אנו מבקשים להודות פקט רבקה לסיוע בהכנת מגיב. MPM נתמך על ידי מלגה ל Kirchstein רות predoctoral מן המכונים הלאומיים לבריאות ותמיכה מענקים GM-41514 (MDC), NS-48252 (KGC), GM-48071 (IP) גם מן המכונים הלאומיים לבריאות.

1. העברת המאמצת של תאים: וריד הזנב או הזרקה תוך עיני הן שיטות מתאים כניסתה של התא גשש שכותרתו או פלורסנט חלבון להביע לימפוציטים. בסרטון זה. אנחנו מדגימים את העברת המאמצת של תאים על ידי הזרקה לווריד הזנב. א חומרים CD4 + T תאים מסומנים עם CFSE 1.4 מיקרומטר במשך 30 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות, שטפתי פעמיים, שוב תלוי μL 100 של RPMI-1640. תאים נטענים לתוך מזרק סטרילי מד 28 אינסולין להזרקה. מספר תאים המשמשים תלוי בניסוי שנעשה. בדרך כלל, 5,000,000 ותאי T הם מספיק להדמיה פשוטה תא T. עוצר מכרסם עבור העכבר הוא זקוק כדי למנוע פגיעה בבעלי חיים ועל לעצמך. ב שמירה על בעלי חיים העכבר הוא מאובטח להעברת המאמצת ידי לאט גיבוי חיה לתוך עוצר המכרסם (ראה וידאו) לסגור את הקצה הפתוח של הצינור על ידי מדכא בעדינות על הבוכנה. אל תעזוב את העכבר הזנב במהלך תהליך זה, כמו כמה חיות קטן יכול להסתובב בתוך עוצר. שיטה זו מונעת את החיה מפגיעה עצמה לנוע במהלך ההזרקה. כאשר הגדרת עוצר מכרסם, לא לדחוף את הבוכנה ב רחוק יותר יש צורך לשמור על בעלי החיים לקפוץ קדימה. כמו כן, לא לדחוף את הבוכנה כלפי בעלי חיים, ולא להשאיר את החיה עוצר לתקופה ממושכת של זמן. ג לדמיין את וריד הזנב משוך בעדינות את הזנב כלפיך כך שהוא עטוף קלות על האצבע המורה והחזיק נגד הפנימי של האצבע על ידי האגודל. זהה את הוורידים הזנב ממוקם משני צידי הזנב זקוף. ויזואליזציה היא בהנחייתם של ההתחממות הזנב במים חמימים, ולאחר מכן מנגב עם אתנול. ד הזרקה של תאים כאשר וריד אותר, הכנס את המזרק שפוע בצד למעלה במקביל זווית רדוד אל הווריד. פעם הוריד, בעדינות לוחץ על המתג, אם אתה בווריד לא צריכה להיות התנגדות הזריקה. אם קיימת התנגדות כלשהי, הסר את המזרק ונסה שוב במיקום שונה. אם אתה בווריד, לאט לוחץ על המתג עד הזריקה תושלם. הזנב לא צריך להיות נפוחה במהלך ההזרקה. אם כן, פירוש הדבר יהיה כי המחט לא בתוך הווריד. אפשר &quot;לאבד&quot; את הווריד במהלך ההזרקה. אם זה יקרה, להסיר את המחט לנסות זריקה שלך במקום אחר. אם אתה צריך יותר ניסיון זריקה אחת, עדיף להעביר את הזנב כלפי מעלה, אל הגוף של העכבר מאתר ההזרקה המקורית. תכנן קדימה לאפשרות זו על ידי הפעלת distally על הזנב לתת לעצמך מקום ניסיון נוסף בבית להעביר את המאמץ. ה לאחר הזרקת שיקולים לאחר הזרקת הושלמה, קטן לאחור זרימת הדם מהעורק תתרחש. לחץ בעדינות באתר ההזרקה עם נקי לנגב עד עוצר דימום. הסר את הבוכנה ולתת לחיה ללכת קדימה, מתוך עוצר, בעוד בעדינות ולהחזיק הזנב. יש לבדוק תמיד עם ועדת שלך לטיפול בבעלי חיים להשתמש בפרוטוקולים בעלי חיים כדי להבטיח שאתה עומד בדרישות. חשוב לתרגל את הטכניקה הזו מספר פעמים לפני שאתה מנסה את הניסוי האמיתי. 2. הלימפה בידוד בידוד של בלוטות לימפה הדמיה פוטון two דורש הסרה זהירה של הצומת לימפה הנכונה מן הרקמה הסובבת. א הבחירה והמיקום של בלוטות הלימפה ההיקפית בחירה של בלוטות הלימפה הדמיה יהיה תלוי מטרות הניסוי. היו מודעים לזיהום מקומי או הזרקת ניקוז בלוטות הלימפה, ובחר את הצומת המתאימה הדמיה. מאמרו של ואן דן Broeck et al. מתארת ​​את המיקום המורפולוגיה של בלוטות הלימפה Murine בפירוט 3. בסרטון הזה, אנחנו מדגימים את כריתה של שש בלוטות לימפה גדולה הפריפריה אשר מתאימים בידוד תא או הדמיה. ב הסרת בלוטת לימפה: זכור את שלמות הרקמה תוך הסרת בלוטות הלימפה. היזהר שלא לקרוע את הקפסולה או נזק בכל דרך המבנה הלימפה. הפסד של שלמות מבנית לימפה הצומת תתפשר על הניסוי. במידת הצורך, להסיר שומן מפני השטח הלימפה עם מלקחיים לנתח (# 5 דומון) קנס תחת מיקרוסקופ לנתח. בלוטות הלימפה לא צריך שום שומן שנותרו על פני השטח של הצומת, כמו זה יהיה לטשטש הדמיה על ידי פיזור האור. פרופר כריתה של בלוטות הלימפה היא גם טכניקה חשוב להתאמן לפני הניסוי האמיתי הראשון. 3. לימפה נודדואר הדמיה ההתקנה ושיקולים קשר הלימפה צריך להיות מאובטח לשלב הדמיה, אשר במקרה זה כולל חדר הפסקה. התחמם, חמצן perfused התקשורת נשאבים אל תוך החדר מצד אחד באמצעות משאבת peristaltic ואת דוד מוטבעות, והוא יוצא דרך ערוץ יורד ציון לתוך תא איסוף עם צינור ואקום בבקבוק איסוף פסולת. במערכת שלנו, הצומת לימפה הוא שקוע 37 ° C מדיה סופר perfused עם רפואי כיתה carbogen (5% CO 2, 95% O 2). הטמפרטורה של התקשורת זלוף יש לרשום קרוב הצומת לימפה האפשר. המערכת הספציפית שלך עשויים לדרוש שינויים בקצב זרימת מדיה ועיצוב הבמה כדי להכיל את שלב המיקרוסקופ ואובייקטיבי. א הדמיה לימפה הצומת ההתקנה: כפי שניתן לראות בסרטון, אנחנו לאבטח את הלימפה הראשון על ידי הצמדתו, לשד בצד למטה (לתמונה T או אזורי B התא באמצעות מיקרוסקופ זקוף) כדי coverslip פלסטיק, לחתוך לגודל המתאים. חשוב להשתמש בדבק לא רעיל רקמות (אנו משתמשים VetBond ™ מבית 3M Corporation). Coverslip מובטחת בתקשורת זורם ידי הצבת טיפה קטנה של שמן סיליקון על החלק התחתון של להחליק את המכסה, אז דבקות זו לבסס את הזכוכית של חדר הדמיה. ב 2-Photon הדמיה שיקולים: מספר גורמים יכולים לגרום לימפוציטים לעצור נע: טמפרטורה כי הוא גבוה מדי או נמוך מדי; כוח לייזר עודף; דחיסה או נזק אחר אל הצומת לימפה, וחוסר חמצן. נזק שייגרם עקב כוח לייזר או טמפרטורות מוגזמות&gt; ~ 39 ° C הוא בלתי הפיך. אם התאים עמומים, הוא בדרך כלל טוב יותר כדי להגדיל את הרווח או גלאי פרוטוקול התא תיוג ולא באמצעות כוח לייזר גבוה יותר לדמיין תאים. אופטימיזציה של תיוג או ביטוי של חלבונים ניאון ייתכן שיהיה צורך להביא את הקרינה מעל לרמה של autofluorescence רקע. עם רווח סביר וכוח הגדרות לייזר, על משמרת שני יומן של הקרינה מעל הבסיס (נמדד על ידי cytometry זרימה) הוא סביר להדמיה התא. עם שני הפוטונים לייזרים מתכונן, אורך הגל המשמש עירור צריך להיות קצת פחות מהמקסימום כפול פוטון יחיד עירור של fluorophore עתה הדמיה. בשני ניסויים באמצעות פוטון יותר מתווית אחת או חלבון פלואורסצנטי ייתכן שיהיה צורך להתנסות עם גל עירור להשתמש כדי למצוא את הגדרות אופטימלי עבור תוויות שניהם. עירור שני פוטונים יכולים לשמש גם למבנים תמונה אנדוגני קולגן על ידי ניצול של הדור כחול פנימי הרמוני השני. דור הרמונית השני (SHG) מתרחשת שם שני פוטונים משולבים בתוך חומר פולטים פוטון יחיד של תדר כפול של פוטונים המקורי. בתוך הרקמה, שני הפוטונים עירור מתרחשת כאשר אור לייזר האירוע ניצב מבנה חלבון הורה מאוד כגון קולגן. בעיות מעשיות לגבי שני הפוטונים הדמיה נדונו תצוגה מקדימה ביקורות 4, 5.

<ol>
	<li>Cahalan, M. D., Parker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Choreography+of+Cell+Motility+and+Interaction+Dynamics+Imaged+by+Two-Photon+Microscopy+in+Lymphoid+Organs.+Annu+Rev+Immunol.">Choreography of Cell Motility and Interaction Dynamics Imaged by Two-Photon Microscopy in Lymphoid Organs. Annu Rev Immunol.</a> Annu Rev Immunol. , (2008).</li><li>Miller, M. J., Wei, S. H., Parker, I., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+imaging+of+lymphocyte+motility+and+antigen+response+in+intact+lymph+node.">Two-photon imaging of lymphocyte motility and antigen response in intact lymph node.</a> Science. 296, 1869-1873 (2002).</li><li>Van den Broeck, W., Derore, A., Simoens, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy+and+nomenclature+of+murine+lymph+nodes:+Descriptive+study+and+nomenclatory+standardization+in+BALB/cAnNCrl+mice.">Anatomy and nomenclature of murine lymph nodes: Descriptive study and nomenclatory standardization in BALB/cAnNCrl mice.</a> J Immunol Methods. 312, 12-19 (2006).</li><li>Cahalan, M. D., Parker, I., Wei, S. H., Miller, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+tissue+imaging:+seeing+the+immune+system+in+a+fresh+light.">Two-photon tissue imaging: seeing the immune system in a fresh light.</a> Nat Rev Immunol. 2, 872-880 (2002).</li><li>Germain, R. N., Miller, M. J., Dustin, M. L., Nussenzweig, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+imaging+of+the+immune+system:+progress,+pitfalls+and+promise.">Dynamic imaging of the immune system: progress, pitfalls and promise.</a> Nat Rev Immunol. 6, 497-507 (2006).</li></ol>

בפרוטוקול וידאו זה אנו מציגים את ההליכים להעברת תא המאמצים הלימפה בידוד והכנת הנדרש תנועתיות הלימפוציטים הדמיה לימפה היקפי. שני הפוטונים הדמיה יש מספר יתרונות על פני הדמיה confocal בשתי רקמות explanted (ראה כאן) בהכנות intravital. יש לציין, השימוש עירור אינפרא אדום ממזער פיזור אור ומאפשר הדמיה ~ 300 מיקרומטר מתחת הקפסולה של הצומת לימפה עמוק בתוך כמה רקמות 4. יתר על כן, רב פוטון עירור מוגבל לנקודת המוקד של המטרה, תוך מזעור צילום הלבנת נזק לרקמות את הצד של המטוס מוקד. כמו עם כל הטכניקה החדשה, לעומת זאת, שני הפוטונים הדמיה אינה תרופת פלא ואת המגבלות שלה ואת החסרונות פוטנציאל יש לזכור 5. בין אלה הוא הדרישה כי - למעט אותות מהותי כגון הדור השני הרמוני על ידי קולגן תאים עניין חייב להיות שכותרתו fluorescently על ידי בדיקות חיצוני או על ידי ביטוי של חלבונים ניאון. הרושם שנוצר ובכך כי תאים אלה שכותרתו שוחים בחלל השחור, ואילו לאמיתו של דבר הם שקועים, וליצור אינטראקציה עם הסביבה מורכבת של אלמנטים מבניים עצום אחרים ללא תווית, תאים בלתי נראה. בשש השנים מאז כניסתה של הדמיה שני פוטונים על באימונולוגיה, טכניקה זו אפשרה לחוקרים כתובת ארוכת שאלות ישירות על ידי הדמיה של רקמות שלמות תהליכי החיים, כולל תאים תאים אינטראקציות, תנועתיות התא ולוקליזציה, מסלולי איתות הסלולר תאים ציטוטוקסיים הרג האירועים. התחום התפתח במהירות מעבר לתיאורים הפנומנולוגית הראשונית, ניתוחים כמותיים יחד עם דוגמנות המחשב וסימולציה עכשיו מתחילים להבין איך תנועות הסלולר כאוטית לכאורה ואת האינטראקציות בתוך בלוטות הלימפה להוביל תגובה חיסונית יעילה. התקדמות זו היא בדיקה מקיפה בפרסום האחרונות 1, אשר מונה מעל 100 מאמרים המתארים את היישום של מיקרוסקופיה שני פוטונים עבור immunoimaging.

dissection and 2-photon imaging of peripheral lymph nodes in mice

שני הפוטונים הדמיה חשף כוריאוגרפיה אלגנטי של תנועתיות אינטראקציות הסלולר בתוך הצומת לימפה בתנאים הבסיסיים ועל ייזום של תגובה חיסונית 1. כאן, אנו מציגים שיטות להעברת המאמצת של תאים T שכותרתו, בידוד של בלוטות הלימפה, ועל תנועתיות הדמיה של CD4 + T תאים בתוך הצומת לימפה explanted כפי שתוארה לראשונה בשנת 2002 2. הדמיה דו פוטון של תאים חיסוניים דורש כי תאים שכותרתו fluorescently, או על ידי צביעה עם צבע גשש התא או על ידי הבעת חלבון פלואורסצנטי. אנו מדגימים את הליך העברת המאמצת של תאים שמקורם הזרקת עכברים התורם לווריד הזנב של חיה הנמען, שם הם בבית הלימפה לאיברים בתוך כ 15-30 דקות. אנו מדגימים את הבידוד של לימפה ולתאר שיטות כדי להבטיח הרכבה נכונה של הצומת לימפה נכרת. שיקולים נוספים כגון חמצון תקין של התקשורת perfused, טמפרטורה, כוח לייזר הם דנו. לבסוף, אנו מציגים תמונות וידאו 3D של CD4 + T תאים נאיבי מפגין תנועתיות מצב יציב על 37 ° C.

Watch this Scientific Journal Video about Dissection and 2-Photon Imaging of Peripheral Lymph Nodes in Mice at JoVE.com

Dissection and 2-Photon Imaging of Peripheral Lymph Nodes in Mice

שני הפוטונים הדמיה חשף תנועתיות הלימפוציטים אינטראקציות הסלולר בתוך הצומת לימפה בתנאי הבסיס, במהלך תגובה חיסונית 1. הנה, אנחנו מדגימים העברת המאמצת של תאים T, בידוד של בלוטות הלימפה, ועל תנועתיות הדמיה של CD4 + T תאים בתוך הצומת לימפה explanted.

Dissection ו 2-Photon הדמיה של בלוטות לימפה הפריפריה עכברים

Two-photon imaging has revealed an elegant choreography of motility and cellular interactions within the lymph node under basal conditions and at the ...

dissection-and-2-photon-imaging-of-peripheral-lymph-nodes-in-mice

Research

JoVE Journal

Biology

46.0K Views.  University of California, Irvine (UCI).  שני הפוטונים הדמיה חשף תנועתיות הלימפוציטים אינטראקציות הסלולר בתוך הצומת לימפה בתנאי הבסיס, במהלך תגובה חיסונית 1. הנה, אנחנו מדגימים העברת המאמצת של תאים T, בידוד של בלוטות הלימפה, ועל תנועתיות הדמיה של CD4 + T תאים בתוך הצומת לימפה explanted. 

Video: Dissection and 2-Photon Imaging of Peripheral Lymph Nodes in Mice

Isolation of CD4+ T cells from Mouse Lymph Nodes Using Miltenyi MACS Purification

Isolation of cells from the primary source is a necessary step in many more complex protocols. Miltenyi offers kits to isolate cells from several organisms including humans, non-human primates, rat and, as we describe here, mice. Magnetic bead-based cell separation allows for either positive selection (or cell depletion) as well as negative selection. Here, we demonstrate negative selection of untouched or na ve CD4+ helper T cells. Using this standard protocol we typically purify cells that are &#8805; 96% pure CD4+/CD3+. This protocol is used in conjunction with the protocol Dissection and 2-Photon Imaging of Peripheral Lymph Nodes in Mice published in issue 7 of JoVE, for purification of T cells and other cell types to adoptively transfer for imaging purposes. Although we did not demonstrate FACS analysis in this protocol video, it is highly recommended to check the overall purity of isolated cells using the appropriate antibodies via FACS. In addition, we demonstrate the non-sterile method of T cell isolation. If sterile cells are needed for your particular end-user application, be sure to do all of the demonstrated procedures in the tissue culture hood under standard sterile conditions. Thank you for watching and good luck with your own experiments!

Isolation of lymphocytes using the Miltenyi MACs kit is a reliable way to purify cells from whole lymphoid tissue homogenates. Cells purified using the Miltenyi system are typically &#8805; 96% pure. Here, we demonstrate the steps taken to isolate CD4+ T cells, one of the many kits offered by Miltenyi.

בידוד של תאים מסוג CD4 + T מ בלוטות לימפה עכבר באמצעות טיהור Miltenyi MACS

Isolation of cells from the primary source is a necessary step in many more complex protocols. Miltenyi offers kits to isolate cells from several ...

In situ Imaging of the Mouse Thymus Using 2-Photon Microscopy

Two-photon Microscopy (TPM) enables us to image deep into the thymus and document the events that are important for thymocyte development. To follow the migration of individuals in a crowd of thymocytes , we generate neonatal chimeras where less than one percent of the thymocytes are derived from a donor that is transgenic for a ubiquitously express fluorescent protein. To generate these partial hematopoetic chimeras, neonatal recipients are injected with bone marrow between 3-7 days of age. After 4-6 weeks, the mouse is sacrificed and the thymus is carefully dissected and bissected preserving the architecture of the tissue that will be imaged. The thymus is glued onto a coverslip in preparation for ex vivo imaging by TPM. During imaging the thymus is kept in DMEM without phenol red that is perfused with 95% oxygen and 5% carbon dioxide and warmed to 37&deg;C. Using this approach, we can study the events required for the generation of a diverse T cell repertoire.

We present step-by-step instructions for the generation of neonatal chimeras as well as the dissection and preparation of the thymus for ex vivo imaging by 2-Photon Microscopy.

בתחום ההדמיה באתרו של קורנית עכבר באמצעות 2-פוטון מיקרוסקופית

Two-photon Microscopy (TPM) enables us to image deep into the thymus and document the events that are important for thymocyte development.  To follow the ...

A Method for 2-Photon Imaging of Blood Flow in the Neocortex through a Cranial Window

The ability to image the cerebral vasculature (from large vessels to capillaries) and record blood flow dynamics in the intact brain of living rodents is a powerful technique. Using in vivo 2-photon microscopy through a cranial window it is possible to image fluorescent dyes injected intravenously. This permits one to image the cortical vasculature and also to obtain measurements of blood flow. This technique was originally developed by David Kleinfeld and Winfried Denk. The method can be used to study blood flow dynamics during or after cerebral ischemia, in neurodegenerative disorders, in brain tumors, or in normal brain physiology. For example, it has been used to study how stroke causes shifts in blood flow direction and changes in red blood cell velocity or flux in and around the infarct. Here we demonstrate how to use 2-photon microscopy to image blood flow dynamics in the neocortex of living mice using fluorescent dyes injected into the tail vein.

Cortical blood flow dynamics can be studied in vivo by imaging fluorescent dextran dyes injected into the tail vein of rodents with 2-photon microscopy. This video shows how to image blood flow dynamics in neocortex of mice through a glass-covered cranial window preparation.

שיטה הדמיה 2-פוטון של זרימת הדם הניאוקורטקס דרך חלון גולגולתי

The ability to image the cerebral vasculature (from large vessels to capillaries) and record blood flow dynamics in the intact brain of living rodents is ...

In Vivo 2-Photon Calcium Imaging in Layer 2/3 of Mice

To understand network dynamics of microcircuits in the neocortex, it is essential to simultaneously record the activity of a large number of neurons . In-vivo two-photon calcium imaging is the only method that allows one to record the activity of a dense neuronal population with single-cell resolution . The method consists in implanting a cranial imaging window, injecting a fluorescent calcium indicator dye that can be taken up by large numbers of neurons and finally recording the activity of neurons with time lapse calcium imaging using an in-vivo two photon microscope. Co-injection of astrocyte-specific dyes allows one to differentiate neurons from astrocytes. The technique can be performed in mice expressing fluorescent molecules in specific subpopulations of neurons to better understand the network interactions of different groups of cells.

To understand network dynamics of microcircuits in the neocortex, it is essential to simultaneously record the activity of a large number of neurons . In-vivo two-photon calcium imaging is the only method that allows one to record the activity of a dense neuronal population with single-cell resolution .

In vivo 2-Photon סידן הדמיה ב Layer 2 / 3 של עכברים

To understand network dynamics of microcircuits in the neocortex, it is essential to simultaneously record the activity of a large number of neurons .  ...

Generation of Bone Marrow Derived Murine Dendritic Cells for Use in 2-photon Imaging

Several methods for the preparation of murine dendritic cells can be found in the literature. Here, we present a method that produces greater than 85% CD11c high dendritic cells in culture that home to the draining lymph node after subcutaneous injection and present antigen to antigen specific T cells (see video). Additionally, we use Essen Instruments Incucyte to track dendritic cell maturation, where, at day 10, the morphology of the cultured cells is typical of a mature dendritic cell and &lt;85% of cells are CD11chigh. The study of antigen presentation in peripheral lymph nodes by 2-photon imaging revealed that there are three distinct phases of dendritic cell and T cell interaction1, 2. Phase I consists of brief serial contacts between highly motile antigen specific T cells and antigen carrying dendritic cells1, 2. Phase two is marked by prolonged contacts between antigen-specific T cell and antigen bearing dendritic cells1, 2. Finally, phase III is characterized by T cells detaching from dendritic cells, regaining motility and beginning to divide1, 2. This is one example of the type of antigen-specific interactions that can be analyzed by two-photon imaging of antigen-loaded cell tracker dye-labeled dendritic cells.

Antigen presentation in secondary lymphoid organs by dendritic cells is crucial for the initiation of the T cell mediated adaptive immune response. Here we demonstrate the culture of bone marrow derived murine dendritic cells, activation, and labeling for 2-photon imaging.

הדור של מח עצם נגזר תאים דנדריטים Murine לשימוש 2-פוטון הדמיה

Several methods for the preparation of murine dendritic cells can be found in the literature. Here, we present a method that produces greater than 85% ...

Functional Imaging of Brown Fat in Mice with 18F-FDG micro-PET/CT

Brown adipose tissue (BAT) differs from white adipose tissue (WAT) by its discrete location and a brown-red color due to rich vascularization and high density of mitochondria. BAT plays a major role in energy expenditure and non-shivering thermogenesis in newborn mammals as well as the adults 1. BAT-mediated thermogenesis is highly regulated by the sympathetic nervous system, predominantly via &beta; adrenergic receptor 2, 3. Recent studies have shown that BAT activities in human adults are negatively correlated with body mass index (BMI) and other diabetic parameters 4-6. BAT has thus been proposed as a potential target for anti-obesity/anti-diabetes therapy focusing on modulation of energy balance 6-8. While several cold challenge-based positron emission tomography (PET) methods are established for detecting human BAT 9-13, there is essentially no standardized protocol for imaging and quantification of BAT in small animal models such as mice. Here we describe a robust PET/CT imaging method for functional assessment of BAT in mice. Briefly, adult C57BL/6J mice were cold treated under fasting conditions for a duration of 4 hours before they received one dose of 18F-Fluorodeoxyglucose (FDG). The mice were remained in the cold for one additional hour post FDG injection, and then scanned with a small animal-dedicated micro-PET/CT system. The acquired PET images were co-registered with the CT images for anatomical references and analyzed for FDG uptake in the interscapular BAT area to present BAT activity. This standardized cold-treatment and imaging protocol has been validated through testing BAT activities during pharmacological interventions, for example, the suppressed BAT activation by the treatment of &beta;-adrenoceptor antagonist propranolol 14, 15, or the enhanced BAT activation by &beta;3 agonist BRL37344 16. The method described here can be applied to screen for drugs/compounds that modulate BAT activity, or to identify genes/pathways that are involved in BAT development and regulation in various preclinical and basic studies.

Functional Imaging of Brown Fat in Mice with 18F-FDG micro-PET/CT

A method of functional imaging of mouse brown adipose tissue (BAT) is described in which cold-stimulated uptake of 18F-Fluorodeoxyglucose (FDG) in BAT is non-invasively assessed with a standardized micro-PET/CT protocol. This method is robust and sensitive to detect differences in BAT activities in mouse models.

הדמיה תפקודית של שומן חום בעכברים עם FDG micro-PET/CT

Brown adipose tissue (BAT) differs from white adipose  tissue (WAT) by its discrete location and a brown-red color due to rich  vascularization and high ...

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, we use the salivary glands of live mice since they provide several advantages. First, they can be easily exposed to enable access to the optics, and stabilized to facilitate the reduction of the motion artifacts due to heartbeat and respiration. This significantly facilitates imaging and tracking small subcellular structures. Second, most of the cell populations of the salivary glands are accessible from the surface of the organ. This permits the use of confocal microscopy that has a higher spatial resolution than other techniques that have been used for in vivo imaging, such as two-photon microscopy. Finally, salivary glands can be easily manipulated pharmacologically and genetically, thus providing a robust system to investigate biological processes at a molecular level.
In this study we focus on a protocol designed to follow the kinetics of the exocytosis of secretory granules in acinar cells and the dynamics of the apical plasma membrane where the secretory granules fuse upon stimulation of the beta-adrenergic receptors. Specifically, we used a transgenic mouse that co-expresses cytosolic GFP and a membrane-targeted peptide fused with the fluorescent protein tandem-Tomato. However, the procedures that we used to stabilize and image the salivary glands can be extended to other mouse models and coupled to other approaches to label in vivo cellular components, enabling the visualization of various subcellular structures, such as endosomes, lysosomes, mitochondria, and the actin cytoskeleton.

Intravital microscopy is a powerful tool that enables imaging various biological processes in live animals. In this article, we present a detailed method for imaging the dynamics of subcellular structures, such as the secretory granules, in the salivary glands of live mice.

מיקרוסקופית Intravital למבני ההדמיה subcellular בעכברים חיים לבטא חלבוני פלורסנט

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

Dissection of the Auditory Bulla in Postnatal Mice: Isolation of the Middle Ear Bones and Histological Analysis

In most mammals, auditory ossicles in the middle ear, including the malleus, incus and stapes, are the smallest bones. In mice, a bony structure called the auditory bulla houses the ossicles, whereas the auditory capsule encloses the inner ear, namely the cochlea and semicircular canals. Murine ossicles are essential for hearing and thus of great interest to researchers in the field of otolaryngology, but their metabolism, development, and evolution are highly relevant to other fields. Altered bone metabolism can affect hearing function in adult mice, and various gene-deficient mice show changes in morphogenesis of auditory ossicles in utero. Although murine auditory ossicles are tiny, their manipulation is feasible if one understands their anatomical orientation and 3D structure. Here, we describe how to dissect the auditory bulla and capsule of postnatal mice and then isolate individual ossicles by removing part of the bulla. We also discuss how to embed the bulla and capsule in different orientations to generate paraffin or frozen sections suitable for preparation of longitudinal, horizontal, or frontal sections of the malleus. Finally, we enumerate anatomical differences between mouse and human auditory ossicles. These methods would be useful in analyzing pathological, developmental and evolutionary aspects of auditory ossicles and the middle ear in mice.

We present a protocol to isolate the auditory bulla, capsule, and ossicles from postnatal mice for whole mount and histological analysis.

דיסקציה של בולה השמיעה של עכברים אחרי לידה: בידוד של עצמות באוזן התיכונה ניתוח היסטולוגית

In most mammals, auditory ossicles in the middle ear, including the malleus, incus and stapes, are the smallest bones. In mice, a bony structure called ...

Micropuncture of Bowman's Space in Mice Facilitated by 2 Photon Microscopy

Renal micropuncture and renal 2-photon imaging are seminal techniques in renal physiology. However, micropuncture is limited by dependence on conventional microscopy to surface nephron features, and 2-photon studies are limited in that interventions can only be assessed at the organ, rather than the nephron level. In particular, micropuncture studies of the glomeruli of mice have been challenged by the paucity of surface glomeruli in mice. To address this limitation in order to pursue studies of aspirate from Bowman&#39;s space in mouse physiologic models, we developed 2-photon glomerular micropuncture. We present a novel surgical preparation that allows lateral access to the kidney while preserving the required vertical imaging column for 2-photon microscopy. Administration of high molecular weight fluorescein isothiocyanate (FITC)-dextran is used to render the renal vasculature and therefore glomeruli visible for 2-photon imaging. A quantum dot-coated pipette is then introduced under stereotactic guidance to a glomerulus selected from the several to many which may be visualized within the imaging window. In this protocol, we provide details of the preparation, materials, and methods necessary to carry out the procedure. This technique facilitates previously-impossible physiologic study of the kidney, including recovery of filtrate from Bowman&#39;s space and all segments of the nephron within the imaging depth limit, about 100 &#181;m below the renal capsule. Pressure, charge and flow may all be measured using the introduced pipette. Here, we provide representative data from liquid chromatography/mass spectrometry performed on aspirate from Bowman&#39;s space. We expect this technique to have wide applicability in renal physiologic investigation.

Micropuncture of Bowman&#039;s Space in Mice Facilitated by 2 Photon Microscopy

We present use of 2-photon microscopy to place a micropipette within Bowman&#39;s urinary space in mice, combining 2 foundational techniques of renal physiology. Use of 2-photon microscopy overcomes critical limitations of conventional microscopy for micropuncture renal physiology studies.

Micropuncture של השטח של באומן בעכברים בהנחייתם של מיקרוסקופיית פוטון 2

Renal micropuncture and renal 2-photon imaging are seminal techniques in renal physiology. However, micropuncture is limited by dependence on conventional ...

Dissection and Lipid Droplet Staining of Oenocytes in Drosophila Larvae

Lipids are essential for animal development and physiological homeostasis. Dysregulation of lipid metabolism results in various developmental defects and diseases, such as obesity and fatty liver. Usually, lipids are stored in lipid droplets, which are the multifunctional lipid storage organelles in cells. Lipid droplets vary in size and number in different tissues and under different conditions. It has been reported that lipid droplets are tightly controlled through regulation of its biogenesis and degradation. In Drosophila melanogaster, the oenocyte is an important tissue for lipid metabolism and has been recently identified as a human liver analogue regarding lipid mobilization in response to stress. However, the mechanisms underlying the regulation of lipid droplet metabolism in oenocytes remain elusive. To solve this problem, it is of utmost importance to develop a reliable and sensitive method to directly visualize lipid droplet dynamic changes in oenocytes during development and under stressful conditions. Taking advantage of the lipophilic BODIPY 493/503, a lipid droplet-specific fluorescent dye, described here is a detailed protocol for the dissection and subsequent lipid droplet staining in the oenocytes of Drosophila larvae in response to starvation. This allows for qualitative analysis of lipid droplet dynamics under various conditions by confocal microscopy. Furthermore, this rapid and highly reproducible method can also be used in genetic screens for indentifying novel genetic factors involving lipid droplet metabolism in oenocytes and other tissues.

Dissection and Lipid Droplet Staining of Oenocytes in Drosophila Larvae

Presented here are detailed methods for the dissection and lipid droplet staining of oenocytes in Drosophila larvae using BODIPY 493/503, a lipid droplet-specific fluorescent dye.

לחיתוך וליפיד Droplet כתמים של Oenocytes בתוך דרוזופילה הזחלים

Lipids are essential for animal development and physiological homeostasis. Dysregulation of lipid metabolism results in various developmental defects and ...