המחברים מבקשים להודות ד&quot;ר אלן Trautmann שעודד אותנו לבצע הצומת פרוסות הלימפה. עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי תרומות של הלאומית Ligue Contre Le הסרטן, מגט לשפוך en la משוכלל ונדיר Médicale צרפת לשפוך האגודה למלחמה בסרטן la משוכלל ונדיר sur le.

1. הכנת פרוסות של בלוטות הלימפה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכינו 4% נמוך ההיתוך פתרון agarose נקודת להטבעת. מדולל agarose בפתרון זה PBS ומיקרוגל. כאשר agarose הוא נמס לגמרי, לשמור על פתרון על 37 מעלות צלזיוס עד מוכן לשימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 6-היטב בתרבות צלחת רקמות. הוסף 1.1 מ&quot;ל בינוני RPMI תרבות שלמה לכל היטב, להוסיף מסנן organotypic היטב כל אחד. מניחים את צלחת 6-היטב 4 ° C עד מוכן להעביר את הפרוסות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים דיסקיות נירוסטה, עם קוטר פנימי של 4 מ&quot;מ, לתוך צלחת פלסטיק מלאים בינוני RPMI להשלים. Washers ישמש נוספת לרכז את התאים על פרוסת חתך vibratome. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקורבן העכבר בהתאם לתקנות רווחת בעלי החיים המקומיים. בזהירות להסיר את בלוטות הלימפה ההיקפית של הרקמה הסובבת ומניחים אותם בצלחת פלסטיק המכיל קר כקרח PBS. יש להקפיד שלא לפגוע במבנה הלימפה, כמו איברים אלה רך מאוד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים את 4%-agarose הג&#39;ל לתוך צלחת בגודל 35 מ&quot;מ פלסטיק בעדינות להעביר את בלוטות לתוך הג&#39;ל. השאירו את הג&#39;ל agarose על קרח דק 5 להתקשות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את גוש מהקערה וקוצצים את אגר כדי להשאיר 3-5 מ&quot;מ של ג&#39;ל סביב כל צומת הלימפה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף את בלוטות מוטבע בדיסק הדגימה של vibratome עם דבק רעיל רקמות. התקן את הדיסק הדגימה במגש מלא קר כקרח PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סעיף אגר, מוטבע על עובי רקמת 320 מיקרומטר במהירות vibratome להגדיר על מגוון איטי (0.3 מ&quot;מ / s) ואת תדירות רטט להגדיר על מגוון בינוני (1.5 מ&quot;מ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר בזהירות פרוסות הצומת לימפה כפי שהם נחתכות על מחדיר תרבות organotypic באמצעות מלקחיים בסדר. מניחים 3 פרוסות על כל הכנס. השתמש בזהירות רבה כמו פרוסות עלולים להיפגע בקלות. הצומת לימפה טיפוסי היקפי תניב 5 חלקים כאשר לחתוך ב 320 מיקרומטר. מחק את פרוסות הראשונה והאחרונה, כפי שהם מכילים רק רקמות שטחיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים דיסקיות נירוסטה על כל פרוסה בודדים. ודא מנקי ממוקמים היטב על agarose סביב רקמות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה את הצלחת התרבות ב 37 מעלות של 5% CO 2 באינקובטור humidified עד מוכן בתאי T צלחת. </li></ol> 2. בידוד בתאי T של בלוטות הלימפה העכבר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבודד תאים T על פי המאמר שפורסם בעבר יופיטר 3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השימוש בתאי T מיד להמשיך לסעיף הבא. אחרת, לימפוציטים יכול להיות מתורבת לילה שלם RPMI בינוני בתוספת 10 ng / ml IL-7. </li></ol> 3. תיוג של תאים T מבודד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו תאים HBSS. Resuspend אותם למאגר באותו בגודל 10 x 10 6 לכל מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים את נפח זהה של HBSS המכיל 1 מיקרומטר Cell Tracker ירוק CMFDA נותן ריכוז סופי של 0.5 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדגור על השעיית התא ב 37 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות. שטפו פעמיים עם תאים להשלים RPMI בינוני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים Resuspend בריכוז סופי של 10 x 10 6 לכל מ&quot;ל להשלים RPMI בינוני. תאים אלה שכותרתו תהיה מצופה על הפרוסות. </li></ol> צבעי ניאון מלבד CMFDA עשוי לשמש מדי, אבל יש לזכור כי מולקולות אלה הם רעילים בריכוזים מעל מסוימים. 4. שכותרתו ציפוי בתאי T על גבי פרוסות הלימפה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר בינוני עודף הכלול בחלק הפנימי של מכונת הכביסה עם טפטפת. אל תאפשר הרקמה להיות יבש; לעבוד במהירות במהלך שלב זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות לוותר על 10-20 שכותרתו μl T תאים התואם 1-2 x 10 5 תאים בחלק הפנימי של מכונת הכביסה. יש להקפיד לא לגעת עם רקמת קצה פיפטה. הקפד כי ירידה של השעיה התא נשאר במקום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את פרוסות עם תאים החממה ב 37 ° C ו 5% CO 2 דקות לפחות 30 כדי לאפשר לימפוציטים להגר לתוך הרקמה. </li></ol> 5. הדמיה T תאים בתוך פרוסות הלימפה במאמר-video זה, אנו פלורסנט התמונה T לתאים הצומת לימפה פרוסות עם מיקרוסקופ widefield הפוכה מיקרוסקופ confocal זקוף. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את הטמפרטורה 37 ° C. מיקרוסקופים שלנו מצוידים בתאי בקרת טמפרטורה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התקנת מערכת המאפשרת זלוף זלוף רציפה של הפרוסה לימפה הצומת עם מחומצן בינוני (5% CO 2, 95% O 2) RPMI פנול אדום חופשי. במערכת שלנו, התקשורת perfused נכנס לתוך תא הדמיה מצד אחד על ידי כוח הכבידה. המדיום הוא aspirated עם משאבה מחוברת בבקבוק איסוף פסולת. הגדר את קצב זרימת מדיה 1 מ&quot;ל / דקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מלקחיים בסדר, בעדינות להוציא את נתח מהצלחת 6-הבאר לטבול הכנת במדיום חימם RPMI מחומצן במשך כמה שניות כדי להיפטר תאים פלורסנט לא הסתננו לתוך הרקמה. </li></ol> אמאגינג בתאי T עם מיקרוסקופ שדה רחב הפוכה <ol start="4" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את נתח במהופך על תא מחוייט הדמיה אשר מורכב של חוטי ניילון מודבק על החלק הפנימי של צלחת תחתית הכוס. בחדר זה, חוטי ניילון להעלות את נתח מן הכוס ולאפשר פתרון מחומצן לנטרל לתוך הרקמה. זה נדרש כמו הגירה T תא בבלוטות הלימפה תלויה מאוד חמצן. Secure את הפרוסה על ידי הוספת על זה מכונת כביסה נירוסטה. בתנאים אלה, פרוסה טמון מיקרונים אחדים מעל החלק התחתון של המנה, המאפשר חידוש הפתרון זלוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי ללכוד שדה גדול של השקפה (800 x 800 מיקרומטר, כשליש משטח פרוסה של מפרק), לאסוף תמונות באמצעות עדשה 10x אובייקטיבי ויבש. מצאנו כי 10x Nikon S פלואוריד 0.5 NA היה המתאים ביותר עבור מנתח שלנו. </li></ol> ניסוי טיפוסי זמן לשגות הדמיה לוכדת 5 מטוסים אופטי פורש עומק סך של 50 מיקרומטר בממד צירית (z). פלורסנט ותאי T הם צילמו בדרך כלל במרווחי זמן הנעים בין 10 עד 30 שניות במשך 10 דקות עד 20. דימות באמצעות מיקרוסקופ בתאי T זקוף confocal מיקרוסקופ confocal להשתמש בפרוטוקול זה Leica SP5 מצויד מטרה 20x טבילה במים (אולימפוס, 20x/0.95 NA). <ol start="6" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Secure הפרוסה לשלב הדמיה של המיקרוסקופ. הערה: בדרך כלל אנחנו במקום מכונת הכביסה על הכנת כדי לשתק אותו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קבע פגישה הדמיה על ידי איסוף סדרה של תמונות לאורך ציר z. כדי בתאי T תמונה במבנה רקמות שלמות, עמדת להתחיל מוגדר בדרך כלל בשעה 5 עד 10 מיקרומטר מתחת תא T הראשון שכותרתו. </li></ol> 6. נציג תוצאות על ידי ביצוע זו וידאו פרוטוקול עליך לצפות לדמיין מספר גדול של תאים T ניאון שהצטברו באזור ה-T של הצומת, תופעה שבדרך כלל מתרחשת בסביבה מסוימת זו in vivo (איור 1). בפרט, ותאי T צריך להיות מחוץ לאזורי תא B, אשר בדרך כלל רק מתחת הקפסולה. ניסוי מוצלח יהיה גם לגרום לתאי T גייס לתוך הרקמה (איור 2), הצגת התנהגות ניעתי מאוד (איור 3) עולה בקנה אחד עם התוצאות שפורסמו שהושגו בלוטות הלימפה שלם 4. בממוצע, מהירות ממוצעת של T תאים בודדים בתוך פרוסות צריך להיות קרוב ל 10 מיקרומטר / דקה (איור 4). <img src="/files/ftp_upload/3054/3054fig1.jpg" alt="איור 1"/> באיור 1. בתאי T להצטבר פרוסת הלימפה. Fluorescently שכותרתו ותאי T (CMFDA, ירוק) נוספו 30 דקות הלימפה פרוסה לפני רכישת התמונה (תמונה למעלה). התמונה היא השלכה המרבי של 5 תמונות פורש 50 מיקרומטר בכיוון z. התמונה בשדה בהיר מוצג למטה. תמונות שנתפסו עם מיקרוסקופ widefield. <img src="/files/ftp_upload/3054/3054fig2.jpg" alt="איור 2"/> איור 2. בתאי T מגויסים לתוך פרוסת הלימפה. Fluorescently שכותרתו ותאי T (CMFDA, ירוק) נוספו 30 דקות הלימפה פרוסה לפני רכישת התמונה באמצעות מיקרוסקופ confocal. תמונות שנתפסו על פני השטח חתך (בתמונה למעלה) ו 40 מיקרומטר למטה (תמונה למטה). <img src="/files/ftp_upload/3054/3054fig3.jpg" alt="איור 3"/> איור 3. ותאי T הם מאוד ניעתי בתוך פרוסת הלימפה. בתאי T fluorescently שכותרתו היו צילמו במשך 12 דקות באמצעות מיקרוסקופ widefield. מסלולים של הפרט בתאי T מוצגים בקידוד צבע מסלולים לייצג התקות גוברת מצד כחול (תאים ניעתי נמוך) לאדום (תאים ניעתי גבוהה). שירים חושבו באמצעות התוכנה Imaris. הקו הלבן עוקב אחר קצה של הצומת, ואילו הסגלגל מקווקו התוחם את אזור המשוערת תא B. <img src="/files/ftp_upload/3054/3054fig4.jpg" alt="איור 4"/> איור 4. בתוך פרוסת הלימפה, מהירות תא T קרובה 10 מיקרומטר / min. מהירויות חושבו באמצעות תוכנת Imaris מהמסילה מיוצג באיור 3.

<ol>
	<li>Asperti-Boursin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CCR7+ligands+control+basal+T+cell+motility+within+lymph+node+slices+in+a+phosphoinositide+3-kinase-independent+manner.">CCR7 ligands control basal T cell motility within lymph node slices in a phosphoinositide 3-kinase-independent manner.</a> J Exp Med. 204, 1167-1167 (2007).</li><li>Bhakta, N. R., Oh, D. Y., Lewis, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+oscillations+regulate+thymocyte+motility+during+positive+selection+in+the+three-dimensional+thymic+environment.">Calcium oscillations regulate thymocyte motility during positive selection in the three-dimensional thymic environment.</a> Nat Immunol. 6, 143-143 (2005).</li><li>Matheu, M. P., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+CD4++T+cells+from+mouse+lymph+nodes+using+Miltenyi+MACS+purification.">Isolation of CD4+ T cells from mouse lymph nodes using Miltenyi MACS purification.</a> J Vis Exp. , (2007).</li><li>Miller, M. J., Wei, S. H., Parker, I., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+imaging+of+lymphocyte+motility+and+antigen+response+in+intact+lymph+node.">Two-photon imaging of lymphocyte motility and antigen response in intact lymph node.</a> Science. 296, 1869-1869 (2002).</li><li>Ehrlich, L. I., Oh, D. Y., Weissman, I. L., Lewis, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+contribution+of+chemotaxis+and+substrate+restriction+to+segregation+of+immature+and+mature+thymocytes.">Differential contribution of chemotaxis and substrate restriction to segregation of immature and mature thymocytes.</a> Immunity. 31, 986-986 (2009).</li><li>Gollmer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CCL21+mediates+CD4++T-cell+costimulation+via+a+DOCK2/Rac-dependent+pathway.">CCL21 mediates CD4+ T-cell costimulation via a DOCK2/Rac-dependent pathway.</a> Blood. 114, 580-580 (2009).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

תיארנו טכניקה פשוטה, מהירה וחזקה להפקת הלימפה פרוסות, המשמשים כדי לחקור את התנהגותם של תאים T הציג. בשנים האחרונות, שיטה זו יושמה בהצלחה באמצעות הרתי ואת הצומת פרוסות הלימפה כדי לזהות את הגורמים תאיים השליטה מיצוב תא T ו תנועתיות 1,5. הוכח גם למדידת Ca 2 + תגובות thymocytes במהלך בחירת חיוביים בתאי T על ההכרה אנטיגן 2,6. Assay פרוסה כיסוי מציגה יתרונות ומגבלות שראוי לדון בו. ראוי לציין, מערכת זו מאפשר גישה לרקמה, שימושי אם צריך לתמרן פרוסות פרמקולוגית כדי להפריע לשליטה המולקולרי של נדידת תאים. לאחר הדמיה, הפרוסות יכול להיות מעובד על אימונוהיסטוכימיה לאסוף מידע נוסף על מבנים שכבר צילמו. יתר על כן, תצפית יכולה להתבצע באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי widefield המסורתית. למרות ההחלטה הוא לא טוב כמו עם confocal או מיקרוסקופ שני הפוטונים ו phototoxicity כי הוא עקרונית חמורה יותר עם פוטון אחד מאשר עם מיקרוסקופ שני הפוטונים, יש לו את היתרונות של פשטות, עלות נמוכה יותר, ובחירה גדולה יותר של אורכי גל עירור. הדמיה של תאים T בתוך הצומת לימפה שלם דורש הזרקה תוך ורידית של לימפוציטים שכותרתו כי בית לאחר מכן הלימפה לאיברים. כפי שהראינו לעיל 1, assay פרוסה תואם לחלוטין עם בניסוי העברת המאמצת. עם זאת, משך הזמן הדרוש בתאי T לבית אל בלוטות הלימפה יכול לסבך את השימוש של צבעי ניאון, כי יש נטייה לדלוף של התאים לאורך זמן. זהו המקרה של Ca 2 + צבע fura-2. עם גיוס מהיר (&lt;30 דקות) של תאים T לתוך הרקמה, assay פרוסה מספקת הזדמנות להשתמש בצבעים כאלה. לבסוף, בשיטה זו יש יתרון גדול לנתח פונקציות תא T ברקמות אנושיות מספר לשמר אותם. מערכת זו מציגה את הניסוי גם מגבלות שצריך לזכור. נזק הקשורים חיתוך עשוי להשפיע על תפקוד תא T, במיוחד באזור שטחית של הרקמה קרוב לפני השטח לחתוך. על מנת להעריך מוות של תאים בתוך הפרוסה, השתמשנו צבע ירוק ניאון SYTOX החודרת תאים עם הממברנה הפלסמטית בסכנה. הניסויים שלנו מראים כי כ -20% מכלל התאים קטרי, מקומי בעיקר באזור שטחית של הרקמה, היו שכותרתו fluorescently עם צבע זה גרעיני. דאגה נוספת עם פוטנציאל assay הוא היכולת של הפרוסות כדי לשמור על גורמים מסיסים החשובים כולל chemokines. אמנם, אין לנו שום אינדיקציה כי הנתונים שלנו הושפעו בעיות כאלה מאז בתאי T להציג תנועתיות טובה בתוך הפרוסה, ברצוננו להדגיש את החשיבות של תאים הדמיה T באזורים בריא הממוקם כמה עשרות מיקרונים מפני השטח לחתוך. לעומת זאת, ניתן לעשות זאת עם מיקרוסקופים המסורתית (widefield או confocal) כמו בפרוטוקול זה, סביר להניח כי הלימפה הכנה פרוסה בשילוב עם שני הפוטונים הדמיה יגדיל את ברזולוציה מרחבית לעומק ולהקטין את phototoxicity.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם מגיב </th><th> חברה </th><th> מספר קטלוגי </th><th> הערות (אופציונלי) </th></tr><tr><td> Confocal מיקרוסקופ </td><td> לייקה </td><td> SP5 </td><td></td></tr><tr><td> Vibratome </td><td> לייקה </td><td> VT1200S </td><td></td></tr><tr><td> פיין מלקחיים </td><td> העולם מכשירי דיוק </td><td> 14142 </td><td></td></tr><tr><td> 30 התרבות מוסיף מ&quot;מ </td><td> Millipore </td><td> PICM0RG50 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI </td><td> Invitrogen </td><td> 61870010 </td><td> השלם RPMI בינוני מיוצר על ידי הוספת 10% חום מומת עגל בסרום העובר פניצילין / סטרפטומיצין </td></tr><tr><td> הנקס &quot;פתרון מאוזן מלח (HBSS) </td><td> Invitrogen </td><td> 14170088 </td><td></td></tr><tr><td> טמפרטורה נמוכה gelling agarose, סוג ז&#39; </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> A0701 </td><td></td></tr><tr><td> Butyl דבק cyanoacrylate, Vetbond </td><td> 3M </td><td> 1469 </td><td></td></tr><tr><td> נירוסטה דיסקיות פלדה, 4 מ&quot;מ קוטר פנימי </td><td> חנות עשה זאת בעצמך </td><td></td><td></td></tr><tr><td> תא Tracker ירוק CMFDA </td><td> Invitrogen </td><td> C7025 </td><td></td></tr></tbody></table>

ex vivo imaging of t cells in murine lymph node slices with widefield and confocal microscopes

בתאי T נאיבי ברציפות תנועה הלימפה לאיברים משניים, כולל בלוטות הלימפה ההיקפית, כדי לזהות אנטיגנים הביע נדיר. ההגירה של תאים T לתוך בלוטות הלימפה היא תהליך מורכב אשר כולל שני גורמים הסלולר כימיים כולל chemokines. לאחרונה, השימוש במיקרוסקופ שני הפוטונים אפשרה לעקוב אחר בתאי T בבלוטות הלימפה שלם כדי להפיק כמה מידע כמותי על התנהגותם ויחסי הגומלין שלהם עם תאים אחרים. אמנם יש יתרונות ברורים על מערכת vivo, גישה זו דורשת מכשור מורכב ויקר ומספק גישה מוגבלת לרקמה. כדי לנתח את התנהגותם של תאים T בתוך בלוטות הלימפה Murine, פיתחנו assay פרוסה 1, שהוקם במקורו על ידי neurobiologists ואת משורבב לאחרונה התימוס Murine 2. בטכניקה זו, ותאי T שכותרתו fluorescently הם מצופה על גבי פרוסת מוכן בחריפות הלימפה. במאמר זה וידאו, לוקליזציה והגירה של תאים T לרקמת מנותחים בזמן אמת עם widefield ו מיקרוסקופ confocal. הטכניקה אשר משלים in vivo שני הפוטונים מיקרוסקופיה מציע גישה יעילה לתאי T תמונה בסביבתם הטבעית וכדי להבהיר המנגנונים הגירה T התא.

Watch this Scientific Journal Video about Ex vivo Imaging of T Cells in Murine Lymph Node Slices with Widefield and Confocal Microscopes at JoVE.com

Ex vivo Imaging of T Cells in Murine Lymph Node Slices with Widefield and Confocal Microscopes

פרוטוקול זה מתאר שיטה פלורסנט התמונה בתאי T הציג לפרוסות הלימפה. הטכניקה אישורים בזמן אמת וניתוחים של נדידת תאים T עם מסורתי widefield פלואורסצנטי או מיקרוסקופים confocal.

Ex vivo הדמיה של תאים T ב Slices צומת Murine לימפה עם widefield ו מיקרוסקופים confocal

Na&iuml;ve T cells continuously traffic to secondary lymphoid organs, including peripheral lymph nodes, to detect rare expressed antigens. The migration ...

ex-vivo-imaging-t-cells-murine-lymph-node-slices-with-widefield

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Ex vivo Imaging of T Cells in Murine Lymph Node Slices with Widefield and Confocal Microscopes

16.8K Views.  Université Paris Descartes, CNRS (UMR 8104). פרוטוקול זה מתאר שיטה פלורסנט התמונה בתאי T הציג לפרוסות הלימפה. הטכניקה אישורים בזמן אמת וניתוחים של נדידת תאים T עם מסורתי widefield פלואורסצנטי או מיקרוסקופים confocal.

Video: Ex vivo Imaging of T Cells in Murine Lymph Node Slices with Widefield and Confocal Microscopes

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen presenting cells (APCs)1. This recognition leads to the activation of T-cells and a series of functional outcomes (e.g. cytokine production, killing of the target cells). Understanding the functional role of TCRs is critical to harness the power of the immune system to treat a variety of immunology related diseases (e.g. cancer or autoimmunity).
It is convenient to study TCRs in mouse models, which can be accomplished in several ways. Making TCR transgenic mouse models is costly and time-consuming and currently there are only a limited number of them available2-4. Alternatively, mice with antigen-specific T-cells can be generated by bone marrow chimera. This method also takes several weeks and requires expertise5. Retroviral transduction of TCRs into in vitro activated mouse T-cells is a quick and relatively easy method to obtain T-cells of desired peptide-MHC specificity. Antigen-specific T-cells can be generated in one week and used in any downstream applications. Studying transduced T-cells also has direct application to human immunotherapy, as adoptive transfer of human T-cells transduced with antigen-specific TCRs is an emerging strategy for cancer treatment6.
Here we present a protocol to retrovirally transduce TCRs into in vitro activated mouse T-cells. Both human and mouse TCR genes can be used. Retroviruses carrying specific TCR genes are generated and used to infect mouse T-cells activated with anti-CD3 and anti-CD28 antibodies. After in vitro expansion, transduced T-cells are analyzed by flow cytometry.

We present a protocol to produce antigen-specific mouse T-cells using retroviral transduction

התמרה retroviral של T-cell קולטנים עכבר מתאי T

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Intravital Microscopy of the Inguinal Lymph Node

Lymph nodes (LN's), located throughout the body, are an integral component of the immune system. They serve as a site for induction of adaptive immune response and therefore, the development of effector cells. As such, LNs are key to fighting invading pathogens and maintaining health. The choice of LN to study is dictated by accessibility and the desired model; the inguinal lymph node is well situated and easily supports studies of biologically relevant models of skin and genital mucosal infection.
The inguinal LN, like all LNs, has an extensive microvascular network supplying it with blood. In general, this microvascular network includes the main feed arteriole of the LN that subsequently branches and feeds high endothelial venules (HEVs). HEVs are specialized for facilitating the trafficking of immune cells into the LN during both homeostasis and infection. How HEVs regulate trafficking into the LN under both of these circumstances is an area of intense exploration. The LN feed arteriole, has direct upstream influence on the HEVs and is the main supply of nutrients and cell rich blood into the LN. Furthermore, changes in the feed arteriole are implicated in facilitating induction of adaptive immune response. The LN microvasculature has obvious importance in maintaining an optimal blood supply to the LN and regulating immune cell influx into the LN, which are crucial elements in proper LN function and subsequently immune response. 
The ability to study the LN microvasculature in vivo is key to elucidating how the immune system and the microvasculature interact and influence one another within the LN. Here, we present a method for in vivo imaging of the inguinal lymph node. We focus on imaging of the microvasculature of the LN, paying particular attention to methods that ensure the study of healthy vessels, the ability to maintain imaging of viable vessels over a number of hours, and quantification of vessel magnitude. Methods for perfusion of the microvasculature with vasoactive drugs as well as the potential to trace and quantify cellular traffic are also presented. 
Intravital microscopy of the inguinal LN allows direct evaluation of microvascular functionality and real-time interface of the direct interface between immune cells, the LN, and the microcirculation. This technique potential to be combined with many immunological techniques and fluorescent cell labelling as well as manipulated to study vasculature of other LNs.

A technique for performing intravital microscopy of the inguinal lymph node (LN) is outlined. Such technique allows for real-time, in vivo study of the lymph node microvasculature and structure both during homeostasis and infection. This technique can be adapted to cell trafficking studies and to other lymph node sites.

מיקרוסקופית Intravital של הצומת לימפה מפשעתי

Lymph nodes (LN's), located throughout the body, are an integral component of the immune system. They serve as a site for induction of adaptive immune ...

Murine Superficial Lymph Node Surgery

In the field of immunology, to understand the progression of an immune response against a vaccine, an infection or a tumour, the response is often followed over time. Similarly, the study of lymphocyte homeostasis requires time course experiments. Performing these studies within the same mouse is ideal to reduce the experimental variability as well as the number of mice used. Blood withdrawal allows performance of time course experiments, but it only gives information about circulating lymphocytes and provides a limited number of cells1-4. Since lymphocytes circulating through the body and residing in the lymph nodes have different properties, it is important to examine both locations. The sequential removal of lymph nodes by surgery provides a unique opportunity to follow an immune response or immune cell expansion in the same mouse over time. Furthermore, this technique yields between 1-2x106 cells per lymph node which is sufficient to perform phenotypic characterization and/or functional assays. Sequential lymph node surgery or lymphadenectomy has been successfully used by us and others5-11. Here, we describe how the brachial and inguinal lymph nodes can be removed by making a small incision in the skin of an anesthetised mouse. Since the surgery is superficial and done rapidly, the mouse recovers very quickly, heals well and does not experience excessive pain. Every second day, it is possible to harvest one or two lymph nodes allowing for time course experiments. This technique is thus suitable to study the characteristics of lymph node-residing lymphocytes over time. This approach is suitable to various experimental designs and we believe that many laboratories would benefit from performing sequential lymph node surgeries.

To follow the progression of an immune response over time within the same mouse, lymph nodes can be sequentially removed by surgery. Here, we describe how this technique can be performed.

צומת Murine שטחית לימפה ניתוח

In the field of immunology, to understand the progression of an immune response against a vaccine, an infection or a tumour, the response is often ...

Intravital Imaging of the Mouse Popliteal Lymph Node

Lymph nodes (LNs) are secondary lymphoid organs, which are strategically located throughout the body to allow for trapping and presentation of foreign antigens from peripheral tissues to prime the adaptive immune response. Juxtaposed between innate and adaptive immune responses, the LN is an ideal site to study immune cell interactions1,2. Lymphocytes (T cells, B cells and NK cells), dendritic cells (DCs), and macrophages comprise the bulk of bone marrow-derived cellular elements of the LN. These cells are strategically positioned in the LN to allow efficient surveillance of self antigens and potential foreign antigens3-5. The process by which lymphocytes successfully encounter cognate antigens is a subject of intense investigation in recent years, and involves an integration of molecular contacts including antigen receptors, adhesion molecules, chemokines, and stromal structures such as the fibro-reticular network2,6-12. 
Prior to the development of high-resolution real-time fluorescent in vivo imaging, investigators relied on static imaging, which only offers answers regarding morphology, position, and architecture. While these questions are fundamental in our understanding of immune cell behavior, the limitations intrinsic with this technique does not permit analysis to decipher lymphocyte trafficking and environmental clues that affect dynamic cell behavior. Recently, the development of intravital two-photon laser scanning microscopy (2P-LSM) has allowed investigators to view the dynamic movements and interactions of individual cells within live LNs in situ12-16. In particular, we and others have applied this technique to image cellular behavior and interactions within the popliteal LN, where its compact, dense nature offers the advantage of multiplex data acquisition over a large tissue area with diverse tissue sub-structures11,17-18. It is important to note that this technique offers added benefits over explanted tissue imaging techniques, which require disruption of blood, lymph flow, and ultimately the cellular dynamics of the system. Additionally, explanted tissues have a very limited window of time in which the tissue remains viable for imaging after explant. With proper hydration and monitoring of the animal's environmental conditions, the imaging time can be significantly extended with this intravital technique. Here, we present a detailed method of preparing mouse popliteal LN for the purpose of performing intravital imaging.

Recent advances in 2-photon microscopy have enabled real-time in situ imaging of live tissues in animal models, thereby enhancing our ability to investigate cellular behavior in both physiologic and pathologic conditions. Here, we outline the preparations required to perform intravital imaging of the mouse popliteal lymph node.

Intravital הדמיה של בלוטות לימפה popliteal עכבר

Lymph nodes (LNs) are secondary lymphoid organs, which are strategically located throughout the body to allow for trapping and presentation of foreign ...

Generation of Lymph Node-fat Pad Chimeras for the Study of Lymph Node Stromal Cell Origin

The stroma is a key component of the lymph node structure and function. However, little is known about its origin, exact cellular composition and the mechanisms governing its formation. Lymph nodes are always encapsulated in adipose tissue and we recently demonstrated the importance of this relation for the formation of lymph node stroma. Adipocyte precursor cells migrate into the lymph node during its development and upon engagement of the Lymphotoxin-b receptor switch off adipogenesis and differentiate into lymphoid stromal cells (B&#233;n&#233;zech&#160;et al.14). Based on the lymphoid stroma potential of adipose tissue, we present a method using a lymph node/fat pad chimera that allows the lineage tracing of lymph node stromal cell precursors. We show how to isolate newborn lymph nodes and EYFP+ embryonic adipose tissue and make a LN/ EYFP+ fat pad chimera. After transfer under the kidney capsule of a host mouse, the lymph node incorporates local adipose tissue precursor cells and finishes its formation. Progeny analysis of EYFP+ fat pad cells in the resulting lymph nodes can be performed by flow-cytometric analysis of enzymatically digested lymph nodes or by immunofluorescence analysis of lymph nodes cryosections. By using fat pads from different knockout mouse models, this method will provide an efficient way of analyzing the origin of the different lymph node stromal cell populations.

Generation of lymph node/fat pad chimeras for the study of lymph node stromal cell origin is described. The method involves the isolation of lymph nodes from newborn mice and embryonic fat pads, the generation of chimeric lymph node-fat pads, and their transfer under the kidney capsule of a host mouse.

The stroma is a key component of the lymph node structure and function. However, little is known about its origin, exact cellular composition and the ...

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the protocols described here use freshly isolated human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) or plasmacytoid dendritic cells (pDCs) to sense infections in either T cell line (MT4) or heterologous primary CD4+ T cells. In order to ensure proper sensing, it is essential that PBMC are isolated immediately after blood collection and that optimal percentage of infected T cells are used. Furthermore, multi-parametric flow cytometric staining can be used to confirm that PBMC samples contain the different cell lineages at physiological ratios. A number of controls can also be included to evaluate viability and functionality of pDCs. These include, the presence of specific surface markers, assessing cellular responses to known agonist of Toll-Like Receptors (TLR) pathways, and confirming a lack of spontaneous type-I interferon (IFN) production. In this system, freshly isolated PBMCs or pDCs are co-cultured with HIV-1 infected cells in 96 well plates for 18-22 hr. Supernatants from these co-cultures are then used to determine the levels of bioactive type-I IFNs by monitoring the activation of the ISGF3 pathway in HEK-Blue IFN-&#945;/&#946; cells. Prior and during co-culture conditions, target cells can be subjected to flow cytometric analysis to determine a number of parameters, including the percentage of infected cells, levels of specific surface markers, and differential killing of infected cells. Although, these protocols were initially developed to follow type-I IFN production, they could potentially be used to study other imuno-modulatory molecules released from pDCs and to gain further insight into the molecular mechanisms governing HIV-1 innate sensing.

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Unlike cell-free HIV-1 particles, infected CD4+ T cells are effectively sensed by plasmacytoid dendritic cells (pDCs). This manuscript describes a method where peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) or isolated pDCs are co-cultured with HIV-1 infected T cells to evaluate innate sensing by pDCs as assessed by release of type-I IFN.

הערכת חישה המולדת של CD4 הנגוע ב- HIV-1<sup&gt; +</sup&gt; T תאים על ידי תאים דנדריטים Plasmacytoid שימוש<em&gt; Ex vivo</em&gt; עמית תרבות מערכת.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the ...

Isolation of Murine Lymph Node Stromal Cells

Secondary lymphoid organs including lymph nodes are composed of stromal cells that provide a structural environment for homeostasis, activation and differentiation of lymphocytes. Various stromal cell subsets have been identified by the expression of the adhesion molecule CD31 and glycoprotein podoplanin (gp38), T zone reticular cells or fibroblastic reticular cells, lymphatic endothelial cells, blood endothelial cells and FRC-like pericytes within the double negative cell population. For all populations different functions are described including, separation and lining of different compartments, attraction of and interaction with different cell types, filtration of the draining fluidics and contraction of the lymphatic vessels. In the last years, different groups have described an additional role of stromal cells in orchestrating and regulating cytotoxic T cell responses potentially dangerous for the host. 
Lymph nodes are complex structures with many different cell types and therefore require a appropriate procedure for isolation of the desired cell populations. Currently, protocols for the isolation of lymph node stromal cells rely on enzymatic digestion with varying incubation times; however, stromal cells and their surface molecules are sensitive to these enzymes, which results in loss of surface marker expression and cell death. Here a short enzymatic digestion protocol combined with automated mechanical disruption to obtain viable single cells suspension of lymph node stromal cells maintaining their surface molecule expression is proposed.

Isolation of lymph node stromal cells is a multistep procedure including enzymatic digestion and mechanical disaggregation to obtain fibroblastic reticular cells, lymphatic and blood endothelial cells. In the described procedure, a short digestion is combined with automated mechanical disaggregation to minimize surface marker degradation of viable lymph node stromal cells.

בידוד של תאי Murine לימפה צומת סטרומה

Secondary lymphoid organs including lymph nodes are composed of stromal cells that provide a structural environment for homeostasis, activation and ...

An Ex vivo Model of an Oligodendrocyte-directed T-Cell Attack in Acute Brain Slices

Death of oligodendrocytes accompanied by destruction of neurons and axons are typical histopathological findings in cortical and subcortical grey matter lesions in inflammatory demyelinating disorders like multiple sclerosis (MS). In these disorders, mainly CD8+ T-cells of putative specificity for myelin- and oligodendrocyte-related antigens are found, so that neuronal apoptosis in grey matter lesions may be a collateral effect of these cells. Different types of animal models are established to study the underlying mechanisms of the mentioned pathophysiological processes. However, although they mimic some aspects of MS, it is impossible to dissect the exact mechanism and time course of &#8216;&#8216;collateral&#8217;&#8217; neuronal cell death. To address this course, here we show a protocol to study the mechanisms and time response of neuronal damage following an oligodendrocyte-directed CD8+ T cell attack. To target only the myelin sheath and the oligodendrocytes, in vitro activated oligodendrocyte-specific CD8+ T-cells are transferred into acutely isolated brain slices. After a defined incubation period, myelin and neuronal damage can be analysed in different regions of interest. Potential applications and limitations of this model will be discussed.

An Ex vivo Model of an Oligodendrocyte-directed T-Cell Attack in Acute Brain Slices

To address mechanisms of demyelination and neuronal apoptosis in cortical lesions of inflammatory demyelinating disorders, different animal models are used. We here describe an ex vivo approach by using oligodendrocyte-specific CD8+ T-cells on brain slices, resulting in oligodendroglial and neuronal death. Potential applications and limitations of the model are discussed.

<em&gt; Ex vivo</em&gt; דגם של התקפת T-Cell-מכוון oligodendrocyte בפרוסות המוח חריף

Death of oligodendrocytes accompanied by destruction of neurons and axons are typical histopathological findings in cortical and subcortical grey matter ...

Ex Vivo Infection of Murine Epidermis with Herpes Simplex Virus Type 1

To enter its human host, herpes simplex virus type 1 (HSV-1) must overcome the barrier of mucosal surfaces, skin, or cornea. HSV-1 targets keratinocytes during initial entry and establishes a primary infection in the epithelium, which is followed by latent infection of neurons. After reactivation, viruses can become evident at mucocutaneous sites that appear as skin vesicles or mucosal ulcers. How HSV-1 invades skin or mucosa and reaches its receptors is poorly understood. To investigate the invasion route of HSV-1 into epidermal tissue at the cellular level, we established an ex vivo infection model of murine epidermis, which represents the site of primary and recurrent infection in skin. The assay includes the preparation of murine skin. The epidermis is separated from the dermis by dispase II treatment. After floating the epidermal sheets on virus-containing medium, the tissue is fixed and infection can be visualized at various times postinfection by staining infected cells with an antibody against the HSV-1 immediate early protein ICP0. ICP0-expressing cells can be observed in the basal keratinocyte layer already at 1.5 hr postinfection. With longer infection times, infected cells are detected in suprabasal layers, indicating that infection is not restricted to the basal keratinocytes, but the virus spreads to other layers in the tissue. Using epidermal sheets of various mouse models, the infection protocol allows determining the involvement of cellular components that contribute to HSV-1 invasion into tissue. In addition, the assay is suitable to test inhibitors in tissue that interfere with the initial entry steps, cell-to-cell spread and virus production. Here, we describe the ex vivo infection protocol in detail and present our results using nectin-1- or HVEM-deficient mice.

Ex Vivo Infection of Murine Epidermis with Herpes Simplex Virus Type 1

The skin is one target tissue of the human pathogen herpes simplex virus type 1 (HSV-1). To explore the invasion route of HSV-1 into tissue, we established an ex vivo infection model of murine epidermal sheets which represent the outermost layer of skin.

זיהום Ex Vivo של Murine אפידרמיס עם סוג וירוס הרפס סימפלקס 1

To enter its human host, herpes simplex virus type 1 (HSV-1) must overcome the barrier of mucosal surfaces, skin, or cornea. HSV-1 targets keratinocytes ...

Isolation and Ex Vivo Culture of V&#948;1+CD4+&#947;&#948; T Cells, an Extrathymic &#945;&#946;T-cell Progenitor

The thymus, the primary organ for the generation of &#945;&#946; T cells and backbone of the adaptive immune system in vertebrates, has long been considered as the only source of &#945;&#946;T cells. Yet, thymic involution begins early in life leading to a drastically reduced output of na&#239;ve &#945;&#946;T cells into the periphery. Nevertheless, even centenarians can build immunity against newly acquired pathogens. Recent research suggests extrathymic &#945;&#946;T cell development, however our understanding of pathways that may compensate for thymic loss of function are still rudimental. &#947;&#948; T cells are innate lymphocytes that constitute the main T-cell subset in the tissues. We recently ascribed a so far unappreciated outstanding function to a &#947;&#948; T cell subset by showing that the scarce entity of CD4+ V&#948;1+&#947;&#948; T cells can transdifferentiate into &#945;&#946;T cells in inflammatory conditions. Here, we provide the protocol for the isolation of this progenitor from peripheral blood and its subsequent cultivation. V&#948;1 cells are positively enriched from PBMCs of healthy human donors using magnetic beads, followed by a second step wherein we target the scarce fraction of CD4+ cells with a further magnetic labeling technique. The magnetic force of the second labeling exceeds the one of the first magnetic label, and thus allows the efficient, quantitative and specific positive isolation of the population of interest. We then introduce the technique and culture condition required for cloning and efficiently expanding the cells and for identification of the generated clones by FACS analysis. Thus, we provide a detailed protocol for the purification, culture and ex vivo expansion of CD4+ V&#948;1+&#947;&#948; T cells. This knowledge is prerequisite for studies that relate to this &#945;&#946;T cell progenitor`s biology and for those who aim to identify the molecular triggers that are involved in its transdifferentiation.

Isolation and Ex Vivo Culture of V&amp;#948;1+CD4+&amp;#947;&amp;#948; T Cells, an Extrathymic &amp;#945;&amp;#946;T-cell Progenitor

Here, we provide an optimized protocol for the isolation and cloning of the scarce T-cell entity of peripheral V&#948;1+CD4+ T cells that is, as we showed recently, an extrathymic &#945;&#946; T-cell progenitor. This technique allows to quantitatively isolate, clone and efficiently expand these cells in ex vivo culture.