עבודה זו נתמכת על ידי תרומות של 1R01CA154656 NCI, NIAID 1R21AI092299, לחקר הסרטן במכון, קרן רחוב Baldrick של, דנה קרן, מלאך גבריאל הקרן, ויונדאי מוטורס של אמריקה &quot;תקווה על גלגלים&quot; התוכנית.

1. מחזיק עכבר האסיפה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שכבת כיסוי של צלחת פטרי 100 מ&quot;מ זכוכית על גבי מכסה של 100 מ&quot;מ צלחת פטרי פלסטיק כלפי מטה. זכוכית יש בקושי נוגע נקודת המרכז של צלחת פלסטיק. באמצעות זכוכית כמו סטנסיל, לעקוב אחר סימן על גבי צלחת פלסטיק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש מקדח יד (כלומר Dremel) להסיר חלק המכסה 100 מ&quot;מ צלחת פלסטיק כדי ליצור פלטפורמה בצורת חצי סהר. זה מכסה בצורת חצי סהר פלסטיק תשמש תמיכה עבור הגוף העליון של העכבר (איור 1 א). לקדוח שני חורים על מכסה בצורת חצי סהר להבטיח מסכת גז עם עניבה טוויסט מתכת. לאבטח את מכסה הפלסטיק לקצה צלחת פטרי מזכוכית באמצעות דבק סופר או דבק חזק שקול (1B איור). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הדבק את המכסים של 2 בעל כיפת יתר PCR צינורות (לחתוך את ציר) 1 ס&quot;מ זה מזה למרכז הצלחת התחתונה לצורך עיגון דשי העור popliteal. </li></ol> 2. עכבר הכנה <strong&gt; הערה: בעזרת תרגול מספיק, צריך להיות מסוגל לבצע הכנה העכבר צעדים כירורגית ב 20-30 דקות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את העכבר עם isoflurane (2-2.5% לזירוז, 1.5 עד 2% לניתוח / הדמיה) ונכללה ב 01:01 O 2: תערובת אוויר בקצב זרימת 1L/min באמצעות הליך IACUC המאושרת. לאחר העכבר הוא הרדים, להבטיח מסכת גז על האף עם הקלטת. לקבוע אם העכבר הוא בהרדמה מלאה של חוסר בתגובה אצבע ו / או צובט הזנב. רמת isoflurane עשוי להיות בהתאם כדי להבטיח את בעל החיים הוא מסומם לגמרי, עם קצב קבוע, שאינו עמל הנשימה בין 60-80 נשימות / דקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש גוזם חשמלי להסרת שיער על רגל אחורית ימין באזור מפשעתי של העכבר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להבריש את השיער פזור בעדינות להחיל את המעיל הצנוע של קרם נאיר על אזור מגולח עם מקלון צמר גפן. אחרי דקה אחת של היישום הראשוני, הסר נאיר ולנקות את העור חשוף עם לחהנייר מגבת. ודא העכבר נקי ויבש לפני שתמשיך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעשות חתך קטן 2-3 מ&quot;מ עם מספריים בברך את הזכות לחשוף את הגיד פושטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל Vetbond יחד במרכז מחזיק את העכבר שבו הגוף העכבר הרגל ימוקמו. בזהירות להבטיח את העכבר על בעל, עם ברך ימין למטה, כדי לחשוף את הפוסות popliteal הנכון. להבטיח את גיד הברך הימנית עם Vetbond של בין 2 בעלי דש העור כדי לעזור לייצב את תחום ההדמיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למתוח סרט הזרועות רגל שמאל לפלטפורמה העליונה של בעל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש עניבה טוויסט כדי לאבטח את מסיכת הגז במקום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את בעל תחת מיקרוסקופ לנתיחה. LN חייב להישאר דוממים, ללא תנועה נשימה של העכבר. לכן, יש לנקוט באמצעי זהירות בעת ביצוע ניתוח כדי לייעל את יציבות הרגל. לקבוע את המיקום של הזנב (בדרך כלל מעל לראש), כי תתרום הגדול ביותריציבות ברגל ימין קלטת הזנב למטה. </li></ol> 3. כירורגיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעוד היקף תחת לנתיחה, לשמור על גוף העכבר הטמפרטורה באמצעות תנור חימום או כרית חימום. הדמיה מוצלחת של LN popliteal, חשוב לשמר את חום הגוף הנכונה במהלך הניתוח, כמו גם לשמור על לחות הרקמה על ידי יישום כל הזמן PBS חם לרקמות חשוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחטא את העור בבטאדין. בעזרת מספריים סטריליות, לעשות חתך קו האמצע דרך העור בקצה הימני באמצע השוק, ולהמשיך לחתוך אנכית עד החלק עליון של הירך הימני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעשות שני חתכים אופקיים העור בחלק העליון של קו חתך אנכי ליצור יריעות עור משני הצדדים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחזור בו ולהדביק את שני שולי העור עם Vetbond. מושך את העור מתוח לפני החלת Vetbond יהיה עוד יותר לקדם את היציבות הרגל, אולם לוודא כי מתח העור לא לחסום את זרימת הדם (כלומר שינויים vesseאני צבע או קוטר). ממשיכים את הדבק במקומות אחרים בגוף, כדי להבטיח יציבות של הרגל לפני חשיפת LN. גודלו של העכבר תקבע עד כמה העור הנוסף נדרש דבק למטה. בדרך כלל, עכברים גדולים ידרוש העור יותר להיות דבוק בעל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> LN צריך לשכב בתוך השקע popliteal או ימינה או שמאלה של הווריד popliteal, בהתאם למיקום של העכבר על בעל. בזהירות להפריד LN מרקמות השומן והשרירים הסמוכים באמצעות מיקרו המבתרים פינצטה או מלקחיים. כדי למזער את הדימום טראומה, להשתמש בטכניקות פילוח עם מיקרו לנתח פינצטה לרקמות שונות. בזהירות לחשוף LN popliteal מבלי לסכן את תקינות כלי הדם מביא ו efferent וכלי הלימפה מביא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ליציבות רקמות הוסיף, זכוכית מכסה מרובע עשוי להיות ממוקם מעל LN לח, בקושי נוגע LN תוך הימנעות חסימת כלי הדם. הזכוכית המכסה יכול להיות securאד עם פלסטלינה משני צדי העכבר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צבעי ניאון כלי בגדלים שונים (למשל TRITC-dextran, לפחות 70kDa) יכול להיות מוצג דרך הווריד בשלב זה כדי לעזור להדגיש את מערכת היחסים השלמות המבנית של LN במהלך ההדמיה. </li></ol> 4. 2-Photon הדמיה רכישת ** <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר LN נחשף בצורה נאותה את היציבות מושגת, מיד להעביר את מכלול שלם בעל העכבר על הבמה מיקרוסקופ מצויד בלוק לתכנות משוב טמפרטורת חימום מבוקר בתא מיקרוסקופ הסביבה כל הזמן על 37 ° C. הוסף סטרילית מספיק חמים (37 מעלות צלזיוס) PBS או HBSS לצלול LN. נפח ישתנה בהתאם לגודל והמיקום של העכבר. לחלופין, PBS חם או HBSS ניתן להחיל ישירות LN גזור באמצעות פיפטה כוס בסדר מצויד למשאבה peristaltic והדביקה לעמודה המטרה העדשה טבילה. זרימת הנוזל צריך להיות כךעמודת המים יציבה יכולה להתקיים בין העדשה רקמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשמור על PBS או הטמפרטורה HBSS על 37 מעלות צלזיוס באמצעות כרית חימום עם החללית משוב. בדיקה נפרדת בטמפרטורה צריך להיות ממוקם מחזיק את העכבר כדי לאשר את הטמפרטורה של PBS בטווח של 36.5-37.5 ° C. בדיקה רקטלית יכול לשמש גם כדי לעקוב אחר הטמפרטורה של ליבת הגוף העכבר ניסיוני במהלך הפגישה הדמיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש EPI-מנורת פלורסנט לעזור מיקום מדריך LN תחת המטרה. לרכישת ערימות תמונה ניאון באמצעות מרווחי זמן המתאימים אינטראקציה הסלולרי הרצוי (בדרך כלל 10 שניות עד 1 דקה בין כל ערימה התמונה XYZ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפקח על מצב בעלי החיים בתא מיקרוסקופ לעתים קרובות על ידי בדיקה ויזואלית או באמצעות מערכת ניטור בעלי חיים. לקבוע אם העכבר הוא בהרדמה מלאה של חוסר בתגובה אצבע ו / או צובט ציפורניים, ו יציב, בלתי מאומצת קצב הנשימה בין ב 60-80reaths / דקה. רמת isoflurane עשוי להיות בהתאם על מנת להבטיח כי בעל החיים הוא מסומם לגמרי. עם ניטור נוזלים תקין, בעלי חיים ניתן הדמיה למשך 4-6 שעות, או אולי יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר ניסוי הדמיה, להרדימו בתא 2 CO באמצעות IACUC המאושרת פרוטוקול המתת חסד. בעלי חיים אסור לצאת מן ההרדמה לפני המתת חסד. </li></ol> ** זה הליך כירורגי עשוי להיות שימושית גם עבור סוגים אחרים של הדמיה intravital מלבד LSM-2P. 5. נציג תוצאות תאים חיסוניים שונים במחזור מגויסים כדי LN בקצב שונה בעקבות העברת המאמצת. עבור CD4 + CD8 + ו לימפוציטים, תאים אלה מתחילים להגיע LN דרך גבוהה אנדותל (HEV) ורדיד דקות לאחר העברת הרביעי עם מספרים משמעותיים המגיעים LN popliteal לאחר 2 עד 4 שעות 6,17-18. עבור B cells, מספר לא מבוטל יצטברו לאחר 8 עד 24 שעות 19. DCS הופעל צריך להתחיל להופיע הייבוש popliteal הוזהרו 8 עד 16 שעות לאחר הזרקת 3,11,16-17 שודד דרכים. איור 2 א &#39;עולה כי גם ללא נקודות ציון אחרות, כגון מבנים זקיקי ב התא ניתן להבחין בקלות על ידי הצטברות תא עגול כדורי גלוי תחת 2P-LSM 19. באמצעות כתב ניאון אנדוגני כגון splenocytes היוביקוויטין-GFP (איור 2, סרטונים תוספת 1 ו 2), ניתן לעקוב אחר העברות אלה הלימפוציטים והתנהגויות ימים עד שבוע בתנאים פיזיולוגיים גירוי לא. עם הרב ערוצית גלאי רגישות גבוהה, אפשר לרכוש הדמיה זמנית במערך שכולל מידע מבניים, כמו גם הדינמיקה של אינטראקציה בין בני זוג הסלולר מספר 17,19. כאשר טכניקות כירורגיות מתבצעות כראוי את תנאי הסביבה במעקב צמוד, lymphocyTES צריך להפגין מהירות הגירה אופיינית, כפי שמודגם באיור 2 ג, 2 ד ובמקומות אחרים 13-14,16. לימפוציטים יכול גם להפגין ההבדלים במהירות העברה בהתאם תתי אזורים של הדמיה LN עוברת, ציוני דרך נוספים כך כמו כלי דם (מסומן על ידי כניסתה של צבעים כלי) יסייע לקבוע את איכות ההדמיה הכללי (כלומר שליטה בטמפרטורה הנכונה , טראומה מינימלית LN, וכו &#39;) 3,6,20. <img alt="באיור 1." src="/files/ftp_upload/3720/3720fig1.jpg" /> באיור 1. הבנייה של בעל העכבר על העכבר popliteal LN Imaging) שרטוטים של ההרכבה בעל העכבר,. ב) הכנת נציג העכבר intravital, ג) השלימו בעל הרכבה העכבר, ד) תקריב הדעות של LN popliteal לאחר חשיפה כירורגית. <img alt="איור 2." src="/files/ftp_upload/3720/3720fig2.jpg" /> איור 2. הגירה ניתוח של ה-GFP + לימפוציטיםב LN popliteal. (א) תמונת מצב 3D מתוך רצף 2P-LSM הדמיה של LN popliteal בעכבר C57BL / 6 הנמען העביר adoptively עם 1x10 7 יום GFP + 1 לימפוציטים לפני הדמיה. קו דש מציין את הגבול של זקיקים ב &#39;תא (ב) שירים של הגירה לימפוציטים במהלך שעה 1 של הדמיה רציפה, ג) התפלגות המהירות הכוללת העברת לימפוציטים. מהירות ממוצעת = 10.04 ± 4.26 מיקרומטר / ד &#39;(סך של 15,125 שירים, ניתח) ד) הגירה הסלולר דיפרנציאלי מהירות הפצה של תאים הנמצאים זקיק תא B (ברים פתוחים, מהירות ממוצעת = 8.79 ± 3.90 מיקרומטר / ד&#39;, 1,525 שירים, בסך הכל נותחו ) ו-T לתא שטח (ברים סגורות, מהירות ממוצעת = 13.77 ± 5.93 מיקרומטר / ד &#39;, סך של 1,250 שירים ניתח). סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. משלימה וידאו 1. צילום בהילוך מהיר intravital 2P-LSM הדמיה של LN העכבר popliteal כמתואר באיור 2. סך של 7 לימפוציטים 1x10 בודדו frאום ubiquitin-GFP + התורם העכבר והעבירו adoptively לווריד לעכבר C57BL / 6 הנמען 24 שעות לפני הדמיה. סדרה של XY (750 מיקרומטר צילומי 750 מיקרומטר) התמונות צולמו באמצעות הקרינה קבועה z ערימות (5 שלבים מיקרומטר, 13 שלבים) להניב מחסנית הדמיה XYZ (750 מיקרומטר צילומי 750 מיקרומטר 65 x מיקרומטר), אשר חזר על עצמו כל 20 שניות עבור סכום כולל של 60 דקות, והתוצאה היא רצף הדמיה xyzt לניתוח מהירות (איורים 2 ג, 2 ד). פלייבק מהירות = 450X. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. חותמת זמן = דקות: שניות. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3720/Huang_Jove_video1.avi" target="_blank">לחץ כאן כדי לצפות בווידאו משלימה</a> . משלימה וידאו 2 הוגדל-נוכח רצף הדמיה וידאו משלימה &#39;1 של זקיק תא B -. אזור T גבול התא. פלייבק מהירות = 450X. סרגל קנה מידה = 25 מיקרומטר. חותמת זמן = דקות:. שניות <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3720/Huang_Jove_video2.avi" target="_blank">C</a>ללקק כאן כדי לצפות בווידאו משלימה.

<ol>
	<li>Bousso, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-Cell+activation+by+dendritic+cells+in+the+lymph+node:+lessons+from+the+movies.">T-Cell activation by dendritic cells in the lymph node: lessons from the movies.</a> Nat. Rev. Immunol. 8, 675-684 (2008).</li><li>Germain, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+friends+in+out-of-the-way+places:+how+cells+of+the+immune+system+get+together+and+how+they+conduct+their+business+as+revealed+by+intravital+imaging.">Making friends in out-of-the-way places: how cells of the immune system get together and how they conduct their business as revealed by intravital imaging.</a> Immunol. Rev. 221, 163-181 (2008).</li><li>Huang, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Illuminating+the+landscape+of+in+vivo+immunity:+insights+from+dynamic+in+situ+imaging+of+secondary+lymphoid+tissues.">Illuminating the landscape of in vivo immunity: insights from dynamic in situ imaging of secondary lymphoid tissues.</a> Immunity. 21, 331-339 (2004).</li><li>Stefanova, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-recognition+promotes+the+foreign+antigen+sensitivity+of+naive+T+lymphocytes.">Self-recognition promotes the foreign antigen sensitivity of naive T lymphocytes.</a> Nature. 420, 429-434 (2002).</li><li>Stefanova, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+role+of+self-recognition+in+T+cell+responses+to+foreign+antigen.">On the role of self-recognition in T cell responses to foreign antigen.</a> Immunol. Rev. 191, 97-106 (2003).</li><li>Bajenoff, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblastic+reticular+cells+guide+T+lymphocyte+entry+into+and+migration+within+the+splenic+T+cell+zone.">Fibroblastic reticular cells guide T lymphocyte entry into and migration within the splenic T cell zone.</a> J. Immunol. 181, 3947-3954 (2008).</li><li>Celli, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decoding+the+dynamics+of+T+cell-dendritic+cell+interactions+in+vivo.">Decoding the dynamics of T cell-dendritic cell interactions in vivo.</a> Immunol. Rev. 221, 182-187 (2008).</li><li>Mempel, T. R., Junt, T., von Andrian, U. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rulers+over+randomness:+stroma+cells+guide+lymphocyte+migration+in+lymph+nodes.">Rulers over randomness: stroma cells guide lymphocyte migration in lymph nodes.</a> Immunity. 25, 867-869 (2006).</li><li>Worbs, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CCR7+ligands+stimulate+the+intranodal+motility+of+T+lymphocytes+in+vivo.">CCR7 ligands stimulate the intranodal motility of T lymphocytes in vivo.</a> J. Exp. Med. 204 (3), 489-495 (2007).</li><li>Bajenoff, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=byways+and+breadcrumbs:+directing+lymphocyte+traffic+in+the+lymph+node.">byways and breadcrumbs: directing lymphocyte traffic in the lymph node.</a> Trends Immunol. 28, 346-352 (2007).</li><li>Mempel, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-cell+priming+by+dendritic+cells+in+lymph+nodes+occurs+in+three+distinct+phases.">T-cell priming by dendritic cells in lymph nodes occurs in three distinct phases.</a> Nature. 427, 154-159 (2004).</li><li>Mempel, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+leukocyte+trafficking+in+blood+vessels+and+tissues.">In vivo imaging of leukocyte trafficking in blood vessels and tissues.</a> Curr. Opin. Immunol. 16, 406-417 (2004).</li><li>Miller, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autonomous+T+cell+trafficking+examined+in+vivo+with+intravital+two-photon+microscopy.">Autonomous T cell trafficking examined in vivo with intravital two-photon microscopy.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100, 2604-2609 (2003).</li><li>Sumen, C., Mempel, T. R., Mazo, I. B., von Andrian, U. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy:+visualizing+immunity+in+context.">Intravital microscopy: visualizing immunity in context.</a> Immunity. 21, 315-329 (2004).</li><li>von Andrian, U. H., Mempel, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homing+and+cellular+traffic+in+lymph+nodes.">Homing and cellular traffic in lymph nodes.</a> Nat. Rev. Immunol. 3, 867-878 (2003).</li><li>Bousso, P., Robey, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+CD8++T+cell+priming+by+dendritic+cells+in+intact+lymph+nodes.">Dynamics of CD8+ T cell priming by dendritic cells in intact lymph nodes.</a> Nat. Immunol. 4, 579-585 (2003).</li><li>Castellino, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokines+enhance+immunity+by+guiding+naive+CD8++T+cells+to+sites+of+CD4++T+cell-dendritic+cell+interaction.">Chemokines enhance immunity by guiding naive CD8+ T cells to sites of CD4+ T cell-dendritic cell interaction.</a> Nature. 440, 890-895 (2006).</li><li>Halin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+lymphocyte+trafficking.">In vivo imaging of lymphocyte trafficking.</a> Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 21, 581-603 (2005).</li><li>Qi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extrafollicular+activation+of+lymph+node+B+cells+by+antigen-bearing+dendritic+cells.">Extrafollicular activation of lymph node B cells by antigen-bearing dendritic cells.</a> Science. 312, 1672-1676 (2006).</li><li>Germain, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+extended+vision+for+dynamic+high-resolution+intravital+immune+imaging.">An extended vision for dynamic high-resolution intravital immune imaging.</a> Semin. Immunol. 17, 431-441 (2005).</li></ol>

החוקרים אין לי מה לחשוף.

ההתקדמות ברזולוציה גבוהה בטכניקות הדמיה באתרו, במיוחד 2P-LSM, היה מלווה עניין הולך וגדל בחקר התנהגות הסלולר הדינאמי in vivo. טכניקת הדמיה 4D על LN popliteal של עכבר חי מאפשר ניתוחים כאלה בהתנהגות הדינמית של תאים חיסוניים בתוך רקמת undisrupted מיקרו סביבה. השימוש LSM-2P עם גלאי מרובים רוחב הקשת כולו גלוי מאפשר הדמיה נתונים בו זמנית אוסף של אוכלוסיות תאים שונות. זה יכול להיות מושג על ידי שימוש בתא ספציפיים בעכברים ב vivo הכתב ניאון (לדוגמה ubiquitin-eGFP,-RFP, או eCFP-) בשילוב עם שימוש של העברת המאמצת של אוכלוסיות תאים אורגניים שכותרתו דיפרנציאלי באמצעות צבעי ניאון סלולריים (למשל CFSE , SNARF-1, תא כתום Tracker) לבחון מנגנונים תאיים ותפקוד בתוך LN. בנוסף תצפית ישירה של יחסי הגומלין בין ג מעקב דיפרנציאליאוכלוסיות גיד, במערך ההדמיה זמנית יכולים לעבור ניתוח נוסף עם זמינים מסחרית עיבוד הדמיה תוכנות (למשל Imaris, BitPlane Inc) להמשיך להסביר, התנהגות התא ותפקודו. מגוון רחב של אפשרויות קיים ללמוד מנגנוני האינטראקציה הסלולר באמצעות אלה in vivo ו בטכניקות סיליקו. המגבלה העיקרית של גישה הניסוי המתואר כאן הוא המורכבות הטכנית הטמונה בגישה הניתוח. טכניקה זו דורשת אימון קפדני על מנת להכיר את האנטומיה רלוונטי בהליכים טכניים מדויקים ומיומנויות כנדרש על ידי פרוטוקול זה. גורמים מסבכים עוד כוללים קושי מזעור הנזק לרקמות במהלך החיפושים LN, אופטימיזציה של יציבות רקמות במהלך ההדמיה, ומניעת פגיעה תרמית לייזר LN לפני ובמהלך ניסוי הדמיה. ההפרעות לכל הגורמים הללו תגרום הלימפה פחות מ-אופטימליתנועתיות ocyte ועל כן להפריע הפרשנות הנכונה של הנתונים וכתוצאה מכך ניתוחים הדמיה.

<table border="1"&gt;<tbody&gt;<tr&gt;<td<strong&gt; מגיב</strong</td&gt;<td<strong&gt; החברה</strong</td&gt;<td<strong&gt; מספר קטלוגי</strong</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Isoflurane, USP</td&gt;<td&gt; Baxter Healthcare Corporation</td&gt;<td&gt; NDC 10019-773-60</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Vetbond</td&gt;<td&gt; 3M</td&gt;<td&gt; 1469SB</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; נאיר - קרם להסרת שיער</td&gt;<td&gt; נאיר</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; PBS, 1X</td&gt;<td&gt; Cellgro</td&gt;<td&gt; 21-040-CV</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; כרית חימום</td&gt;<td&gt; Watlow</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; חימום Pad בקר</td&gt;<td&gt; Watlow</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; האוויר O<sub&gt; 2</sub</td&gt;<td&gt; Airgas</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; טמפרטורת בדיקה</td&gt;<td&gt; הרווארד Apparatus</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; מלקטת דומון # 5</td&gt;<td&gt; העולם Precision מכשירים, Inc</td&gt;<td&gt; 14101</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; מלקחיים, גרפה איריס, 7 ס&quot;מ מעוקל</td&gt;<td&gt; העולם Precision מכשירים, Inc</td&gt;<td&gt; 14141</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; מספריים</td&gt;<td&gt; Roboz כירורגית כלי ושות&#39; בע&quot;מ</td&gt;<td&gt; RS-5880</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; כיסוי של צלחת זכוכית 100x20 מ&quot;מ התא התרבות</td&gt;<td&gt; קורנינג</td&gt;<td&gt; 70165-102</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; כיסוי של צלחת 100x20 מ&quot;מ קלקר תא תרבות</td&gt;<td&gt; קורנינג</td&gt;<td&gt; 430167</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; בבטאדין פתרון (10% Povidine-יוד פתרון מקומי)</td&gt;<td&gt; פרדו מוצרים, LP</td&gt;<td&gt; NDC 67618-150-08</td&gt;</tr&gt;</tbody&gt;</table

intravital imaging of the mouse popliteal lymph node

בלוטות הלימפה (LNs) הם איברי הלימפה משניים, אשר ממוקמים אסטרטגית בכל הגוף, כדי לאפשר לכידה והצגה של אנטיגנים זרים ברקמות היקפי ראשוניים תגובה חיסונית אדפטיבית. זה לצד זה בין התגובות החיסוניות מולד אדפטיבית, LN הוא אתר אידיאלי ללמוד 1,2 אינטראקציות החיסונית התא. (לימפוציטים ותאי T, תאים מסוג B ותאי נ&quot;ח), תאים דנדריטים (DCS), ומקרופגים מהווים את חלק הארי של מח עצם הנגזרות אלמנטים הסלולר של LN. תאים אלה ממוקמים אסטרטגית LN כדי לאפשר מעקב יעיל של אנטיגנים עצמיים ו אנטיגנים זרים פוטנציאליים 3-5. התהליך שבו לימפוציטים בהצלחה נתקלים אנטיגנים מאותו מקור הוא הנושא של חקירה אינטנסיבית בשנים האחרונות, וכולל שילוב של קשרים מולקולאריים כולל קולטנים אנטיגן, מולקולות הדבקה, כמוקינים, ומבנים סטרומה כגון רשת fibro-רשתי 2,6-12 . </p&gt; לפני התפתחות ברזולוציה גבוהה בזמן אמת ניאון in vivo הדמיה, חוקרים הסתמכו על הדמיה סטטי, אשר רק מציע תשובות לגבי, מורפולוגיה מיקום, ואדריכלות. בעוד שאלות אלה הם בסיסי להבנת התנהגות התא החיסונית, את המגבלות הפנימיות עם טכניקה זו אינה מאפשרת ניתוח לסחר לימפוציטים לפענח רמזים סביבתיים המשפיעים על התנהגות התא דינמי. לאחרונה, פיתוח intravital שני הפוטונים סריקת לייזר מיקרוסקופית (2P-LSM) אפשרה לחוקרים כדי להציג את תנועות דינאמיות ואת האינטראקציות של תאים בודדים בתוך LNs חיות 12-16 באתרו. בפרט, אנו ואחרים יישמו טכניקה זו התנהגות התמונה אינטראקציות הסלולר בתוך LN popliteal, שם, טבע צפופה קומפקטית שלה מציעה את היתרון של רכישת זמנית נתונים על שטח גדול עם מגוון רקמות רקמות תת מבנים 11,17-18 . זה אניחשוב לציין כי טכניקה זו מציעה יתרונות על פני הוסיף explanted הדמיה טכניקות רקמה, אשר דורשים הפרעה הדם, זרימת הלימפה, ובסופו של דבר הדינמיקה הסלולר של המערכת. בנוסף, רקמות explanted יש חלון מצומצם מאוד של הזמן שבו הרקמה עדיין מעשית עבור הדמיה לאחר explant. עם לחות ניטור נאות של תנאי הסביבה של בעלי חיים, זמן דימות ניתן להרחיב באופן משמעותי עם טכניקה זו intravital. כאן, אנו מציגים שיטה מפורטת של הכנת LN popliteal העכבר לצורך ביצוע הדמיה intravital.

Watch this Scientific Journal Video about Intravital Imaging of the Mouse Popliteal Lymph Node at JoVE.com

Intravital Imaging of the Mouse Popliteal Lymph Node

ההתקדמות מיקרוסקופיה 2-פוטון אפשרו בזמן אמת<em&gt; ב</em&gt; דימות של רקמות חיות באתרו במודלים של בעלי חיים, ובכך משפרים את היכולת שלנו לחקור את התנהגות הסלולר בתנאים הן פיזיולוגי פתולוגי. כאן אנו מתארים את ההכנות הדרושות כדי לבצע הדמיה של intravital הלימפה popliteal העכבר.

Intravital הדמיה של בלוטות לימפה popliteal עכבר

Lymph nodes (LNs) are secondary lymphoid organs, which are strategically located throughout the body to allow for trapping and presentation of foreign ...

intravital-imaging-of-the-mouse-popliteal-lymph-node

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

28.1K Views.  Case Western Reserve University. ההתקדמות מיקרוסקופיה 2-פוטון אפשרו בזמן אמת ב דימות של רקמות חיות באתרו במודלים של בעלי חיים, ובכך משפרים את היכולת שלנו לחקור את התנהגות הסלולר בתנאים הן פיזיולוגי פתולוגי. כאן אנו מתארים את ההכנות הדרושות כדי לבצע הדמיה של intravital הלימפה popliteal העכבר.

Video: Intravital Imaging of the Mouse Popliteal Lymph Node

Intravital Microscopy of the Inguinal Lymph Node

Lymph nodes (LN's), located throughout the body, are an integral component of the immune system. They serve as a site for induction of adaptive immune response and therefore, the development of effector cells. As such, LNs are key to fighting invading pathogens and maintaining health. The choice of LN to study is dictated by accessibility and the desired model; the inguinal lymph node is well situated and easily supports studies of biologically relevant models of skin and genital mucosal infection.
The inguinal LN, like all LNs, has an extensive microvascular network supplying it with blood. In general, this microvascular network includes the main feed arteriole of the LN that subsequently branches and feeds high endothelial venules (HEVs). HEVs are specialized for facilitating the trafficking of immune cells into the LN during both homeostasis and infection. How HEVs regulate trafficking into the LN under both of these circumstances is an area of intense exploration. The LN feed arteriole, has direct upstream influence on the HEVs and is the main supply of nutrients and cell rich blood into the LN. Furthermore, changes in the feed arteriole are implicated in facilitating induction of adaptive immune response. The LN microvasculature has obvious importance in maintaining an optimal blood supply to the LN and regulating immune cell influx into the LN, which are crucial elements in proper LN function and subsequently immune response. 
The ability to study the LN microvasculature in vivo is key to elucidating how the immune system and the microvasculature interact and influence one another within the LN. Here, we present a method for in vivo imaging of the inguinal lymph node. We focus on imaging of the microvasculature of the LN, paying particular attention to methods that ensure the study of healthy vessels, the ability to maintain imaging of viable vessels over a number of hours, and quantification of vessel magnitude. Methods for perfusion of the microvasculature with vasoactive drugs as well as the potential to trace and quantify cellular traffic are also presented. 
Intravital microscopy of the inguinal LN allows direct evaluation of microvascular functionality and real-time interface of the direct interface between immune cells, the LN, and the microcirculation. This technique potential to be combined with many immunological techniques and fluorescent cell labelling as well as manipulated to study vasculature of other LNs.

A technique for performing intravital microscopy of the inguinal lymph node (LN) is outlined. Such technique allows for real-time, in vivo study of the lymph node microvasculature and structure both during homeostasis and infection. This technique can be adapted to cell trafficking studies and to other lymph node sites.

מיקרוסקופית Intravital של הצומת לימפה מפשעתי

Lymph nodes (LN's), located throughout the body, are an integral component of the immune system. They serve as a site for induction of adaptive immune ...

Ex vivo Imaging of T Cells in Murine Lymph Node Slices with Widefield and Confocal Microscopes

Na&iuml;ve T cells continuously traffic to secondary lymphoid organs, including peripheral lymph nodes, to detect rare expressed antigens. The migration of T cells into lymph nodes is a complex process which involves both cellular and chemical factors including chemokines. Recently, the use of two-photon microscopy has permitted to track T cells in intact lymph nodes and to derive some quantitative information on their behavior and their interactions with other cells. While there are obvious advantages to an in vivo system, this approach requires a complex and expensive instrumentation and provides limited access to the tissue. To analyze the behavior of T cells within murine lymph nodes, we have developed a slice assay 
1, originally set up by neurobiologists and transposed recently to murine thymus 2. In this technique, fluorescently labeled T cells are plated on top of an acutely prepared lymph node slice. In this video-article, the localization and migration of T cells into the tissue are analyzed in real-time with a widefield and a confocal microscope. The technique which complements in vivo two-photon microscopy offers an effective approach to image T cells in their natural environment and to elucidate mechanisms underlying T cell migration.

Ex vivo Imaging of T Cells in Murine Lymph Node Slices with Widefield and Confocal Microscopes

This protocol describes a method to image fluorescent T cells introduced into lymph node slices. The technique permits real-time analyses of T cell migration with traditional widefield fluorescence or confocal microscopes.

Ex vivo הדמיה של תאים T ב Slices צומת Murine לימפה עם widefield ו מיקרוסקופים confocal

Na&iuml;ve T cells continuously traffic to secondary lymphoid organs, including peripheral lymph nodes, to detect rare expressed antigens. The migration ...

Murine Superficial Lymph Node Surgery

In the field of immunology, to understand the progression of an immune response against a vaccine, an infection or a tumour, the response is often followed over time. Similarly, the study of lymphocyte homeostasis requires time course experiments. Performing these studies within the same mouse is ideal to reduce the experimental variability as well as the number of mice used. Blood withdrawal allows performance of time course experiments, but it only gives information about circulating lymphocytes and provides a limited number of cells1-4. Since lymphocytes circulating through the body and residing in the lymph nodes have different properties, it is important to examine both locations. The sequential removal of lymph nodes by surgery provides a unique opportunity to follow an immune response or immune cell expansion in the same mouse over time. Furthermore, this technique yields between 1-2x106 cells per lymph node which is sufficient to perform phenotypic characterization and/or functional assays. Sequential lymph node surgery or lymphadenectomy has been successfully used by us and others5-11. Here, we describe how the brachial and inguinal lymph nodes can be removed by making a small incision in the skin of an anesthetised mouse. Since the surgery is superficial and done rapidly, the mouse recovers very quickly, heals well and does not experience excessive pain. Every second day, it is possible to harvest one or two lymph nodes allowing for time course experiments. This technique is thus suitable to study the characteristics of lymph node-residing lymphocytes over time. This approach is suitable to various experimental designs and we believe that many laboratories would benefit from performing sequential lymph node surgeries.

To follow the progression of an immune response over time within the same mouse, lymph nodes can be sequentially removed by surgery. Here, we describe how this technique can be performed.

צומת Murine שטחית לימפה ניתוח

In the field of immunology, to understand the progression of an immune response against a vaccine, an infection or a tumour, the response is often ...

Intravital Imaging of the Mouse Thymus using 2-Photon Microscopy

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic tools and surgical procedures, TPM becomes a powerful technique to identify "niches" inside organs and to document cellular "behaviors" in live animals. While intravital imaging provides information that best resembles the real cellular behavior inside the organ, it is both more laborious and technically demanding in terms of required equipment/procedures than alternative ex vivo imaging acquisition. Thus, we describe a surgical procedure and novel "stereotactic" organ holder that allows us to follow the movements of Foxp3+ cells within the thymus.
Foxp3 is the master regulator for the generation of regulatory T cells (Tregs). Moreover, these cells can be classified according to their origin: ie. thymus-differentiated Tregs are called "naturally-occurring Tregs" (nTregs), as opposed to peripherally-converted Tregs (pTregs). Although significant amount of research has been reported in the literature concerning the phenotype and physiology of these T cells, very little is known about their in vivo interactions with other cells. This deficiency may be due to the absence of techniques that would permit such observations. The protocol described in this paper provides a remedy for this situation.
Our protocol consists of using nude mice that lack an endogenous thymus since they have a punctual mutation in the DNA sequence that compromises the differentiation of some epithelial cells, including thymic epithelial cells. Nude mice were gamma-irradiated and reconstituted with bone marrows (BM) from Foxp3-KIgfp/gfp mice. After BM recovery (6 weeks), each animal received embryonic thymus transplantation inside the kidney capsule. After thymus acceptance (6 weeks), the animals were anesthetized; the kidney containing the transplanted thymus was exposed, fixed in our organ holder, and kept under physiological conditions for in vivo imaging by TPM. We have been using this approach to study the influence of drugs in the generation of regulatory T cells.

We have developed novel laboratory tools and protocols for intravital imaging acquisition of the thymus. Our technique should help in the identification of &#x201C;niches&#x201D; within the thymus where T cell development occurs.

הדמיה Intravital של קורנית עכבר באמצעות 2-פוטון מיקרוסקופית

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic ...

Generation of Lymph Node-fat Pad Chimeras for the Study of Lymph Node Stromal Cell Origin

The stroma is a key component of the lymph node structure and function. However, little is known about its origin, exact cellular composition and the mechanisms governing its formation. Lymph nodes are always encapsulated in adipose tissue and we recently demonstrated the importance of this relation for the formation of lymph node stroma. Adipocyte precursor cells migrate into the lymph node during its development and upon engagement of the Lymphotoxin-b receptor switch off adipogenesis and differentiate into lymphoid stromal cells (B&#233;n&#233;zech&#160;et al.14). Based on the lymphoid stroma potential of adipose tissue, we present a method using a lymph node/fat pad chimera that allows the lineage tracing of lymph node stromal cell precursors. We show how to isolate newborn lymph nodes and EYFP+ embryonic adipose tissue and make a LN/ EYFP+ fat pad chimera. After transfer under the kidney capsule of a host mouse, the lymph node incorporates local adipose tissue precursor cells and finishes its formation. Progeny analysis of EYFP+ fat pad cells in the resulting lymph nodes can be performed by flow-cytometric analysis of enzymatically digested lymph nodes or by immunofluorescence analysis of lymph nodes cryosections. By using fat pads from different knockout mouse models, this method will provide an efficient way of analyzing the origin of the different lymph node stromal cell populations.

Generation of lymph node/fat pad chimeras for the study of lymph node stromal cell origin is described. The method involves the isolation of lymph nodes from newborn mice and embryonic fat pads, the generation of chimeric lymph node-fat pads, and their transfer under the kidney capsule of a host mouse.

The stroma is a key component of the lymph node structure and function. However, little is known about its origin, exact cellular composition and the ...

Highly Resolved Intravital Striped-illumination Microscopy of Germinal Centers

Monitoring cellular communication by intravital deep-tissue multi-photon microscopy is the key for understanding the fate of immune cells within thick tissue samples and organs in health and disease. By controlling the scanning pattern in multi-photon microscopy and applying appropriate numerical algorithms, we developed a striped-illumination approach, which enabled us to achieve 3-fold better axial resolution and improved signal-to-noise ratio, i.e. contrast, in more than 100 &#181;m tissue depth within highly scattering tissue of lymphoid organs as compared to standard multi-photon microscopy. The acquisition speed as well as photobleaching and photodamage effects were similar to standard photo-multiplier-based technique, whereas the imaging depth was slightly lower due to the use of field detectors. By using the striped-illumination approach, we are able to observe the dynamics of immune complex deposits on secondary follicular dendritic cells &#8211; on the level of a few protein molecules in germinal centers.

High-resolution intravital imaging with enhanced contrast up to 120 &#181;m depth in lymph nodes of adult mice is achieved by spatially modulating the excitation pattern of a multi-focal two-photon microscope. In 100 &#181;m depth we measured resolutions of 487 nm (lateral) and 551 nm (axial), thus circumventing scattering and diffraction limits.

מיקרוסקופית Intravital הפסים תאורה נפתר מאוד של מרכזי ז&#39;רמינל

Monitoring cellular communication by intravital deep-tissue multi-photon microscopy is the key for understanding the fate of immune cells within thick ...

Isolation of Murine Lymph Node Stromal Cells

Secondary lymphoid organs including lymph nodes are composed of stromal cells that provide a structural environment for homeostasis, activation and differentiation of lymphocytes. Various stromal cell subsets have been identified by the expression of the adhesion molecule CD31 and glycoprotein podoplanin (gp38), T zone reticular cells or fibroblastic reticular cells, lymphatic endothelial cells, blood endothelial cells and FRC-like pericytes within the double negative cell population. For all populations different functions are described including, separation and lining of different compartments, attraction of and interaction with different cell types, filtration of the draining fluidics and contraction of the lymphatic vessels. In the last years, different groups have described an additional role of stromal cells in orchestrating and regulating cytotoxic T cell responses potentially dangerous for the host. 
Lymph nodes are complex structures with many different cell types and therefore require a appropriate procedure for isolation of the desired cell populations. Currently, protocols for the isolation of lymph node stromal cells rely on enzymatic digestion with varying incubation times; however, stromal cells and their surface molecules are sensitive to these enzymes, which results in loss of surface marker expression and cell death. Here a short enzymatic digestion protocol combined with automated mechanical disruption to obtain viable single cells suspension of lymph node stromal cells maintaining their surface molecule expression is proposed.

Isolation of lymph node stromal cells is a multistep procedure including enzymatic digestion and mechanical disaggregation to obtain fibroblastic reticular cells, lymphatic and blood endothelial cells. In the described procedure, a short digestion is combined with automated mechanical disaggregation to minimize surface marker degradation of viable lymph node stromal cells.

בידוד של תאי Murine לימפה צומת סטרומה

Secondary lymphoid organs including lymph nodes are composed of stromal cells that provide a structural environment for homeostasis, activation and ...

Intravital Microscopy Imaging of the Liver following Leishmania Infection: An Assessment of Hepatic Hemodynamics

Intravital microscopy (IVM) is a powerful optical imaging technique that has made possible the visualization, monitoring and quantification of various biological events in real time and in live animals. This technology has greatly advanced our understanding of physiological processes and pathogen-mediated phenomena in specific organs.
In this study, IVM is applied to the mouse liver and protocols are designed to image in vivo the circulatory system of the liver and measure red blood cell (RBC) velocity in individual hepatic vessels. To visualize the different vessel subtypes that characterize the hepatic organ and perform blood flow speed measurements, C57Bl/6 mice are intravenously injected with a fluorescent plasma reagent that labels the liver-associated vasculature. IVM enables in vivo, real time, measurement of RBC velocity in a specific vessel of interest. Establishing this methodology will make it possible to investigate liver hemodynamics under physiological and pathological conditions. Ultimately, this imaging-based methodology will be important for studying the influence of L. donovani infection&#160;on hepatic hemodynamics.
This method can be applied to other infectious models and mouse organs and might be further extended to pre-clinical testing of a drug&#8217;s effect on inflammation by quantifying its effect on blood flow.

Intravital Microscopy Imaging of the Liver following Leishmania Infection: An Assessment of Hepatic Hemodynamics

This article reports on a detailed method for the dynamic measurement and quantification of blood flow velocity within individual blood vessels of the mouse liver vasculature using intravital microscopy imaging in combination with a specific methodology for image acquisition and analysis.

מיקרוסקופית Intravital הדמיה של הכבד הבא<em&gt; שושנת יריחו</em&gt; זיהום: הערכה של פרמטרים המודינמיים בדיה

Intravital microscopy (IVM) is a powerful optical imaging technique that has made possible the visualization, monitoring and quantification of various ...

Myeloid Cell Isolation from Mouse Skin and Draining Lymph Node Following Intradermal Immunization with Live Attenuated Plasmodium Sporozoites

Malaria infection begins when the sporozoite stage of Plasmodium is inoculated into the skin of a mammalian host through a mosquito bite. The highly motile parasite not only reaches the liver to invade hepatocytes and transform into erythrocyte-infective form. It also migrates into the skin and to the proximal lymph node draining the injection site, where it can be recognized and degraded by resident and/or recruited myeloid cells. Intravital imaging reported the early recruitment of brightly fluorescent Lys-GFP positive leukocytes in the skin and the interactions between sporozoites and CD11c+ cells in the draining lymph node. We present here an efficient procedure to recover, identify and enumerate the myeloid cell subsets that are recruited to the mouse skin and draining lymph node following intradermal injection of immunizing doses of sporozoites in a murine model. Phenotypic characterization using multi-parametric flow cytometry provides a reliable assay to assess early dynamic cellular changes during inflammatory response to Plasmodium infection.

Myeloid Cell Isolation from Mouse Skin and Draining Lymph Node Following Intradermal Immunization with Live Attenuated Plasmodium Sporozoites

We describe here a protocol for isolating myeloid cells from mouse skin and draining lymph node following intradermal injection of Plasmodium sporozoites. Flow cytometry of collected cells provides a reliable assay to characterize the skin and draining lymph node inflammatory response to the parasite.

בידוד תא מיאלואידית מעור העכבר וניקוז הלימפה הצומת בעקבות החיסון תוך-עורית עם נחלש חי<em&gt; Plasmodium</em&gt; Sporozoites

Malaria infection begins when the sporozoite stage of Plasmodium is inoculated into the skin of a mammalian host through a mosquito bite. The highly ...

Two-photon Intravital Imaging of Leukocytes During the Immune Response in Lipopolysaccharide-treated Mouse Liver

Sepsis is a type of severe infection that can cause organ failure and tissue damage. Although the mortality and morbidity rates associated with sepsis are extremely high, no direct treatment or organ-related mechanism has been examined in detail in real time. The liver is the key organ that manages toxins and infections in the human body. Herein, we aimed to perform intravital imaging of mouse liver after induction of endotoxemia in order to track the motility of immune cells, such as neutrophils and liver capsular macrophages (LCMs). Accordingly, we designed a novel surgical method for exposure of the liver with minimally invasive surgery. Mice were intraperitoneally injected with lipopolysaccharide (LPS), a common endotoxin. Using our novel surgical approach for exposure and intravital imaging of the mouse liver, we found that neutrophil recruitment in LPS-treated LysM-green fluorescent protein (GFP) mouse liver was increased compared with that in phosphate-buffered saline-treated liver. After LPS treatment, the number of neutrophils increased significantly with time. Additionally, using CX3Cr1-GFP mice, we successfully visualized liver resident macrophages called LCMs. Therefore, to investigate the efficacy of new reagents to control immune mobility in vivo, determining the motility and morphology of neutrophils and LCMs in the liver may allow us to identify therapeutic effect in organ failure and tissue damage caused by leukocytes activation in sepsis.

We established a novel surgical protocol for two-photon imaging of live mice liver with minimal invasion. With this technique, we identified the detailed structure of the liver during lipopolysaccharide-induced endotoxemia. We anticipate that this method may be utilized to determine the effectiveness of various reagents treatment to hepatic leukocyte migration.

שני הפוטונים הדמיה Intravital של לויקוציטים במהלך התגובה החיסונית בכבד עכבר שטופלו ליפופוליסכריד

Sepsis is a type of severe infection that can cause organ failure and tissue damage. Although the mortality and morbidity rates associated with sepsis are ...