cells (MSCs) derived from bone marrow are a powerful cellular resource and have been used in numerous studies as potential candidates to ...

Isolation and Immortalization of Patient-derived Cell Lines from Muscle Biopsy for Disease Modeling

The generation of patient-specific cell lines represents an invaluable tool for diagnostic or translational research, and these cells can be collected from skin or muscle biopsy tissue available during the patient&#8217;s diagnostic workup. In this protocol, we describe a technique for live cell isolation from small amounts of muscle or skin tissue for primary cell culture. Additionally, we provide a technique for the immortalization of myogenic cell lines and fibroblast cell lines from primary cells. Once cell lines are immortalized, substantial expansion of patient-derived cells can be achieved. Immortalized cells are amenable to many downstream applications, including drug screening and in vitro correction of the genetic mutation. Altogether, these protocols provide a reliable tool to generate and preserve patient-derived cells for downstream applications.

This protocol describes techniques for live cell isolation and primary culture of myogenic and fibroblast cell lines from muscle or skin tissue. A technique for the immortalization of these cell lines is also described. Altogether, these protocols provide a reliable tool to generate and preserve patient-derived cells for downstream applications.

Isolamento e Immortalizzazione di paziente derivati ​​da linee cellulari provenienti da Muscle Biopsia per la malattia Modeling

The generation of patient-specific cell lines represents an invaluable tool for diagnostic or translational research, and these cells can be collected ...

A High Throughput, Multiplexed and Targeted Proteomic CSF Assay to Quantify Neurodegenerative Biomarkers and Apolipoprotein E Isoforms Status

Many neurodegenerative diseases are&#160;still lacking effective treatments. Reliable biomarkers for identifying and classifying these diseases will be important in the development of future novel therapies. Often&#160;potential new biomarkers do not make it&#160;into the clinic&#160;due to limitations&#160;in their development and&#160;high costs.&#160;However,&#160;targeted proteomics using Multiple Reaction Monitoring Liquid Chromatography-tandem/Mass Spectrometry (MRM LC-MS/MS), specifically using triple quadrupole mass spectrometers, is one method that can be used to rapidly evaluate and validate biomarkers&#160;for clinical translation into diagnostic laboratories. Traditionally, this platform has been used extensively for measurement of small molecules&#160;in clinical laboratories, but it is the potential to analyze proteins, that makes it an attractive alternative to ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)-based methods. We describe here how targeted proteomics can be used to measure multiplexed markers of dementia, including the detection and quantitation of the known risk factor apolipoprotein E isoform 4 (ApoE4).
In order to make the assay suitable for translation, it is designed to be rapid, simple, highly specific and cost effective. To achieve this, every step in the development of the assay must be optimized for the individual proteins and tissues they are analyzed in. This method describes a typical workflow including various tips and tricks to developing a targeted proteomics MRM LC-MS/MS for translation.
The method development is optimized using custom synthesized versions of tryptic quantotypic peptides, which calibrate&#160;the MS for detection and then spiked into CSF to determine correct identification of the endogenous peptide in the chromatographic separation prior to analysis in the MS. To achieve absolute quantitation, stable isotope-labeled internal standard versions of the peptides with short amino acid sequence tags and containing a trypsin cleavage site, are included in the assay.

We describe a high-throughput, multiplex, and targeted proteomic cerebrospinal fluid (CSF) assay developed with potential for clinical translation. The test can quantitate potential markers and risk factors for neurodegeneration, such as the apolipoprotein E variants (E2, E3 and E4), and measure their allelic expression.

A High Throughput, Multiplexer e mirata Proteomica CSF test per quantificare neurodegenerative Biomarkers e apolipoproteina E Isoforme Stato

Many neurodegenerative diseases are&#160;still lacking effective treatments. Reliable biomarkers for identifying and classifying these diseases will be ...

High-Throughput Analysis of Optical Mapping Data Using ElectroMap

Optical mapping is an established technique for high spatio-temporal resolution study of cardiac electrophysiology in multi-cellular preparations. Here we present, in a step-by-step guide, the use of ElectroMap for analysis, quantification, and mapping of high-resolution voltage and calcium datasets acquired by optical mapping. ElectroMap analysis options cover a wide variety of key electrophysiological parameters, and the graphical user interface allows straightforward modification of pre-processing and parameter definitions, making ElectroMap applicable to a wide range of experimental models. We show how built-in pacing frequency detection and signal segmentation allows high-throughput analysis of entire experimental recordings, acute responses, and single beat-to-beat variability. Additionally, ElectroMap incorporates automated multi-beat averaging to improve signal quality of noisy datasets, and here we demonstrate how this feature can help elucidate electrophysiological changes that might otherwise go undetected when using single beat analysis. Custom modules are included within the software for detailed investigation of conduction, single file analysis, and alternans, as demonstrated here. This software platform can be used to enable and accelerate the processing, analysis, and mapping of complex cardiac electrophysiology.

This protocol describes the setup and use of ElectroMap, a MATLAB-based open-source software platform for analysis of cardiac optical mapping data. ElectroMap provides a versatile high-throughput tool for analysis of optical mapping voltage and calcium datasets across a wide range of cardiac experimental models.

Analisi ad alta velocità effettiva dei dati di mappatura ottica tramite ElectroMapHigh-Throughput Analysis of Optical Mapping Data Using ElectroMap

Optical mapping is an established technique for high spatio-temporal resolution study of cardiac electrophysiology in multi-cellular preparations. Here we ...