فإن الكتاب أود أن أشكر الدكتور آلان تراوتمان الذي شجعنا على أداء شرائح العقدة الليمفاوية. وأيد هذا العمل في جزء من المنح المقدمة من الدوري الفرنسي لمكافحة السرطان الوطني كونتر جنيه ، ومؤسسة بحوث من أجل لا ميديكال ان فرنسا وتصب جمعية بحوث السرطان لا سور جنيه.

1. إعداد شرائح من العقد الليمفاوية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 4 ٪ منخفضة ذوبان agarose حل لتضمين نقطة. تمييع agarose في حل هذا برنامج تلفزيوني والميكروويف. عندما يذوب تماما agarose ، والحفاظ على الحل عند 37 درجة مئوية لتصبح جاهزة للاستخدام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعد زراعة الأنسجة 6 - جيدا لوحة. إضافة 1.1 مل RPMI مستنبت الكامل لكل بئر ، وإدراج مرشح عضوي النمط في كل بئر. مكان لوحة 6 - جيدا في 4 درجات مئوية حتى على استعداد لنقل الشرائح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان غسالات الفولاذ المقاوم للصدأ ، مع بأقطار داخلية من 4 ملم ، في طبق من البلاستيك مملوءة المتوسطة RPMI كاملة. وسيتم استخدام غسالات مزيد من التركيز على الخلايا على شريحة قطع vibratome. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التضحية الماوس وفقا للوائح المحلية الرفق بالحيوان. إزالة بعناية الغدد الليمفاوية الطرفية من الأنسجة المحيطة بها ووضعها في صحن من البلاستيك تحتوي على الجليد الباردة برنامج تلفزيوني. ويجب الحرص على عدم الاضرار بنية العقدة الليمفاوية ، وهذه الأجهزة هي لينة جدا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صب 4 ٪ ، agarose هلام في طبق بلاستيكي 35 ملم ونقل بدقة العقد الى هلام. مغادرة agarose هلام على الجليد لمدة 5 دقائق لتتصلب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة كتلة من الطبق وتقليم آغار من أجل ترك 3-5 ملم من الجل حول كل العقدة الليمفاوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نعلق العقد جزءا لا يتجزأ من على القرص عينة من الأنسجة vibratome مع الغراء غير سامة. تثبيت القرص العينة في علبة مليئة الجليد الباردة برنامج تلفزيوني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> القسم جزءا لا يتجزأ من نسيج أغار على سماكة 320 ميكرون مع سرعة vibratome مجموعة على مجموعة بطيئا (0.3 مم / ثا) وتواتر الاهتزاز تعيين على المدى المتوسط ​​(1.5 ملم). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل بعناية شرائح العقدة الليمفاوية كما يجري قطعوا يدرج على ثقافة عضوي النمط باستخدام الملقط الغرامة. 3 شرائح مكان على كل إدراج. استخدام عناية كبيرة كما يمكن أن شرائح تلف بسهولة. سوف نموذجي العقدة الليمفاوية الطرفية العائد 5 أقسام عندما قطع في 320 ميكرون. تجاهل الشرائح الأولى والأخيرة ، لأنها تحتوي فقط على الأنسجة السطحية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان غسالات الفولاذ المقاوم للصدأ على كل شريحة على حدة. تأكد من وضع جيد غسالات على agarose المحيطة الأنسجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لوحة احتضان الثقافة في 37 درجة مئوية في حاضنة 5 ٪ CO 2 مرطب حتى جاهزة للخلايا T لوحة. </li></ol> 2. عزل خلايا تي من الغدد الليمفاوية الماوس <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عزل خلايا T وفقا للمادة 3 إن الرب المنشورة سابقا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام الخلايا التائية فورا والشروع في المقطع التالي. خلاف ذلك ، قد يكون مثقف الخلايا الليمفاوية بين عشية وضحاها في إكمال RPMI المتوسطة تستكمل مع 10 نانوغرام / مل IL - 7. </li></ol> 3. توسيم الخلايا التائية معزولة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الخلايا في HBSS. Resuspend لهم في المنطقة العازلة نفسها في 10 6 10 س في مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة نفس الحجم من HBSS يحتوي على 1 ميكرومتر المقتفي الخلية الخضراء CMFDA إعطاء تركيز النهائي من 0.5 ميكرومتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان تعليق خلية عند 37 درجة مئوية خلال 5 دقائق. تغسل مرتين مع خلايا كاملة RPMI المتوسط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend الخلايا بتركيز نهائي من 10 6 10 س في مل في إكمال RPMI المتوسط. وسيتم مطلي هذه الخلايا المسمى على الشرائح. </li></ol> قد تستخدم الأصباغ الفلورية الأخرى من CMFDA جدا ، ولكن نأخذ في الاعتبار أن هذه الجزيئات يمكن أن تكون سامة فوق تركيزات معينة. 4. طلاء الخلايا التائية المسمى على شرائح العقدة الليمفاوية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الزائدة المتوسطة الواردة في الجزء الداخلي من غسالة مع ماصة. لا تسمح لتصبح الأنسجة الجافة ، والعمل سريعا من خلال هذه الخطوة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الاستغناء بلطف 10-20 خلايا T ميكرولتر المسمى الذي يطابق إلى 1 ل2 × 5 10 الخلايا في الجزء الداخلي من غسالة. ويجب الحرص على عدم لمس الأنسجة مع غيض من ماصة. تأكد من أن قطرة من تعليق الخلية يبقى في مكانه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان شرائح مع الخلايا في الحاضنة عند 37 درجة مئوية و 5 ٪ CO 2 على الأقل 30 دقيقة للسماح للهجرة الخلايا الليمفاوية في الأنسجة. </li></ol> 5. التصوير داخل الخلايا التائية شرائح العقدة الليمفاوية في هذه المقالة عن طريق الفيديو ، ونحن خلايا T الفلورية في صورة شرائح العقدة الليمفاوية تحت المجهر widefield مقلوب ومبائر المجهر تستقيم. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضبط درجة الحرارة عند 37 درجة مئوية. المجاهر مجهزة لدينا مع درجة الحرارة التي تسيطر عليها الغرف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تثبيت نظام نضح نضح تمكين المستمر لشريحة العقدة الليمفاوية مع (5 ٪ CO 2 ، 95 ٪ O 2) الفينول الاوكسيجين المتوسطة RPMI الحمراء الخالية. في نظامنا ، ووسائل الإعلام perfused يدخل الى غرفة التصوير من جانب واحد عن طريق الجاذبية. ويستنشق المتوسط ​​مع مضخة متصلة جمع النفايات القارورة. ضبط معدل تدفق وسائل الاعلام الى 1 مل / دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملقط مع الغرامة ، واتخاذ بدقة من شريحة من لوحة 6 - جيدا وتراجع في إعداد حرارة متوسطة RPMI الاوكسيجين لبضع ثوان للتخلص من الخلايا الفلورسنت لا تسللوا إلى الأنسجة. </li></ol> IMAجينج الخلايا التائية مع المجهر واسعة المجال المقلوب <ol start="4" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع شريحة رأسا على عقب على غرفة مخصصة التصوير الصنع التي تتكون من خيوط النايلون لصقها على الجزء الداخلي من وعاء زجاجي القاع. في هذه القاعة ، وخيوط النايلون رفع شريحة من الزجاج ، وتمكين الحل لنزع فتيل الاوكسيجين في الأنسجة. هذا أمر مطلوب والهجرة تي خلية في الغدد الليمفاوية وتعتمد بشدة على الأوكسجين. تأمين شريحة بإضافة على أنه غسالة الفولاذ المقاوم للصدأ. في ظل هذه الظروف ، فإن شريحة تقع بضعة ميكرونات فوق قاع الطبق ، مما يسهل تجديد حل الارواء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للقبض على حقل كبير للعرض (800 × 800 ميكرون ، ما يقرب من ثلث مساحة شريحة العقدة) ، وجمع الصور باستخدام عدسات 10X الهدف الجافة. وجدنا أن 10X نيكون S ثر 0.5 NA كان الأكثر ملاءمة لتحليلاتنا. </li></ol> تجربة نموذجية الوقت الفاصل بين التصوير تلتقط 5 طائرات البصرية التي تمتد على عمق ما مجموعه 50 ميكرومتر في البعد (ض) المحوري. يتم تصويرها عادة الفلورسنت الخلايا التائية على فترات تتراوح بين 10-30 ثانية خلال 10-20 دقيقة. تصوير الخلايا التائية مع المجهر تستقيم مبائر المجهر مبائر المستخدمة في هذا البروتوكول هو SP5 ايكا مجهزة الهدف مياه الغمر 20X (أوليمبوس ، 20x/0.95 NA). <ol start="6" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تأمين شريحة إلى مرحلة التصوير من المجهر. ملاحظة : نحن نضع عادة غسالة على إعداد لشل حركة عليه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعيين جلسة التصوير عن طريق جمع سلسلة من الصور على طول المحور z. صورة لخلايا تي في بنية الأنسجة سليمة ، يتم تعيين وعادة ما تبدأ في موقف 5-10 ميكرون أسفل الخلية الأولى المسماة تي. </li></ol> 6. ممثل النتائج باتباع هذا الفيديو البروتوكول ينبغي أن تتوقع أن تصور عدد كبير من الخلايا التائية الفلورسنت المتراكمة في منطقة T من العقدة ، وهي الظاهرة التي تحدث عادة في هذه البيئة ولا سيما في الجسم الحي (الشكل 1). على وجه الخصوص ، ينبغي استبعاد الخلايا التائية من مناطق الخلية B ، والتي عادة ما تكون فقط تحت الكبسولة. وهناك تجربة ناجحة نتيجة أيضا في الخلايا التائية تجنيدهم في الأنسجة (الشكل 2) ، وعرض السلوك متحركة عالية (الشكل 3) بما يتفق مع النتائج المنشورة التي تم الحصول عليها في العقد اللمفاوية سليمة 4. في المتوسط ​​، يجب أن يعني السرعة من الخلايا التائية الفردية داخل شرائح تكون قريبة إلى 10 ميكرون / دقيقة (الشكل 4). <img src="/files/ftp_upload/3054/3054fig1.jpg" alt="الشكل 1"/> الشكل 1. تتراكم الخلايا التائية الليمفاوية في شريحة العقدة. أضيفت Fluorescently المسمى خلايا T (CMFDA ، الأخضر) إلى 30 دقيقة العقدة الليمفاوية شريحة قبل الحصول على الصور (صورة أعلى). كانت الصورة الإسقاط أقصى 5 ميكرون الصور التي تغطي 50 في اتجاه ض. يظهر صورة مشرقة في الحقل السفلي. والتقاط الصور مع المجهر widefield. <img src="/files/ftp_upload/3054/3054fig2.jpg" alt="الشكل 2"/> الشكل 2. ويتم تجنيد الخلايا اللمفية تي في شريحة العقدة. أضيفت Fluorescently المسمى خلايا T (CMFDA ، الأخضر) إلى 30 دقيقة العقدة الليمفاوية شريحة قبل الحصول على الصور باستخدام المجهر مبائر. والتقاط الصور على سطح قطع (صورة أعلى) و 40 ميكرومتر أدناه (صورة القاع). <img src="/files/ftp_upload/3054/3054fig3.jpg" alt="الشكل 3"/> الشكل 3. الخلايا التائية هي متحركة عالية ضمن شريحة عقدة الليمفاوية ، وتم تصوير الخلايا التائية التي تحمل علامات Fluorescently خلال 12 دقيقة باستخدام المجهر widefield. يتم عرض المسارات من الخلايا التائية المسارات الفردية وترميز الألوان لتمثيل النزوح المتزايد من الأزرق (خلايا متحركة منخفض) إلى (خلايا متحركة عالية) الحمراء. حسبت المسارات باستخدام برنامج Imaris. الخط الأبيض يلي حافة عقدة ، في حين أن يحد البيضاوي متقطع الخلية المفترضة B المنطقة. <img src="/files/ftp_upload/3054/3054fig4.jpg" alt="الشكل 4"/> الشكل 4. غضون الليمفاوية شريحة عقدة ، وسرعة الخلايا التائية ، على مقربة من 10 ميكرون / دقيقة. حسبت بسرعة باستخدام البرمجيات Imaris من المسارات ممثلة في الشكل 3.

<ol>
	<li>Asperti-Boursin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CCR7+ligands+control+basal+T+cell+motility+within+lymph+node+slices+in+a+phosphoinositide+3-kinase-independent+manner.">CCR7 ligands control basal T cell motility within lymph node slices in a phosphoinositide 3-kinase-independent manner.</a> J Exp Med. 204, 1167-1167 (2007).</li><li>Bhakta, N. R., Oh, D. Y., Lewis, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+oscillations+regulate+thymocyte+motility+during+positive+selection+in+the+three-dimensional+thymic+environment.">Calcium oscillations regulate thymocyte motility during positive selection in the three-dimensional thymic environment.</a> Nat Immunol. 6, 143-143 (2005).</li><li>Matheu, M. P., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+CD4++T+cells+from+mouse+lymph+nodes+using+Miltenyi+MACS+purification.">Isolation of CD4+ T cells from mouse lymph nodes using Miltenyi MACS purification.</a> J Vis Exp. , (2007).</li><li>Miller, M. J., Wei, S. H., Parker, I., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+imaging+of+lymphocyte+motility+and+antigen+response+in+intact+lymph+node.">Two-photon imaging of lymphocyte motility and antigen response in intact lymph node.</a> Science. 296, 1869-1869 (2002).</li><li>Ehrlich, L. I., Oh, D. Y., Weissman, I. L., Lewis, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+contribution+of+chemotaxis+and+substrate+restriction+to+segregation+of+immature+and+mature+thymocytes.">Differential contribution of chemotaxis and substrate restriction to segregation of immature and mature thymocytes.</a> Immunity. 31, 986-986 (2009).</li><li>Gollmer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CCL21+mediates+CD4++T-cell+costimulation+via+a+DOCK2/Rac-dependent+pathway.">CCL21 mediates CD4+ T-cell costimulation via a DOCK2/Rac-dependent pathway.</a> Blood. 114, 580-580 (2009).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

وقد وصفت لدينا مباشرة ، وتقنية سريعة وقوية لتوليد شرائح العقدة الليمفاوية ، والتي تستخدم للتحقيق في سلوك الخلايا التائية قدم. في السنوات الأخيرة ، وقد تم تطبيق هذه الطريقة بنجاح باستخدام التوتة وشرائح العقدة الليمفاوية لتحديد العوامل خارج الخلية السيطرة على الخلية وتحديد المواقع تي 1،5 حركية. كما تم استخدامه لقياس الكالسيوم 2 + الردود في أثناء اختيار thymocytes إيجابية في الخلايا التائية وعند الاعتراف مستضد 2،6. وفحص شريحة تراكب يقدم مزايا والقيود التي تستحق أن تناقش. من الملاحظة ، وهذا النظام يسمح بالوصول إلى الأنسجة ، مفيدة إذا كان أحد يحتاج إلى معالجة شرائح عقاقيري من أجل التدخل في مكافحة الهجرة الجزيئي للخلايا. بعد التصوير ، ويمكن معالجة المناعية للشرائح لجمع مزيد من المعلومات عن الهياكل التي تم تصويرها. وعلاوة على ذلك ، يمكن إجراء المراقبة مع المجهر مضان widefield التقليدية. رغم ان القرار ليست جيدة كما مع مبائر أو مجهر ثنائي الفوتون ، وأنه من حيث المبدأ الضيائية أكثر شدة مع فوتون واحد من اثنين مع المجهري الفوتون ، لها مزايا البساطة ، وأقل تكلفة ، وأكبر الاختيار موجات من الإثارة. التصوير من خلايا تي في العقدة الليمفاوية سليمة يتطلب الحقن في الوريد من الخلايا الليمفاوية المسمى ذلك المنزل في وقت لاحق إلى الأجهزة اللمفاوية. كما بينا سابقا 1 ، وفحص شريحة متوافقة تماما مع تجربة نقل بالتبني. ومع ذلك ، يمكن لطول الفترة الزمنية اللازمة للخلايا T إلى منزل في الغدد الليمفاوية تعقيد استخدام الأصباغ الفلورية التي لديها ميل إلى تسرب الخلايا مع مرور الوقت. هذا هو حال كا 2 + صبغ fura - 2. مع توظيف سريع (&lt;30 دقيقة) من خلايا تي في النسيج ، وفحص شريحة يوفر فرصة لاستخدام هذه الأصباغ. أخيرا ، فإن هذا الأسلوب له ميزة كبيرة لتحليل وظائف الخلية تي في الأنسجة البشرية عدة أبقى على قيد الحياة. ويعرض هذا النظام التجريبي أيضا القيود التي تحتاج إلى أن توضع في الاعتبار. قد يؤدي إلى تلف المرتبطة تشريح تؤثر T أداء الخلية ، وخصوصا في المنطقة السطحية من الأنسجة بالقرب من سطح قطع. من أجل تقييم موت الخلايا داخل شريحة ، وقد استخدمنا الفلورية الخضراء SYTOX الصبغة التي تخترق خلايا غشاء البلازما مع خطر. تجاربنا التي كانت تكشف عن fluorescently المسمى حوالي 20 ٪ من مجموع الخلايا العقدية ، مترجمة في معظمها في المنطقة السطحية من الأنسجة ، وهذه الصبغة النووية. قلق آخر محتمل مع مقايسة هو قدرة الشرائح على الاحتفاظ بما في ذلك العوامل الهامة للذوبان chemokines. على الرغم من أنه ليس لدينا أي دليل على أن تأثرت البيانات المتوفرة لدينا من مشاكل من هذا النوع منذ الخلايا التائية عرض حركية جيدة داخل شريحة ، نود أن نؤكد على أهمية الخلايا T التصوير في المناطق الصحية التي تقع في عشرات ميكرون من سطح قطع. في حين ، ويمكن القيام بذلك مع المجاهر التقليدية (أو widefield مبائر) في مثل هذا البروتوكول ، فمن المرجح أن شريحة العقدة الليمفاوية إعداد مجتمعة مع اثنين من الفوتون التصوير سوف يزيد من عمق في التحليل المكاني والحد من الضيائية.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> اسم كاشف </th><th> شركة </th><th> فهرس العدد </th><th> تعليقات (اختياري) </th></tr><tr><td> مبائر المجهر </td><td> لايكا </td><td> SP5 </td><td></td></tr><tr><td> Vibratome </td><td> لايكا </td><td> VT1200S </td><td></td></tr><tr><td> غرامة الملقط </td><td> العالم آلات دقيقة </td><td> 14142 </td><td></td></tr><tr><td> 30 ملم إدراج الثقافة </td><td> ميليبور </td><td> PICM0RG50 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI </td><td> Invitrogen </td><td> 61870010 </td><td> إكمال RPMI المتوسطة يتم من خلال إضافة 10 ٪ للحرارة المعطل الجنين مصل العجل والبنسلين / الستربتوميسين </td></tr><tr><td> هانكس &quot;محلول الملح المتوازن (HBSS) </td><td> Invitrogen </td><td> 14170088 </td><td></td></tr><tr><td> انخفاض درجة الحرارة التبلور Agarose ، اكتب السابع - A </td><td> سيغما الدريخ </td><td> A0701 </td><td></td></tr><tr><td> بوتيل Cyanoacrylate غراء ، Vetbond </td><td> 3M </td><td> 1469 </td><td></td></tr><tr><td> غسالات الفولاذ المقاوم للصدأ ، و 4 ملم القطر الداخلي </td><td> DIY تخزين </td><td></td><td></td></tr><tr><td> المقتفي الخلية الخضراء CMFDA </td><td> Invitrogen </td><td> C7025 </td><td></td></tr></tbody></table>

ex vivo imaging of t cells in murine lymph node slices with widefield and confocal microscopes

الخلايا التائية السذاجة المرور بشكل مستمر لأجهزة اللمفاوية الثانوية ، بما في ذلك الغدد الليمفاوية الطرفية ، لكشف المستضدات النادرة التي أعرب عنها. الهجرة من خلايا تي في الغدد الليمفاوية هو عملية معقدة تنطوي العوامل الخلوية والكيميائية بما في ذلك chemokines. في الآونة الأخيرة ، سمح استخدام اثنين من الفوتون المجهري لتعقب الخلايا التائية في الغدد الليمفاوية وسليمة للحصول على بعض المعلومات الكمية على سلوكهم وتفاعلها مع الخلايا الأخرى. في حين أن هناك مزايا واضحة الى النظام في الجسم الحي ، وهذا النهج يتطلب أجهزة معقدة ومكلفة ، ويوفر فرص محدودة في الأنسجة. لتحليل سلوك الخلايا التائية داخل الغدد الليمفاوية الفئران ، وضعنا مقايسة شريحة 1 ، وضعه في الأصل من قبل علماء بيولوجيا الأعصاب ونقلها مؤخرا إلى التوتة الفئران 2. في هذه التقنية ، يتم مطلي الخلايا التائية fluorescently المسمى على أعلى شريحة العقدة اللمفية مستعدة تماما. في هذه المقالة عن طريق الفيديو ، ويتم تحليل والتوطين والهجرة من خلايا تي في الأنسجة في الوقت الحقيقي مع widefield ومبائر المجهر. الأسلوب الذي يكمل في الجسم الحي اثنين الفوتون المجهري يقدم نهجا فعالا لخلايا T صورة في بيئتها الطبيعية ، وتوضيح الآليات الكامنة وراء الهجرة تي الخلية.

Watch this Scientific Journal Video about Ex vivo Imaging of T Cells in Murine Lymph Node Slices with Widefield and Confocal Microscopes at JoVE.com

Ex vivo Imaging of T Cells in Murine Lymph Node Slices with Widefield and Confocal Microscopes

يصف هذا البروتوكول وسيلة لخلايا T الفلورسنت عرض الصور الى شرائح العقدة الليمفاوية. هذه التقنية تسمح في الوقت الحقيقي والتحليلات للهجرة الخلايا التائية مع مضان widefield التقليدية أو المجاهر مبائر.

التصوير خارج الحي من خلايا تي في الفئران شرائح العقدة الليمفاوية مع Widefield ومجاهر متحد البؤر

Na&iuml;ve T cells continuously traffic to secondary lymphoid organs, including peripheral lymph nodes, to detect rare expressed antigens. The migration ...

ex-vivo-imaging-t-cells-murine-lymph-node-slices-with-widefield

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Ex vivo Imaging of T Cells in Murine Lymph Node Slices with Widefield and Confocal Microscopes

16.7K Views.  Université Paris Descartes, CNRS (UMR 8104). يصف هذا البروتوكول وسيلة لخلايا T الفلورسنت عرض الصور الى شرائح العقدة الليمفاوية. هذه التقنية تسمح في الوقت الحقيقي والتحليلات للهجرة الخلايا التائية مع مضان widefield التقليدية أو المجاهر مبائر.

Video: Ex vivo Imaging of T Cells in Murine Lymph Node Slices with Widefield and Confocal Microscopes

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen presenting cells (APCs)1. This recognition leads to the activation of T-cells and a series of functional outcomes (e.g. cytokine production, killing of the target cells). Understanding the functional role of TCRs is critical to harness the power of the immune system to treat a variety of immunology related diseases (e.g. cancer or autoimmunity).
It is convenient to study TCRs in mouse models, which can be accomplished in several ways. Making TCR transgenic mouse models is costly and time-consuming and currently there are only a limited number of them available2-4. Alternatively, mice with antigen-specific T-cells can be generated by bone marrow chimera. This method also takes several weeks and requires expertise5. Retroviral transduction of TCRs into in vitro activated mouse T-cells is a quick and relatively easy method to obtain T-cells of desired peptide-MHC specificity. Antigen-specific T-cells can be generated in one week and used in any downstream applications. Studying transduced T-cells also has direct application to human immunotherapy, as adoptive transfer of human T-cells transduced with antigen-specific TCRs is an emerging strategy for cancer treatment6.
Here we present a protocol to retrovirally transduce TCRs into in vitro activated mouse T-cells. Both human and mouse TCR genes can be used. Retroviruses carrying specific TCR genes are generated and used to infect mouse T-cells activated with anti-CD3 and anti-CD28 antibodies. After in vitro expansion, transduced T-cells are analyzed by flow cytometry.

We present a protocol to produce antigen-specific mouse T-cells using retroviral transduction

تنبيغ من فيروسات تي خلية المستقبلات في الخلايا التائية ماوس

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Intravital Microscopy of the Inguinal Lymph Node

Lymph nodes (LN's), located throughout the body, are an integral component of the immune system. They serve as a site for induction of adaptive immune response and therefore, the development of effector cells. As such, LNs are key to fighting invading pathogens and maintaining health. The choice of LN to study is dictated by accessibility and the desired model; the inguinal lymph node is well situated and easily supports studies of biologically relevant models of skin and genital mucosal infection.
The inguinal LN, like all LNs, has an extensive microvascular network supplying it with blood. In general, this microvascular network includes the main feed arteriole of the LN that subsequently branches and feeds high endothelial venules (HEVs). HEVs are specialized for facilitating the trafficking of immune cells into the LN during both homeostasis and infection. How HEVs regulate trafficking into the LN under both of these circumstances is an area of intense exploration. The LN feed arteriole, has direct upstream influence on the HEVs and is the main supply of nutrients and cell rich blood into the LN. Furthermore, changes in the feed arteriole are implicated in facilitating induction of adaptive immune response. The LN microvasculature has obvious importance in maintaining an optimal blood supply to the LN and regulating immune cell influx into the LN, which are crucial elements in proper LN function and subsequently immune response. 
The ability to study the LN microvasculature in vivo is key to elucidating how the immune system and the microvasculature interact and influence one another within the LN. Here, we present a method for in vivo imaging of the inguinal lymph node. We focus on imaging of the microvasculature of the LN, paying particular attention to methods that ensure the study of healthy vessels, the ability to maintain imaging of viable vessels over a number of hours, and quantification of vessel magnitude. Methods for perfusion of the microvasculature with vasoactive drugs as well as the potential to trace and quantify cellular traffic are also presented. 
Intravital microscopy of the inguinal LN allows direct evaluation of microvascular functionality and real-time interface of the direct interface between immune cells, the LN, and the microcirculation. This technique potential to be combined with many immunological techniques and fluorescent cell labelling as well as manipulated to study vasculature of other LNs.

A technique for performing intravital microscopy of the inguinal lymph node (LN) is outlined. Such technique allows for real-time, in vivo study of the lymph node microvasculature and structure both during homeostasis and infection. This technique can be adapted to cell trafficking studies and to other lymph node sites.

Intravital الميكروسكوب من العقدة الليمفاوية الأربي

Lymph nodes (LN's), located throughout the body, are an integral component of the immune system. They serve as a site for induction of adaptive immune ...

Murine Superficial Lymph Node Surgery

In the field of immunology, to understand the progression of an immune response against a vaccine, an infection or a tumour, the response is often followed over time. Similarly, the study of lymphocyte homeostasis requires time course experiments. Performing these studies within the same mouse is ideal to reduce the experimental variability as well as the number of mice used. Blood withdrawal allows performance of time course experiments, but it only gives information about circulating lymphocytes and provides a limited number of cells1-4. Since lymphocytes circulating through the body and residing in the lymph nodes have different properties, it is important to examine both locations. The sequential removal of lymph nodes by surgery provides a unique opportunity to follow an immune response or immune cell expansion in the same mouse over time. Furthermore, this technique yields between 1-2x106 cells per lymph node which is sufficient to perform phenotypic characterization and/or functional assays. Sequential lymph node surgery or lymphadenectomy has been successfully used by us and others5-11. Here, we describe how the brachial and inguinal lymph nodes can be removed by making a small incision in the skin of an anesthetised mouse. Since the surgery is superficial and done rapidly, the mouse recovers very quickly, heals well and does not experience excessive pain. Every second day, it is possible to harvest one or two lymph nodes allowing for time course experiments. This technique is thus suitable to study the characteristics of lymph node-residing lymphocytes over time. This approach is suitable to various experimental designs and we believe that many laboratories would benefit from performing sequential lymph node surgeries.

To follow the progression of an immune response over time within the same mouse, lymph nodes can be sequentially removed by surgery. Here, we describe how this technique can be performed.

الفئران عقدة اللمفاوية السطحية جراحة

In the field of immunology, to understand the progression of an immune response against a vaccine, an infection or a tumour, the response is often ...

Intravital Imaging of the Mouse Popliteal Lymph Node

Lymph nodes (LNs) are secondary lymphoid organs, which are strategically located throughout the body to allow for trapping and presentation of foreign antigens from peripheral tissues to prime the adaptive immune response. Juxtaposed between innate and adaptive immune responses, the LN is an ideal site to study immune cell interactions1,2. Lymphocytes (T cells, B cells and NK cells), dendritic cells (DCs), and macrophages comprise the bulk of bone marrow-derived cellular elements of the LN. These cells are strategically positioned in the LN to allow efficient surveillance of self antigens and potential foreign antigens3-5. The process by which lymphocytes successfully encounter cognate antigens is a subject of intense investigation in recent years, and involves an integration of molecular contacts including antigen receptors, adhesion molecules, chemokines, and stromal structures such as the fibro-reticular network2,6-12. 
Prior to the development of high-resolution real-time fluorescent in vivo imaging, investigators relied on static imaging, which only offers answers regarding morphology, position, and architecture. While these questions are fundamental in our understanding of immune cell behavior, the limitations intrinsic with this technique does not permit analysis to decipher lymphocyte trafficking and environmental clues that affect dynamic cell behavior. Recently, the development of intravital two-photon laser scanning microscopy (2P-LSM) has allowed investigators to view the dynamic movements and interactions of individual cells within live LNs in situ12-16. In particular, we and others have applied this technique to image cellular behavior and interactions within the popliteal LN, where its compact, dense nature offers the advantage of multiplex data acquisition over a large tissue area with diverse tissue sub-structures11,17-18. It is important to note that this technique offers added benefits over explanted tissue imaging techniques, which require disruption of blood, lymph flow, and ultimately the cellular dynamics of the system. Additionally, explanted tissues have a very limited window of time in which the tissue remains viable for imaging after explant. With proper hydration and monitoring of the animal's environmental conditions, the imaging time can be significantly extended with this intravital technique. Here, we present a detailed method of preparing mouse popliteal LN for the purpose of performing intravital imaging.

Recent advances in 2-photon microscopy have enabled real-time in situ imaging of live tissues in animal models, thereby enhancing our ability to investigate cellular behavior in both physiologic and pathologic conditions. Here, we outline the preparations required to perform intravital imaging of the mouse popliteal lymph node.

Intravital التصوير من العقدة اللمفية الفأر المأبضية

Lymph nodes (LNs) are secondary lymphoid organs, which are strategically located throughout the body to allow for trapping and presentation of foreign ...

Generation of Lymph Node-fat Pad Chimeras for the Study of Lymph Node Stromal Cell Origin

The stroma is a key component of the lymph node structure and function. However, little is known about its origin, exact cellular composition and the mechanisms governing its formation. Lymph nodes are always encapsulated in adipose tissue and we recently demonstrated the importance of this relation for the formation of lymph node stroma. Adipocyte precursor cells migrate into the lymph node during its development and upon engagement of the Lymphotoxin-b receptor switch off adipogenesis and differentiate into lymphoid stromal cells (B&#233;n&#233;zech&#160;et al.14). Based on the lymphoid stroma potential of adipose tissue, we present a method using a lymph node/fat pad chimera that allows the lineage tracing of lymph node stromal cell precursors. We show how to isolate newborn lymph nodes and EYFP+ embryonic adipose tissue and make a LN/ EYFP+ fat pad chimera. After transfer under the kidney capsule of a host mouse, the lymph node incorporates local adipose tissue precursor cells and finishes its formation. Progeny analysis of EYFP+ fat pad cells in the resulting lymph nodes can be performed by flow-cytometric analysis of enzymatically digested lymph nodes or by immunofluorescence analysis of lymph nodes cryosections. By using fat pads from different knockout mouse models, this method will provide an efficient way of analyzing the origin of the different lymph node stromal cell populations.

Generation of lymph node/fat pad chimeras for the study of lymph node stromal cell origin is described. The method involves the isolation of lymph nodes from newborn mice and embryonic fat pads, the generation of chimeric lymph node-fat pads, and their transfer under the kidney capsule of a host mouse.

جيل من العقدة الليمفاوية الدسم سادة الوهم لدراسة العقدة الليمفاوية اللحمية خلية المنشأ

The stroma is a key component of the lymph node structure and function. However, little is known about its origin, exact cellular composition and the ...

Isolation of Murine Lymph Node Stromal Cells

Secondary lymphoid organs including lymph nodes are composed of stromal cells that provide a structural environment for homeostasis, activation and differentiation of lymphocytes. Various stromal cell subsets have been identified by the expression of the adhesion molecule CD31 and glycoprotein podoplanin (gp38), T zone reticular cells or fibroblastic reticular cells, lymphatic endothelial cells, blood endothelial cells and FRC-like pericytes within the double negative cell population. For all populations different functions are described including, separation and lining of different compartments, attraction of and interaction with different cell types, filtration of the draining fluidics and contraction of the lymphatic vessels. In the last years, different groups have described an additional role of stromal cells in orchestrating and regulating cytotoxic T cell responses potentially dangerous for the host. 
Lymph nodes are complex structures with many different cell types and therefore require a appropriate procedure for isolation of the desired cell populations. Currently, protocols for the isolation of lymph node stromal cells rely on enzymatic digestion with varying incubation times; however, stromal cells and their surface molecules are sensitive to these enzymes, which results in loss of surface marker expression and cell death. Here a short enzymatic digestion protocol combined with automated mechanical disruption to obtain viable single cells suspension of lymph node stromal cells maintaining their surface molecule expression is proposed.

Isolation of lymph node stromal cells is a multistep procedure including enzymatic digestion and mechanical disaggregation to obtain fibroblastic reticular cells, lymphatic and blood endothelial cells. In the described procedure, a short digestion is combined with automated mechanical disaggregation to minimize surface marker degradation of viable lymph node stromal cells.

عزل خلايا الفئران العقدة الليمفاوية اللحمية

Secondary lymphoid organs including lymph nodes are composed of stromal cells that provide a structural environment for homeostasis, activation and ...

An Ex vivo Model of an Oligodendrocyte-directed T-Cell Attack in Acute Brain Slices

Death of oligodendrocytes accompanied by destruction of neurons and axons are typical histopathological findings in cortical and subcortical grey matter lesions in inflammatory demyelinating disorders like multiple sclerosis (MS). In these disorders, mainly CD8+ T-cells of putative specificity for myelin- and oligodendrocyte-related antigens are found, so that neuronal apoptosis in grey matter lesions may be a collateral effect of these cells. Different types of animal models are established to study the underlying mechanisms of the mentioned pathophysiological processes. However, although they mimic some aspects of MS, it is impossible to dissect the exact mechanism and time course of &#8216;&#8216;collateral&#8217;&#8217; neuronal cell death. To address this course, here we show a protocol to study the mechanisms and time response of neuronal damage following an oligodendrocyte-directed CD8+ T cell attack. To target only the myelin sheath and the oligodendrocytes, in vitro activated oligodendrocyte-specific CD8+ T-cells are transferred into acutely isolated brain slices. After a defined incubation period, myelin and neuronal damage can be analysed in different regions of interest. Potential applications and limitations of this model will be discussed.

An Ex vivo Model of an Oligodendrocyte-directed T-Cell Attack in Acute Brain Slices

To address mechanisms of demyelination and neuronal apoptosis in cortical lesions of inflammatory demyelinating disorders, different animal models are used. We here describe an ex vivo approach by using oligodendrocyte-specific CD8+ T-cells on brain slices, resulting in oligodendroglial and neuronal death. Potential applications and limitations of the model are discussed.

ل<em&gt; السابقين فيفو</em&gt; نموذج لهجوم T-خلية الموجه دبقية قليلة التغصن في الدماغ الحادة شرائح

Death of oligodendrocytes accompanied by destruction of neurons and axons are typical histopathological findings in cortical and subcortical grey matter ...

Ex Vivo Infection of Murine Epidermis with Herpes Simplex Virus Type 1

To enter its human host, herpes simplex virus type 1 (HSV-1) must overcome the barrier of mucosal surfaces, skin, or cornea. HSV-1 targets keratinocytes during initial entry and establishes a primary infection in the epithelium, which is followed by latent infection of neurons. After reactivation, viruses can become evident at mucocutaneous sites that appear as skin vesicles or mucosal ulcers. How HSV-1 invades skin or mucosa and reaches its receptors is poorly understood. To investigate the invasion route of HSV-1 into epidermal tissue at the cellular level, we established an ex vivo infection model of murine epidermis, which represents the site of primary and recurrent infection in skin. The assay includes the preparation of murine skin. The epidermis is separated from the dermis by dispase II treatment. After floating the epidermal sheets on virus-containing medium, the tissue is fixed and infection can be visualized at various times postinfection by staining infected cells with an antibody against the HSV-1 immediate early protein ICP0. ICP0-expressing cells can be observed in the basal keratinocyte layer already at 1.5 hr postinfection. With longer infection times, infected cells are detected in suprabasal layers, indicating that infection is not restricted to the basal keratinocytes, but the virus spreads to other layers in the tissue. Using epidermal sheets of various mouse models, the infection protocol allows determining the involvement of cellular components that contribute to HSV-1 invasion into tissue. In addition, the assay is suitable to test inhibitors in tissue that interfere with the initial entry steps, cell-to-cell spread and virus production. Here, we describe the ex vivo infection protocol in detail and present our results using nectin-1- or HVEM-deficient mice.

Ex Vivo Infection of Murine Epidermis with Herpes Simplex Virus Type 1

The skin is one target tissue of the human pathogen herpes simplex virus type 1 (HSV-1). To explore the invasion route of HSV-1 into tissue, we established an ex vivo infection model of murine epidermal sheets which represent the outermost layer of skin.

العدوى فيفو السابقين الفئران البشرة مع فيروس الهربس البسيط من النوع 1

To enter its human host, herpes simplex virus type 1 (HSV-1) must overcome the barrier of mucosal surfaces, skin, or cornea. HSV-1 targets keratinocytes ...

Isolation and Ex Vivo Culture of V&#948;1+CD4+&#947;&#948; T Cells, an Extrathymic &#945;&#946;T-cell Progenitor

The thymus, the primary organ for the generation of &#945;&#946; T cells and backbone of the adaptive immune system in vertebrates, has long been considered as the only source of &#945;&#946;T cells. Yet, thymic involution begins early in life leading to a drastically reduced output of na&#239;ve &#945;&#946;T cells into the periphery. Nevertheless, even centenarians can build immunity against newly acquired pathogens. Recent research suggests extrathymic &#945;&#946;T cell development, however our understanding of pathways that may compensate for thymic loss of function are still rudimental. &#947;&#948; T cells are innate lymphocytes that constitute the main T-cell subset in the tissues. We recently ascribed a so far unappreciated outstanding function to a &#947;&#948; T cell subset by showing that the scarce entity of CD4+ V&#948;1+&#947;&#948; T cells can transdifferentiate into &#945;&#946;T cells in inflammatory conditions. Here, we provide the protocol for the isolation of this progenitor from peripheral blood and its subsequent cultivation. V&#948;1 cells are positively enriched from PBMCs of healthy human donors using magnetic beads, followed by a second step wherein we target the scarce fraction of CD4+ cells with a further magnetic labeling technique. The magnetic force of the second labeling exceeds the one of the first magnetic label, and thus allows the efficient, quantitative and specific positive isolation of the population of interest. We then introduce the technique and culture condition required for cloning and efficiently expanding the cells and for identification of the generated clones by FACS analysis. Thus, we provide a detailed protocol for the purification, culture and ex vivo expansion of CD4+ V&#948;1+&#947;&#948; T cells. This knowledge is prerequisite for studies that relate to this &#945;&#946;T cell progenitor`s biology and for those who aim to identify the molecular triggers that are involved in its transdifferentiation.

Isolation and Ex Vivo Culture of V&amp;#948;1+CD4+&amp;#947;&amp;#948; T Cells, an Extrathymic &amp;#945;&amp;#946;T-cell Progenitor

Here, we provide an optimized protocol for the isolation and cloning of the scarce T-cell entity of peripheral V&#948;1+CD4+ T cells that is, as we showed recently, an extrathymic &#945;&#946; T-cell progenitor. This technique allows to quantitatively isolate, clone and efficiently expand these cells in ex vivo culture.

العزلة و<em&gt; السابقين فيفو</em&gt; ثقافة Vδ1<sup&gt; +</sup&gt; CD4<sup&gt; +</sup&gt; خلايا T γδ، وهو Extrathymic αβT خلايا السلف

The thymus, the primary organ for the generation of &#945;&#946; T cells and backbone of the adaptive immune system in vertebrates, has long been ...

Murine Lymphocyte Labeling by 64Cu-Antibody Receptor Targeting for In Vivo Cell Trafficking by PET/CT

This protocol illustrates the production of 64Cu and the chelator conjugation/radiolabeling of a monoclonal antibody (mAb) followed by murine lymphocyte cell culture and 64Cu-antibody receptor targeting of the cells. In vitro evaluation of the radiolabel and non-invasive in vivo cell tracking in an animal model of an airway delayed-type hypersensitivity reaction (DTHR) by PET/CT are described.
In detail, the conjugation of a mAb with the chelator 1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid (DOTA) is shown. Following the production of radioactive 64Cu, radiolabeling of the DOTA-conjugated mAb is described. Next, the expansion of chicken ovalbumin (cOVA)-specific CD4+ interferon (IFN)-&#947;-producing T helper cells (cOVA-TH1) and the subsequent radiolabeling of the cOVA-TH1 cells are depicted. Various in vitro techniques are presented to evaluate the effects of 64Cu-radiolabeling on the cells, such as the determination of cell viability by trypan blue exclusion, the staining for apoptosis with Annexin V for flow cytometry, and the assessment of functionality by IFN-&#947; enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Furthermore, the determination of the radioactive uptake into the cells and the labeling stability are described in detail. This protocol further describes how to perform cell tracking studies in an animal model for an airway DTHR and, therefore, the induction of cOVA-induced acute airway DHTR in BALB/c mice is included. Finally, a robust PET/CT workflow including image acquisition, reconstruction, and analysis is presented.
The 64Cu-antibody receptor targeting approach with subsequent receptor internalization provides high specificity and stability, reduced cellular toxicity, and low efflux rates compared to common PET-tracers for cell labeling, e.g.64Cu-pyruvaldehyde bis(N4-methylthiosemicarbazone) (64Cu-PTSM). Finally, our approach enables non-invasive in vivo cell tracking by PET/CT with an optimal signal-to-background ratio for 48 h. This experimental approach can be transferred to different animal models and cell types with membrane-bound receptors that are internalized.

Murine Lymphocyte Labeling by 64Cu-Antibody Receptor Targeting for In Vivo  Cell Trafficking by PET/CT

Following the preparation of a 64Cu-modified monoclonal antibody binding to a transgenic murine T cell receptor, T cells are radiolabeled in vivo, analyzed for viability, functionality, labeling stability and apoptosis, and adoptively transferred into mice with an airway delayed-type hypersensitivity reaction for non-invasive imaging by positron emission tomography/computed tomography (PET/CT).

الفئران اللمفاويات وسمها من قبل<sup&gt; 64</sup&gt; النحاس والأجسام المضادة مستقبلات استهداف ل<em&gt; في فيفو</em&gt; الاتجار خلية بواسطة PET / ط م

This protocol illustrates the production of 64Cu and the chelator conjugation/radiolabeling of a monoclonal antibody (mAb) followed by murine lymphocyte ...