מחקר זה נתמך על ידי הבריאות הלאומי המועצה למחקר רפואי של אוסטרליה (הפרויקט להעניק אין. 6288480) ואת סקובי וקלייר מקינון אמון.

1. Micromixing תגובה RT <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני ביצוע תגובה RT עם micromixing, לאזן micromixer לטמפרטורה הרצויה התגובה RT. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את micromixer בתוך 37 ° C (או הטמפרטורה המומלצת על ידי הספק RT) חממה לפחות שעה 1 לפני תחילת התגובה RT. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת תמהיל RT לפי הספק של transcriptase הפוכה (למשל MMTV-RT מ Promega, Omniscript מ Qiagen) הוראות, למעט תא בודד כמויות להשתמש בסך הכל קלט RNA (למשל 0.1-1pg/μl), במקום מיקרוגרם ng- כמויות המומלץ על ידי הספקים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אנו משתמשים תקן סטרילי, nuclease ללא 200μL דק דופן צינורות PCR. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיקום RT צינורות היטב לתוך micromixer ברגע שהם מוכנים ערבוב. Micromixer צריך להישאר בתוך 37 ° C החממה למשך התגובה RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את התדירות המתאימה משרעת של micromixing. בדוגמה זו אנו משתמשים 150Hz. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כבה את micromixer על ולהשאיר אותה במשך כל תקופת התגובה RT (60 דקות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כבה את micromixer את לקחת את שפופרות RT החוצה פעם את התגובה RT תושלם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את צינורות RT על הקרח ולהמשיך כרגיל עם יישומים נוספים, כגון תגובת שרשרת כמותי פולימראז (qPCR או בזמן אמת PCR). </li></ol> 2. נציג תוצאות: היתרון של micromixing בהקשר של תגובות RT היא עלייה בתשואה cDNA יחסית כאשר שיטות ערבוב אחרים (כגון טלטולים, vortexing או טחינה דקה) משמשים. ניתן לראות זאת, למשל, על ניתוח בדיעבד של התגובה cDNA באמצעות כמותי פולימראז שרשרת (qPCR או בזמן אמת PCR). איור 2A ממחיש את ההשפעות של micromixing במשך 5 הדקות הראשונות (כחול, &quot;micromixed5&quot;) או כל 60 דקות (אדום, &quot;micromixed60&quot;) לעומת טחינה דקה התגובה RT מיד לפני הדגירה RT (שחור, &quot;טחינה דקה&quot; ). במקרה זה את עוצמת התגובה RT הקודמת היה 25μL והוא הכיל 2.5pg של רנ&quot;א מוחלט. עקבות qPCR באמצעות primers נועד לזהות Nurr-1 cDNA המייצג mRNA מוצגים לעיל, וכן אמצעי ± SEMs של מספר מחזורים כדי להגיע הקרינה המקסימלית של 50% 3 חזרות של הניסוי הזה הם זממו אותו למטה. הכוכבית מציינת הבדל משמעותי סטטיסטית (ANOVA חד כיווני עם השוואות טיוקי מרובים). שים לב micromixing במשך 5 הדקות הראשונות של התגובה הקודמת RT המיוצר שיפור לא משמעותי על פני טחינה דקה ואילו micromixing במשך 60 דקות שלמות של התגובה הקודמת RT המיוצר שיפור משמעותי לעומת טחינה דקה, גודל שהיה שווה ערך ל כ 15 qPCR מחזורי, בממוצע. היתרון של micromixing ניתן גם לראות ניתוח עקומת התכה של המוצרים הבאים המתקבלים qPCR. במהלך הניסוי ממחישה 2B איור, micromixing במשך 60 דקות שלמות של התגובה RT הקודמת הביאו אות qPCR עקבית כפולות דגימות (איור 2BA, 2 עקבות אדום), ואילו micromixing במשך 5 הדקות הראשונות או טחינה דקה מיוצר רק qPCR עקבי עקבות (איור 2BA, 2 עקבות כחול 2 עקבות שחור, בהתאמה). עקבות אפור פיקוח שליליים (&quot;נג&quot;). CDNA שבו הושאר מחוץ התגובה qPCR. כאשר המוצרים qPCR מניסוי זה היו מפוגל ידי ramping הטמפרטורה שלהם (כלומר ניתוח עקומת התכה) היה ברור כי ראוי PCR המוצרים (כלומר amplicon היה זהה לזה שהושג כאשר ריכוזים גבוהים בהרבה של mRNA תועתקו הפוך מוגבר על ידי qPCR, מידע לא מוצג) נכחו רק התגובות הבאות RT שהיו micromixed במשך 60 דקות (איור 2Bb, 2 עקבות אדומים). כל האחרים (כלומר micromixed5, טחינה דקה בקרות שלילי) שנוצר amplicon מוצרים אלטרנטיביים (למשל הדימרים פריימר). <img src="/files/ftp_upload/3144/3144fig1.jpg" alt="איור 1"/> באיור 1. תרשים זרימה של פרוטוקול ליישום micromixing לרמת התגובות מעבדה RT. תיאורים מפורטים יותר של עקרון פיזית המעורבים, micromixer וכיצד לבנות בתוך הבית micromixer ניתנים הפניות 13,14 <img src="/files/ftp_upload/3144/3144fig2.jpg" alt="איור 2"/> איור 2. נציג נתונים qPCR הממחישות את היתרונות של micromixing להחיל הקודמת התגובות RT הכוללת תא בודד כמויות של mRNA בתגובות מעבדה סטנדרטיים אחרת RT. דוגמה עקבות qPCR גילוי mRNA המייצג cDNA קידוד Nurr-1 הגן. התגובות הקודמות RT הכלול 2.5pg של רנ&quot;א הכולל בהיקף של 25μL ו בוצעו באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות. התגובות היו מעורבות RT ידי טחינה דקה של RT לערבב לפני הדגירה (עקבות שחורים, &quot;טחינה דקה&quot;), micromixed במהלך 5 הדקות הראשונות של התגובה RT (עקבות כחול, &quot;micromixed5&quot;) או micromixed במשך 60 דקות שלמות של התגובה RT (עקבות אדומים, &quot;micromixed60&quot; ). אמצעי ± SEMs של מספר מחזורים qPCR נדרש להגיע הקרינה המקסימלית 50% הם זממו להלן עבור n = 3 חזרות של הניסוי הזה. כוכבית מציינת הבדל משמעותי (ANOVA חד כיווני עם השוואות טיוקי מרובים). B ניסוי נוסף qPCR בחינת Nurr-1 מוצר cDNA, הפעם בעקבות התגובות RT המכיל 25pg של רנ&quot;א הכולל בהיקף של 25μL. עקבות qPCR (א), כמו גם ניתוח עקומת התכה של המוצרים qPCR שהושגו (ב) מוצגים על תנאי ערבוב שונים. שולטת שלילי שבו לא cDNA נכלל התגובה RT הקודמת כלולים גם (עקבות אפור, &quot;נג&quot;).. התגובות RT עם ריכוזים גבוהים בהרבה של mRNA בוצעו גם והפיק עקומת התכה פסגות (מידע לא מוצג) זהים לאלה (ב) עבור micromixed60 (עקבות אדומים) דגימות.

<ol>
	<li>Livesey, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brief+Funct+Genomic+Proteomic.">Brief Funct Genomic Proteomic.</a> 2 (1), 31-31 (2003).</li><li>Aumann, T. D., Gantois, I., Egan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Exp Neurol. 213 (2), 419-419 (2008).</li><li>Ottino, J. M., Wiggins, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Philos Transact A Math Phys Eng Sci. 362 (1818), 923-923 (2004).</li><li>Losey, M. W., Jackman, R. J., Firebaugh, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> J Microelectromech. Syst. 11, 709-709 (2002).</li><li>Bontoux, N., Dauphinot, L., Vitalis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Lab Chip. 8 (3), 443-443 (2008).</li><li>Marcus, J. S., Anderson, W. F., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Anal Chem. 78 (9), 3084-3084 (2006).</li><li>Marcus, J. S., Anderson, W. F., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Anal Chem. 78 (3), 956-956 (2006).</li><li>Warren, L., Bryder, D., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (47), 17807-17807 (2006).</li><li>Jiao, Z. J., Huang, X. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Microfluidics Nanofluidics. 6, 847-847 (2009).</li><li>Ahmed, D., Xiaole, M., Juluri, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Microfluidics Nanofluidics. 7, 727-727 (2009).</li><li>Paxton, W. F., O'Hara, M. J., Peper, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Anal Chem. 80, 4070-4070 (2008).</li><li>Autom, L. a. b. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> 11, 399-399 (2006).</li><li>Petkovic-Duran, K., Manasseh, R., Zhu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> 47 (4), 827-827 (2009).</li><li>Boon, W. C., Petkovic-Duran, K., White, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> 50 (2), 116-116 (2011).</li><li>Liu, R. H., Lenigk, R., Druyor-Sanchez, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Anal Chem. 75 (8), 1911-1911 (1911).</li><li>Riley, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ann+Rev+Fluid+Mech.">Ann Rev Fluid Mech.</a> 33, 43-43 (2001).</li><li>Whitehill, J., Neild, A., Ng, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Applied Physics Letters. 96 (5), 053501-053501 (2010).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

שיטת היישום של micromixing לרמת התגובות מעבדה RT המתואר כאן יכול, כמובן, כרוך mRNA שנקטפו באמצעות שיטה כלשהי (למשל תמוגה התא, לייזר microdissection ללכוד). זה גם יכול לכלול כל המותגים או סוגי RT ריאגנטים, כל טמפרטורה (תוך סובלנות של החומרים של micromixer), וכל תקופה. לדוגמה, ראינו שיפור התשואו...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם מגיב </th><th> חברה </th><th> מספר קטלוגי </th><th> הערות (אופציונלי) </th></tr><tr><td> סה&quot;כ היה RNA שבודד קפוא הצמד פרוסות מוכן בחריפות עכבר מבוגר המוח התיכון </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> PicoPure RNA בידוד Kit </td><td> ארקטורוס, קליפורניה, ארה&quot;ב </td><td> KIT0204 </td><td> הערכה זמינה כעת מ-Applied Biosystems </td></tr><tr><td> ה-DNA בחינם DNase טיפול להסרת ריאגנטים </td><td> Ambion </td><td> AM1906M </td><td></td></tr><tr><td> אקראיים hexamer primers </td><td> Promega </td><td> C1181 </td><td></td></tr><tr><td> AMV-RT </td><td> Promega </td><td> M5101 </td><td></td></tr><tr><td> dNTP להגדיר </td><td> Promega </td><td> U1240 </td><td></td></tr><tr><td> RNasin Ribonuclease אינהיביטור </td><td> Promega </td><td> N2111 </td><td></td></tr><tr><td> Nuclease ללא מים </td><td> Promega </td><td> P1193 </td><td></td></tr><tr><td> SYBR גרין PCR מאסטר מיקס </td><td> אפלייד Biosystem </td><td> 4309155 </td><td></td></tr><tr><td> Hprt קדימה (20mer): CTT TGC TGA CCT GCT GGA TT </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Hprt הפוך (20mer): תאת GTC CCC CGT TGA CTG AT </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Nurr1 קדימה (23mer): החטיבה CTC CGA TTT CTT AAC TCC AG </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Nurr1 הפוך (23mer): GGT GAG GTC CAT GCT AAA CTT GA </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> NanoDrop 1000 ספקטרופוטומטר. </td><td> Thermo Scientific </td><td></td><td></td></tr><tr><td> קורבט רוטור ג&#39;ין RG-6000 </td><td> קורבט מדעי החיים </td><td></td><td> קורבט מדעי החיים נרכשה על ידי QIAGEN ביולי 2008 </td></tr></tbody></table>

increasing cdna yields from single-cell quantities of mrna in standard laboratory reverse transcriptase reactions using acoustic microstreaming

ביטוי גנים correlating עם התנהגות התא נעשית באופן אידיאלי ברמת מתחיל מתא בודד. עם זאת, זו אינה מושגת בקלות כי כמות קטנה של mRNA יציב נוכח בתא בודד (1-5% של 1-RNA 50pg הכולל, או 0.01-mRNA 2.5pg, לכל תא 1) בעיקר מדרדרת לפני שניתן יהיה להפוך עיבד לתוך עותק cDNA יציב. לדוגמה, באמצעות ריאגנטים מעבדה סטנדרטיים החומרה, רק מספר קטן של גנים ניתן להעריך איכותית לכל תא 2. דרך אחת להגביר את היעילות של תקן מעבדה הפוכה transcriptase (RT) תגובות (ריאגנטים כלומר תקן בכמויות microliter) הכולל תא בודד כמויות של mRNA יהיה במהירות רבה יותר בתמהיל ריאגנטים כך את ה-mRNA ניתן להמיר cDNA לפני שהיא מדרדרת. אולם זה לא טריוויאלי כי בקני מידה microliter זרימת הנוזל היא למינרית, כלומר השיטות הקיימות כיום של ערבוב (כלומר רועד, vortexing ו טחינה דקה) לא מצליחים לייצר תנועה כאוטית מספיק ביעילות לערבב חומרים כימיים. כדי לפתור בעיה זו, מיקרו בקנה מידה טכניקות ערבוב צריך לשמש 3,4. מספר microfluidic טכנולוגיות מבוססות ערבוב אשר פותחו בהצלחה להגדיל את התשואות RT תגובה 5-8. עם זאת, טכנולוגיות מיקרופלואידיקה דורשים חומרה מיוחדת, כי הוא יקר יחסית, עדיין אינו זמין באופן נרחב. פתרון זול יותר, נוח יותר רצוי. המטרה העיקרית של מחקר זה היא להדגים כיצד היישום של טכניקה חדשנית &quot;micromixing&quot; לתגובות מעבדה סטנדרטיים RT הכוללת תא בודד כמויות של mRNA מגביר באופן משמעותי בתשואות cDNA שלהם. אנו מוצאים תשואות cDNA להגדיל בכ 1-10 כפולה, המאפשרת: (1) במספרים גדולים יותר של גנים כדי להיות מנותח לכל תא, (2) ניתוח כמותי יותר של ביטוי גנים; ו (3) זיהוי טוב יותר נמוכה שפע גנים בתוך תאים בודדים. Micromixing מבוססת על אקוסטית microstreaming 9-12, תופעה שבה גלי הקול מתפשט סביב מכשול קטן ליצור זרימה מתכוון ליד המכשול. פיתחנו מכשיר אקוסטי microstreaming מבוססות (&quot;micromixer&quot;), עם פישוט מפתח: microstreaming אקוסטי ניתן להשיג בתדרים אודיו ידי הבטחת למערכת יש ממשק נוזלי אוויר עם רדיוס עקמומיות קטן של 13. המניסקוס של נפח microliter של פתרון צינור מספק רדיוס קטן כראוי של עקמומיות. השימוש בתדרי שמע כלומר החומרה יכול להיות זולה צדדי 13, וחומצות גרעין ו ריאגנטים ביוכימיים אחרים אינם פגומים כמו שהם יכולים להיות עם sonicators מעבדה סטנדרטיים.

Watch this Scientific Journal Video about Increasing cDNA Yields from Single-cell Quantities of mRNA in Standard Laboratory Reverse Transcriptase Reactions using Acoustic Microstreaming at JoVE.com

Increasing cDNA Yields from Single-cell Quantities of mRNA in Standard Laboratory Reverse Transcriptase Reactions using Acoustic Microstreaming

אנו מתארים שיטה חדשה להגדלת התשואה cDNA של תא בודד של mRNA בכמויות ברמת אחרת הפוכה התגובות מעבדה שעתוק. החידוש מתגורר השימוש micromixer, אשר מנצל את התופעה של microstreaming אקוסטי, לערבב נוזלים בקני מידה microliter בצורה יעילה יותר מאשר רועד, vortexing או טחינה דקה.

הגדלת התשואות cDNA של תא בודד כמויות ה-mRNA בתקן Reverse transcriptase תגובות מעבדה באמצעות Microstreaming אקוסטית

Correlating gene expression with cell behavior is ideally done at the single-cell level.  However, this is not easily achieved because the small amount of ...

increasing-cdna-yields-from-single-cell-quantities-mrna-standard

Research

JoVE Journal

Bioengineering

10.1K Views.  University of Melbourne. אנו מתארים שיטה חדשה להגדלת התשואה cDNA של תא בודד של mRNA בכמויות ברמת אחרת הפוכה התגובות מעבדה שעתוק. החידוש מתגורר השימוש micromixer, אשר מנצל את התופעה של microstreaming אקוסטי, לערבב נוזלים בקני מידה microliter בצורה יעילה יותר מאשר רועד, vortexing או טחינה דקה.

Video: Increasing cDNA Yields from Single-cell Quantities of mRNA in Standard Laboratory Reverse Transcriptase Reactions using Acoustic Microstreaming

Creating Transient Cell Membrane Pores Using a Standard Inkjet Printer

Bioprinting has a wide range of applications and significance, including tissue engineering, direct cell application therapies, and biosensor microfabrication.1-10 Recently, thermal inkjet printing has also been used for gene transfection.8,9 The thermal inkjet printing process was shown to temporarily disrupt the cell membranes without affecting cell viability. The transient pores in the membrane can be used to introduce molecules, which would otherwise be too large to pass through the membrane, into the cell cytoplasm.8,9,11
The application being demonstrated here is the use of thermal inkjet printing for the incorporation of fluorescently labeled g-actin monomers into cells. The advantage of using thermal ink-jet printing to inject molecules into cells is that the technique is relatively benign to cells.8, 12 Cell viability after printing has been shown to be similar to standard cell plating methods1,8. In addition, inkjet printing can process thousands of cells in minutes, which is much faster than manual microinjection. The pores created by printing have been shown to close within about two hours. However, there is a limit to the size of the pore created (~10 nm) with this printing technique, which limits the technique to injecting cells with small proteins and/or particles. 8,9,11
A standard HP DeskJet 500 printer was modified to allow for cell printing.3, 5, 8 The cover of the printer was removed and the paper feed mechanism was bypassed using a mechanical lever. A stage was created to allow for placement of microscope slides and coverslips directly under the print head. Ink cartridges were opened, the ink was removed and they were cleaned prior to use with cells. The printing pattern was created using standard drawing software, which then controlled the printer through a simple print command. 3T3 fibroblasts were grown to confluence, trypsinized, and then resuspended into phosphate buffered saline with soluble fluorescently labeled g-actin monomers. The cell suspension was pipetted into the ink cartridge and lines of cells were printed onto glass microscope cover slips. The live cells were imaged using fluorescence microscopy and actin was found throughout the cytoplasm. Incorporation of fluorescent actin into the cell allows for imaging of short-time cytoskeletal dynamics and is useful for a wide range of applications.13-15

A description of the methods used to convert an HP DeskJet 500 printer into a bioprinter. The printer is capable of processing living cells, which causes transient pores in the membrane. These pores can be utilized to incorporate small molecules, including fluorescent G-actin, into the printed cells.

יצירת חולף קרום התא הנקבוביות באמצעות מדפסת הזרקת דיו רגילה

Bioprinting has a wide range of applications and significance, including tissue engineering, direct cell application therapies, and biosensor ...

A Label-free Technique for the Spatio-temporal Imaging of Single Cell Secretions

Inter-cellular communication is an integral part of a complex system that helps in maintaining basic cellular activities. As a result, the malfunctioning of such signaling can lead to many disorders. To understand cell-to-cell signaling, it is essential to study the spatial and temporal nature of the secreted molecules from the cell without disturbing the local environment. Various assays have been developed to study protein secretion, however, these methods are typically based on fluorescent probes which disrupt the relevant signaling pathways. To overcome this limitation, a label-free technique is required.
In this paper, we describe the fabrication and application of a label-free localized surface plasmon resonance imaging (LSPRi) technology capable of detecting protein secretions from a single cell. The plasmonic nanostructures are lithographically patterned onto a standard glass coverslip and can be excited using visible light on commercially available light microscopes. Only a small fraction of the coverslip is covered by the nanostructures and hence this technique is well suited for combining common techniques such as fluorescence and bright-field imaging.
A multidisciplinary approach is used in this protocol which incorporates sensor nanofabrication and subsequent biofunctionalization, binding kinetics characterization of ligand and analyte, the integration of the chip and live cells, and the analysis of the measured signal. As a whole, this technology enables a general label-free approach towards mapping cellular secretions and correlating them with the responses of nearby cells.

Inter-cellular communication is critical for controlling various physiological activities within and outside the cell. This paper describes a protocol for measuring the spatio-temporal nature of single cell secretions. To achieve this, a multidisciplinary approach is used which integrates label-free nanoplasmonic sensing with live cell imaging.

טכניקה ללא תווית להדמית החלל-הזמן של פרשות תא בודדת

Inter-cellular communication is an integral part of a complex system that helps in maintaining basic cellular activities. As a result, the malfunctioning ...

An Ultrahigh-throughput Microfluidic Platform for Single-cell Genome Sequencing

Sequencing technologies have undergone a paradigm shift from bulk to single-cell resolution in response to an evolving understanding of the role of cellular heterogeneity in biological systems. However, single-cell sequencing of large populations has been hampered by limitations in processing genomes for sequencing. In this paper, we describe a method for single-cell genome sequencing (SiC-seq) which uses droplet microfluidics to isolate, amplify, and barcode the genomes of single cells. Cell encapsulation in microgels allows the compartmentalized purification and tagmentation of DNA, while a microfluidic merger efficiently pairs each genome with a unique single-cell oligonucleotide barcode, allowing &gt;50,000 single cells to be sequenced per run. The sequencing data is demultiplexed by barcode, generating groups of reads originating from single cells. As a high-throughput and low-bias method of single-cell sequencing, SiC-seq will enable a broader range of genomic studies targeted at diverse cell populations.

Single-cell sequencing reveals genotypic heterogeneity in biological systems, but current technologies lack the throughput necessary for the deep profiling of community composition and function. Here, we describe a microfluidic workflow for sequencing &gt;50,000 single-cell genomes from diverse cell populations.

פלטפורמת Microfluidic על קוליים בתפוקה של רצף הגנום בתא יחיד

Sequencing technologies have undergone a paradigm shift from bulk to single-cell resolution in response to an evolving understanding of the role of ...

A Converging Strategy for the Generation of a Virtually Sequenced cDNA Library from Unreferenced Pacific Oysters

The access to biological material of reference species, which were used previously in key experiments such as in the development of novel cell lines or genome sequencing projects, are often difficult to provide for further studies or third parties due to the consumptive nature of the samples. Although now widely distributed over the Pacific coasts of Asia, Australia and North America, individual Pacific oyster specimens are genetically quite diverse and are therefore not directly suitable as the starting material for gene libraries. In this article, we demonstrate the use of unreferenced Pacific oyster specimens obtained from regional seafood markets to generate cDNA libraries. These libraries were then compared to the publicly available oyster genome, and the closest related library was selected using the mitochondrial reference genes Cytochrome C Oxidase subunit I (COX1) and NADH Dehydrogenase (ND). The suitability of the generated cDNA library is also demonstrated by cloning and expression of two genes encoding the enzymes UDP-glucuronic acid dehydrogenase (UGD) and UDP-xylose synthase (UXS), which are responsible for the biosynthesis of UDP-xylose from UDP-glucose.

We describe a strategy for how to use RNA samples from unreferenced Pacific oyster specimens, and evaluate the genetic material by comparison with publicly available genome data to generate a virtually sequenced cDNA library.

אסטרטגיה מתכנס לדור של ספריית דנ א בלתי מופנה מצדפות פסיפיק

The access to biological material of reference species, which were used previously in key experiments such as in the development of novel cell lines or ...

Increasing Durability of Dissociated Neural Cell Cultures Using Biologically Active Coralline Matrix

Cultures of dissociated hippocampal neuronal and glial cells are a valuable experimental model for studying neural growth and function by providing high cell isolation and a controlled environment. However, the survival of hippocampal cells in vitro is compromised: most cells die during the first week of culture. It is therefore of great importance to identify ways to increase the durability of neural cells in culture.
Calcium carbonate in the form of crystalline aragonite derived from the skeleton of corals can be used as a superior, active matrix for neural cultures. By nurturing, protecting, and activating glial cells, the coral skeleton enhances the survival and growth of these cells in vitro better than other matrices.
This protocol describes a method for cultivating hippocampal cells on a coralline matrix. This matrix is generated by attaching grains of coral skeletons to culture dishes, flasks, and glass coverslips. The grains assist in improving the environment of the cells by introducing them to a fine three-dimensional (3D) environment to grow on and to form tissue-like structures. The 3D environment introduced by the coral skeleton can be optimized for the cells by grinding, which enables control over the size and density of the grains (i.e., the matrix roughness), a property that has been found to influence glial cells activity. Moreover, the use of grains makes the observation and analysis of the cultures easier, especially when using light microscopy. Hence, the protocol includes procedures for generation and optimization of the coralline matrix as a tool to improve the maintenance and functionality of neural cells in vitro.

Dissociated hippocampal cell culture is a pivotal experimental tool in neuroscience. Neural cell survival and function in culture is enhanced when coralline skeletons are used as matrices, due to their neuroprotective and neuromodulative roles. Hence, neural cells grown on coralline matrix show higher durability, and thereby are more adequate for culturing.

הגברת העמידות של תרביות תאים עצביים מנותקים באמצעות מטריצת אלמוגים פעילה ביולוגית

Cultures of dissociated hippocampal neuronal and glial cells are a valuable experimental model for studying neural growth and function by providing high ...

Primary Clarification of CHO Harvested Cell Culture Fluid using an Acoustic Separator

Primary clarification is an essential step in a biomanufacturing process for the initial removal of cells from therapeutic products within the harvested cell culture fluid. While traditional methods like centrifugation or filtration are widely implemented for cell removal, the equipment for these processes have large footprints and operation can involve contamination risks and filter fouling. Additionally, traditional methods may not be ideal for continuous bioprocessing schemes for primary clarification. Thus, an alternate application using acoustic (sound) waves was investigated to continuously separate cells from the cell culture fluid. Presented in this study is a detailed protocol for using a bench-scale acoustic wave separator (AWS) for the primary separation of culture fluid containing a monoclonal IgG1 antibody from a CHO cell bioreactor harvest. Representative data are presented from the AWS and demonstrate how to achieve effective cell clarification and product recovery. Finally, potential applications for AWS in continuous bioprocessing are discussed. Overall, this study provides a practical and general protocol for the implementation of AWS in primary clarification for CHO cell cultures and further describes its application potential in continuous bioprocessing.

Presented here is a protocol for the primary clarification of CHO cell culture using an acoustic separator. This protocol can be used for the primary clarification of shake flask cultures or bioreactor harvests and has the potential application for continuous clarification of the cell bleed material during perfusion bioreactor operations.

הבהרה ראשונית של נוזל תרבית תאים שנקטפו על ידי CHO באמצעות מפריד אקוסטי

Primary clarification is an essential step in a biomanufacturing process for the initial removal of cells from therapeutic products within the harvested ...

Standard Test Method ASTM D 7998-19 for the Cohesive Strength Development of Wood Adhesives

The properties of cured wood adhesives are difficult to study because of the loss of water and other components to the wood, the influence of wood on the adhesive cure, and the effect of adhesive penetration on the wood interphase; thus, normal testing of a neat adhesive film is generally not useful. Most tests of wood adhesive bond strength are slow, laborious, can be strongly influenced by the wood and do not provide information on the kinetics of cure. Test method ASTM D 7998-19, however, can be used for fast evaluation of the strength of wood bonds. The use of a smooth, uniform, and strong wood surface, like maple face-veneer, and sufficient bonding pressure reduces the adhesion and wood strength effects on bond strength. This method has three main applications. The first is to provide consistent data on bond strength development. The second is to measure the dry and wet strengths of bonded lap shear samples. The third is to better understand the adhesive heat resistance by quickly evaluating thermal sensitivity and distinguishing between thermal softening and thermal degradation.

We present a procedure, ASTM D7998-19, for a rapid and more consistent evaluation of both dry and wet strength of adhesive bonds on wood. The method can also be used to provide information on strength development as a function of temperature and time or strength retention up to 250 &#176;C.

שיטת בדיקה סטנדרטית ASTM D 7998-19 לפיתוח חוזק מלוכד של דבקי עץ

The properties of cured wood adhesives are difficult to study because of the loss of water and other components to the wood, the influence of wood on the ...

Magnetic-, Acoustic-, and Optical-Triple-Responsive Microbubbles for Magnetic Hyperthermia and Pothotothermal Combination Cancer Therapy

The precision delivery of anti-cancer agents which aim for targeted and deep-penetrated delivery as well as a controlled release at the tumor site has been challenged. Here, we fabricate iron oxide nanoparticle shelled microbubbles (NSMs) through self-assembly, synergizing magnetic, acoustic, and optical responsiveness in one nanotherapeutic platform. Iron oxide nanoparticles serve as both magnetic and photothermal agents. Once intravenously injected, NSMs can be magnetically guided to the tumor site. Ultrasound triggers the release of iron oxide nanoparticles, facilitating the penetration of nanoparticles deep into the tumor due to the cavitation effect of microbubbles. Thereafter, magnetic hyperthermia and photothermal therapy can be performed on the tumor for combinational cancer therapy, a solution for cancer resistance due to the tumor heterogeneity. In this protocol, the synthesis and characterization of NSMs including structural, chemical, magnetic and acoustic properties were performed. In addition, the anti-cancer efficacy by thermal therapy was investigated using in vitro cell cultures. The proposed delivery strategy and combination therapy holds great promise in cancer treatment to improve both delivery and anticancer efficacies.

Presented here is a protocol for the fabrication of iron oxide nanoparticle-shelled microbubbles (NSMs) through self-assembly, synergizing magnetic, acoustic, and optical responsiveness in one nanotherapeutic platform for magnetic hyperthermia and photothermal combination cancer therapy.

מיקרו-גיבלים מגנטיים, אקוסטיים ואופטיים-משולשים-רספונסיביים לטיפול בסרטן משולב של פוטוטותרמיה

The precision delivery of anti-cancer agents which aim for targeted and deep-penetrated delivery as well as a controlled release at the tumor site has ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically carried out in low throughput. Rapid and ongoing expansion of induced pluripotent stem cell (iPSC) technology presents a new standard in cardiovascular research and alternate methods are now necessary to increase throughput of electrophysiological data at a single cell level. VF2.1Cl is a recently derived voltage sensitive dye which provides a rapid single channel, high magnitude response to fluctuations in membrane potential. It possesses kinetics superior to those of other existing voltage indicators and makes available functional data equivalent to that of traditional microelectrode techniques. Here, we demonstrate simplified, non-invasive action potential characterization in externally paced human iPSC derived cardiomyocytes using a modular and highly affordable photometry system.

Here we describe optical acquisition and characterization of action potentials from induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes using a high-speed modular photometry system.

מדידה פוטנציאלית לפעולה אופטית חד-תאית בקרדיומיוציטים שמקורם בתאי גזע מושרים על ידי תאי גזע אנושיים

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...

Simplified, High-throughput Analysis of Single-cell Contractility using Micropatterned Elastomers

Cellular contractile force generation is a fundamental trait shared by virtually all cells. These contractile forces are crucial to proper development, function at both the cellular and tissue levels,and regulate the mechanical systems in the body. Numerous biological processes are force-dependent, including motility, adhesion, and division of single-cells, as well as contraction and relaxation of organs such as the heart, bladder, lungs, intestines, and uterus. Given its importance in maintaining proper physiological function, cellular contractility can also drive disease processes when exaggerated or disrupted. Asthma, hypertension, preterm labor, fibrotic scarring, and underactive bladder are all examples of mechanically driven disease processes that could potentially be alleviated with proper control of cellular contractile force. Here, we present a comprehensive protocol for utilizing a novel microplate-based contractility assay technology known as fluorescently labeled elastomeric contractible surfaces (FLECS), that provides simplified and intuitive analysis of single-cell contractility in a massively scaled manner. Herein, we provide a step-wise protocol for obtaining two six-point dose-response curves describing the effects of two contractile inhibitors on the contraction of primary human bladder smooth muscle cells in a simple procedure utilizing just a single FLECS assay microplate, to demonstrate proper technique to users of the method. Using FLECS Technology, all researchers with basic biological laboratories and fluorescent microscopy systems gain access to studying this fundamental but difficult-to-quantify functional cell phenotype, effectively lowering the entry barrier into the field of force biology and phenotypic screening of contractile cell force.

This work presents a flexible protocol for utilizing fluorescently labeled elastomeric contractible surfaces (FLECS) Technology in microwell format for simplified, hands-off quantification of single-cell contractile forces based on visualized displacements of fluorescent protein micropatterns.

ניתוח פשוט בעל תפוקה גבוהה של התכווצות של תאים חד-תאיים באמצעות אלסטומרים מיקרו-מרופדים

Cellular contractile force generation is a fundamental trait shared by virtually all cells. These contractile forces are crucial to proper development, ...